Visualisere de tidlige stadiene av Fagocytose

Abstract

Pattedyrkroppen er utstyrt med forskjellige lag av mekanismer som bidrar til å forsvare seg mot patogene invasjoner. Profesjonelle fagocytter av immunsystemet - for eksempel nøytrofile, dendrittiske celler og makrofager - beholde medfødt evne til å oppdage og fjerne slike invaderende patogener gjennom fagocytose ^en. Fagocytose innebærer koreograferte hendelser av membran omorganisering og aktin ombygging på celleoverflaten ^{to, tre.} Fagocytter vellykket internal og utrydde fremmede molekyler bare når alle stadier av fagocytose er oppfylt. Disse trinnene omfatter gjenkjenning og binding av organismen ved mønstergjenkjenning reseptorer (PRRS) bosatt på celleoverflaten, til dannelse av fagocytisk koppen gjennom aktin-anriket membran fremspring (pseudopods) omgir det partikulære, og spalting av den phagosome fulgt av phagolysosome modning som resultater idrepe av organismen ^{tre, fire.}

Imaging og kvantifisering av ulike stadier av fagocytose er instrumental for å belyse de molekylære mekanismene for dette cellulære prosessen. Den nåværende manuskriptet rapporterer metoder for å studere de ulike fasene av fagocytose. Vi beskriver et mikroskop basert tilnærming for å visualisere og kvantifisere binding, fagocytisk cup formasjon, og internalisering av partikler av fagocytter. Som fagocytose oppstår når medfødte reseptorer på fagocyttiske celler støter ligander på en mål-partikkel større enn 0,5 um, assayene vi presenterer her omfatte anvendelse av patogene sopp Candida albicans og andre partikler som for eksempel zymosan og IgG-belagte perler.

Introduction

Til tross for kontinuerlig eksponering for patogener som bakterier, virus og sopp, er kroppen vår godt utstyrt med immunsystemet som gir beskyttelse mot infeksjon. Det medfødte immunsystem er den første linjen i forsvaret mot invaderende patogener og bygger hovedsakelig på phagocytic celler som gjenkjenner og internal utenlandske mål.

Fagocytose er en evolusjonært konservert cellulær prosess som omfatter engulfment av uønskede partikler større enn 0,5 um. Fagocytiske celler uttrykker et bredt spekter av immun reseptorer (også kjent som mønstergjenkjenning reseptorer, PRRS) på celleoverflaten som gjør dem i stand til å gjenkjenne patogen-assosiert molekyl mønstre (PAMPs) som er tilstede på patogener før mot opptak ^tre. Patogen-binding er etterfulgt av reseptor-gruppering på celleoverflaten og utløser dannelsen av en fagocytisk kopp. Dette resulterer i aktin-drevet membranremodellering som stikker frem rundtmålet, etterhvert som innhyller den og knipe-off for å danne en diskret phagosomal vacuole ^{2, 5.} Den phagosome deretter modnes og acidifies ved etterfølgende fusjon med sene endosomer og lysosomer som danner phagolysosome ^6.

Selv om fagocytose er beskrevet som reseptor-mediert og aktin-drevet arrangement, denne fremgangsmåten er også avhengig av romlig-temporale modifikasjon av lipider som skriver plasmamembranen, slik som phosphoinositides (PI) og sfingolipider ^{7, 8.} Mens aktin polymerisasjon er diktert av en lokal opphopning av phosphoinositol-4,5-bifosfat (PI (4,5) _P-2) ved bunnen av fagocytisk koppen, avhenger actin depolymerisasjon av omdannelsen av (PI (4,5) P- ₂ til phosphoinositol-3,4,5-hydrogenfosfat (PI (3,4,5) P ₃₎ ^{3, 9.} Begge modifikasjonerer viktig som de tidligere fører til vellykket utvidelse av pseudopods rundt målet og sistnevnte gjør det mulig å synke partikler i cytosol av fagocyttsystemet ^10.

Celler som har evne til å fagocyttere er enten profesjonell fagocytter, slik som makrofager / monocytter, granulocytter / neutrofiler, og dendrittiske celler (DCS) eller amatør-fagocytter, som for eksempel fibroblast og epitelceller ^11. Fagocytose utføres av alle fagocytter spiller en sentral rolle i vev vedlikehold og ombygging, mens fagocytose utført av profesjonelle fagocytter er ansvarlig for koordineringen av det medfødte og adaptive immunrespons mot patogener. Profesjonelle fagocytter ikke bare sluker og drepe patogen, men også presentere antigener til lymfoide celler av den adaptive immunsystemet. Dette bidrar til frigjøring av pro-inflammatoriske cytokiner og av inngrepet av lymfoide celler, og derfor fører tilvellykket blokade av infeksjon ^12.

Konvensjonelle biokjemiske teknikker har vært medvirkende i å få kunnskap om den molekylære mekanismen for ulike cellulære prosesser i løpet av fagocytose, for eksempel posttranslasjonelle modifikasjoner og ulike høy affinitet assosiasjoner mellom proteiner. Det er imidlertid vanskelig å oppnå informasjon om de romlige og tidsmessige dynamikken i fagocyttiske hendelser ved hjelp av konvensjonelle biokjemiske metoder. Live-cell imaging ikke bare tillater oss å overvåke cellulære hendelser i en tid sensitiv måte, men også gjør oss i stand til å få informasjon på en enkelt celle nivå. Her beskriver vi en fremgangsmåte for å undersøke de forskjellige stadier av fagocytose, så vel som for å analysere hele prosessen spatiotemporally ved hjelp av konfokal mikroskopi.

Protocol

1. Utarbeidelse av DC2.4 og RAW 264,7 cellelinjer

MERK: makrofag-lignende cellelinje RAW 264.7 og dendrittiske cellelinjen DC2.4 er både murin opprinnelse, og de følgende betingelser ble anvendt for å dyrke cellene.

1. Vokse RAW 264.7 celler i DMEM (Dulbecco Minimal Eagle 's medium) supplert med 10% inaktivert føtalt bovint serum (FBS) ved 37 ° C i en fuktet inkubator med _5% CO2.
2. Grow DC2.4 celler i tilsvarende forhold med den i RAW 264.7-celler, bortsett fra anvendelse RPMI (Roswell Park Memorial Institute) medium supplert med L-glutamin i stedet for DMEM.

2. Utarbeidelse av Fluorescent Conjugated Partikler: C. albicans, Zymosan, IgG-belagte perler

1. Økende Candida albicans
   1. Inokuler C. albicans belastning SC5314 fra et frosset lager glycerol i 25 ml YPD supplert med Uri (2% Bacto-pepton, 1%gjærekstrakt, 2% glukose og 80 ug / ml uridin) over natten ved 30 ° C.
      MERK: Unngå voksende Candida kultur mer enn en OD ₆₀₀ av 12.
   2. Ta 1 ml av C. albicans og spinner den ned ved 2000 xg i 5 min ved romtemperatur.
   3. Aspirer supernatanten og re-suspen pellet med 1 ml PBS.
   4. Samle pellet ved sentrifugering ved 2000 x g i 5 min ved romtemperatur.
   5. Gjenta trinn 2.1.4.
   6. Beregn multiplisitet av infeksjon (MOI) med C. albicans i forhold til antallet av fagocytter og fortsette med fagocytose analyse som beskrevet i seksjon 3. En OD ₆₀₀ av en tilsvarer 2,5 x 10 ⁷ Candida albicans per 1 ml.
      MERK: Generering av Candida-BFP er beskrevet i referanse ^13.
2. Fremstilling av Zymosan og IgG-belagte perler
   MERK: Zymosan er en β-glukan-holdigfungal karbohydrat partikkelformet preparat som er avledet fra Saccharomyces cerevisiae. Zymosan er kjent for å fremkalle inflammatoriske signaler i makrofager og dendrittiske celler, og det har vært brukt i stor utstrekning i fagocytose studier ^{13, 14, 15.}
   1. I korthet vortex tube som inneholder den partikkelformige, og aliquot en mengde som er tilstrekkelig for et eksperiment i et 1,5 ml rør.
      MERK: Vanligvis bruker vi 1:10 ratio (for en celle, legger 10 zymosan partikler eller IgG-belagte perler).
   2. Tilsett 1 ml iskald PBS, og samle partiklene ved sentrifugering i 1 minutt ved 10.000 x g.
   3. Aspirer supernatanten og resuspender pelleten i 1 ml iskald PBS.
   4. Gjenta trinn 2.2.2-2.2.3
      MERK: Gå videre til trinn 2.2.5 eller lagre røret ved 4 ° C inntil bruk.
   5. Sonikere partiklene i 10 sekunder i et ultrasonisk bad-sonikator (120 V, 50 til 60 kHz) for å unngå enny partikkel aggregering.

3. Fagocytose

MERK: Fagocytose er en kompleks prosess som begynner med binding av partiklene på celleoverflaten av fagocytter gjennom interaksjon av PRRS med ligander på overflaten av partikkelen. Binding er etterfulgt av sammenstillingen av aktin, og dens assosierte proteiner på kontaktstedet, og dannelse av en fagocytisk kopp. Den etterfølgende aktin demontering skjer på phagosome og resulterer i fullstendig engulfment av partikkelmaterialet. Nedenfor beskriver vi de ulike stadier av fagocytose.

1. binding Assay
   MERK: Formålet med dette eksperimentet er å overvåke det første trinnet av fagocytose som involverer interaksjon mellom ligander på målet partiklene og reseptorer på fagocytter.
   1. Seed ca 5 x 10 ⁴ celler i et kammer lysbilde slik at de er 60-70% konfluent på tidspunktet for forsøket. Alternatively, plate cellene på dekkglass (i 24- eller 12-brønners format) eller glassbunn 96-brønners plater. Inkuber cellene over natten ved 37 ° C fuktet inkubator med _5% CO2.
      MERK: Celler telles ved bruk av hemocytometer eller en lignende teknikk.
   2. Plasser kammeret sleiden (eller plate) ved 10 ° C i 10 min.
   3. fjerne mediet forsiktig fra hver brønn med en pipette eller aspirator.
      FORSIKTIG: Utfør dette trinnet nøye som hver brønn av en kamret dekkglass system er liten; det er lett å forstyrre cellene med tuppen av en pipette eller en sterk luftstrøm av en aspirator.
   4. Bland de fluorescensmerkede partikler med et cellekulturmedium (fremstilt som beskrevet ovenfor). Legg Candida -BFP (ved en MOI på 10), fluorescensmerket konjugert-zymosan eller latexkuler-kanin-IgG-FITC (10 partikler pr celle) til cellene. Bruke et sluttvolum på 200 ul media for ett kammer godt for å sikre at alle cellene er dekket.
   5. Spinn ned kammeret lysbildet på 277x g i 3 min ved 10 ° C.
      MERK: Dette sentrifugeringstrinn bidrar til å øke kontakten mellom partikler og celler, og den synkroniserer innbindingsprosessen.
   6. Umiddelbart overføre kammeret lysbildet til en 37 ° C fuktet inkubator med _5% CO2 i 5 min.
   7. Fjern kammeret lysbilde fra inkubatoren og aspirer media.
   8. Vask cellene 3x med iskald PBS.
      MERK: Kontroller nærvær av ubundne partikler med et lysmikroskop og vaskes flere ganger med PBS om nødvendig. Det er viktig å fjerne ubundne partikler fra brønnen for å redusere bakgrunnsstøy i løpet av analysen.
   9. Fix-celler ved tilsetning av 500 ul 4% paraformaldehyd (PFA) fortynnet i PBS ved inkubering i 30 minutter ved romtemperatur.
      FORSIKTIG: Dette trinnet krever bruk av 4% PFA som er svært giftig, etsende og potensielle kreftfremkallende. Riktig forsiktighet bør utvises ved bruk av denne væsken. Også beskytte prøvene mot lys.
   10. Gjenta 3.1.9 trinn to ganger.
       MERK: På dette trinnet, fylle hvert hetteglass umiddelbart etter fjerning av tidligere PBS.
   11. Stoppe den fiksering ved inkubering med 500 pl av 50 mM _NH4CI i PBS i 10 min.
   12. Vask cellene to ganger med PBS som beskrevet i trinn 3.1.10.
   13. Permeabilisere cellene ved tilsetning av 250 ul bindingsbuffer (0,1% saponin, 0,2% BSA i PBS) i 30 minutter ved romtemperatur.
   14. Stain F-aktin ved å legge fluorescens-konjugert phalloidin (fortynnet 1: 500 i bindingsbuffer). Inkuber cellene i 1 time ved romtemperatur.
   15. Vask cellene tre ganger med PBS som beskrevet i trinn 3.1.10.
   16. Ta bilder ved hjelp av en konfokal mikroskop (63X objektiv, og 402 nm og 488 nm laser) og analysere bilder ved hjelp ImageJ ^16.
       MERK: En vellykket partikkel-binding er kjennetegnet ved tilstedeværelsen av en fagocytisk cup på stedet der partikkel kontakt phagocytic cellen (figur 1). Se trinn 3.2.5.
2. Fagocytose opptaksanalyse
   MERK: Dette forsøket er utformet for å overvåke den komplette internalisering av fluorescensmerkede partikler av fagocytter ved hjelp av konfokal mikroskopi (figur 2).
   1. Seed ca 5 x 10 ⁴ celler i et kammer lysbilde slik at de er 60-70% konfluent på tidspunktet for forsøket. Alternativt kan plate cellene på dekkglass (i 24- eller 12-brønners format) eller glassbunn 96-brønners plater. Inkuber cellene over natten ved 37 ° C fuktet inkubator med _5% CO2.
      MERK: Celler telles ved bruk av hemocytometer eller en lignende teknikk.
   2. Hold kammers objektglass (eller plate) ved 10 ° C i 10 min.
      MERK: kjøling er nødvendig for å blokkere endocytose, så vel som uønsket fagocytose, og deretter for å ha en synkronisert fagocytose.
   3. PerfOrm skritt fra 3.1.3 til 3.1.5
   4. Overfør kammeret lysbildet til en 37 ° C fuktet inkubator med 5% CO _2, og inkuberes i forskjellige tidspunkter. Fix celler etter 30, 60 og 90 min etter infeksjon. Observer C. albicans begynne å danne hyfer på 60 min etter infeksjon; phagocytes begynner å vise celledød (pyroptosis) etter 90 min ^8.
      MERK: Dette er en anbefaling, og optimaliseringen er vesentlig avhengig av celletypen og den partikkelformede anvendes.
   5. Utfør trinn fra 3.1.7 til 3.1.15. Analyser bilder ved hjelp ImageJ ^16.
      MERK: et vellykket opptak er preget av en fullstendig internalisering av et partikkel inne i cytoplasma i en phagocyte (figur 2). Farging av fagocytter med markør celleoverflaten som phalloidin bidrar til å avgrense konturen av celler. Det er også viktig å utføre z-stabler for å bestemme hvorvidt det partikulære er bundet til celleoverflaten eller kompletely internalisert.
3. Levende Imaging av Fagocytose
   MERK: I denne protokollen beskriver vi bruk av konfokalmikroskopi å fange opp de ulike stadier av fagocytose ved hjelp av fluorescens-konjugert zymosan. Vi bruker dendrittiske cellelinje som stabilt uttrykker DC2.4 mCherry-merket F-aktin ^8, en biosensor som viser fordelingen av trådformede aktin i levende celler. Siden fagocytose er en aktin-drevet prosess levende avbildning i denne celle gjør det mulig ikke bare oss å fange bevegelse og dynamikk av F-aktin-nettverk, men også for å visualisere de forskjellige fagocyttiske hendelser innen de levende cellene (figur 3, film 1).
   1. Seed ca 5 x 10 ⁴ celler i et kammer lysbilde ved en konsentrasjon slik at de er 60-70% konfluent på tidspunktet for forsøket. Inkuber cellene over natten ved 37 ° C fuktet inkubator med _5% CO2.
      MERK: Celler kan telles ved hjelp hemocytometer eller enlignende teknikk.
   2. Hold kammer lysbilder på is i 10 min.
      MERK: Kjøle er nødvendig for å blokkere uønsket opptak, og å ha en synkronisert fagocytose.
   3. Utfør trinn fra 3.1.3 til 3.1.5
   4. Forvarme objektbordet til 37 ° C og likevekt i kammeret med _5% CO2. Vent 30-45 min for temperatur og CO ₂ for å stabilisere seg før start av bildebehandling.
      MERK: Siden CO ₂ og temperaturnivåer er kritiske for fagocytose, er det viktig å slå på mikroskop varmeren før forsøket for å stabilisere miljøkammeret.
   5. Plasser kammeret lysbilde som inneholder cellene i mikroskopet inkubator kabinettet ekvilibrert ved 37 ° C og _5% CO2.
   6. Opptre live avbildning ^{17, 18.}
      MERK: Innstillingene for laser makt (gevinst, pinhole, etc.) kan variere avhengig av hvilken type the mikroskop og fluorescerende probe brukes. Derfor anbefaler vi å konsultere bruksanvisningen til mikroskop for optimal tilstand for live bildebehandling ^17,18.
      1. Bruk konfokal laser scanning mikroskop (og tilhørende programvare) for live bildebehandling. Bruk 63X 1.4NA oljeobjektiv med et pinhole av 1-1.1 Airy enheter.
      2. For å starte bilde, brukes den lyse feltet for å finne en representant region på kammeret lysbildet. Deretter velger du feltet ved å klikke på Plassering alternativet på programvaren. For å oppdage GFP i spor 1 brukes filtersettet for 488 nm laser med en stråledeler på 582 nm, for å oppdage bølgelengder mellom 488 og 582 nm.
      3. I Spor 2 velge et filter satt optimal for mCherry (RFP) ved hjelp av en stråledeler på 578 nm og detektere bølgelengder mellom 578 og 600 nm. Bruk 488 nm og 578 nm lasere med 50% laser makt og en gevinst produksjon på 600-700. Få bilder hvert 30. sekund for totalt 90 min.

Representative Results

Mikroskop basert metode for å overvåke de forskjellige stadier av fagocytose er presentert. De ulike hendelser i løpet av fagocytose av ulike fluorescerende partikler av DC2.4 celler er vist. Ved hjelp av teknikker som er beskrevet her, undersøkte vi rollen sphingolipids i de tidlige stadier av fagocytose. For dette formål DC2.4 dendrittiske celler genetisk mangelfull i Sptlc2, enzymet som katalyserer den første og hastighetsbegrensende trinn i den biosyntetiske vei sfingolipid, ble anvendt. I forhold til villtype celler, Sptlc2 ^{- / -} DC2.4 celler har betydelig redusert nivå av sphingolipids inkludert ceramid, sphingomyelin og glukosylceramid ^8. Sptlc2 ^{- / -} DC2.4 celler er defekte i binding, så vel som i opptaket av C. albicans, zymosan og IgG latekskuler ^8. I figur 1 er binding av fluorescerende konjugert-zymosan partikler i DC2.4 celler vist (se seksjonn 3.1 for detaljer). Sptlc2 ^{- / -} DC2.4 celler viste signifikant mindre binding av zymosan enn kontroll DC2.4-celler (p = 0,0008; figur 1A). Antallet partikler zymosan bundet per celle var signifikant høyere for kontrollceller enn for Sptlc2 ^{- / -} DC2.4 celler (p <0,0001; figur 1C). Vi neste undersøkte evnen til Sptlc2 ^{- / -} DC2.4 celler til fagocyttere C. albicans. Sptlc2 ^{- / -} DC2.4 celler viste signifikant mindre fagocytose av C. albicans (p <0,0005) sammenlignet med kontrollcellene (figur 2A, 2B). Som forventet, Sptlc2-manglende celler viste signifikant høyere antall ikke-fagocytiske celler (p <0,05; figur 1C) og redusert antall av C. albicans per celle (figur 1C, D). Disse resultatene understreker den rollen som et intakt sfingolipid-biosyntese-veien i binding, så vel som i than opptak av partikler. Figur 3 viser time-lapse bilder som viser de tidlige stadiene av fagocytose (se avsnitt 3.3 for detaljert prosedyre). Movie 1 viser live avbildning av DC2.4 celler som stabilt uttrykker F-aktin, en biosensor som avslører fordelingen av trådformede aktin i levende celler (se avsnitt 3.1 for mer informasjon).

Figur 1: Binding analysen av zymosan i DC2.4 celler. (A) Spenning og Sptlc2 ^{- / -} DC2.4-celler ble inkubert med fluorescens-konjugert zymosan, og deres evne til å binde partiklene undersøkt av konfokal mikroskopi. Pilene viser områder av bindende. Scale bar = 100 mikrometer. (B, C) Kvantifisering av antall bundne partikler zymosan (B) og antall partikler zymosan bundet per cell (C) er vist. Bundne partikler ble kvantifisert og presentert som prosentandelen i forhold til kontrollen. Alle diagrammene viser SD fra tre uavhengige eksperimenter, og minst 200 celler ble tellet for hvert eksperiment. Uparet t-test ble anvendt for å analysere betydningen av de observerte forskjellene. ** P <0,001. Scale bar = 100 mikrometer. Opptrykk med tillatelse fra Tafesse et al. 2015 ^8. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2: Fagocytose av C. albicans i DC2.4 celler. (A) Celler ble infisert med C andida -BFP som beskrevet i trinn 3.2. Ved 90 minutter etter infeksjon, ble cellene fiksert og farget med fluorescens-konjugert phalloidi og avbildes med konfokalmikroskopi. (B - D) Kvantifisering av antall intern Candida -BFP, ikke-fagocytiske celler, og antallet Candida -BFP per celle er vist. Alle diagrammene viser SD fra tre uavhengige eksperimenter, og minst 200 celler ble tellet for hvert eksperiment. Uparet t-test ble anvendt for å analysere betydningen av de observerte forskjellene. ** P <0,001. Scale bar = 100 mikrometer. Opptrykk med tillatelse fra Tafesse et al. 2015 ^8. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3: Time-lapse avbildning av C. albicans opptak for å visualisere de tidlige stadiene av fagocytose. Ville typen DC2.4 celler som stabilt uttrykker F-aktin -mCherry (F-aktin) ble inkubert med Candida -BFP (vist i rødt) og avbildes med konfokalmikroskopi. Bilder tatt med 30 sek intervaller vises. Stjernene viser de ulike stadier av aktin ombygging i løpet av fagocytose. Scale bar = 100 mikrometer. Opptrykk med tillatelse fra Tafesse et al. 2015 ^8. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Film 1: Live-bildebehandling. Ville typen DC2.4 celler som stabilt uttrykker F-aktin-mCherry (vist i grønt) ble infisert med Candida -BFP (vist i rødt). Levende avbildning ble utført ved bruk av konfokal mikroskopi som beskrevet i trinn 3.3. Opptrykk med tillatelse fra Tafesse et al. 2015 ^8.s / ftp_upload / 54646 / 54646mov1.avi "target =" _ blank "> Klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)

Discussion

Profesjonelle fagocytter, slik som makrofager og dendrittiske celler, sluker og eliminere invaderende patogener derfor gjør fagocytose en viktig del av vertens forsvarssystemet. Under denne prosessen fagocytter gjennomgå omfattende membran reorganisering og cytoskjelettet omleiring på deres celleoverflate ^{8, 19, 20.} For bedre å forstå denne dynamisk prosess, er visualiseringen av de ulike stadier av fagocytose avgjørende. Her har vi beskrevet en mikroskop-basert metode som ble brukt til å overvåke de forskjellige trinn av fagocytose.

Den største betydning av levende avbildningsteknikk er at den gir bemerkelsesverdig evne til å overvåke vert-patogen grensesnitt på molekylært nivå. Ved å tillate visualisering av de viktige trinnene i mikrobiell infeksjon, gir levende avbildning kritisk innsikt i grunnleggende natur av immunresponsenmot patogener ^{8, 10, 21, 22.} I tillegg til fagocytose, kan de teknikker som er beskrevet her, bli utvidet for å studere andre typer av reseptormediert endocytose, inkludert macropinocytosis ^10. Levende avbildning er også en verdifull metode for å studere vert-patogen forhold av intracellulære bakterier slik som Mycobacterium tuberculosis og Salmonella typhi, samt parasitter inkludert Leishmania og Toxoplasma gondii ^{22, 23.}

Det er flere fordeler med levende celle avbildning over de andre teknikker som for eksempel konvensjonelle biokjemiske metoder. Live-cell imaging tillater oss å overvåke de romlige og tidsmessige dynamikken i cellulære prosesser ^8. Videre tillater levende avbildning oss til å få informereasjon på en enkelt celle oppløsning ^21. Fagocytose er en dynamisk prosess som involverer cellulær den gruppering av reseptorer, aktin og membranlipid-remodellering i løpet av noen få minutter ^10. Live-bildebehandling gjør oss i stand til å fange opp slike opplysninger i en tid sensitiv måte, som ellers er vanskelig å oppnå.

Den store begrensning av denne teknikk er at den krever forsiktig optimalisering av eksperimentelle betingelser og mikroskop oppsett. Det er flere viktige faktorer avgjørende for å lykkes med å skaffe bilder. Kvaliteter av det fluorescerende protein (eller biosensor) anvendt for å visualisere de fagocytter (for eksempel F-aktin) samt arten av det fargestoff som brukes til å merke det partikulære er kritiske aspekter ved avbildning. For levende avbildning, like viktig er det likevekt av miljøkammeret av mikroskopet oppsett. Avhengig av instrumentet, kan ekvilibreringen ta fra 15 minutter til flere timer. Since CO ₂ tilførsel er beregnet på å opprettholde en passende pH i kulturmediet, er det nødvendig å tillate nok kjøretids forut for å sette opp forsøket. I de tilfellene hvor CO ₂ tilførselen er utilstrekkelig og / eller ujevn, zwitterionisk organisk kjemisk buffermiddel slik som HEPES kan suppleres til vekstmediet. Langvarig eksponering av fluorescerende partikler og levende celler til konfokal laser kan føre til fototoksisitet og bleking. Optimalisere laser makt (mindre eksponeringstid jo bedre) og sørge for at skodder er stengt mellom bilde oppkjøp kan redusere disse problemene. Totalt sett teknikkene beskrevet her er ideelle for å studere det dynamiske forholdet mellom patogener og phagocytes under fagocytose.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
β-Mercaptoethanol	AppliChem	A1108
Bovine serum albumin (BSA)	Cell Signaling Technology	9998
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate)	ThermoFisher	D3571
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	ThermoFisher	BP-231-1
DMEM (Dulbecco’s Minimal Eagle’s medium)	Gibco	11965
PBS, 1x (Phosphate- Buffered Saline)	Corning cellgro	21-031-CV
Fetal Bovine serum	Sigma Aldrich	12003C
FITC-coupled IgG-coated latex beads	Cayman	500290
L-Glutamine 200 mM (100x)	ThermoFisher	25030081
Paraformaldehyde Solution (4% in PBS)	Affymetrix	19943 1 LT
Penicillin-streptomycin (10,000 U/ml)	ThermoFisher	15-140-122
Phalloidin-Alexa Fluor 488	ThermoFisher	A12379
RAW 264.7 cells	ATCC	TIB-71
RPMI (Roswell Park Memorial Institute)	Gibco	61870
Saponin	Sigma Aldrich	S7900
Trypan blue solution (0.4% (w/v) in PBS)	Corning cellgro	MT25900CI
Trypsin-EDTA (1x) (0.05%)	ThermoFisher	25300054
Tween 20 Surfact-Amps Detergent Solution	ThermoFisher	85114
Zymosan-Alexa Fluor 594	ThermoFisher	Z23374
Chambered 1.0 Borosilicate Coverglass system (8 chambers)	ThermoFisher	155361
Glasstic slide 10 with grids	Hycor	87144