Summary
本明細書において、我々は、末梢T細胞受容体レパートリーの相補hemichainと、関心対象の抗原特異性を有する、既存のTCRのTCRα又はTCRβをペアリングすることにより、抗原特異的T細胞受容体（TCR）を生成する新規な方法を記載します。 デノボ生成されたTCRは、親和性を変化させて、抗原特異性を保持します。
Abstract
T細胞受容体（TCR）は、免疫療法の有望なモダリティとして腫瘍を標的とするT細胞の特異性を指示するために臨床的に使用されます。そのため、様々な腫瘍関連抗原に特異的なTCRをクローニングすることは、多くの研究の目標でした。効果的なT細胞応答を誘発するために、TCRは、最適な親和性で標的抗原を認識しなければなりません。しかし、このようなTCRをクローニングすることが課題と多くの利用可能なのTCR同族抗原に対する準最適な親和性を有するとなっています。このプロトコルでは、我々はhemichain中心主義を利用することによって、既存のTCRを使用してデノボ高親和性抗原特異的TCRをクローン化する方法について説明します。いくつかのTCRのために、それぞれのTCRα又はTCRβのhemichainは抗原認識に等しく寄与しないことが知られており、ドミナントhemichainを中心hemichainと呼ばれます。我々はオリジナルのカウンターチェーンは異なるカウンター鎖を有する中心のhemichainを組み合わせることで、我々は抗原秒を維持することが可能であることが示されていますpecificity、同族抗原に対するその相互作用の強度を変調しながら。したがって、所与のTCRの治療可能性を中心とカウンタhemichains間の対形成を最適化することによって改善することができます。
Introduction
T細胞受容体（TCR）は、TCRαおよびTCRβ鎖からなるTリンパ球によって発現されるヘテロ二適応免疫受容体です。これらは、HLA /ペプチド複合体の実質的に無制限の構成を認識することができる非常に多様なレパートリーを産生するV（D）J遺伝子セグメントの体細胞再編成によって生成されます。臨床的には、腫瘍関連抗原に特異的なクローン型TCRを発現するように操作されたT細胞は癌1の様々な有効性が実証されています。しかし、この目的のためにクローニングされた多くのTCRは、それらの治療的適用を制限する目的の抗原に対して十分な親和性を欠いています。
ここでは、チェーン中心主義を利用することにより、既存のTCRのためにこの制限を克服する方法を説明します。それは1のTCR hemichainは、標的抗原2の認識で、より支配的な役割を果たし得ることが報告されている、ここでは中心主義と呼ばれます。結晶構造解析は、その1中心を示していますTCRのhemichainは3,4 MHC /ペプチド複合体上のフットプリントの大部分を占める可能性があります。この概念を使用して、我々は以前にSIG35αTCRαがTCRβ鎖の多様なレパートリーと対HLA-A2 5により提示MART1 27-35ペプチドに対する反応性を維持することができることを実証しました。同様の結果が中心TCRβのhemichainは、様々なTCRα鎖と対にし、HLA-A24 6により提示WT1 235-243ペプチドについて反応性を維持しTAK1 TCRで得られました。 MART1およびWT1の両方が腫瘍関連抗原です。チェーン中心主義は、異なるVβ11TCRβ鎖7を有するヒトのiNKT TCRの不変Vα24-Jα18（Vα24i）TCRα鎖を組み合わせることで、CD1d拘束不変ナチュラルキラー（iNKT細胞）TCRの抗原認識を研究するために適用されました。
全ての場合において、我々は、トランスによってTCRのデノボレパートリーを生成することができました導入hemichainが内因性TCRαまたはTCRβカウンター鎖と対になった末梢血T細胞、に中心のTCRのhemichainをducing。本質的には、中心hemichainは一緒に対に適切なカウンタ鎖を同定するために用いることができるベイトとして機能まだ親和性が異なる、目的の抗原特異性を維持するTCRを形成します。これらの新規レパートリーから、我々は既存のTCRと比較して、標的抗原に対する改善された相互作用の強度を有するクローン型TCRを単離することができました。したがって、我々は、この方法は、臨床応用のための最適なTCRを特定のパイプラインを加速すると考えています。
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Protocol
1.レトロウイルスは、利息のエンコーディングTCR Hemichainを構築する準備
- 以降のTCR遺伝子の挿入を可能にするようにするpMXベクターを線状化。 3時間37℃（ 表1）にEcoRIおよびNotI制限酵素でプラスミドDNAを消化8。
- 1.2％アガロースゲル上で消化されたプラスミドの電気泳動を行います。物品は約4,500塩基対（BPS）のバンド、および市販のゲル抽出キット9を用いて、30μlの滅菌水に溶出します。
- 設計5 'および3'にもそれぞれ8するpMXベクターのEcoRIおよびNotI消化部位と重複15-20 BPSをコードする目的のTCR遺伝子のためのプライマー。
- プライマーを用いてTCR遺伝子を増幅します。 PCR産物の電気泳動を行い、ステップ1.2で説明したように約1000 BPSのバンドを溶出させます。
- 市販のプラスミドをそれぞれ線状断片を組み合わせて消化したベクターにクローンTCR遺伝子組立マスターミックス試薬と1時間50℃でインキュベートします。
注：各成分の相対ボリュームに対して、製造業者のプロトコルを参照してください。この組立方法は、もともとギブソンら 10によって記載された技術に基づいています。 - 人間の神経成長因子受容体フリン切断部位、セリン-グリシンリンカー、および2Aシーケンス12,13によって分離された（ΔNGFR、アミノ酸1から277）11の切断型で形質導入された細胞をマークする（オプション）タグTCR遺伝子。断片の末端と重複し、工程1.3-1.5に記載されるようにプラスミドを組み立てる設計プライマーをコードする配列。
注：これらの配列は参考文献11-13に記載されています。 - 化学的にコンピテントE.を変換製造業者のプロトコル14次の組み立てプラスミドで大腸菌 。種子は、寒天プレート上の細菌（20 mg / mlでLB培地（LB）、15 mg / mlで寒天とを1μg/ mlのアンピシリン）を形質転換し、18時間37℃でインキュベートします。 文化37℃、毎分200回の振とう培養器で16時間50 LB培地1ml（20 mg / mlとLBとを1μg/ mlアンピシリン）で単一の細菌コロニー。
- 製造業者のプロトコルに従って、市販のミディプレップキットを使用してプラスミドを精製します。周りを1μg/μlの濃度にプラスミドを希釈します。
注：プラスミド精製プロトコルは、アルカリ抽出法15に基づいています。
2.安定したパッケージング細胞株を生成します
注：両方293GPGとPG13細胞が接着性です。ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）で培養細胞を、10％ウシ胎児血清（FCS）および50μg/ mlのゲンタマイシンを補充しました。トランスフェクションの前に1μg/ mlのテトラサイクリンと文化293GPG細胞。すべてのステップの間、5％CO 2で37℃で細胞をインキュベートします。
- トランスフェクト293GPGは、ステップ1.9で得られたhemichainをコードするベクターでUSIを細胞T75フラスコ内で培養16をパッケージング製造者のプロトコル1 7以下の市販のトランスフェクション試薬をngの。注：50から60までパーセントの密集度でのトランスフェ293GPG細胞。
- 吸引293GPG細胞用培地と新鮮なDMEM培地1日後、トランスフェクションの10ミリリットルを追加します。
- 収穫は一過シリンジに培地を移し、0.45μmフィルターを通過させることにより2日ステップ2.2の後、トランスフェクト293GPG細胞からウイルスを産生しました。
注：ウイルスは、直ちに使用するか、または将来の使用のために-80℃で保存することができます。 - T25フラスコでの培養は、1×10 5 PG13細胞。血球計数器を用いて細胞を数えます。 1日、吸引培地とポリブレンの8 / mlのと一緒に、ステップ2.3および1.5ミリリットルDMEM培地から293GPG由来ウイルスの1.5ミリリットルを追加した後。
- 4日間1日1回のステップ2.4で説明したように、関心のTCRのhemichainをコードするレトロウイルスを産生する安定PG13パッケージング細胞株を確立するために、メディアを変更します。
- 吸引し培地と交換してください24時間さらに培養のための最後の感染後PG13細胞株のための新鮮なDMEM培地で。
注：0.05％トリプシン-EDTA溶液で剥離することにより凍結またはサブ培養細胞。 - 三日間細胞を播種した後、ステップ2.3に記載のように形質導入PG13細胞株からのウイルスを生成するために、T75培養における2×10 6個の細胞を10mlのDMEM培地、および収穫ウイルスフラスコ。
注：ウイルスは最高のすぐに使用されますが、2つまでの数ヶ月のために-80℃で保存することができます。
3.アクティベーションおよび形質導入ヒトT細胞の
注：ヒトサンプルを得て、機関の倫理委員会承認プロトコールに従って使用されます。ロズウェルパーク記念研究所（RPMI）の代わりにFCSの10％ヒト血清を添加した培地および50μg/ mlのゲンタマイシンで培養初代ヒト細胞です。すべてのステップの間、5％CO 2で37℃で細胞をインキュベートします。
- 密度によってヒト末梢血単核細胞（PBMC）を単離し製造業者のプロトコル18以下の勾配分離。
- レトロウイルス感染のために必要な増殖を誘導するためにT細胞を活性化。組換えヒトインターロイキン2抗CD3モノクローナル抗体の（のrhIL-2）および50 ng / mlでの100 IU / mlのRPMI培地5ml中の6ウェルプレート中のウェルあたり文化2×10 7新鮮なまたは解凍したPBMC、 （クローンOKT3）。
- 三日は、刺激を投稿4分間350×gでピペッティングし、遠心分離することによってT細胞を収集します。上清を捨て、ステップ2.7からPG13ウイルスの1ミリリットル中に再懸濁し、24ウェルプレートにウェル当たり0.5〜1×10 6 T細胞を播種する、とのrhIL-2の200 IU / mlを添加したRPMI培地の1ミリリットル。 1時間1,000×gで32℃での遠心分離プレート。
- 24時間後、4分間350×gでピペッティングし、遠心分離することによってT細胞を収集します。ステップ2.7からPG13ウイルスの1ミリリットルで上清と再懸濁細胞を捨てて、のrhIL-2の200 IU / mlを添加したRPMI培地の1ミリリットル。 6未感染の合計に対して、この手順を繰り返しイオン。
注：感染症の数は、細胞株をパッケージングすることにより産生されたウイルスの力価に応じて最適化する必要があります。必要に応じて、毎日の細胞の20-30％を除去することにより流路T細胞が異常増殖を防止します。 - 24時間最後の感染後、4分間350×gでピペッティングし、遠心分離することによってT細胞を収集します。さらなる培養のためのrhIL-2の100 IU / mlのRPMI培地中で上清と再懸濁細胞を捨てます。
- 2~3日ステップ3.5、15分間、4℃で30分間、4℃でHLAマルチマーで染色T細胞は、抗ヒトCD3および共受容体モノクローナル抗体（mAb）の後。フローサイトメトリーによって分析します。 19 - （3 図1）陰性対照として無関係の多量体および/または非形質導入細胞を使用してください。
- 導入された中心hemichainがTCRα鎖である場合は、20フローサイトメトリーにより、市販のVβ特異的抗体のパネルを使用してデノボ多量体陽性細胞のVβの使用状況を分析。
4.クローニング・デ・ノボ TCRカウンターhemichains
- フロー支援細胞選別によって、ステップ3.6で新たに多量陽性集団をソートします。
- 酸グアニジンチオシアネート-フェノール-クロロホルム抽出法21,2 2を使用してソートT細胞からRNAを単離します。
注：RNAを-80℃で保存することができるが、できるだけ早くのcDNAを生成するために使用されるべきです。 - 製造業者のプロトコル23,24以下の市販の逆転写酵素PCRキットを用いて抽出したRNAからcDNAライブラリーを合成します。
- TCRβカウンター鎖をクローニングした場合、ステップ3.7で決定されるように、Vβ遺伝子とTCRβ定常領域特異的なプライマーを設計し、ステップ1.3から1.9に記載されているように、全長TCRβ遺伝子をクローニングします。カウンターチェーンがTCRαであればそうでない場合は5.1に進み、ステップ4.5を参照してください。
- 市販のVα特異的抗体が限られている、したがって、Vα遺伝子の使用はできませんフローサイトメトリーによって決定されます。市販の5 'RACEキット6を用いて、cDNA末端の5'迅速増幅（RACE）25を介してクローンTCRαカウンター鎖、。
- 製造業者のプロトコルに従ってステップ4.2で抽出されたRNAから5 'RACE互換性のcDNAを合成。
- 表2に記載したように第1ラウンドのPCRを行います。
- PCR産物の電気泳動を行い、ステップ1.2で説明したように、1,100 bpsのバンドを溶出します。
- テンプレートとして第1回目のPCR産物を使用して、 表3に記載されているように第2ラウンドのPCRを行います。
注： 表3の下に示すプライマー配列をEcoRIおよびNotIにクローニングするために設計されたのPMXベクターを消化しました。 - PCR産物の電気泳動を行い、ステップ1.2で説明したように、約1000 BPSのバンドを溶出します。
- EcoRIとNotIにクローンTCRα遺伝子をするpMXベクターおよびプリ消化しましたステップ1.5から1.9に記載されているように年度のプラスミド。
5.再構成新規抗原特異的TCRクローン
注：培養ジャーカット細胞を76及び10％のFCSおよび50μg/ mlのゲンタマイシンを補充したRPMI培地中でその後の細胞株。すべてのステップの間、5％CO 2で37℃で細胞をインキュベートします。
- ステップ2.3で作製293GPGウイルスを使用して中心のTCR hemichainと（ - / -ヒトT細胞株または同等TCR）ジャーカット76セル26に伝達します。ジャーカット76、シードRPMI培地の1ウイルスのミリリットルと1ミリリットルで24ウェルプレート中のウェルあたり5×10 4細胞について。 1時間1,000×gで32℃での遠心分離プレート。
- 感染後24時間は、4分間350×gでピペッティングし、遠心分離によってhemichain形質導入されたジャーカット76細胞を収集します。さらなる培養のための新鮮なRPMI培地で上清と再懸濁を捨てます。
- hemichainは2-3日ステップ5.2後にタグ付けされた分子である場合に染色することによって、形質導入された細胞を精製流れアシストまたは磁気アシストセル（オプション）27をソートすることによって、その後抗NGFRモノクローナル抗体コンジュゲート蛍光体でる。
- ステップ2.1〜2.3に続いて、293GPGウイルスはステップ4.4または4.5からクローン化TCRを反鎖をコード生成します。
- 完全にTCRを再構成するには、安定的にステップ5.4からウイルスを用いて、ステップ5.1から5.3で生成された中心のTCRのhemichainを発現するT細胞株を形質導入します。ステップ5.1から5.2に記載されているように形質導入を行います。
- 2-3日ステップ5.5 27の後に、製造業者のプロトコルに従って抗CD3磁気補助セルソーティングを使用して、CD3 +トランスフェを精製します。
- 、抗原特異性を検証し、抗CD3および/またはコレセプターモノクローナル抗体、およびHLA多量で、様々なカウンター鎖と対をなす中心のTCRのhemichainで構成されるクロノタイプTCRを発現するトランスフェクタントを染色するために、3~5日は、CD3精製を投稿してください。 19 -フローサイトメトリーによる細胞（5 図4）を分析します。
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Representative Results
チェーン中心であるhemichainの予備知識なしに、TCRα及びTCRβ鎖を別々にクローン化されるべきであり、HLA-A24 / WT1反応TAK1 TCR（ 図1）の場合に行われた末梢血T細胞への形質導入します。 TAK1βの形質導入は、抗原特異的T細胞の顕著に高い頻度が得られました。逆に、非中心hemichainの形質導入は、TAK1α鎖（ 図1）で見られるように、 デノボ多量体陽性T細胞が得られないでしょう。分析中、NGFR +細胞上のゲートは、TCR遺伝子は、具体的には（ - 2 図1）形質導入細胞を分析するためにタグを付けられた場合。支配的であることが知られている一方、単一中心hemichainは、例えばSIG35α不変Vα24TCRα鎖（ 図2及び3）、形質導入することができます。それぞれのcognに特異的なT細胞中心のTCRαのhemichainの導入時に周波数が増加した抗原を食べました。 （ 図2から3）。一緒に、これらのデータは、目的の抗原特異性を有する新規 TCRを生成することができ、末梢血T細胞の中心TCRα又はTCRβhemichainの導入を示します。
抗原特異的集団をソーティングフロー補助セルによってソートすることができ、4クローン型TCRを反鎖は個別に安定して中心hemichainを発現するT細胞系に再構成することができるプロトコルの項で説明するようにTCRのhemichainsをクローニングすることができます。多量体5,6を染色HLA /ペプチドによって決定されるようTAK1βまたはSIG35α中心のhemichain形質導入されたT細胞から新たにクローン化されたユニークなTCRを発現しているジャーカット76トランスフェは、それぞれの同族抗原のための様々な結合活性を有していました。具体的には、 デノボ TCRαカウンター鎖トンを単離することができましたTAK1βと対になった帽子は、親TAK1αβペアリングよりもWT1抗原複合体による低いか高い強度（ 図4）のいずれかで染色しました。同様に、SIG35αはユニークなカウンター鎖と対には、高い結合活性（ 図5）に中等度でHLA-A2 / MART1を認識しました。 SIG35αはTCRαβヘテロ5の独立したクローン化したので、このhemichainのための親のペアリングは、比較のために利用できませんでした。重要なことに、これらのデータは、さまざまなカウンタ鎖を有する中心のhemichainをペアリングすることによって、標的抗原に対する親和性を調節することが可能であることを示しています。
図1：TAK1βHLA-A24 / WT1反応性TAK1 TCRのHLA制限TCRβの中心hemichainTCRαまたはTCRβhemichains の例として切り捨てられた神経成長因子RECEでタグ付けされましたptor（ΔNGFR）、個別末梢血T細胞に形質導入。形質転換体は、2倍、抗原特異的に続いて、PC5結合抗CD8で染色した（133倍速希釈）およびFITC結合抗NGFR（20倍希釈）モノクローナル抗体（mAb）、およびHLA-A24マルチマー（5μg/ ml）を示しました刺激。 6人のドナーの合計を試験しました。すべてのデータは、NGFR +細胞にゲートしました。図参照6からの許可を得て再印刷。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：HLA制限TCRα中心のhemichainの一例としてSIG35αSIG35αTCRαのΔNGFRでタグ付けされたチェーン、または単独のタグは、末梢血T細胞に形質導入しました。トランスフェクタントは、PC5-共同で染色しましたnjugated抗CD8（133倍速希釈）およびFITC結合抗NGFRモノクローナル抗体を（20倍希釈）、およびHLA-A2マルチマー（8 / mlの）を示しました。 4人のドナーの合計を試験しました。すべてのデータは、NGFR +細胞にゲートしました。図の再印刷参照5（ 著作権2015免疫学者のアメリカ協会 ）の許可を得て。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：不変ナチュラルキラーT（iNKT細胞）細胞レセプターVα24（Vα24i）CD1d拘束性TCRα中心のhemichainの一例として Vα24iTCRα鎖は、末梢血T細胞に形質導入しました。トランスフェクタントは、FITC結合抗CD3（20倍希釈）mAbで染色し、CD1dの多量体（5μg/ ml）を示しました。アンロードのCD1dカ月leculesは、HEK293細胞および存在する内因性の未知の自己脂質から製造しました。 iNKT TCRは、α-GalCerをまたはそのアナログPBS-57を提示するCD1dの認識によって定義されます。 4人のドナーの合計を試験しました。図参照7からの許可を得て再印刷。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4：TAK1βからクローン化された代表的TCRαカウンター鎖はT細胞を形質導入した TCRαクローンT262、A262、A186、A133、およびT4は、HLA-A24 / WT1からクローニングした多量体正TAK1βは、末梢T細胞を形質導入し、個別にジャーカット76細胞上に再構成しますTAK1βチェーンとともに、CD8を発現しています。トランスフェクタントは、PC5結合抗CD8 mAbで染色された（133倍速希釈）とHLA-A24を示しました多量体（5μg/ mlの）。データは、2つの独立した実験の代表です。エラーバーは、範囲を示します。図参照6からの許可を得て再印刷。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5：SIG35αからクローン化された代表的TCRβカウンター鎖はT細胞を形質導入した TCRβはクローン413、523、788、1086、794、および830は、HLA-A2 / MART1から多量の正SIG35α形質導入された末梢T細胞をクローニングし、個別にジャーカットに再構成しました。 SIG35αチェーンとともに、CD8を発現している76の細胞。 DMF5は、HLA-A2 / MART1を認識する以前にクローン化された高親和性TCRました。トランスフェクタントは、PC5結合抗CD8モノクローナル抗体（133倍速希釈）で染色し、HLA-A2の多量体（2μgの/メートルを指摘されましたL）。データは、2つの独立した実験の代表です。エラーバーは、範囲を示します。図の再印刷参照5（ 著作権2015免疫学者のアメリカ協会 ）の許可を得て。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
表1：するpMXベクター消化のためのセットアップ試薬およびそれぞれのボリュームが示されている。 この表の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
表2：1 回目の ラウンド5 'RAC のセットアップE PCR。試薬および各ボリューム、PCRの設定、およびプライマー配列が示されている。 この表の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
表3：2のセットアップ 番目 のラウンド5 'RACE PCR試薬および各ボリューム、PCRの設定、およびプライマー配列が示されている。 この表の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
この方法の成功した適用のための最初の要件は、関心のhemichain一次T細胞の十分な変換効率を達成することです。我々の経験、ヒト一次T細胞における導入遺伝子の安定的かつ効率的な発現のレトロウイルスベクターの結果として、パッケージング細胞株とするpMXとしてPG13を用いて組み合わせました。 PG13パッケージング細胞を形質導入効率を向上させるために高力価のパッケージング細胞を選択するためにクローン化された単一細胞であることができます。さらに、T細胞の増殖はまた、レトロウイルスによる高導入効率のために必要とされます。記載されたプロトコルでは、のrhIL-2の高濃度と共に可溶性抗CD3モノクローナル抗体OKT3による刺激は、細胞分裂を誘導するために必要な活性化シグナルを提供します。単球はおそらくFc受容体との結合を介して、可溶性OKT3の刺激能力のために必要とされます。したがって、バルクPBMC、及びませんが、T細胞を精製し、この特定の刺激プロトコルのために必要とされます。 T細胞をRPMI中で培養されるべき最適な実験結果のためのヒト血清を補充しました。ここに記載の他の全ての細胞は、ウシ胎仔血清の存在下で培養することができます。
第二に、発現細胞のde novo生成抗原特異的TCRは、検出可能でなければなりません。このようなTAK1βなどの特定のTCR hemichainsについては、 デノボ TCRを発現する細胞は、抗原パルス抗原提示細胞（APC）による刺激後にのみ検出可能です。抗原特異的なTCRを中心hemichainの形質導入後すぐに検出されない場合はこのように、彼らは、APCによる拡張後に検出可能である可能性があります。非中心hemichainの形質導入がTAK1αのhemichain（ 図1）に見られるように、偶数のAPCと抗原特異的な増殖後デノボ抗原特異的T細胞が得られないであろう注意。我々の研究では、HLAマルチマーを検出するために使用されるが、これはTCR制限、特にHLAクラスIIいくつかのTCRに利用できないかもしれません秒。代替的には、T細胞の機能的応答を検出することであろう。 Hemichain形質導入されたT細胞は、目的の抗原でパルスしたAPCで刺激することができます。車両パルスAPCおよび非形質導入T細胞は、対照として使用することができます。応答するT細胞は、のCD107a、CD154、またはCD137などの表面活性化マーカーのアップレギュレーションによって検出することができます。
最後に、中心hemichainと対になったときにクローン化されたカウンター鎖は、実際には、目的の抗原を認識しないことを検証することが重要です。中心hemichainがTCRα遺伝子の対立遺伝子排除の漏洩であり、周辺αβT細胞のかなりの部分が複数のTCRα鎖28を発現すると推定されるので、TCRβおよび対向鎖は、TCRαあるとき、これは特に重要です。反応は、多量体染色または同種抗原を提示するAPCによる刺激後の機能的応答を測定することで確認することができます。
One limitatiこの技術の上TCRαおよびTCRβ両方がいくつかの例3に抗原認識と同等に寄与するため、必ずしもすべてのTCRは、中心hemichainを構成するということです。したがって、このような非中心hemichainsで形質導入末梢T細胞が新規の抗原特異的TCRを得ないかもしれません。
それにもかかわらず、この方法は、両方のTCRαおよびTCRβ遺伝子がクローン化されなければならないと正しいペアリング29,30を確保しなければならないTCRをクローニングする従来のアプローチ、時の概念の進歩を表しています。我々の手法では、hemichains間のペアリングは、もはや主な関心事とTCR鎖の一方のみ他方が固定されていることを考えると、クローン化される必要はありません。 HLAクラスIまたはCD1d拘束性TCRに加えて、記載された方法はまた、TCR遺伝子治療のためのHLAクラスII拘束性TCRの単離に適用することができます。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Wisent Bioproducts | 325-043-CL | |
| 293GPG cells | Generated by Ory et al. (ref 8) | ||
| Agar | Wisent Bioproducts | 800-010-CG | |
| Agarose | Wisent Bioproducts | 800-015-CG | |
| Ampicillin sodium salt | Wisent Bioproducts | 400-110-IG | |
| Chloroform | BioShop | CCL402 | |
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix | New England Biolabs | N0447L | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Life Technologies | 11995065 | |
| EcoRI | New England Biolabs | R0101S | |
| EZ-10 Spin Column DNA Gel Extraction Kit | BS353 | ||
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 12483020 | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Filter | Corning | 431220 | 0.45 mm pore SFCA membrane |
| FITC-conjugated anti-human CD271 (NGFR) mAb | Biolegend | 345104 | clone ME20.4 |
| FITC-conjugated anti-human CD3 mAb | Biolegend | 300440 | clone UCHT1 |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750078 | |
| Gibson Assembly Master Mix | New England Biolabs | E2611L | used for multi-piece DNA assembly |
| HLA-A2 pentamer | Proimmune | depends on antigenic peptide | HLA-A2/MART1 multimer used here was purchased from Proimmune |
| HLA/CD1d monomers | NIH Tetramer Core Facility | multimerize monomers according to protocol provided by NIH tetramer core facility | |
| Human AB serum | Valley Biomedical | HP1022 | |
| human CD3 microbeads | Miltenyi Biotec | 130-050-101 | |
| IOTest Beta Mark TCR V beta Repertoire Kit | Beckman Coulter | IM3497 | |
| Jurkat 76 cells | Generated by Heemskerk et al. (ref 10) | ||
| LB Broth | Wisent Bioproducts | 800-060-LG | |
| LS MACS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| NEB 5-alpha Competent E. coli | New England Biolabs | C2987I | |
| NEBuffer 3.1 | New England Biolabs | B7203S | used for EcoRI and NotI digestion |
| NotI | New England Biolabs | R0189S | |
| NucleoBond Xtra Midi | Macherey-Nagel | 740410 | used for plasmid purification |
| PC5-conjugated anti-human CD8 mAb | Beckman Coulter | B21205 | clone B9.11 |
| PG13 cells | ATCC | CRL-10686 | |
| Phusion HF Buffer Pack | New England Biolabs | B0518S | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530L | |
| pMX retroviral vector | Cell Biolabs | RTV-010 | |
| polybrene | Sigma-Aldrich | H-9268 | |
| Proleukin (recombinant human interleukin-2) | Novartis | by Rx only | equivalent product can be purchased from Sigma-Aldrich |
| Purified anti-human CD3 antibody | Biolegend | 317301 | clone OKT3, used for T cell stimulation |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 11875119 | |
| SA-PE | Life Technologies | S866 | used for multimerizing monomers from NIH tetramer core facility |
| SMARTer RACE 5'/3' Kit | Clontech | 634858 | |
| Sterile water | Wisent Bioproducts | 809-115-LL | |
| SuperScript III First-Strand Synthesis System | Invitrogen | 18080051 | for cDNA synthesis |
| Syringe | BD | 301604 | 10 ml, slip tip |
| Tetracycline hydrochloride | Sigma-Aldrich | T7660 | |
| TransIT-293 | Mirus Bio | MIR 2700 | used to transfect 293GPG cells |
| TRIzol Reagent | Life Technologies | 15596026 |
References
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