Summary
Descreve-se aqui um novo método para gerar receptores de células T específicas para o antigénio (TCR) por emparelhamento a TCRα ou TCRβ de um TCR existente, possuindo a especificidade do antigénio de interesse, com hemichain complementar do repertório do receptor de células T periféricas. Os TCRs gerados de novo manter-antigénio com especificidade uma afinidade variável.
Abstract
receptores de células T (TCR) são utilizados clinicamente para dirigir a especificidade das células T para tumores alvo promissor como uma modalidade de imunoterapia. Por conseguinte, a clonagem de TCR específicos para vários antigénios associados a tumor tem sido o objectivo de muitos estudos. Para provocar uma resposta eficaz de células T, o TCR deve reconhecer o antigénio alvo com afinidade óptima. No entanto, a clonagem, tais TCRs tem sido um desafio e muitos TCRs disponíveis possuem afinidade sub-ótima para o antigénio correspondente. Neste protocolo, descrevemos um método de clonagem de novo de alta afinidade TCRs antígeno-específicas usando TCRs existentes, explorando hemichain centralidade. Sabe-se que para algumas TCR, cada TCRα ou TCRβ hemichain não contribuem igualmente para o reconhecimento do antigénio, e a hemichain dominante é referido como o hemichain centrada. Nós mostramos que, emparelhando o hemichain centrado com contra-correntes diferentes da cadeia contador original, somos capazes de manter o antígeno specificity, enquanto modula a sua força de interação para o antigénio cognato. Assim, o potencial terapêutico de um determinado TCR pode ser melhorada pela optimização do emparelhamento entre as centrais e contador hemichains.
Introduction
receptores de células T (TCR) são receptores heterodiméricos imunes adaptativas expressa por linfócitos T, compostas por uma cadeia TCRα e TCRβ. Eles são gerados por meio de rearranjo somático de V (D) J segmentos de genes, o que produz um repertório diverso altamente capazes de reconhecer configurações virtualmente ilimitado de complexos de HLA / péptido. Clinicamente, as células T manipuladas para expressar clonotípico TCRs específicos para antigénios associados a tumores demonstraram eficácia em uma variedade de cancros 1. No entanto, muitos TCRs clonados para este propósito não têm afinidade suficiente para o antigénio de interesse, o que limita a sua aplicação terapêutica.
Aqui, descrevemos um método para superar esta limitação para TCRs existentes, explorando cadeia de centralidade. Tem sido relatado que um hemichain TCR poderia desempenhar um papel mais dominante no reconhecimento do antigénio alvo 2, aqui denominado centralidade. análises estruturais de cristal têm mostrado que um centradahemichain de um TCR poderia ser responsável pela maior parte da pegada do MHC / péptido complexo 3,4. Utilizando este conceito, já anteriormente demonstrado que a SIG35α TCRα pode emparelhar com um repertório diversificado de cadeias TCRβ e manter a reactividade contra o peptídeo MART1 27-35 apresentado por HLA-A2 5. Resultados semelhantes foram obtidos com o TCR TAK1, onde o hemichain TCRβ centrada emparelhado com várias cadeias TCRα e mantida a reactividade para o péptido WT1 235-243 apresentado por HLA-A24 6. Ambos MART1 e WT1 são antigénios associados a tumores. Chain-centricity também foi aplicado para estudar o reconhecimento do antígeno de TCR CD1d-restritas invariantes natural killer (iNKT), emparelhando a invariante cadeia Vα24-Jα18 (Vα24i) TCRα de TCRs iNKT humanos com diferentes cadeias Vβ11 TCRβ 7.
Em todos os casos, fomos capazes de gerar um repertório de novo de TCR por transdução do hemichain TCR centric às células T do sangue periférico, onde a hemichain introduzido emparelhados com o TCRα endógena ou TCRβ contra-correntes. Em essência, o hemichain centrada serve como um isco, que pode ser usado para identificar as contra-correntes adequadas, as quais quando combinadas em conjunto formam TCRs que mantêm a especificidade do antigénio de interesse, mas variando na afinidade. A partir destes novos repertórios, fomos capazes de isolar TCR clonotípicas com uma resistência melhorada contra a interacção do antigénio alvo em comparação com os TCRs pré-existentes. Portanto, acreditamos que este método irá acelerar o gasoduto de identificar TCRs ideais para aplicação clínica.
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Protocol
1. Preparar Retroviral construção que codifica TCR Hemichain de Interesse
- Linearizar pMX vector para permitir a inserção de um gene de TCR em passos subsequentes. Digerir o ADN de plasmídeo com enzimas de restrição EcoRI e NotI a 37 ° C durante 3 horas (Tabela 1) 8.
- Realizar a eletroforese do plasmídeo digerido em 1,2% em gel de agarose. Banda especial de consumo de aproximadamente 4.500 pares de base (bps), e eluir em 30 mL de água estéril usando comercialmente disponíveis kits de extração de gel 9.
- Design de 5 'e 3', os iniciadores para o gene de TCR de interesse que também codificam 15-20 pb que se sobreponham ao local digestão com EcoRI e Notl do vector pMX, respectivamente 8.
- Amplificar o gene do TCR com primers. Efectuar a electroforese do produto de PCR e eluem banda de aproximadamente 1000 pb, tal como descrito na etapa 1.2.
- Clonar o gene do TCR no vector digerido por combinação de cada fragmento linear com o plasmídeo disponível comercialmentemestre montagem reagente mistura e incubando a 50 ° C durante 1 h.
NOTA: Consulte o protocolo do fabricante para os volumes relativos de cada componente. Este método de montagem é baseada na técnica originalmente descrita por Gibson et ai. 10. - (Opcional) Tag gene TCR para marcar as células transduzidas com a forma truncada do receptor do factor de crescimento do nervo humano (ΔNGFR, aminoácidos 1-277) 11 separados por local de clivagem de furina, ligante serina-glicina, e 2A sequências 12,13. sequências de codificação de conceber iniciadores que se sobrepõem as extremidades do fragmento e montar plasmídeo como descrito nas etapas 1,3-1,5.
NOTA: Estas sequências podem ser encontradas nas referências 11-13. - Transformar E. quimicamente competente coli com o plasmídeo montados seguindo o protocolo do fabricante 14. Semente bactérias transformadas sobre placas de agar (20 mg / ml de caldo lisogenia (LB), 15 mg / ml de agar, e 1 ug / ml de ampicilina) e incubar a 37 ° C durante 18 h. A cultura de uma colónia única bactéria em 50 ml de meio LB (20 mg / ml de LB e 1 ug / ml de ampicilina) durante 16 horas numa incubadora com agitação a 37 ° C e 200 ciclos por minuto.
- Purifica-se os plasmídeos utilizando estojos comercialmente disponíveis Midiprep seguindo o protocolo do fabricante. Dilui-se o plasmídeo a concentração de cerca de 1 ug / uL.
NOTA: O protocolo de purificação de plasmídeo baseia-se no método de extracção alcalina 15.
Linha celular de empacotamento estável 2. Geração
NOTA: Tanto as células 293GPG e PG13 são aderentes. Células de cultura de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal de vitelo (FCS) e 50 ug / ml de gentamicina. 293GPG células de cultura com 1 ug / ml de tetraciclina antes da transfecção. Incubar as células a 37 ° C com 5% de CO 2 entre todos os passos.
- 293GPG transfectar células de empacotamento 16 em cultura em balão T75 com o vector que codifica hemichain obtido na etapa 1.9, USIng reagente de transfecção disponíveis comercialmente seguindo o protocolo do fabricante 1 7. NOTA: As células transfectar 293GPG a 50-60% de confluência.
- médio aspirado para 293GPG células e adicionar 10 ml de fresco DMEM meio 1 dia pós transfecção.
- Colheita transitoriamente produzidos vírus a partir de células transfectadas 293GPG 2 dias após o passo 2.2 pela transferência de meio de cultura a seringa e que passa através do filtro de 0,45 um.
NOTA: O vírus pode ser utilizada imediatamente ou armazenada a -80 ° C para uso futuro. - Culturas 1 x 10 5 células em PG13 frasco T25. Contagem de células utilizando um hemocitómetro. Após um dia, meio de cultura aspirado e adicionar 1,5 ml de vírus 293GPG derivado a partir do passo 2.3 e 1,5 ml de meio DMEM, juntamente com 8 ug / ml de polibreno.
- Mudar a forma como descrito no passo 2.4, uma vez por dia durante 4 dias, para estabelecer que produzem retrovírus estável linha celular de empacotamento PG13 codificando o hemichain TCR de interesse.
- Aspirar médio e substituircom meio DMEM fresco para linhas celulares PG13 24 horas após a última infecção para posterior cultura.
NOTA: congelar ou sub-cultura de células por destacando com solução de tripsina-EDTA 0,05%. - Para produzir vírus de linhas celulares transduzidas PG13, a cultura 2 x 10 6 em células T75 frasco com 10 ml de meio DMEM, e vírus da colheita, tal como descrito na etapa 2.3 três dias após a sementeira das células.
NOTA: Vírus é melhor usado imediatamente, mas pode ser armazenado a -80 ° C durante até dois meses.
3. A activação e Transdução de células T humanas
NOTA: As amostras humanas são obtidas e utilizadas de acordo com os protocolos aprovados da comissão de ética institucionais. células humanas primárias em cultura de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) meio suplementado com 10% de soro humano em vez de FCS e 50 ug / ml de gentamicina. Incubar as células a 37 ° C com 5% de CO 2 entre todos os passos.
- Isolar células periféricas humanas mononucleares do sangue (PBMC) por densidadeseparação por gradiente seguindo o protocolo do fabricante 18.
- Activar as células T para induzir a proliferação necessário para a infecção retroviral. Cultura de 2 x 10 7 PBMC frescas ou descongeladas por poço em placas de 6 poços, em 5 ml de meio RPMI com 100 UI / ml de recombinante humano IL-2 (rhIL-2) e 50 ng / ml de anticorpo monoclonal anti-CD3 (OKT3 clone).
- Três dias após a estimulação, recolher as células T por pipetagem e centrifugar a 350 g durante 4 min. Elimine o sobrenadante e sementes de 0,5-1 x 10 6 células T por poço em placas de 24 poços ressuspensas em 1 ml de vírus PG13 do passo 2.7, e de 1 ml de meio RPMI suplementado com 200 UI / ml de rhIL-2. Centrifugar a placa 1000 xg e 32 ° C durante 1 h.
- Após 24 horas, recolher as células T por pipetagem e centrifugar a 350 g durante 4 min. Rejeitar sobrenadante e ressuspender as células em 1 ml de vírus PG13 do passo 2.7, e de 1 ml de meio RPMI suplementado com 200 UI / ml de rhIL-2. Repita este passo para um total de 6 Infectíons.
NOTA: Número de infecções deve ser optimizada, dependendo título do vírus produzido pela linha celular de empacotamento. Se necessário, as células T por remoção de passagem de 20-30% das células de cada dia para prevenir o crescimento excessivo. - 24 h após a última infecção, recolher as células T por pipetagem e centrifugar a 350 xg durante 4 min. Rejeitar sobrenadante e ressuspender as células em meio RPMI com 100 UI / ml de rhIL-2 para posterior cultura.
- 2-3 dias após a etapa 3.5, as células T com mancha multímero de HLA, a 4 ° C durante 30 min, em seguida, CD3 anti-humano e anticorpos monoclonais do co-receptor (mAb) a 4 ° C durante 15 min. Analisar por citometria de fluxo. Use multímero irrelevante e / ou células não transduzidas como controlos negativos (Figura 1 - 3) 19.
- Se o hemichain centric introduzido é uma cadeia TCRα, analisar o uso Vp dos de novo multimero células positivas utilizando o painel de anticorpos específicos de Vp comercialmente disponível por citometria de fluxo 20.
4. Clonagem De Novo TCR Counter-hemichains
- Ordenar o novo população positiva de multimero no passo 3,6 por separação de células assistida por fluxo.
- Isolar o ARN a partir de células T classificados usando o guanidínio ácido tiocianato-fenol-clorofórmio método de extracção de 2 21,2.
NOTA: o RNA pode ser armazenado a -80 ° C, mas devem ser utilizadas para gerar ADNc tão rapidamente quanto possível. - Sintetizar biblioteca de ADNc a partir de ARN extraído utilizando kits de transcriptase reversa-PCR disponíveis comercialmente seguindo o protocolo do fabricante 23,24.
- Se a clonagem TCRβ contra-correntes, projetar gene Vp e região constante primers específicos TCRβ, conforme determinado na etapa 3.7, e clonar full-length TCRβ genes como descrito nos passos 1,3-1,9. Veja o passo 4.5 se contra-corrente é TCRα, caso contrário, continue para o passo 5.1.
- Comercialmente os anticorpos específicos-Va disponíveis estão limitados, assim, o uso de genes Va não podeser determinada por citometria de fluxo. Clone TCRα contra-correntes através de amplificação 5'-rápida de extremidades de cDNA (RACE) 25, utilizando comercialmente disponível 5 kits RACE «6.
- Sintetizar 5 'RACE de cDNA compatível partir de RNA extraído no passo 4.2, seguindo o protocolo do fabricante.
- Execute 1º PCR rodada, conforme descrito na Tabela 2.
- Efectuar a electroforese do produto de PCR e eluem banda de aproximadamente 1100 pb, tal como descrito na etapa 1.2.
- Realizar 2 ND ciclo de PCR como descrito na Tabela 3, utilizando-se um produto de PCR como molde redondo r.
NOTA: As sequências dos iniciadores mostrados sob Tabela 3 foram desenhados para clonagem EcoRI e NotI digerido vector pMX. - Efectuar a electroforese do produto de PCR e eluem banda de aproximadamente 1000 pb, tal como descrito na etapa 1.2.
- clonar genes TCRα em EcoRI e Notl vector digerido pMX e puriplasmídeos fy como descrito nos passos 1,5-1,9.
Clones de TCR antígeno-específica 5. Reconstituting Novel
NOTA: Cultura de Jurkat 76 células e linhas celulares subsequentes em meio RPMI suplementado com FCS a 10% e 50 ug / ml de gentamicina. Incubar as células a 37 ° C com 5% de CO 2 entre todos os passos.
- Transduzir células Jurkat 76 26 (ou equivalente TCR - / - linha de células T humana) com hemichain TCR centrada utilizando vírus 293GPG produzido no passo 2.3. Para Jurkat 76, semente de 5 x 10 4 culas por po em placa de 24 cavidades com 1 ml de vírus e de 1 ml de meio RPMI. Centrifugar a placa 1000 xg e 32 ° C durante 1 h.
- 24 h após a infecção, recolhe hemichain Jurkat transduzidas 76 células por pipetagem e centrifugar a 350 xg durante 4 min. Elimine o sobrenadante e ressuspender em meio RPMI fresco para posterior cultura.
- Purificar células transduzidas se o hemichain é molecularmente marcado 2-3 dias após o passo 5.2, por coloraçãoing com fluoróforo conjugado anti NGFR-mAb seguido por assistida por fluxo ou célula magnética assistida classificação (opcional) 27.
- Seguindo os passos 2.1 a 2.3, produzem vírus 293GPG que codifica uma cadeia contador de TCR clonado a partir de passos 4.4 ou 4.5.
- Para reconstituir integralmente a TCR, transdução de linha de células T expressando estavelmente o hemichain TCR centric gerado nas etapas 5,1-5,3 utilize o vírus a partir do passo 5.4. Realizar transdução como descrito nos passos 5,1-5,2.
- Purificar CD3 + transfectantes utilizando anti-CD3 separação de células magnética assistida seguindo o protocolo do fabricante, 2-3 dias após o passo 5.5 27.
- Para validar a especificidade do antigénio, manchar os transfectantes que expressam TCR clonotípicas compostos da hemichain TCR centrada emparelhado com vários contra-correntes, com os mAbs co-receptor de anti-CD3 e / ou, e multimero de HLA, 3-5 dias após a purificação CD3. Analise as células por citometria de fluxo (Figura 4-5) 19.
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Representative Results
Sem o conhecimento prévio de que hemichain cadeia é centrada, a cadeia TCRα e TCRβ deve ser clonadas separadamente e transduzidos para células T de sangue periférico, o que foi feito no caso do HLA-A24 / WT1 reactivo TAK1 TCR (Figura 1). Transdução de TAK1β produziram uma frequência notavelmente mais elevada de células T específicas de antigénio. Por outro lado, a transdução de um hemichain não centrada não produziria de novo as células T positivas multímero, como pode ser visto com cadeia TAK1α (Figura 1). Durante a análise, portão em células NGFR + se o gene de TCR foi etiquetado para analisar especificamente células transduzidas (Figura 1-2). Por outro lado, a única hemichain centrada podem ser transduzidas se que é conhecido por ser dominante, por exemplo, o SIG35α e cadeias invariantes Vα24 TCRα (Figura 2 e 3). células T específicas para o respectivo Cogncomeu antígeno aumentaram em frequência após a transdução de um hemichain TCRα centric. (Figura 2-3). Em conjunto, estes dados demonstram que a introdução de um ou centrada TCRα TCRβ hemichain para células T de sangue periférico podem gerar de novo de TCR com o antigénio de interesse-especificidade.
população específica de antigénio podem ser classificados por células assistida por fluxo de triagem e hemichains TCR podem ser clonados como descrito na secção 4. Protocolo de TCR clonotípicas contra-correntes pode ser reconstituído individualmente em uma linha de células T que expressam estavelmente o hemichain centrada. Jurkat 76 transfectantes, expressando recentemente clonado a partir de células únicas TCRs T TAK1β ou SIG35α centrada hemichain transduzidas, possuía variando avidez para o respectivo antigénio cognato, tal como determinado por HLA / péptido multímero de coloração 5,6. Especificamente, nós fomos capazes de isolar de novo TCRα contra-correntes tchapéu quando emparelhado com TAK1β foram coradas quer com maior ou menor intensidade pelo complexo antigénio WT1 que o emparelhamento TAK1αβ parental (Figura 4). Da mesma forma, SIG35α emparelhado com contra-cadeias únicas reconhecidas HLA-A2 / MART1 com moderada a elevada avidez (Figura 5). SIG35α foi clonado independente de um heterodímero TCRαβ 5, por conseguinte, um emparelhamento parental para esta hemichain não estava disponível para comparação. Mais importante, estes dados indicam que é possível modular a afinidade para o antigénio alvo por emparelhamento a hemichain centrada com vários contra-correntes.
Figura 1:. TAK1β como um exemplo de HLA-restritos hemichains TCRβ centrada hemichain TCRα ou TCRβ do HLA-A24 / WT1 reactivo TAK1 TCR foi etiquetado com nervo truncada de factor de crescimento do recePtor (ΔNGFR), e individualmente transduzido para as células T do sangue periférico. Os transfectantes foram coradas com PC5-conjugado anti-CD8 (133x diluída) e conjugado com FITC anti-NGFR (20x diluída) anticorpos monoclonais (mAbs), e indicado multímero HLA-A24 (5 ug / ml), seguindo específica antigénio-duas vezes estimulação. Total de 6 dadores foram testadas. Todos os dados foram fechado em células NGFR +. Figura re-impressa com a permissão de referência 6. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2:. SIG35α como um exemplo de HLA-restricted centrada hemichain TCRα SIG35α TCRα cadeia marcado com ΔNGFR, ou a etiqueta sozinho, foi transduzido para as células T de sangue periférico. Transfectantes foram coradas com PC5-conjugated anti-CD8 (133x diluída) e conjugado com FITC anti-NGFR (20x diluída) mAb, e indicado para HLA-A2 multímero (8 ug / ml). Total de 4 dadores foram testadas. Todos os dados foram fechado em células NGFR +. Figura re-impresso com a permissão de referência 5 (Direitos de autor 2015. A Associação Americana de imunologistas, Inc.). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3:. Receptor de células T assassinas naturais invariante (iTNK) Vα24 (Vα24i) como um exemplo de restrição CD1d TCRα centrada hemichain Vα24i cadeia TCRα foi transduzido para as células T de sangue periférico. Os transfectantes foram coradas com FITC conjugado com anti-CD3 (20x diluída) e mAb indicado multímero CD1d (5 ug / ml). Descarregado mo CD1dlecules foram produzidos a partir de células HEK293 e presentes endógenos de auto-lípidos desconhecidos. iTNK TCR é definido por reconhecimento de CD1d apresentando α-GalCer ou o seu análogo 57-PBS. Total de 4 dadores foram testadas. Figura re-impresso com a permissão da referência 7. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: representativas TCRα contra-correntes clonados a partir TAK1β transduzidas células T TCRα clones T262, A262, A186, A133, e T4 foram clonados a partir de HLA-A24 / WT1 células T periféricas TAK1β transduzidas multímero positivos, e reconstituída individualmente em Jurkat 76 células. expressam CD8, juntamente com a cadeia TAK1β. Os transfectantes foram coradas com PC5 conjugado mAb anti-CD8 (133x diluída) e indicado HLA-A24multímero (5 ug / ml). Os dados são representativos de dois ensaios independentes. As barras de erro indicam a variação. Figura re-impressa com a permissão de referência 6. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: representativas TCRβ contra-correntes clonados a partir SIG35α transduzidas células T TCRβ clones 413, 523, 788, 1086, 794, e 830 foram clonadas a partir de HLA-A2 / MART1 células T periféricas multímero SIG35α positivo transduzidas e, individualmente, reconstituída em células Jurkat. 76 células que expressam CD8, juntamente com a cadeia SIG35α. DMF5 era um TCR de elevada afinidade previamente clonada reconhece HLA-A2 / MART1. Os transfectantes foram coradas com PC5 conjugado mAb anti-CD8 (133x diluída) e indicado a HLA-A2 multímero (2 ug / meu). Os dados são representativos de duas experiências independentes. As barras de erro indicam a variação. Figura re-impresso com a permissão de referência 5 (Direitos de autor 2015. A Associação Americana de imunologistas, Inc.). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1:.. Instalação para pMX digestão vector Reagentes e respectivos volumes são mostrados por favor clique aqui para ver uma versão maior desta tabela.
Tabela 2: Instalação para o round 5 1 st 'RACE PCR. Reagentes e respectivos volumes, configurações de PCR, e sequência de iniciador são apresentados. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta tabela.
Tabela 3: Instalação para o 2º round 5 'RACE PCR Reagentes e respectivos volumes, configurações de PCR e sequências de iniciadores são mostrados.. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta tabela.
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Discussion
O primeiro requisito para a aplicação bem sucedida deste método é alcançar a eficiência de transdução suficiente de células T primárias com o hemichain de interesse. Na nossa experiência, a combinação de PG13 utilizando como linha celular de empacotamento e pMX como resultado o vector retroviral na expressão estável e eficiente do gene introduzido em células T humanas primárias. células de empacotamento PG13 pode ser clonado de uma única célula para seleccionar para células de empacotamento de título elevado para melhorar a eficácia de transdução. Além disso, também é necessária a proliferação de células T para a alta eficiência de transdução por retrovirus. No protocolo descrito, a estimulação com anti-CD3 solúvel mAb OKT3, juntamente com alta concentração de rhIL-2, fornece os sinais de activação necessários para induzir a divisão celular. Os monócitos são necessários para a capacidade estimuladora de OKT3 solúvel, provavelmente através de ligação com os receptores Fc. Portanto, grandes quantidades de PBMC, e não purificado células T, é necessário para este protocolo de estimulação específica. TAs células devem ser cultivadas em meio RPMI suplementado com soro humano para os resultados experimentais ideais. Todas as outras células aqui descritas podem ser cultivadas na presença de soro fetal de vitelo.
Em segundo lugar, de novo TCR específico para o antigénio geradas células que expressam deve ser detectável. Para certas hemichains de TCR, tais como TAK1β, células que expressam de novo TCR só são detectáveis após a estimulação com células apresentadoras de antigénio antigénio-pulsado (APCs). Assim, se os TCRs específicos de antigénio não são detectadas imediatamente após a transdução de hemichain centrada, que pode ser detectável depois da expansão por APCs. Note-se que a transdução de uma hemichain não centrada não produziria células T específicas para o antigénio de novo, mesmo após a expansão específico para o antigénio com APCs, como pode ser visto com o hemichain TAK1α (Figura 1). Em nossos estudos, multímeros HLA são usados para a detecção, no entanto, esta pode não estar disponível para alguns TCRs, especialmente HLA de classe II TCR restritos. Uma alternativa seria a de detectar as respostas funcionais das células T. As células T podem ser transduzidas Hemichain estimuladas com APCs pulsadas com o antigénio de interesse. APC pulsada com veículo e as células T não transduzidas podem ser utilizadas como controlos. As células T que respondem podem ser detectados por regulação positiva de marcadores de activação de superfície, tais como CD107a, CD154, CD137 ou.
Por último, é importante para validar que os contra-correntes clonados que, de fato, reconhecem o antígeno de interesse quando emparelhado com o hemichain centric. Isto é particularmente importante quando o hemichain é centrada TCRβ e contra-correntes são TCRα, desde exclusão alélica para genes TCRα é permeável e estima-se que uma porção significativa de células T periféricas αβ expressar mais do que uma cadeia TCRα 28. A reactividade pode ser confirmado com a coloração multímero ou medir a resposta funcional, após a estimulação com APCs que apresentam o antigénio cognato.
um limitation desta técnica é que nem todos os TCR irá compor uma hemichain centric, uma vez que ambos TCRα e TCRβ contribuir comparativamente ao antigénio reconhecimento em alguns casos 3. Portanto, as células T periféricas transduzidas com tais hemichains não-centric não pode produzir de novo TCRs antígeno-específicas.
No entanto, este método representa um avanço conceitual sobre a abordagem convencional para TCRs clonagem, onde os genes tanto TCRα e TCRβ devem ser clonados e emparelhamento correto deve ser assegurada 29,30. Na nossa técnica, o emparelhamento entre hemichains já não é uma preocupação principal e apenas uma das cadeias de TCR tem de ser clonado, uma vez que a outra é fixa. Além de HLA de classe I ou TCR restrito-CD1d, o método descrito pode também ser aplicado para o isolamento de TCRs de HLA de classe II-restritos para a terapia de genes de TCR.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Wisent Bioproducts | 325-043-CL | |
| 293GPG cells | Generated by Ory et al. (ref 8) | ||
| Agar | Wisent Bioproducts | 800-010-CG | |
| Agarose | Wisent Bioproducts | 800-015-CG | |
| Ampicillin sodium salt | Wisent Bioproducts | 400-110-IG | |
| Chloroform | BioShop | CCL402 | |
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix | New England Biolabs | N0447L | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Life Technologies | 11995065 | |
| EcoRI | New England Biolabs | R0101S | |
| EZ-10 Spin Column DNA Gel Extraction Kit | BS353 | ||
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 12483020 | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Filter | Corning | 431220 | 0.45 mm pore SFCA membrane |
| FITC-conjugated anti-human CD271 (NGFR) mAb | Biolegend | 345104 | clone ME20.4 |
| FITC-conjugated anti-human CD3 mAb | Biolegend | 300440 | clone UCHT1 |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750078 | |
| Gibson Assembly Master Mix | New England Biolabs | E2611L | used for multi-piece DNA assembly |
| HLA-A2 pentamer | Proimmune | depends on antigenic peptide | HLA-A2/MART1 multimer used here was purchased from Proimmune |
| HLA/CD1d monomers | NIH Tetramer Core Facility | multimerize monomers according to protocol provided by NIH tetramer core facility | |
| Human AB serum | Valley Biomedical | HP1022 | |
| human CD3 microbeads | Miltenyi Biotec | 130-050-101 | |
| IOTest Beta Mark TCR V beta Repertoire Kit | Beckman Coulter | IM3497 | |
| Jurkat 76 cells | Generated by Heemskerk et al. (ref 10) | ||
| LB Broth | Wisent Bioproducts | 800-060-LG | |
| LS MACS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| NEB 5-alpha Competent E. coli | New England Biolabs | C2987I | |
| NEBuffer 3.1 | New England Biolabs | B7203S | used for EcoRI and NotI digestion |
| NotI | New England Biolabs | R0189S | |
| NucleoBond Xtra Midi | Macherey-Nagel | 740410 | used for plasmid purification |
| PC5-conjugated anti-human CD8 mAb | Beckman Coulter | B21205 | clone B9.11 |
| PG13 cells | ATCC | CRL-10686 | |
| Phusion HF Buffer Pack | New England Biolabs | B0518S | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530L | |
| pMX retroviral vector | Cell Biolabs | RTV-010 | |
| polybrene | Sigma-Aldrich | H-9268 | |
| Proleukin (recombinant human interleukin-2) | Novartis | by Rx only | equivalent product can be purchased from Sigma-Aldrich |
| Purified anti-human CD3 antibody | Biolegend | 317301 | clone OKT3, used for T cell stimulation |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 11875119 | |
| SA-PE | Life Technologies | S866 | used for multimerizing monomers from NIH tetramer core facility |
| SMARTer RACE 5'/3' Kit | Clontech | 634858 | |
| Sterile water | Wisent Bioproducts | 809-115-LL | |
| SuperScript III First-Strand Synthesis System | Invitrogen | 18080051 | for cDNA synthesis |
| Syringe | BD | 301604 | 10 ml, slip tip |
| Tetracycline hydrochloride | Sigma-Aldrich | T7660 | |
| TransIT-293 | Mirus Bio | MIR 2700 | used to transfect 293GPG cells |
| TRIzol Reagent | Life Technologies | 15596026 |
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