Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Bruk av en rekombinant Mosquito Densovirus som et gen levering vektor for funksjonell analyse av gener i Larvene

Published: October 6, 2017 doi: 10.3791/56121
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1
1Department of Pathogen Biology, Guangdong Provincial Key Laboratory of Tropical Disease Research, School of Public Health, Southern Medical University, 2Reproductive Medical Centre of Guangdong Women and Children's Hospital

Summary

Vi rapporterer bruker en kunstig intronic liten RNA uttrykk strategi for å utvikle en ikke-defekt rekombinant Aedes aegypti densovirus (AaeDV) i vivo leveringssystem. En detaljert prosedyre for konstruksjon, emballasje og kvantitativ analyse av rAaeDV vektorer så vel som for larver infeksjon er beskrevet.

Abstract

I vivo microinjection er mest brukte genet overføring teknikken for å analysere genet funksjonene i individuelle mygg. Men denne metoden krever en mer teknisk krevende operasjon og innebærer kompliserte prosedyrer, spesielt når de brukes i Larvene deres liten størrelse, relativt tynt og skjøre cuticle og høy dødelighet, som begrenser anvendelsen. Derimot er viral vektorer for gen levering utviklet for å overvinne ekstracellulære og intracellulær barrierer. Disse systemene har fordelene med enkel manipulering, høy genet signaltransduksjon effektivitet, langsiktig vedlikehold av genuttrykk og evnen til å produsere vedvarende effekter i vivo. Mosquito densoviruses (MDVs) er mygg-spesifikke, liten én-strandet DNA virus som kan effektivt levere utenlandsk nukleinsyrer til mygg celler. imidlertid fører erstatning eller innsetting av utenlandske gener å opprette rekombinant virus vanligvis til tap av emballasje og/eller replikering evner, som er et hinder for utviklingen av disse virusene som levering vektorer.

Her rapporterer vi bruker en kunstig intronic små-RNA uttrykk strategi for å utvikle en ikke-defekt rekombinant Aedes aegypti densovirus (AaeDV) i vivo leveringssystem. Detaljerte fremgangsmåter, emballasje og kvantitativ analyse av rAaeDV vektorer og larver infeksjon er beskrevet.

Denne studien viser, for første gang, muligheten for å utvikle en ikke-defekt rekombinant MDV micro RNA (miRNA) uttrykk system, og dermed gir et kraftig verktøy for funksjonell analyse av gener i mygg og etablere et grunnlag for den anvendelse av viral paratransgenesis for å kontrollere mygg-sykdommer. Vi viste at Aedes albopictus 1st skikkelsen Larvene kan være enkelt og effektivt infisert av introdusere viruset i vannmassen næringsplante avl området og at den utviklet rAaeDVs kan brukes overexpress eller slå ned på uttrykk med et bestemt mål i larvene, gir et verktøy for funksjonsanalyse av mosquito gener.

Introduction

Mygg-sykdommer som malaria, denguefeber, zika feber og gul feber, er store internasjonale folkehelseproblemer som fortsatt står for en betydelig andel av de globale infeksjonssykdommer byrde1,2. Konvensjonelle insektmidler, som har vært brukt i respons til vektorer, er en viktig komponent i bærekraftig integrert mygg strategi for forebygging av mygg-sykdommer. Men slike strategier har vist seg for å være relativt ineffektiv eller uønsket på grunn av tilknyttede negative miljøvirkninger samt utviklingen av motstand i mygg bestander3,4. For disse grunner, det er et presserende behov for alternative metoder for mygg kontroll og bruk av transgene metoder for å produsere sterilt mannlige mygg og utgivelsen av patogen-resistente mygg har oppstått som lovende nye kontroll strategier. For å utvikle effektive nye kontroll metoder, som sikker og effektiv tilnærminger i vivo gen levering, av mygg gen funksjon er nødvendig.

Direkte microinjection av plasmider DNA, dobbel strandet RNA (dsRNA) eller lite forstyrrende RNA (siRNA) er mest brukte i vivo -genet leveringsmåte i mygg. Faktisk produksjon av transgene stammer av mygg fortsatt stole på en prosess av embryoet microinjection5,6,7. Microinjection har imidlertid flere begrensninger. Først denne teknikken er teknisk krevende og innebærer kompliserte prosedyrer. Andre forårsaker injeksjon en fysisk fornærmelse til fosteret, larver, pupae og voksen, som direkte påvirker levedyktigheten til organismen mål. For det tredje er det vanskelig å nakkens Larvene for microinjection fordi de fleste bor i et akvatisk habitat og har en karakteristisk sprellende bevegelse. Fjerde, 1st-2nd skikkelsen Larvene er 10 - til 20 ganger mindre enn 4th skikkelsen og eldre larver og neglebåndene av det tidligere er mer delikat. Disse funksjonene gjør det vanskelig å manipulere 1st-2nd skikkelsen Larvene sammenlignet med de i eldre stadier. Kombinert, bidra disse faktorene til en redusert etter injeksjon overlevelse for Larvene (ca 5%) sammenlignet med voksne8. Viral-baserte levering systemer er utviklet for å overvinne den tilknyttede ekstracellulære og intracellulær barrierer. Disse systemene har fordelene med enkel manipulering, høy signaltransduksjon effektivitet, langsiktig og robust nivåer av uttrykk og evnen til å produsere vedvarende effekter i vivo. Derfor brukt genet leveringssystemer utnytte retroviruses, lentiviruses og adenoviruses har vært mye inmammalian linjer og modell arter. Sindbis viral uttrykk systemet hadde tidligere blitt brukt analysere funksjonen genet i voksen mosquito; Foruten de biosikkerhet bekymringene, men er injeksjon fortsatt nødvendig for virusinfeksjon9. Selv om muntlig levering av soaking larver i dsRNA løsningen er rapportert tidligere som en mulig leveringsmetode, er det uegnet for små RNA funksjonen analyse10. Så, effektiv viral leveringsmåter må fortsatt utvikles for myggen.

Mosquito densoviruses (MDVs) er en del av Densovirinae og Parvoviridae, og alle unntatt én ligger innenfor slekten Brevidensovirus11. MDV virions er ikke innhyllet og består av en enkelt-strandet DNA (ssDNA) genom og en icosahedral kapsid (20 nm i diameter). Viral genomet er ca 4 kb inne størrelse og replikeres i kjerner i verten cellene. MDVs er relativt stabil i miljøet og viser mange smale vert med høy spesifisitet for myggen. Disse virusene har potensial til å spre og vedvarer naturlig mygg bestander og kan invadere nesten alle organer og vev av disse insekter, inkludert midttarmen, Malpighian tubuli, fett kroppen, muskulaturen, nerveceller og spyttkjertler12.

Behold MDV genomer kan være subcloned i plasmider vektorer å produsere plasmider-baserte smittsomme kloner; Når disse Klonene leveres i mygg celler, er viral genomet er Hentet fra plasmider vektoren og smittsomme virus partikler produseres. Fordi MDV har en liten ssDNA genom, smittsomme kloner er enkelt konstruert og viral genomet kan være lett manipulert11,13. Disse egenskapene gjør MDV en verdifull agent for å undersøke mygg biologi. Men fordi nesten alle viral genomet rekkefølgen er viktig for viral spredning, etableringen av rekombinant viruset gjennom erstatning eller innsetting av utenlandske gener forårsaker tap i viral emballasje og/eller replikering evner, som skaper en barriere for utviklingen av MDVs som Gen levering vektorer. Her rapporterer vi bruker en kunstig intronic små-RNA uttrykk strategi for å utvikle en ikke-defekt rAaeDV i vivo RNA leveringssystem som har fordelene med enkel plasmider bygging og vedlikehold av en funksjonell virus som kan produsere stabil og langsiktig uttrykk i vertsceller uten behov for vill-type virus. I tillegg gir denne metoden enkel Albin på larvene.

Protokollene for fremgangsmåten er beskrevet i denne studien: 1) design av rAaeDVs koding en intronic liten-RNA uttrykk kassett, 2) produksjon av rekombinant viruspartikler med C6/36 emballasje cellen linje, 3) kvantitativ analyse for celle-fri rAaeDV genomet kopiere tall og 4) infeksjon i Ae. albopictus larver av direkte innføring av virus i selve vann larver habitat. Samlet vist denne arbeid at bestemte små RNAs eller mål gener kan overexpressed og slått ned i Larvene bruker utviklet MDV leveringssystem.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

alle protokoller ble godkjent av den etiske komiteen av Southern medisinsk University.

1. utforme en kunstig Intron

Merk: den kunstige intron brukt i dette arbeidet er 65 bp i lengde, og rekkefølgen er 5 ' - GTAAGAGTCGATCGACGCGTTACTAACTGGTACCTCTTCTTTTTTTTTTGATATCCTGCAG - 3 '.

  1. Sett Hpa jeg begrensning nettsted på begge ender av kunstige intron så at Hpa jeg fordøyelsen kan frigi intron fra plasmider (se figur 1 A).
  2. Sted to Xba jeg begrensning nettsteder i intron så det Xba jeg fordøyelsen kan brukes til å sette inn små-RNA uttrykk sekvenser.
  3. For syntese av full lengde DNA-sekvenser av den kunstige intron fra DNA leverandøren. Syntetiske DNA skapt er fra kloning i en standard pUC19 plasmider.
    Merk: De nødvendige komponentene av den kunstige intron inkluderer flere konsensus nukleotid elementer, inkludert en 5 ' donor skjøte nettsted (DS) med rekkefølgen GUAAGAGU, en bevart forgreningspunktet sekvens (BPS) med rekkefølgen UACUAAC, en poly-pyrimidine område (PPT) med følge UCUUC(U) 10, og en 3 '-acceptor skjøte nettsted (AS) med rekkefølgen GAUAUCCUGCAG ( figur 1 A). To Xba jeg begrensning områder ble introdusert mellom DS og BPS som kan brukes til å sette inn små-RNA uttrykk sekvenser. Muligheten til å effektivt skjøte denne kunstige intron fra pattedyr og mygg celler har vært tidligere bekreftet 14.

2. Utforme en kunstig Intronic liten RNA uttrykk kassett

Merk: overuttrykte eller knockdown av endogene miRNA, sekvenser koding forløper miRNA eller en miRNA svamp ble satt inn mellom DS og BPS. For å tjene som et eksempel, ble en endogen forløper miRNA Ae. albopictus aal-la-7 valgt å konstruere rekombinant viral vektorer for miRNA overuttrykte og knockdown. En anti-let-7 svamp ble utformet i henhold til tidligere beskrevet metoder 15. For å slå ned mål gener i larver, designet vi bestemt kunstig miRNA (amiRNA) eller kort hårnål RNA (shRNA) sekvenser med online programvare 16 , 17; å tjene som et eksempel, V-ATPase delenhet en mRNA (tiltredelse nei. AY864912) ble valgt som et mål gen i denne studien. AmiRNA vil bli referert til som amiVTP senere. Alle sekvenser detaljene i pre-miRNA, svamp, amiRNA og shRNA er beskrevet i supplerende tabell 1.

  1. For syntese av full lengde cDNA sekvenser av forløperen miRNAs, miRNA svamper og shRNA med Xba jeg begrensning nettsteder på begge ender fra DNA leverandøren.
  2. Etter å ha mottatt bestilte DNA, spin rør som inneholder DNA blokker på 10.000-14.000 x g for 1 min å sikre at alle tørket DNA er på bunnen av røret.
  3. Resuspend tørkede DNA i DNase-fritt vann for å oppnå en siste konsentrasjon av 10 ng/µL.
  4. Fordøye plasmider ryggraden og DNA sekvenser med Xba jeg ved 37 ° C i 1 time, og deretter dephosphorylate 5 ' endene av lineær plasmider ryggraden med kalv intestinal alkalisk fosfatase (CIAP) ifølge produsenten ' s-protokollen .
  5. Deaktivere CIAP ved å varme for 60 min på 65 ° C.
  6. Kjører en 1,0% agarose gel og kuttet linearisert ryggraden. Deretter pakker du ut DNA fra gel stykke ved hjelp av en gel utvinning kit etter produsenten ' s instruksjoner.
  7. Ligate DNA fragmentet i backboneby T4 DNA ligase (5 U/µL) på 22 ° C i 1 h.
  8. Transformere produkter av hemorroider reaksjonen fra trinn 2.7 i kompetent Escherichia coli (E. coli) celler og plate på en Lysogeny kjøttkraft (LB) agar plate inneholder Ampicillin (i en konsentrasjon av 100 µg/mL).
    1. Utføre transformasjonen gjennom en varme sjokk metoden 18, og bruk den riktige E. coli belastning. Bruk for eksempel E. coli belastning DH5α for varme sjokk transformasjon.
  9. Hakke en enkelt koloni fra trinn 2.8 og ruge i en kultur av 3 mL beriket middels inneholder Ampicillin (i en konsentrasjon av 100 µg/mL).
  10. Ekstra plasmider DNA fra bakteriell kultur med en mini prep kit etter produsenten ' s instruksjoner. Send prøven til et DNA sekvensering selskap.
    Merk: Overuttrykte eller knockdown av endogene miRNA, sekvenser koding forløper miRNA eller en miRNA svamp ble satt inn mellom to Xba jeg nettsteder. Alle miRNA uttrykk eller svamp konstruksjoner må være kortere enn 400 bp (10% av viral genomet lengde) på grunn av emballasjen begrensning av virus 19.

3. Generere en rAeaDV konstruksjon ved kloning en miRNA eller shRNA uttrykk kassett i en plasmider ryggrad

Merk: pUCA, en smittsomme klone som består av en pUCA plasmider inneholder AaeDV genomet (3,981 nt) 19 var vennlige gitt av professor Jonathan Carlson og har tidligere blitt beskrevet i detalj 11. p7NS1-DsRed uttrykker et ikke-strukturell protein 1 (NS1)-rød fluorescerende protein (DsRed) fusion protein fra p7 arrangøren og har blitt beskrevet i detalj andre steder 14. Et menneske-spesifikke miR-941-1 forløper 20 og dens svamp, en kryptert shRNA (CGACGACTATCGTGCAATTTCAAGAG AATTGCACGATAGTCGTCG), ble også subcloned til AaeDV som en negativ kontroll.

  1. Ligate pre-miRNA, svamp, shRNA eller en amiVTP uttrykk kassett til Hpa jeg området i regionen AaeDV NS1-koding i pUCA plasmider ryggraden som beskrevet i protokollen trinn 2.4 til 2.7.
  2. DNA forvandle Stbl3 kompetent E. coli celler og velg en positiv klone som beskrevet i trinn 2.8 til 2.10.
  3. Følge dette ekstra rAaeDV plasmider fra bakterieceller bruker en maxi prep kit etter produsenten ' s instruksjoner.
    Merk: Stbl3 eller Stbl4 E. coli celler skal benyttes for rAaeDV DNA transformasjon for å redusere uønskede ITR rekombinasjon. En maxi prep bør brukes til å hente rAaeDV plasmider for å få en stor mengde DNA (> 100 µg). Før du genererer viruset, sekvens integriteten til rAaeDV plasmider bør alltid være undersøke av DNA sekvensering 21.

4. Transfecting C6/36 celler med rAaeDV plasmider

  1. kultur C6/36 celler i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium som inneholder 10% fosterets bovin serum (FBS) og 1% penicillin/streptomycin i en 28 ° C inkubator.
  2. På dag 0, plate cellene i ti 25 cm 2 kultur kolber 18-20 h før transfection ved å dele 90-95% confluent celler i en 1:2 fortynning.
    Merk: Ved dag 1, cellene skal nå 90-95% samløpet.
  3. På dag 1, transfect cellene med en rekke rAaeDV plasmider 22.
    1. Fortynne 10 µg DNA i 600 µL av RPMI-1640 medium i et microcentrifuge rør og bland forsiktig. I mellomtiden forbereder 600 µL av RPMI-1640 medium og 25 µL av transfection reagensen per transfection.
    2. Incubate i 5-10 min ved romtemperatur (RT). Legg deretter til 625 µL av 1640-transfection reagens blandingen til 1640-plasmider DNA blanding.
    3. Ruge denne blandingen i 20-30 minutter på RT. Før transfection, vaske cellene to ganger med 2 mL av RPMI-1640 medium.
    4. Etter RT inkubasjon (trinn 4.3.3), Legg the1640-hva reagens DNA plasmider blanding 25 cm 2 kultur kolbe og Inkuber for 6 h 28 ° C.
    5. Ca 6 h etter transfection, fjerner Hva media, vaske cellene to ganger med 5 mL av RPMI-1640 medium, og deretter legge RPMI-1640 medium med 10% FBS.
      Merk: rAaeDV viser høy forekomst av infeksjon (95%) i Ae. albopictus larver, men i vår erfaring, nesten 50% av infiserte larvene, infeksjon var begrenset til primær infeksjon steder (f.eks anal papiller og bust celler) uten formidling 23. Derfor, hvis det er behov for å infisere larver i flere vev, defekt rekombinant virus uttrykke fluorescerende protein bør være co-infisert aktivere visualisering av infeksjon nettsteder. For eksempel for å produsere defekt rekombinant virus uttrykke DsRed, p7NS1-DsRed bør være co transfekterte med en hjelper plasmider i C6/36 celler etter beskrevet ovenfor (cotransfection konsentrasjon forholdet skal være 2:1).

5. Høsting rAaeDV Virions fra transfekterte C6/36 celler

  1. høste celler 5 dager etter hva. Løsne og suspendere cellene i retter av en 5 mL glass dropper, pipettering opp og ned med kultur medium. Overføre alle cellen suspensjoner til sterilt 15-mL rør.
  2. Fryse på-80 ° C eller tørris/etanol badekar i 30 min og deretter tine på 37 ° C. Vortex i 1 gjenta fryse og tine 3 ganger.
  3. Sentrifuge prøven på 4800 x g for 20 min på 4 °C.Collect nedbryting og kast pellet. Deretter går nedbryting gjennom et 0.22 µm disponibel sprøyte filter. Aliquot og lagre den endelige renset virion aksjer til-80 ° C.
    Merk: Unngå gjentatte fryse-Tin sykluser.

6. Kvantifisere rAaeDV

  1. forberede DNA standarder. Linearize alle rAaeDV plasmider med Hpa jeg, og rense fordøyd produktene med en gel utvinning kit 24.
  2. Lage absolutt kvantitative standardkurven og måle titer av virus alt etter tidligere beskrevet metoder 25.

7. Mygg signaltransduksjon

  1. vask 100 1 st skikkelsen Ae. albopictus larver tre ganger bruker vaskebuffer vann, og deretter overføre Larvene i et beaker med 95 mL vaskebuffer vann. Legge til 5 mL av rAaeDV aksjer (siste konsentrasjon av 1.00 x 10 10 Kopier/mL).
  2. Ruge for 24 timer på 28 ° C, vaske Larvene tre timene benytter deionisert vann, og deretter overføre Larvene tilbake til platene og mate regelmessig.
  3. Overvåke nivået av målet genuttrykk Larvene lever på ulike qPCR eller Western blot (representant resultatene vises i tallene 3 og 4).
    Merk: Fluorescens signal gjenkjennings-metoden kan brukes til å isolere infiserte Larvene mer presist. For eksempel for å oppdage fluorescerende signaler fra Larvene infisert med rekombinant virus uttrykke DsRed, kan Larvene plasseres på et concavity lysbilde og observert under en invertert fluorescens mikroskop hver 8 h til 2 dager etter smitte. Når fluorescerende Larvene er oppdaget, bør de skilles i individuelle plast testen kopper å tillate etterfølgende kontinuerlig observasjon. Larvene med flere vev infisert kan identifiseres ved hjelp av denne metoden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Strategier for rAaeDV bygging
En defekt rAaeDV vektor ble generert for å uttrykke DsRed genet i larvene. Den resulterende plasmider inneholdt en NS1-DsRed fusion protein kassett med VP protein slettet (figur 1A). rAaeDV plasmider som inneholder uttrykket konstruksjoner for miRNA, ble miRNA svamp, shRNA og amiRNA utformet (vist i figur 1B). For eksempel ble en rAaeDV vektor generert for å overexpress aal-la-7 i larvene. Den resulterende plasmider inneholdt en intronic pre-aal-la-7 kassett i viral NS1 ekson (figur 1B). En rAaeDV vektor inneholder en intronic aal-la-7 svamp uttrykk kassett i viral NS1 ekson ble generert for å slå ned aal-la-7 uttrykk i Larvene (figur 1B og figur 2B). En rAaeDV shRNA vektor og en rAaeDV amiRNA vektor inneholder intronic shRNA og pre-amiRNA uttrykk kassetter, henholdsvis, ble brukt til å slå ned V-ATPase mRNA i Larvene (figur 2C).

Beregne rAaeDV titers basert på en standard kurve som genereres med lineær regresjonsanalyse
Y-aksen representerer Log10 verdien av standard DNA molekylær konsentrasjon, og x-aksen viser CT verdien. CT tall (x-aksen) og Log10 (konsentrasjon) verdiene (y-aksen) vises en god sammenheng (R2 = 0.9988) og møte ligningen y = - 0.288 x + 13.87 (Figur 3). Beregne rAaeDV titers prøver ved hjelp av lineær formelen (tabell 1). Ved hjelp av metoden beskrevet i protokollen (trinn 6.2 og tabell 1), de høye titers av rAaeDV (4 mL, > 7.65 x 1010 partikler/mL) ble høstet. Rekombinant virus (VrepUCA-7, VrepUCA-7s, VrepUCA-amiVTP, VrepUCA-shVTP, VrepUCA941-1, VrepUCA-941-1s og VrepUCA-shct) ble generert av transfecting tilsvarende infeksjon kloner pUCA-7, pUCA-7s, pUCA-amiVTP, pUCA941-1, pUCA941-1s, pUCA-shct i C6/36 celler (3, 4 og 5).

Bestemme miRNA overuttrykte og knockdown effektiviteten av rAaeDV vektorer
I eksemplet er vektorgrafikk 100 1st skikkelsen Larvene ble behandlet med like mye (1,00 x 1010 partikler/mL) rAaeDV som inneholder intronic pre-let-7 uttrykket, intronic la-7 svamp uttrykk vektor, menneske-spesifikke pre-miR-941-1 uttrykk vektor eller miR-941-1 svamp uttrykk vektoren som tilføyer viruset i selve vann larver habitat. Fem dager etter smitte, uttrykk for aal-la-7 ble bestemt av qPCR (Figur 4, n = 3; Supplerende tabell 2). La-7 nivåene som vises som den gjennomsnittlig ± SD av tre biologiske replikeres i larvene, var betydelig økes eller senkes med den pre-let-7-uttrykke rAaeDV (overexpressed med 2,843.31 ± 80.72%, p < 0.0001, t-test) og La-7-svamp-uttrykke rAaeDV (downregulated med 74.78 ± 1,60%, p < 0.0001, t-test), henholdsvis.

Overvåke V-ATPase mRNA knockdown effektiviteten av rAaeDV vektorer
Totalt 100 1st skikkelsen Larvene ble behandlet med like mye (1,00 x 1010 partikler/mL) intronic amiRNA-uttrykke rAaeDV, intronic shRNA-uttrykke rAaeDV, menneske-spesifikke pre-miR-941-1-uttrykke rAaeDV orscramble shRNA-uttrykke rAaeDV ved å legge viruset i selve vann larver habitat. Fem dager etter smitte, uttrykk for V-ATPase mRNA ble bestemt av qPCR (figur 5, n = 3; Supplerende tabell 2). V-ATPase nivået vises som gjennomsnittlig ± SD av tre biologiske replikeres i Larvene ble betydelig redusert med amiRNA-uttrykke rAaeDV (downregulated med 43.01 ±6.37%, p = 0.0011, t-test) og intronic shRNA-uttrykke rAaeDV (downregulated av 72.88 ± 5.74%, p = 0,0001, t-test).

Figure 1
Figur 1 : Skjematisk organiseringen av rekombinant AaeDV plasmider. (A) den pNS og pVP viral arrangørene kjøre uttrykket NS1/NS2 gener og VP gener, henholdsvis. I p7NS1-DsRed-plasmider ble DsRed genet smeltet til NS1 genet. (B) pUCA-7, pUCA-7s, pUCA-941-1, pUCA-941-1s, pUCA-shct, pUCA-shVTP og pUCA-amiVTP inneholder kunstige introns, inkludert aal-la-7, aal-la-7 svamp, har-miR-941-1, har-miR-941-1 svamp, krypterte shRNA, V-ATPase shRNA og kunstig miRNA, henholdsvis som ble klonet til Hpajeg området av NS1 genet. Den kunstige intron vises flanked av skjøte giver (DS) og et acceptor område (AS) og inneholder et forgreningspunktet domene (BrP), poly-pyrimidine skrift (PPT) og pre-miRNA. MiRNA svamp eller kunstig miRNA sekvensen er satt inn i intron mellom 5-skjøte området og BrP. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Biogenesis kunstig intronic microRNA (miRNA) og strategi for å generere miRNA svamper og kunstige miRNAs. (A) Intronic miRNA er co transkribert i en forløper budbringer RNA (pre-mRNA) i NS1, som vil bli drevet av pNS1 selskapet og kløyvde av pre-mRNA av RNA skjøting. Selv om exons er samskrevet for å danne en moden budbringer RNA (mRNA) for NS1 proteinsyntese, behandles skjøtes intron med pre-miRNA videre til modne miRNA av Dicer. (B) strategi for å generere de anti-let-7 og miR-941-1 konstruksjoner. Justering av anti-let-7 og miR-941-1 sekvenser med aal-la-7 og har-miR-941-1, henholdsvis. Komplett matching av regionene frø med anti-miRNA sekvens og hale regionene vises. Både La-7 og miR-941-1 svamper inneholder tre gjenta antisense konstruksjoner (røde bokstaver) som kan binde til aal-la-7 og har-miR-941-1, henholdsvis. (C) sekvenser og anslått forløper strukturer for miRNA-basert kunstig miRNAs og shRNA brukt i denne studien. Eldre kunstig miRNAs og shRNA er vist i rødt, og de relaterte mål mRNA sekvensene er i blått. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Standardkurven for rAaeDV titrering og den beregnede concentrations av MDVs. (A) sanntid qPCR ble utført med en pUCA standard som ble utvannet av 10 ganger forstørrelse forholdet, og CT verdien ble målt på en ABI 7500 x. Antall kopier ble beregnet etter trinn 6.2 og 6.3 med følgende formel: kopiere nummer (y) =-0.288x + 10,87; R2 = 0.9988. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 : Rekombinant MDV-mediert aal-la-7 overuttrykte og knockdown i Ae. albopictus larver. (A) analyse av endogene miRNA uttrykk i Larvene etter rekombinant viruset som inneholder aal-la-7 uttrykket kassetten (venstre panel). (B) effektiviteten av anti-let-7 konstruere ble bestemt i Larvene (høyre panel). De har-miR-941-1 og har-941-1 svamp (negativ kontroll) overexpressed og downregulated den eldre la-7 miRNAs, henholdsvis sammenlignet den basale nivået i kontrollgruppen. miRNA overflod var normalisert til 5S rRNA, og dataene vises som gjennomsnittlig ± SD av tre biologiske replikerer. T-tester ble utført på Presisjonsstudier nivåer av betydning. Stjernene angir statistisk betydelige forskjeller mellom smittede og tilsvarende uekte-behandlet Larvene (fire stjernene, p < 0,0001). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5 : Analyse av V-ATPase mRNA uttrykk etter rekombinant viruset som inneholder shRNA og amiRNA kassetter. mRNA overflod var normalisert til aalrpS7. Feilfelt representere standardavviket for 2−ΔΔCT verdiene for V-ATPase mRNA uttrykk i Ae. albopictus larver som vurdert av sanntids RT PCR (**, p < 0.01; ***, p < 0,001). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Table 1
Tabell 1: Rekombinant MDV C T verdien bestemmes av qPCR tilsvarer den x verdien i formelen, som brukes til å beregne den y verdi. Viral genomet kopi tallet i hver 1 µL prøve ble innhentet av funksjonen kraften (10, y), som ble til slutt multiplisert med 40, konvertere verdien til virus konsentrasjonen av virus suspensjon.

Supplemental Table 1
Supplerende tabell 1: Sekvenser av miRNA forløper.

Supplemental Table 2
Supplerende tabell 2: qPCR data.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det er viktig å overvinne to av de viktigste hindringene som begrenser rAaeDV konstruksjon. Først er produksjon av defekte rekombinant virus. Det har blitt rapportert at MDV kan brukes som en vektor uttrykke riktig størrelse utenlandske gener, som scorpion insekt-spesifikke neurotoxins20 og GFP protein; men uansett konstruksjon strategi form når ORFs MDV er satt inn eller erstattet med eksogene gener, virions ikke uavhengig med mindre en hjelper plasmider er cotransfected for å levere manglende uunnværlig virale proteiner. Defekt viruset er ikke engasjere seg i sekundære overføring, som oppstår i vivo i mygg med defekt genomer. Våre resultater validere en intronic uttrykk strategi som tilbyr et nytt paradigme som kan overvinne begrensningene til MDVs med defekt genomer å muliggjøre effektiv levering av utenlandske gener i mygg.

Andre er krevende lengdegrensen i rekombinant viral genomet pålagt av størrelsen på viral kapsid. For miljøvennlig emballasje, kan ikke genomet størrelsen overstige 4400 nukleotider (110% av wt MDVs genomet). En intronic miRNA uttrykk kassett (inkludert miRNA uttrykk kassett og kunstig intron) med mer enn 400 nt kan bli introdusert i AaeDV genomet. Selv om rekombinant virus genomet er fortsatt egnet for emballasje, har levering systemet rom for forbedring. På grunn av begrensning i genomet lengde er det vanskelig å uttrykke genene uten defekt intronic uttrykk strategier.

Det er viktig å sikre at C6/36 celler er sunt å aktivere vellykket transfection og pakking av rAaeDV. Men kationisk liposome reagenser her og kommersielle insekt celle bestemt hva reagenser, bedre ikke effektiviteten av C6/36 celle transfection (40-60%). Derfor for å høste høy-titer rekombinant virus, er det nødvendig å opprettholde cellene i 5 dager etter transfection basert på tidligere beskrevet vekst egenskaper14. I tillegg for vellykket larver infeksjon er det avgjørende for larvae å være i kontakt med infeksiøse viruspartikler 24-36 h å sikre høy infeksjon prosenter23.

Avslutningsvis er intronic uttrykk strategi beskrevet her først til å overvinne barrierer pålagt av generasjonen av defekte MDV. Denne strategien kan ikke-defekt rekombinant MDVs som kan overexpress eller downregulate miRNAs og mål gener i mygg. Denne teknikken gir et verktøy for funksjonsanalyse av mygg gener uten bruk av kompliserte Larvene microinjection prosedyrer og har klart kommersielle programmer. Videre studier vil utvide anvendelsen av beskrevet uttrykk strategien å undersøke mygg biologi og paratransgenesis for dengue virus kontroll.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Forfatterne bekrefter økonomisk støtte fra National nøkkelen forskning og utvikling Program i Kina (2016YFC1200500 til Xiao-Guang Chen), National Natural Science Foundation av Kina (81672054 og 81371846), naturlige forskningsprogram Team Science Foundation i Guangdong (2014A030312016), og vitenskapelige og teknologiske programmet Guangzhou (201508020263). Vi erkjenner takknemlig Professor Jonathan Carlson (Colorado State University) for vennlig gir pUCA og p7NS1-GFP plasmider og kritisk lesing dette manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Centrifuge machine Thermo Scientific 75004260
Centrifuge System Beckman Coulter 363118
GeneJET Gel Extraction Kit Thermo Scientific K0691
E.Z.N.A. Plasmid Midi Kit Omega Biotech D6904
Purified Agar OXOID LP0028A
FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase (1 U/µL) Thermo Scientific EF0651
FastDigest HpaI Thermo Scientific FD1034
FastDigest XbaI Thermo Scientific FD0684
T4 DNA Ligase (5 U/µL) Thermo Scientific EL0011
TransStbl3 Chemically Competent Cell Beijing Transgen Biotech CD521-01
Ampicillin  Beijing Tiangen Biotech RT501
Proteinase K Promega MC5008
SuperReal PreMix Plus (SYBR Green) Beijing Tiangen Biotech FP205

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tolle, M. A. Mosquito-borne diseases. Current problems in pediatric and adolescent health care. 39, 97-140 (2009).
  2. Petersen, L. R., Jamieson, D. J., Powers, A. M., Honein, M. A. Zika Virus. The New England journal of medicine. 374, 1552-1563 (2016).
  3. Roberts, D. R., Andre, R. G. Insecticide resistance issues in vector-borne disease control. The American journal of tropical medicine and hygiene. 50, 21-34 (1994).
  4. Attaran, A., Roberts, D. R., Curtis, C. F., Kilama, W. L. Balancing risks on the backs of the poor. Nature medicine. 6, 729-731 (2000).
  5. Volohonsky, G., et al. Transgenic Expression of the Anti-parasitic Factor TEP1 in the Malaria Mosquito Anopheles gambiae. PLoS pathogens. 13, 1006113 (2017).
  6. Galizi, R., et al. A synthetic sex ratio distortion system for the control of the human malaria mosquito. Nature communications. 5, 3977 (2014).
  7. Bourtzis, K., Lees, R. S., Hendrichs, J., Vreysen, M. J. More than one rabbit out of the hat: Radiation, transgenic and symbiont-based approaches for sustainable management of mosquito and tsetse fly populations. Acta tropica. 157, 115-130 (2016).
  8. Kumar, S. S., Puttaraju, H. P. Improvised microinjection technique for mosquito vectors. The Indian journal of medical research. 136, 971-978 (2012).
  9. Attardo, G. M., Higgs, S., Klingler, K. A., Vanlandingham, D. L., Raikhel, A. S. RNA interference-mediated knockdown of a GATA factor reveals a link to anautogeny in the mosquito Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 13374-13379 (2003).
  10. Singh, A. D., Wong, S., Ryan, C. P., Whyard, S. Oral delivery of double-stranded RNA in larvae of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti: implications for pest mosquito control. Journal of insect science. 13, (Online) 69 (2013).
  11. Ward, T. W., et al. Aedes aegypti transducing densovirus pathogenesis and expression in Aedes aegypti and Anopheles gambiae larvae. Insect molecular biology. 10, 397-405 (2001).
  12. Carlson, J., Suchman, E., Buchatsky, L. Densoviruses for control and genetic manipulation of mosquitoes. Advances in virus research. 68, 361-392 (2006).
  13. Barreau, C., Jousset, F. X., Bergoin, M. Pathogenicity of the Aedes albopictus parvovirus (AaPV), a denso-like virus, for Aedes aegypti mosquitoes. Journal of invertebrate pathology. 68, 299-309 (1996).
  14. Liu, P., et al. Development of non-defective recombinant densovirus vectors for microRNA delivery in the invasive vector mosquito, Aedes albopictus. Scientific reports. 6, 20979 (2016).
  15. Ortega, M. M., Bouamar, H. Guidelines on Designing MicroRNA Sponges: From Construction to Stable Cell Line. Methods in molecular biology. 1509, Clifton, N.J. 221-233 (2017).
  16. BLOCKiT RNAi Designer. , Available from: http://rnaidesigner.lifetechnologies.com/rnaiexpress/ (2017).
  17. GE Dharmacon siDesign Center siRNA design tool. , Available from: dharmacon.gelifesciences.com/design-center/ (2017).
  18. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. Journal of visualized experiments : JoVE. , e253 (2007).
  19. Afanasiev, B. N., Kozlov, Y. V., Carlson, J. O., Beaty, B. J. Densovirus of Aedes aegypti as an expression vector in mosquito cells. Experimental parasitology. 79, 322-339 (1994).
  20. Hu, H. Y., et al. Evolution of the human-specific microRNA miR-941. Nature communications. 3, 1145 (2012).
  21. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74, 5463-5467 (1977).
  22. Dalby, B., et al. Advanced transfection with Lipofectamine 2000 reagent: primary neurons, siRNA, and high-throughput applications. Methods (San Diego, Calif). 33, 95-103 (2004).
  23. Gu, J. B., Dong, Y. Q., Peng, H. J., Chen, X. G. A recombinant AeDNA containing the insect-specific toxin, BmK IT1, displayed an increasing pathogenicity on Aedes albopictus. The American journal of tropical medicine and hygiene. 83, 614-623 (2010).
  24. Hou, Y., Zhang, H., Miranda, L., Lin, S. Serious overestimation in quantitative PCR by circular (supercoiled) plasmid standard: microalgal pcna as the model gene. PloS one. 5, 9545 (2010).
  25. Ding, J., et al. Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2016).

Tags

Utviklingspsykologi biologi problemet 128 mygg densovirus gen levering vektor liten RNA, Aedes albopictus vektor kontroll kunstige intron.
Bruk av en rekombinant Mosquito Densovirus som et gen levering vektor for funksjonell analyse av gener i Larvene
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liu, P. W., Xu, J. B., Dong, Y. Q.,… More

Liu, P. W., Xu, J. B., Dong, Y. Q., Chen, X. G., Gu, J. B. Use of a Recombinant Mosquito Densovirus As a Gene Delivery Vector for the Functional Analysis of Genes in Mosquito Larvae. J. Vis. Exp. (128), e56121, doi:10.3791/56121 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter