Summary
Identifikation af genetiske varianter bidrager til komplekse menneskelige sygdom tillader os at identificere nye mekanismer. Her viser vi en multiplex genotypebestemmelse tilgang til kandidat gener eller gen pathway analyse, der maksimerer dækning til en lav pris og er indstillet til kohorte-baserede undersøgelser.
Abstract
Komplekse sygdomme understøttes ofte af flere fælles genetiske varianter, der bidrager til sygdom modtagelighed. Her, beskriver vi en omkostningseffektiv tag enkelt nukleotid polymorfisme (SNP) tilgang ved hjælp af en multiplex genotypebestemmelse assay med massespektrometri, til at undersøge gen pathway foreninger i klinisk kohorter. Vi undersøger mad allergi kandidat locus Interleukin13 (IL13) som et eksempel. Denne metode maksimerer effektivt dækning ved at udnytte fælles kobling ubalance (LD) inden for en region. Valgte LD SNPs er derefter designet i en multiplex assay, gør det muligt for op til 40 forskellige SNPs analyseres samtidig øge omkostningseffektiviteten. Polymerasekædereaktionen (PCR) anvendes til at forstærke target loci, efterfulgt af enkelt nucleotid udvidelse, og amplikoner derefter måles ved hjælp af matrix assisted laser desorption/Ionisation-tid af flight(MALDI-TOF) massespektrometri. Det rå output er analyseret med genotype kræver software, ved hjælp af strenge kvalitetskontrol definitioner og cut-offs, og høj sandsynlighed genotyper er fastlagt og output til dataanalyse.
Introduction
I menneskers komplekse sygdom, genetiske varianter bidrage til sygdom modtagelighed og kvantificere disse varianter kan være nyttig for forståelsen patogenese, identificerer patienten højrisikogrupper og behandling respondenter. Faktisk, løftet om præcision medicin er afhængig af udnytte genomiske information for at identificere patienten undergrupper1. Desværre, inden for det komplekse sygdomme biologi rum, hvor sygdommen fænotyper er understøttet af betydelige genetiske heterogenitet, lav penetrans og variabel ekspressivitet, kohorte størrelse krav til genome-wide tilgange til at identificere roman kandidater er ofte uoverkommeligt store2. Alternativt, en målrettet kandidat gen tilgang begynder med en apriori hypotese om specifikke gener/veje i sygdom ætiologi3. Sti analyseværktøjer er almindeligt anvendt til at undersøge Patofysiologi af et identificeret mål loci, genererer talrige kandidat veje skal undersøges. Vi viser her en multiplex genotypebestemmelse tilgang giver mulighed for undersøgelse af snesevis til hundredvis af SNPs med en assay, egnet til menneskelige kohorte studier4. Denne tilgang er relativt høj gennem-læg, tillader hundreder til tusinder af DNA-prøver skal genotypebestemmes for romanen discovery undersøgelser og efterforskning af specifikke veje. De metoder, der er skitseret her er nyttig til at identificere risikoen alleler og deres foreninger med kliniske træk i en relativt hurtig og billig måde. Denne platform er blevet meget fordelagtige for screening og diagnostiske formål5,6, og for nylig, for mikrobiel infektion7 og humant papillomvirus8.
Denne protokol begynder med udvælgelsen af et sæt af gener for undersøgelsen, dvs., målområder, typisk bestemmes gennem litteratur søgning, eller en på forhånd hypoteser for deltagelse i sygdomsprocessen; eller måske valgte for replikering som de førende sammenslutninger af en opdagelse genome-wide association (GWA) undersøgelse. Forskeren vil gen sæt Vælg et raffineret liste over tag SNPs. Det vil sige, bruges kobling ubalance (LD), eller korrelation, blandt varianter i regionen til at identificere en repræsentant 'tag SNP' for en gruppe af SNPs i høj LD, kendt som en haplotype. Den høje LD i regionen betyder, at SNPs ofte er arvet sammen, således at genotypebestemmelse en SNP er tilstrækkeligt til at repræsentere variationen på alle SNPs i haplotype. Alternativt, hvis følger op på en definitiv liste over SNPs fra mange områder, fx., replikering til en GWA undersøgelse, denne proces kan være unødvendig. For multipleksede genotypebestemmelse, skal en analyse derefter være konstrueret omkring disse mål sådan, at forstærkning primere er af forskellig masse til dem af de forlængelse primere og produkter til at producere fortolkelige masse spektre. Disse parametre der let kan implementeres af en multiplex genotypebestemmelse assay designværktøj. Frem og bak primere fra dette design vil blive brugt til at målrette markører af interesse og forstærke den sekvens, som indeholder SNP. Udvidelse primere vedhæfte direkte proksimalt for SNPs og en enkelt, masse-modificeret, "terminator" base, der supplerer SNP er tilføjet. Terminator base forhindrer yderligere udvidelse af DNA. Mass-ændring af basen giver fragmenter afviger en enkelt base til at blive opdaget af massespektrometri. Pladen indeholder genotypebestemmelse kemi derefter anvendes på en chip til måling på en massespektrometri platform. Efter anvender passende kvalitetskontrol på de rå genotypebestemmelse opfordringer registreret af systemet, kan data eksporteret og brugt til statistisk analyse til at teste for association med sygdom fænotyper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Det genetiske materiale, der anvendes heri blev etisk godkendt til brug af Kontoret for børn HREC (Human forskning etiske komité) (CDF/07/492), Institut for Human Services HREC (10/07) og Royal children's Hospital (RCH) HREC (27047).
1. designe multipleksede analysen
- Forberede assay design en SNP liste.
- Inddata målområde i funktionen mærker af Haploview (https://www.broadinstitute.org/haploview/downloads). Bruge LD (korrelation, Rasmussen2) mellem SNPs spanning regionen mål til at generere en liste over SNPs, som giver fuld dækning af den ønskede region med færrest mulige nødvendige varianter. Genererer en liste over SNPs, sådan at alle alleler til at blive fanget er korreleret over en bruger-defineret grænse (fx., Rasmussen2 ≥0.8).
- Identifikation af egnede sekvenser for fremad, bakgear og udvidelse primere
- Angiv den genererede liste over SNPs i værktøjet assay design valg.
Bemærk: De følgende instruktioner gælder for assay designværktøj bruges til at generere de repræsentative resultater, som specificeret i Tabel af materialer. - Når værktøjet assay design er blevet lanceret, Vælg Ny genotypebestemmelse Design. Angiv et navn til assay design i feltet Design navn .
- Give SNP listen oprettet i trin 1.1.1 ved at klikke på knappen Startplacering de instruktioner rs eller FASTA til venstre for knappen Rediger tekstinput .
Bemærk: SNPs kan være angivet som en tekstliste reference (rs) SNP-id'er eller uploadet i FASTA format, eller SNP gruppe filformat bruges af værktøjet. For at uploade filer i disse formater, skal du vælge knappen Filsending . Den øvre grænse for varianter, der kan designes til en enkelt assay, betegnes «godt,» er 40 SNPs. Det er muligt at angive SNPs, der er en prioritet for design før Start Kør; disse vil blive beregnet først. Kontrol SNPs kan være angivet: for eksempel en analyse at opdage køn prøve mix ups eller et kontrolelement til at bestemme tilstrækkelig skabelonen blev tilføjet hvis arbejder med lav eller dårlig kvalitet DNA. Dog skal det bemærkes, at ved hjælp af kontrol og prioriterede SNPs kan reducere antallet af SNPs, der kan designes i en enkelt godt. - Vælg indstillingen høj Multiplexing iPLEX forudindstilling i menuen forudindstilling . Vælg den organisme, som DNA skal genotypebestemmes stammer i menuen organisme . For de repræsentative resultater præsenteres her, var dette menneske.
Bemærk: Mus og kvæg organismer er også kompatibel med værktøjet. Man kan også vælge andre hvis arbejder med en alternativ organisme som plante eller mikrobe; men de automatiserede trin for at finde proksimale SNPs og optimal primer områder vil ikke være tilgængelig på grund af fraværet af en reference genom. - Vælg den seneste build af genomet, eller en alternativ bygge om nødvendigt menuen kemi i menuen Database . Vælg iPLEX og Angiv det højeste niveau af multiplexing for feltet Multiplex niveau : 40. Vælg nu Begynder at køre. "Trin 1" af værktøjet vil begynde.
Bemærk: Under trin 1, værktøjet henter og formater SNP sekvenser. Her, kan fejl indeholde formatering af filen FASTA tilfælde filen FASTA bør kontrolleres og omformateret så nødvendigt. En anden fejl er SNP rs numre, der er blevet sammenlagt med en anden rs nummer, hvor sagen rs antallet bør søges i en SNP database som NCBI'S dbSNP til at identificere nye SNP rs antallet. Sekvenser omkring SNP søges der efter alle kendte proksimale SNPs, der kunne forstyrre primer design. Potentielle PCR primer steder sammenlignes mod genom at undgå ikke-specifikke forstærkning på grund af flere hits i genomet. - Afvente afslutningen af "Trin 2" i designværktøjet proksimale SNPs vil blive identificeret.
Bemærk: Hvis du bruger en organisme, der ikke understøttes af dette skridt, anmærke sekvenser med proksimale SNPs i IUPAC anmærkning hvis oplysningerne er tilgængelige. Der er sjældent fejl under dette trin; fejl kan dog forekomme hvis forkert reference organisme eller genom blev markeret, eller hvis cDNA sekvenser blev indtastet i stedet for genomisk DNA. For at optimere trin 2, under Avancerede indstillinger, er det muligt at bortfiltrere SNPs baseret på en population, hvis arbejde inden for en bestemt population. Sjældne SNPs kan også være filtreret ud af maskerne med en hyppighed under 1%. SNPs, der ikke har en godkendt status eller ikke har befolkningen oplysninger kan endelig også være udelukket, hvis det ønskes. - Afvente afslutningen af "Trin 3" i designværktøjet, der identificerer optimal primer regioner. Hvis det foretrækkes primer placeringer er blevet identificeret, eller hvis arbejder med en anden organisme, manuelt input primer steder ved udfyldelse inputsekvensen (SNP gruppe filer) med de foretrukne primer regioner i store bogstaver og resten af sekvens i nederste sag, skal du vælge Bevar sag fra menuen Avancerede indstillinger for dette trin.
Bemærk: Fejl for trin 2 & 3 kan omfatte: (1) A proksimale SNP blokering design af en primer med den løsning er at maskere med en ikke-skabelon base og bestille en oligo med en universel base som Isonine eller designe to primere, en med hver af alleler af proxim Al SNP, eller design en primer med den almindelige allel kun. (2) en anden almindelig fejl er at identificere et unikt sted for primeren med den løsning at ændre amplikon længde for at identificere et unikt sted. I værktøjet anvendes til dette papir, er standarden 80-120 bp. Dette kan ændres fra 60-400 bp i dialogen Avancerede indstillinger under indstillingerne amplikon længde i "3. Identificere optimale Primer områder"og også under fanen amplikon af"4. Design Assays." Sikre, at begge er ændret. Dog skal det bemærkes, at øge længden på amplikonen når ved hjælp af forringet DNA ikke kan anbefales. - Afvente afslutningen af analysen design trin ("step 4" af design værktøj), her værktøjet sigter mod at give optimal pass adskillelse mellem forlængelse primere og alleler af alle SNPs i multipleksede design. Når dette trin er fuldført, eksportere filen Oligo ordre, der er formateret til nem bestilling gennem en oligo bestilling leverandør af valg.
Bemærk: Forstærkning primere (frem (F) og omvendt (R)) er designet til at producere en optimal amplikon størrelse på 80 til 120 bp. Forstærkning primer massen må afvige fra udvidelse primer og sit produkt til at undgå modstridende resultater i masse spektrum og for overordnede PCR ydeevne. Den forlængelse primer skal være 15-30 nukleotider lange (4.500-9.000 Da), designet, så 3' enden vil vedhæfte støder direkte op til stedet, hvor polymorfi. Alle disse indstillinger angives automatisk i værktøjet bruges til at generere de repræsentative resultater.
- Angiv den genererede liste over SNPs i værktøjet assay design valg.
- Eksportere design fra de valgte værktøj og orden primere fra en oligomer udbyder: 25 nmol hver af PCR-primere (forward og reverse) og 100 nmol hver udvidelse primere. Se tabel 1 for primere bruges til at generere de repræsentative resultater.
2. genotypebestemmelse (1-2 dage)
- Forberede forstærkning primere.
- Hvis frysetørrede primere var bestilt, rekonstitueres med vand af Molekylær renhed. Bruge en koncentration på 100 μM/μL til frem og bak primere og 500 μM/μL for udvidelse.
- Pool frem & omvendt primere for hver multipleksede analysen ind i en bestand primer blanding, der indeholder hver primer ved en koncentration på 0,5 mM.
Bemærk: For eksempel, en 400 μL primer pulje til 400 reaktioner:
2 μl af hver primer, i en koncentration på 100 μM/μL, der kræves for stock primer pool. For en 30-plex assay med 60 frem og bak primere, ialt 120 μL af primer ville være påkrævet (koncentreret primer pool). 280 μl vand af Molekylær renhed ville derefter være tilføjet for at gøre en endelige mængden af 400 μL af primer blandes.
- Forstærkning ved hjælp af Polymerase Chain Reaction (PCR)
- Gøre en master mix for PCR indeholdende 100 nM af primer mix beskrevet ovenfor, 500 μM af dNTP'er, 2 mM af MgCl2og 0,5 U af et DNA polymerase enzym. 1 U er nødvendig for større end 26-plex assays. Henvises til tabel 2.
- Tilsæt 4 μL af denne blanding til hver brønd af 384-godt PCR plade, sammen med 1 μL af genomisk DNA i en koncentration på 5-10 ng/μl.
Bemærk: kvalitetskontrol skal også medtages på pladen, som en ikke-skabelon kontrol, og en positiv kontrol, der har tidligere optrådt godt med analysen (under en prøvekørsel). Hvis kører flere plader, flere DNA prøver fra de andre skilte, fx., i tre eksemplarer, skal køres som teknisk kontrol for Inter plate variabilitet. - Der centrifugeres plade ved 200 x g i 1 minut ved stuetemperatur med en plade cover for at sikre alle væske er indeholdt i bunden af pladen brønde.
- Køre PCR med følgende thermocycler betingelser: 4 min inkubation ved 94 ° C til at aktivere DNA-polymerasen; 45 cyklusser af følgende (denaturering på 94 ° C i 20 s, udglødning ved 56 ° C i 30 s og udvidelse ved 72 ° C i 1 min) og derefter en sidste udvidelse ved 72 ° C i 3 min. henvis til PCR program i tabel 3.
- Udføre Agarosen gelelektroforese for at sikre DNA amplifikation er vellykket. Brug 1 µL PCR produkt (med 3 µL af loading bufferen) på en 2% (w/v) agarosegel, fremstillet ved at blande Agarosen pulver og 0,5% Tris Borat EDTA (TBE) buffer, og køre i 45 min. ved 100 V.
- Rejer alkalisk fosfatase (SAP) rensning trin
Bemærk: Dette trin bruges til at fjerne personlige nukleotider. SAP enzym kløver fosfat grupper for at forhindre, at overskydende primer og personlige dNTP'er blander sig i den kommende udvidelse reaktion.- Gøre en master mix indeholdende 1,7 enheder/μL af rejer alkalisk fosfatase (SAP) enzymet, 10 x SAP buffer og fyldes op til mærket med vand af Molekylær renhed. Henvises til tabel 4.
- Tilføj 2 μl af den frisklavet op SAP master mix til hvert hul i pladen, der allerede indeholder 5 μL fra PCR reaktionen. Centrifugeres kort og vende tilbage til thermocycler ved 37 ° C i 40 min og derefter på 85 ° C i 5 min for enzymet inaktivering. Henvises til tabel 5.
- Primer udvidelse reaktion
Bemærk: Koncentrationen af udvidelse primere i forlængelse primer mix skal justeres efter størrelse (lineær Primer justering – LPA). Dette er fordi der er et omvendt forhold i peak intensitet (på massespektre) og produkt masse. Justering af udvidelse primer koncentration korrigerer for dette forhold at producere toppene af samme støtteintensiteter. Justeret primere bruges til at generere repræsentant resultater er givet i tabel 6 & 7. De diskenheder, der er til at generere 1,5 mL udvidelse primer mix.- Beregne fortynding faktorer for hver primer med en gradient algoritme, tilgængelig fra Agena Biosciences (» lineær Primer tilpasning'), som justerer for masse og koncentrationen af primeren, og det samlede antal primere i multipleksede reaktion (Se Tabel 6 & 7). Angiv UEP massen for hver primer til feltet UEP_MASS i arket lineær Primer justering.
Bemærk: Den masse korrigerede koncentration for primeren vil automatisk blive beregnet i celle med headerteksten "Target reaktion koncentration (µM)." Mængden af primer tilføjes til primer pool vil være output i cellen under headerteksten "Volumen Stock Primer tilføjes til swimmingpool (µL)." Mængden vand der skal føjes til primer poolen for at kompensere de beregnede koncentrationer er output til cellen ved siden af teksten "volumen af PCR Grade RNase gratis H2O at være tilføjet Primer Pool (µL)." - Tage mængden af hver primer som angivet i filen lineær Primer justering og udgør en primer pool. Tilføje mængden vand beregnes af algoritmen til at fortynde primer poolen som bestemt i trin 2.4.1.
Bemærk: Hvis metoden gradient algoritme er tilgængelig, en anden metode er at opdele primere i lav masse og højmesse og tilføje dobbelt koncentration af de høje masse primere i forhold til den lave masse gruppe. Tre eller fire grupper kan være behov for en high-plex assay (dvs mere end 19 SNPs). Denne metode vil dog ikke give som optimal takster som metoden gradient algoritme. - Samle udvidelse master mix. For lav plex assay (1-18 plex), tilføje 0.2 μL af bufferen, 0,1 μL af opsigelse mix, 0,94 μL af LPA justeret primer mix og 0.0205 μL af enzymet (forberedt på is). For høj plex assay (19-36 plex), tilføje dobbelt koncentration af opsigelse mix og enzym (opsigelse mix 0,2 μL og iPLEX enzym 0.041 μL). Henvises til tabel 8.
- Tilføj 2 μl af udvidelse reaktion master mix til pladen fra den tidligere reaktion, nu at bringe den samlede mængde til 9 μl pr. brønd. Centrifugeres kort og placere i thermocycler: 94 ° C for en 30 s oprindelige inkubation, 40 cyklusser af 1 x 94 ° C 5 s med 5 x (52 ° C til 5 s, efterfulgt af 80 ° C i 5 s), og derefter mindst 72 ° C i 3 min. henvises til tabel 9.
- Beregne fortynding faktorer for hver primer med en gradient algoritme, tilgængelig fra Agena Biosciences (» lineær Primer tilpasning'), som justerer for masse og koncentrationen af primeren, og det samlede antal primere i multipleksede reaktion (Se Tabel 6 & 7). Angiv UEP massen for hver primer til feltet UEP_MASS i arket lineær Primer justering.
- Harpiks rensning.
Bemærk: Overskydende salte kan nu fjernes fra reaktion med brugen af harpiks.- Tilføje 16 μL ionbyttet vand brønde af hentet plade, at bringe volumen i plade op til 25 μL.
- Anvende harpiks, sædvanligvis 6 mg af dimple harpiks plade (købes separat), jævnt til hele pladen. Forlade harpiks til tørre i harpiks dimple plade i 20 min. ved stuetemperatur før anvendelse til reaktion pladen. Efter tilsætning af harpiks, rotere pladen i 5 min ved stuetemperatur, enten i hånden eller med en suspension mixer ved en langsom hastighed (fx., 7,5 rpm).
Bemærk: Forud for lastning genotypebestemmelse analysand på genotypebestemmelse chip, prøver og analysen layout skal være inddata i software interfacet. Dette kan opnås ved hjælp af filen Design Resumé fra assay designværktøj.
- Måling på en massespektrometri platform.
- Der centrifugeres plade på 3.200 x g for 5 min at undgå anvendelse af harpiks på massespektre chip.
- Uploade plade layout af prøver til systemets software interface før tiden.
Bemærk: Trin 2.6.3 bør kun udføres af uddannet personale. - Anvende genotypebestemmelse analysand blanding fra pladen til genotypebestemmelse chip med en udlevering system. Næste, indlæse chip på MALDI-TOF-system til at generere de massespektre fra analysanden blanding, som kan fortolkes ved hjælp af den platform software interface.
Bemærk: Systemet genererer de massespektre ved at dirigere korte pulser af UV-lys på hver 'pad,"svarer til et enkelt godt af genotypebestemmelse plade af massespektre chip. Denne puls resulterer i desorption og ionisering af analysanden. Disse ioniseret DNA molekyler er derefter fremdrives til toppen af vakuum rør ved en høj spænding elektrostatisk felt, adskille ud lysere ioner, som rejse hurtigere og nå detektoren først, fra de tungere ioner. "Flight tid" af disse analysander er registreret af systemet, som kan bestemmes massen af hver DNA-fragment og dermed nukleotid base stede ved SNP kan udledes.
3. genotypebestemmelse Data
Bemærk: kvalitetskontrol og data fortolkning er ikke fokus i denne metode papir. Men, følgende kort dækker fortolkning af de massespektre.
- Manuel inspektion og kvalitetskontrol af massespektre.
Bemærk: De rå massespektre er genereret af systemet og analyseret med software som anført i Tabel af materialer. En Gaussisk blandingen klyngedannelse metode anvendes på dette output til at foretage sandsynlighedsberegninger genotypebestemmelse opkald.- Åbn analyse software. Vælg types Analyzer. Fra menuen fil , Vælg Åbn Wells fra fil og vælg XML-fil med spektrum data genereret i trin 2.6.3. Navnet chip til flugt skal være synlige, Vælg det og en "trafiklys" rude af 384-godt plade vises med en liste over SNPs i den valgte godt. Her, Vælg Kalder klynge grunde til at se en scatterplot af datapunkter for hvert SNP.
Bemærk: Det anbefales, at en 'ingen opkald' resultat anvendes for lav intensitet SNPs. I den software, der anvendes for de repræsentative resultater, foreslås en klyngedannelse størrelsesorden cut-off af 5, som er højere end standard, for strenge kvalitetskontrol. Denne indstilling kan justeres i størrelsen Cutoff felt under parametre i ruden Post Processing klynger . Vælg Autocluster under fanen værktøjer til at køre en cluster analyse. - Udføre manuel kontrol af genotype opkald ved at undersøge den kartesianske parceller i ruden Post Processing. I ruden Assay Vælg SNP interesse og klik på fanen Post-Processing klynger , en klynge plot med genotype klyngedannelse bliver synlig med prøve-id'er og tilsvarende genotyper for SNP.
- Undersøge genotype opkald klynger og vurdere, hvor godt hver enkelte opkald klynger med andre opkald for SNP. Softwaren giver nogle grænse linjer på plottet for hver genotype vejledning; Se eksempel på en genotype opkald klynge plot fra en IL13 SNP (figur 1). Hvis opkaldet ikke klynge tæt med andre opkald og sidder klart uden for en klynge, eller hvis den har meget lav intensitet, lige falde i hak datapoint og vælge Skift kalder manuelt indstille den til ikke ringe.
- For at sikre høj kvalitet genotypebestemmelse data benyttes til downstream analyse, udelukke SNPs og enkeltpersoner med opkald satser en QC tærskel, fx 90%. Når har foretaget passende justeringer til opkaldsdataene, eksportere data til statistiske programmer. I den software, der bruges til at generere de repræsentative resultater (listet i Tabel af materialer) er dette opnået med den Plade Data valg fra menuen og vælge Gem som.
- Åbn analyse software. Vælg types Analyzer. Fra menuen fil , Vælg Åbn Wells fra fil og vælg XML-fil med spektrum data genereret i trin 2.6.3. Navnet chip til flugt skal være synlige, Vælg det og en "trafiklys" rude af 384-godt plade vises med en liste over SNPs i den valgte godt. Her, Vælg Kalder klynge grunde til at se en scatterplot af datapunkter for hvert SNP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med den protokol, der er beskrevet ovenfor, tag vi genotypebestemmes SNPs på tværs af Th2 immun gen IL13 i en kohorte af mad allergi tilfælde og kontroller9. Vi anvendte logistisk regressionsanalyse, korrigeret for afstamning og andre potentielle kovariater, at teste, om de genetiske varianter inden for det pågældende område, øget mad allergi risiko. Tabel 10 9 viser, at en variant rs1295686 er forbundet med udfordring-bevist fødevareallergi og vi bekræftet denne forening i en replikering kohorte benytter den samme multipleksede genotypebestemmelse tilgang. En meta-analyse af resultaterne fra de to kohorter fremlagt stærke beviser for Sammenslutningen af IL13 med FA (tabel 11)9. Vi genetisk udledes og justeret for afstamning i analysen ved hjælp af en afstamning informative SNP markør panel, tilpasset fra en offentliggjort panel10. Vi genotypebestemmes panelet ved hjælp af den samme multipleksede assay tilgang.
Den tilknyttede variant, rs1295686, har tidligere identificeret som en astma risiko loci11 og forbundet med andre allergiske immunologiske parametre12, tyder på, det kan være en generel allergisk sygdom risiko loci. De næste skridt ville være at foretage yderligere undersøgelser, såsom differential udtryk analyse, kortlægning fysiske interaktion med en kromatin capture metode, fine kortlægning af regionen, og haplotype analyse, at pin punkt den funktionelle variant og karakterisere biologi bag de observerede association med fødevareallergi.
Figur 1: kartesiske klynge plot for IL13 SNP rs1295686. Gul klynger repræsenterer homozygot genotype opfordrer til A-allel, blå for G-allel og grøn for heterozygous opkald. De par genotype opkald, der ikke klynge med enten homozygote eller heterozygous massespektre blev sat til "ingen opkald."
Tabel 1: Primer sekvenser bruges til at generere de repræsentative resultater for IL13. Kolonnen navn indeholder SNP ID, den godt nummer (som tidligere nævnt, "godt" antallet refererer til ID'ET for multipleksede analysen), og typen af primer (F fremad, R for bakgear og UEP for forlængelse primer). De næste kolonner indeholder sekvensen af primeren, størrelsen af primeren og typen rensning. Det skal bemærkes, at SPINK5 og en afstamning Informative markører (AIM) panelet var genotypebestemmes ved hjælp af den samme analyse, selv om disse resultater ikke er drøftet med de præsenteres repræsentative resultater. SNPs slutter i _CEU og _CHB henviser til målet SNPs for den nordlige europæere fra Utah og Han-kinesere i Beijin, Kina befolkninger fra 1000 genomer projekt henholdsvis. Venligst klik her for at downloade denne fil.
| Master Mix | Lav Plex (≤26 SNPs) | Høj Plex (> 26 SNP) | |||
| Reagens | Koncentreret i 5 µL | × 1 | × 200 | × 1 | × 200 |
| Vand (deioniseret vand) | 1.9 | 380 | 1.8 | 360 | |
| Buffer | 1 × (2 mM MgCl2) | 0,5 | 100 | 0,5 | 100 |
| MgCl2 | 2 mM | 0,4 | 80 | 0,4 | 80 |
| dNTP'er | 500 ΜM | 0,1 | 20 | 0,1 | 20 |
| Primer mix ** | 100 nM | 1 | 200 ** | 1 | 200 ** |
| Taq-polymerase | 0,5 U / 1 U | 0,1 | 20 | 0,2 | 40 |
| I alt | 4 ΜL | 800 ΜL | 4 ΜL | 800 ΜL | |
| ** allerede fortyndes med deioniseret vand H20 som beskrevet i punkt 2.1.2 | |||||
Tabel 2: reagenser og koncentrationer skal gøre forstærkning PCR primer blandes. Master mix bind gives for 200 reaktioner, fordi 400 (nok til at dække en 384-godt plade) ikke vil passe ind i en 1,5 µL tube og dermed 2 x 200 bør foretages i separate rør. Diskenheder angivet under lav Plex bør anvendes, hvis multipleksede analysen "nå" indeholder mindre end eller lig med 26 SNPs, hvis større end 26 SNPs er godt brug høj Plex diskenheder.
| Thermocycler betingelser |
| 94 ° C i 4 min |
| 45 cyklusser (94 ° C 20 s, 56 ° C 30 s, 72 ° C 1 min) |
| 72 ° C i 3 min |
| 4 ° C hold |
Tabel 3: Thermocycler betingelser for forstærkning PCR.
| Master Mix | × 1 | × 410 |
| Vand (deioniseret vand) | 1,53 | 627.3 |
| 10 × buffer | 0,17 | 69,7 |
| SAP enzym (1,7 U/µL) | 0,3 | 123 |
| I alt | 2 ΜL | 820 ΜL |
Tabel 4: reagenser og koncentrationer for master mix for SAP reaktion. Master mix bind gives for 410 reaktioner til at dække en 384-godt plade med en margen for pipettering fejl.
| Thermocycler betingelser |
| 37 ° C i 40 min. |
| 85 ° C i 5 min |
| 4 ° C hold |
Tabel 5: Thermocycler-betingelserne for SAP reaktion.
| # | Udvidelse primere | Oprindelige bestand koncentration (µM) | Misc. | UEP_ MASSE | Target reaktion koncentration (µM) | EXT Primer Pool koncentration (µM) | Volumen Stock Primer tilføjes til swimmingpool (µL) |
| 1 | rs36110_CHB | 500 | 4359.8 | 0.560 | 5.36 | 16,09 | |
| 2 | rs10488619_CHB | 500 | 4546 | 0.602 | 5.76 | 17.29 | |
| 3 | rs1986420_CEU | 500 | 4761.1 | 0.648 | 6.21 | 18.62 | |
| 4 | rs2934193_CEU | 500 | 4964.3 | 0.690 | 6,61 | 19.82 | |
| 5 | rs4968382_CEU | 500 | 5047.3 | 0,707 | 6,77 | 20.30 | |
| 6 | rs1227647_CEU | 500 | 5136.4 | 0.724 | 6.93 | 20.80 | |
| 7 | rs1402851_CEU | 500 | 5338.5 | 0.763 | 7,30 | 21.91 | |
| 8 | rs4705054 | 500 | 5476.6 | 0.788 | 7,55 | 22.64 | |
| 9 | rs6928827 | 500 | 5678.7 | 0.824 | 7.89 | 23.68 | |
| 10 | rs9325072 | 500 | 5762.8 | 0.839 | 8.03 | 24,10 | |
| 11 | rs4841401_CHB | 500 | 5853.9 | 0.855 | 8.18 | 24.55 | |
| 12 | rs11098964_CHB | 500 | 6052.9 | 0.888 | 8,50 | 25.51 | |
| 13 | rs2416504_CHB | 500 | 6174 | 0.908 | 8.69 | 26.08 | |
| 14 | rs1860933 | 500 | 6264.1 | 0.923 | 8.83 | 26,50 | |
| 15 | rs2193595_CHB | 500 | 6391.2 | 0,943 | 9,03 | 27.08 | |
| 16 | rs1519260_CHB | 500 | 6469.2 | 0.955 | 9.14 | 27.43 | |
| 17 | rs11184898_CHB | 500 | 6588.3 | 0.973 | 9.32 | 27,95 | |
| 18 | rs679832_CEU | 500 | 6757.4 | 0.998 | 9.56 | 28,68 | |
| 19 | rs326626_CEU | 500 | 6765.4 | 1,000 | 9.57 | 28.71 | |
| 20 | rs1612904 | 500 | 6873.5 | 1.015 | 9.72 | 29.17 | |
| 21 | rs862942 | 500 | 6960.5 | 1.028 | 9.84 | 29.53 | |
| 22 | rs2486448_CHB | 500 | 7169.7 | 1.058 | 10.13 | 30.38 | |
| 23 | rs4824001_CEU | 500 | 7341.8 | 1.081 | 10.35 | 31.06 | |
| 24 | rs6552216_CEU | 500 | 7465.9 | 1.098 | 10.51 | 31.54 | |
| 25 | rs1488299_CHB | 500 | 7620 | 1.119 | 10,71 | 32.13 | |
| 26 | rs1347201_CHB | 500 | 7626 | 1.119 | 10.72 | 32.15 | |
| 27 | rs315280_CHB | 500 | 7747 | 1.135 | 10.87 | 32.60 | |
| 28 | rs11203006_CHB | 500 | 7834.1 | 1.146 | 10.97 | 32.92 | |
| 29 | rs4240793_CHB | 500 | 8036.3 | 1.172 | 11.22 | 33.66 | |
| 30 | rs9325071 | 500 | 8219.4 | 1.194 | 11.43 | 34.30 | |
| 31 | rs12678324_CEU | 500 | 8394.5 | 1.215 | 11.64 | 34.91 | |
| 32 | rs4653130_CEU | 500 | 8455.5 | 1.223 | 11,71 | 35.12 | |
| 33 | rs9275596 | 500 | 8537.6 | 1.232 | 11.80 | 35.39 | |
| 34 | rs12595448_CHB | 500 | 8603.6 | 1.240 | 11.87 | 35.62 | |
| Volumen af PCR Grade Rnase gratis H2O at være tilføjet Primer Pool (µL) | 561.78 | ||||||
Tabel 6: godt 1 justerede primere bruges til at generere de repræsentative resultater. En tabel med udvidelse primere justeret efter størrelse, herunder target koncentration, diskenhed i primer pool, og endelig koncentration for hver primer i primer puljen for godt 1. Mængden af vand skal der fyldes op til det endelige rumfang er fastsat i bunden af tabellen. Den samlede mængde af primer pool var 1,5 mL.
| # | Udvidelse primere | Oprindelige bestand koncentration (µM) | Misc. | UEP_ MASSE | Target reaktion koncentration (µM) | EXT Primer Pool koncentration (µM) | Volumen Stock Primer tilføjes til swimmingpool (µL) |
| 1 | rs10515597 | 500 | 4482.9 | 0.588 | 5,63 | 16.89 | |
| 2 | rs2759281_CEU | 500 | 4921.2 | 0.681 | 6,52 | 19.57 | |
| 3 | rs17641748 | 500 | 5080.3 | 0.713 | 6.83 | 20.48 | |
| 4 | rs1698042_CEU | 500 | 5201.4 | 0.737 | 7,05 | 21,16 | |
| 5 | rs5753625_CHB | 500 | 5411.6 | 0.776 | 7.43 | 22.30 | |
| 6 | rs3912537_CEU | 500 | 5811.8 | 0.848 | 8.12 | 24.35 | |
| 7 | rs6141319_CEU | 500 | 5883.8 | 0.860 | 8.23 | 24.70 | |
| 8 | rs1002587_CEU | 500 | 6026.9 | 0.884 | 8.46 | 25.39 | |
| 9 | rs1295686 | 500 | 6172 | 0.908 | 8.69 | 26.07 | |
| 10 | rs16877243_CEU | 500 | 6386.2 | 0,942 | 9.02 | 27.05 | |
| 11 | rs1103811 | 500 | 6595.3 | 0.974 | 9.33 | 27,98 | |
| 12 | rs6510332_CEU | 500 | 6790.4 | 1,003 | 9,61 | 28.82 | |
| 13 | rs6595142_CHB | 500 | 6874.5 | 1.016 | 9.72 | 29.17 | |
| 14 | rs4484738_CEU | 500 | 6966.5 | 1,029 | 9,85 | 29.55 | |
| 15 | rs1432975 | 500 | 7028.6 | 1.038 | 9.94 | 29.81 | |
| 16 | rs10879311_CEU | 500 | 7317.8 | 1.078 | 10.32 | 30.97 | |
| 17 | rs864481 | 500 | 7416.9 | 1.092 | 10.45 | 31.35 | |
| 18 | rs1295687 | 500 | 7447.8 | 1.096 | 10,49 | 31.47 | |
| 19 | rs12644851_CHB | 500 | 7634 | 1.120 | 10,73 | 32.18 | |
| 20 | rs4265409_CHB | 500 | 7926.2 | 1.158 | 11.09 | 33,26 | |
| 21 | rs2927385_CHB | 500 | 7997.2 | 1.167 | 11.17 | 33.52 | |
| 22 | rs1538956_CHB | 500 | 8286.4 | 1.202 | 11.51 | 34.54 | |
| Volumen af PCR Grade Rnase gratis H2O at være tilføjet Primer Pool (µL) | 899.42 | ||||||
Tabel 7: godt 2 justerede primere bruges til at generere repræsentative resultater. En tabel med udvidelse primere justeret efter størrelse, herunder target koncentration, diskenhed i primer pool, og endelig koncentration for hver primer i primer puljen for godt 2. Mængden af vand skal der fyldes op til det endelige rumfang er fastsat i bunden af tabellen. Den samlede mængde af primer pool var 1,5 mL.
| Master Mix | Lav Plex (1-18) | Høj Plex (19-36) | ||
| Reagens | × 1 | × 410 | × 1 | × 410 |
| Vand (deioniseret vand) | 0.7395 | 303.195 | 0,619 | 253.79 |
| Buffer | 0,2 | 82 | 0,2 | 82 |
| Opsigelse mix | 0,1 | 41 | 0,2 | 82 |
| Primer mix (LPA justeret) | 0,94 | 385.4 | 0,94 | 385.4 |
| iPLEX enzym * | 0.0205 | 8.405 | 0.041 | 16.81 |
| I alt | 2 ΜL | 820 ΜL | 2 ΜL | 820 ΜL |
Tabel 8: reagenser og koncentrationer for forlængelse reaktion master mix. I dette tilfælde bør diskenheder for lav-Plex reaktioner anvendes, hvis der er 18 eller færre SNPs i brønden. 19 eller flere SNPs bruge høj Plex reaktioner diskenheder. Dette er anderledes end SNP kravene i lav-plex og høj-plex forstærkning PCR master mix udførligt beskrevet i tabel 2.
| Thermocycler betingelser |
| 94 ° C til 30 s |
| 40 cyklusser (94 ° C 5 s, (5 cyklusser af 52 ° C 5 s, 80 ° C 5 s)) |
| 72 ° C i 3 min |
| 4 ° C hold |
Tabel 9: Thermocycler betingelser for udvidelse reaktion
| Fødevarer allergisk tilfælde vs nonfood-allergiske objekter | |||||
| SNP | A1 | P | ELLER | L95 | U95 |
| rs1295686 | A | 0,003 | 1,75 | 1.2 | 2,53 |
| rs2243297 | A | 0,13 | 2.1 | 0,8 | 5,51 |
| rs1295687 | G | 0,19 | 1.63 | 0,78 | 3.41 |
| rs2243211 | A | 0,22 | 1.45 | 0,8 | 2,64 |
| rs1295683 | T | 0,25 | 1.32 | 0,82 | 2.13 |
| rs2243248 | G | 0,51 | 1.21 | 0,69 | 2.11 |
| rs2243300 | T | 0,51 | 1.19 | 0,7 | 2.02 |
| rs1800925 | T | 0,6 | 1.11 | 0,75 | 1.63 |
| rs3091307 | G | 0,62 | 1.1 | 0,75 | 1,6 |
Tabel 10: Variant rs1295686 af den IL13 locus er forbundet med udfordring-bevist fødevareallergi. Logistisk regressionsanalyse, korrigeret for afstamning, sex og tilstedeværelsen af atopisk eksem, afslørede at variant rs1295686 er forbundet med udfordring bevist fødevareallergi i discovery kohorte (n = 367 sager og 156 ikke-allergiske objekter). SNP kolonne indeholder markører undersøges, kolonnen A1 indeholder den mindre allel, anvendes som reference-allel for association test. Kolonnen Pedersen viser P-værdier fra regressionsanalysen, kolonnen OR viser de tilsvarende odds ratio og L95 og U95 er de øvre og nedre grænser for et 95% konfidensinterval fra analysen. Data gengivet fra Ashely et al., 20179.
| A. replikering analyse: fødevarer allergisk tilfælde vs nonfood-allergiske objekter | B. Meta-analyse-Discovery og replikering | ||||||||||
| SNP | A1 | ELLER | L95 | U95 | P | P | P(R) | ELLER | OR(R) | Q | Jeg |
| rs1295686 | A | 1,37 | 1,03 | mod 1,82 | 0,03 | 0.0005 | 0.0006 | 1.5 | 1.5 | 0.31 | 3,32 |
| rs1295687 | C | 1.1 | 0,68 | 1,78 | 0,7 | 0,3 | 0,3 | 1.24 | 1.24 | 0,38 | 0 |
Tabel 11: Replikering i en uafhængig befolkning bekræfter association mellem IL13 variant rs1295686 og challenge-bevist fødevareallergi. Logistisk regression, korrigeret for afstamning hovedkomponenter, sex og atopisk eksem, i en uafhængig befolkning (n = 203 fødevarer allergisk tilfælde og 330 ikke-allergiske objekter) bekræftede tilknytningen mellem variant rs1295686 og fødevareallergi. Meta-analyse blev derefter gennemført, giver den højeste grad af bevis for en forening mellem SNP og resultatet, med lille tegn på heterogenitet i kraft størrelser mellem de to befolkningsgrupper på denne SNP. Her kolonnerne er ifølge tabel 10, med yderligere P(R) og OR(R) værdier for tilfældige effekter meta-analyse model vs den faste effekter model (P og eller). Q og jeg er P-værdien til Cochrane-test og indeks henholdsvis, begge er foranstaltninger af heterogenitet i effekt størrelser mellem undersøgelserne. Data gengivet fra Ashely et al., 20179.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her viser vi metode til multipleksede genotypebestemmelse ved hjælp af massespektrometri. De repræsentative resultater blev genereret ved hjælp af PCR parret med MALDI-TOF-massespektrometri4 med assay kemi listet i Tabel af materialer13. Med denne platform genereret vi ialt 11,295 genotyper på 1,255 personer for 9 SNPs inden for 40 h i laboratoriet.
Vi illustrerer nytten af teknikken i besvarelsen genetiske hypoteser ved at generere og analysere SNP data for kandidat-gen IL13 i en discovery kliniske kohorte phenotyped for fødevareallergi og med selvstændig replikation. Platformen er relativt robust over for lavere DNA kvalitet og kræver minimal råvare, et input af kun 10 ng. Kritiske trin i protokollen omfatter følgende: omhyggelig fejlfinding af assay designproces at sikre maksimal SNP medtagelse i de multipleksede assays, vellykket forstærkning af destinationsområderne under forstærkning PCR, succesfulde single nukleotid udvidelse under udvidelse reaktion, og indlæsning af den analyse og prøve plade layout i analyse software for at software præcist tildele massespektre data.
Som tidligere nævnt er assay designværktøj kompatibel med brug af mus og kvæg polymorfier, i tillæg til menneske. For andre organismer såsom mikrobe eller plante, kan "andre" vælges i menuen "Organisme". Men de automatiserede trin for at finde proksimale SNPs og identificere optimale primer områder vil ikke være tilgængelige.
Under designprocessen, hvis en proksimal SNP blokerer for identifikation af en optimal primer område, kan man enten fjerne SNP fra design og vælge en anden i høj LD (fx, Rasmussen2 = 1), eller vælge at designe to primere, med referencen allel af SNP og en med alternative allel, eller designe en primer med den almindelige allel, eller maskering SNP med en universel base (f.eks.Inosine). Hvis der er et problem med at identificere et unikt sted for primeren, kan man ændre indstillingerne amplikon længde for at finde et unikt sted. Standardindstillingen er 80-120 bp, men dette kan ændres fra 60-400 bp. Dog skal det bemærkes, at hvis arbejder med forringede DNA (f.eks.fra FFPE væv), det ikke er ideelt at øge amplikon længde.
Fejl under trinnet assay design af værktøjet kan omfatte høj hårnål eller primer dimer potentielle. Begge indstillinger kan lempes for at forsøge en rumme design. Det anbefales dog at tærskler ikke lempes under 0,8; Start med 0,9 at se, hvis denne indstilling er tilstrækkelig til at redde SNPs og reducere til 0,8 kun hvis nødvendigt. I de avancerede indstillinger er det muligt at ændre antallet af design iterationer (op til 10) under fanen Multiplex "4. Designe Assays", samt de bedste iteration udvælgelseskriterier til Højeste gennemsnitlige Multiplex eller Færrest afviser af lav Plex. Øge antallet af design iterationer kan være fordelagtig, fordi værktøjet vil tage den første SNP i den rækkefølge, de blev leveret og vil designe en assay. Derefter tester det hvis den næste SNP er kompatibel med den samme multiplex assay. Således, rækkefølgen af SNPs sagen. Den flere gentagelser indstilling er valgt, vil softwaren randomisere rækkefølgen af SNPs og prøve andre gentagelser. Dette kan øge antallet af SNPs stand skal være konstrueret til hver multiplex eller kan nedsætte antallet af SNP afviser. Det vil dog også komme på en tid, omkostninger, som designværktøjet vil tage meget længere på dette trin.
Multiplex genotypebestemmelse er en hurtig og billig tilgang til undersøgelse af loci af interesse. Metoden er strømlinet og giver mulighed for afvikling af ca 760 prøver af op til 40-plex SNPs i 10 timer, tillader titusinder af genotyper skal genereres i mindre end en dag14. De massespektre kan let analyseres med værktøjer, som platformen.
Nogle begrænsninger at platformen omfatter et anslået tab på 5-10% af SNPs, der mislykkes assay designproces. Dette kan nogle gange rettes ved udvælgelse af en alternativ tag eller proxy SNP. Bred Institut SNP Annotation og Proxy søgning (SNAP) databasen er et sådant værktøj, der letter identifikation af proxy SNPs15. En anden begrænsning af systemet er at det er en målrettet platform og derfor ikke giver mulighed for omfattende roman opdagelse, som opnås med genome-wide tilgange. Desuden, som metoden bruger tag-SNP fuldmagter til at maksimere dækningen på tværs af gener, fine-mapping undersøgelser kan efterfølgende være nødvendigt at fastslå den præcise kausale variant.
Multiplex genotypebestemmelse er stadig en nyttig platform for afhøring af sygdom forbundet SNPs identificeret i GWA undersøgelse tilgange eller hypotese drevet kandidat og vej gen udforskning. Fremtidige ansøgninger om platform forventes at være nye anvendelser for diagnostik og screening i områder som kræft og kliniske virologi. Samlet er multipleksede genotypebestemmelse med massespektrometri en hurtig, omkostningseffektiv og pålidelig medium-overførselshastighed metode til genotypebestemmelse kandidat loci.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Forfatterne har ingen anerkendelser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Genomic DNA | - | - | 1 μL at a concentration of 5-10 ng/μL |
| Primers: forward and reverse amplification and extension | IDT | - | see manuscript section 1.2.1 on design of primers |
| Deionized water | E.g. Milli-Q water | - | deionized with 18.2 MΩ.cm resistivity |
| Genotyping reagent kit. iPLEX Gold Chemistry reagent set | Agena Bioscience | #10148-2 | includes all reagents for reactions in 2.2.1, 2.3.1 and 2.4.2 , chip and resin |
| PCR plates (384-well) | Abgene | #ABGAB-1384 | For the MassARRAY system plates by Abgene are compatible |
| Micropipettes | single and 8-channel | ||
| Centrifuge | compatible with 384-well plates | ||
| Thermocycler | compatible with PCR programs as detailed in 2.2.4, 2.3.2 and 2.4.3 | ||
| Dimple resin plate | Agena Bioscience | 6mg, 384-well | |
| Plate rotator | |||
| MassARRAY Analyzer 4 System | Agena Biosciences | MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption/ionization – time of flight) Mass Spectrometer. | |
| RS1000 Nanodispenser | Agena Biosciences | ||
| Assay Design Suite | Agena Biosciences | Tool used to design the multiplex genotyping assays | |
| Hot Start Taq | DNA polymerase enzyme | ||
| Resin | Agena Biosciences | Supplied with iPLEX kit |
References
- Aronson, S. J., Rehm, H. L. Building the foundation for genomics in precision medicine. Nature. 526 (7573), 336-342 (2015).
- Ball, R. D. Designing a GWAS: power, sample size, and data structure. Genome-Wide Association Studies and Genomic Prediction. , 37-98 (2013).
- Kwon, J. M., Goate, A. M.
- Oeth, P., Mistro, G. D., Marnellos, G., Shi, T., van den Boom, D. Qualitative and quantitative genotyping using single base primer extension coupled with matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MassARRAY). Single Nucleotide Polymorphisms: Methods and Protocols. , 307-343 (2009).
- Pusch, W., Kostrzewa, M. Application of MALDI-TOF mass spectrometry in screening and diagnostic research. Current pharmaceutical design. 11 (20), 2577-2591 (2005).
- Su, K. Y., et al. Pretreatment epidermal growth factor receptor (EGFR) T790M mutation predicts shorter EGFR tyrosine kinase inhibitor response duration in patients with non-small-cell lung cancer. Journal of clinical oncology. 30 (4), 433-440 (2012).
- Singhal, N., Kumar, M., Kanaujia, P. K., Virdi, J. S. MALDI-TOF mass spectrometry: an emerging technology for microbial identification and diagnosis. Frontiers in microbiology. 6, 791 (2015).
- Cricca, M., et al. High-throughput genotyping of high-risk Human Papillomavirus by MALDI-TOF Mass Spectrometry-based method. New Microbiologica. 38 (2), 211-223 (2015).
- Ashley, S., et al. Genetic Variation at the Th2 Immune Gene IL13 is Associated with IgE-mediated Paediatric Food Allergy. Clinical & Experimental Allergy. 47 (8), 1032-1037 (2017).
- Bousman, C. A., et al. Effects of NRG1 and DAOA genetic variation on transition to psychosis in individuals at ultra-high risk for psychosis. Translational psychiatry. 3 (4), e251 (2013).
- Moffatt, M. F., et al. A large-scale, consortium-based genomewide association study of asthma. New England Journal of Medicine. 363 (13), 1211-1221 (2010).
- Granada, M., et al. A genome-wide association study of plasma total IgE concentrations in the Framingham Heart Study. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 129 (3), 840-845 (2012).
- Oeth, P., et al. iPLEX assay: Increased plexing efficiency and flexibility for MassARRAY system through single base primer extension with mass-modified terminators. Sequenom application note. 27, (2005).
- Ellis, J. A., Ong, B. The MassARRAY System for Targeted SNP Genotyping. Genotyping: Methods and Protocols. , 77-94 (2017).
- Johnson, A. D., et al. SNAP: A web-based tool for identification and annotation of proxy SNPs using HapMap. Bioinformatics. 24 (24), 2938-2939 (2008).
