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방법 논문

인간 지방 Microphysiologic 플랫폼: 백색 지방 조직에 끼여

6.1K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/57909

⸱

2018년 8월 15일

 ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, Louisiana State University Health Sciences Center, 2Department of Surgery, Louisiana State University Health Sciences Center

이 논문에서

요약

흰색 adipose 조직 (WAT) 약물 개발 및 대사 연구를 방해, 그것의 현재 기본 문화 모델에 중요 한 결함을 있다. 여기, 선물이 stromal 세포 시트 사이 붙여 와트에 의해 많은 microphysiological 시스템을 생산 하는 프로토콜. 이 구조는 기본 와트 문화에 대 한 안정적이 고 융통성 있는 플랫폼을 제공합니다.

초록

흰색 adipose 조직 (WAT)은 무게와 매일 건강을 조절에 중요 한 역할을 한다. 아직도, 모두 충실 하 게 정리 지방 microenvironment 또는 2 주 이상 와트 생존을 연장 하지 사용할 수 있는 기본 문화 모델에 상당한 한계가 있다. 신뢰할 수 있는 주 문화 모델의 부족은 심각 하 게 와트 대사 및 약물 개발에 연구를 방해 한다. 이 위해 우리 와트 주 문화 라는 'SWAT' (샌드위치 백색 지방 조직)에 대 한 새로운 플랫폼을 개발 하는 microphysiologic 시스템의 NIH의 표준 활용 있다. 우리는 지방이 많은 파생 된 stromal 세포 시트 사이 다진된 와트 클러스터 사이 여 adipocytes의 자연 력 극복. 이 구문에서 와트 샘플 가능한 이상 8 주 문화에 있다. 스와트 유지 그대로 ECM, 셀 연락처 및 물리적 압력 조건의 vivo에서 와트; 또한, 기동 강력한 transcriptional 프로필, 외 인 화학 신호 및 전체 조직 기능에 감도 유지 합니다. SWAT의 주 지방 문화, 재현성, 간단 하 고 효과적인 메서드를 나타냅니다. 잠재적으로, 그것은 와트 생리학, 병 태 생리학, 물질 대사, 및 제약 개발 연구에 대 한 광범위 하 게 적용 가능한 플랫폼입니다.

서론

지방 조직 미국1$147 십억 $210 십억 사이 연간 직접 의료 비용 운반 비만의 주 기관 이다. 지방이 많은 직물의 축적은 또한 심장 질환, 2 형 당뇨병, 그리고 특정 유형의 암2등 죽음의 다른 주요 원인에 기여. 생체 외에서 문화 모델 대사 연구와 신약 개발을 위해 필수적입니다 하지만 지방이 많은 직물의 현재 연구 모델 주요 결함. Adipocytes, 부 력, 그리고 말기 분화 세포를 세포 문화 플라스틱에 고착 하지 않을 것 이다 따라서 기존의 셀 문화 방법을 사용 하 여 경작 될 수 없습니다. 1970 년대 이후, 여러 가지 방법이 사용 되었습니다 시도에서 유리 coverslips, 천장, 현 탁 액 문화, 문화와 세포 외 매트릭스3,,45, 의 사용을 포함 하 여 이러한 장벽을 극복 하기 위해 6 , 그러나 7., 이러한 방법은 세포 죽음과 dedifferentiation, 의해 표시 된 하 고 그들은 2 주 연구 기간 보다 더 일반적으로 사용 됩니다. 또한,이 모델을 시도 하지 않는다 그들은 그대로 ECM을 유지 하지 않는, adipocytes 사이 고 stromal 상호 작용 지원 셀도 수축 힘 셀에 에서 vivo에서 발휘로 네이티브 지방 microenvironment 정리 와트.

골드 표준 기본 지방 문화 방법의 부재, 지방 연구는 차별화 된 사전 adipocytes (diffAds)에 주로 의존 했다. DiffAds multilocular, 부착, 그리고 metabolically 활성 있습니다. 대조적으로, 기본 흰색 adipocytes 단원제의 nonadherent, 그리고 상대적으로 낮은 신진 대사를 보여 줍니다. 건강 한 성숙 지방 조직 생리학 정리 현재 지방 문화 모델의 실패 가능성이 FDA 승인 약품을 직접 대상으로 adipocytes의 부재에 주요 요인입니다. 사실, 기관 모델 physiologic 생체 외에서 부족 대부분 장기 및 질병에서 중요 한 문제입니다.

Microphysiological 시스템 (MPS) 프로그램의 생성을 발표의 위치 종이, 국립 보건원 (NIH) 모든 인간의 제약 임상 시험 통해 2013 성공률은만 18 단계 II에 대 한 %와 50% 단계 III에 대 한 보고 임상 시험8. MPS 프로그램은 직접 모델 인간의 생리를 생체 외에서 monoculture의 무 능력을 해결 하기 위해 설계 되었습니다. NIH 문화 시스템 인간의 기본 또는 기관 기능 정리 다세포 3D 구문에서 줄기 세포의 구성으로 MPSs를 정의 합니다. 균질, 불멸 하 게 한 세포 배양의 reductionist 모델과 달리 MPSs-셀, 마약 셀, 약물-약물, 및 장기 약물 상호 작용9모델 정확 하 게 한다. 단기 주 문화 메서드와 달리 NIH 기준 MPS 지속 문화8에서 4 주 이상 지정합니다. MPS 프로그램의 자세한 내용은 NIH의 댓글은 (#RFA-엉-18-001)10에서 찾을 수 있습니다.

우리 간단 하 게, 소설, 적응력, 개발 하 고 저렴 한 지방 의원 "백색 지방 조직에 끼여" 되 나 (기동)11. 우리는 지방이 많은 파생 된 stromal 세포 (줄기) (그림 1) 시트 사이 "붙여" 다진된 기본 지방 조직으로 adipocytes의 자연 력 극복. 결과 3D 구조 셀 연락처 및 네이티브 지방 microenvironment 자연 체형 지원 세포 인구를 가진 성숙한 adipocytes 주변으로. 스와트 8 주 생존, exogenous 신호, adipokine 분 비, 및 동물 모델로 engraftment 응답으로 검증 되었습니다.

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프로토콜

LSUHSC-NO. IRB 사무실에 의해 승인 된 프로토콜 #8759 #9189, 준수 모든 작업 수행 했다 모든 동물 작품 프로토콜 #3285 IACUC 사무실 LSUHSC-호에 의해 승인 준수에서 수행 되었다

1. 셀 시트 끼우기의 시드

참고: 그림 1을 참조 하십시오.

  1. 씨 줄기 조직 문화 접시 (6 cm 또는 6 잘 플레이트)에 약 80 %confluency. 스와트 원하는 각 잘 잘 1 기존의 조직 문화 및 조직 문화 poly(N-isopropylacrylamide (pNIPAAm) 코팅 플라스틱 접시에 해당 크기의 1 잘 씨앗.
    참고: 따라, 스와트 6 잘 플레이트 필요 합니다 한 6-잘 표준 조직 배양 플레이트 (기본 레이어)에 셀과 하나의 조직 문화 6-잘 pNIPAAm 코팅 접시 (상위 계층) 시드. pNIPAAm 코팅 접시 상업적으로 구입하실 수 있습니다 또는 실험실에서12,,1314를 생산.
  2. 37 ° C, 5% CO2 에 Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM) 10 보충에서 줄기를 유지 하 고 1 %FBS 페니실린/스. x 미디어 매 2 일 변경.
  3. 때까지 그들은 100% 합칠 되 고 전기 패턴 (약 6-8 일)에 합체를 셀 수 있습니다.
    참고: 이러한 셀 부 력 지방 조직 안정화 위해 단일 그대로 셀 시트 작동 해야 합니다. 충분 confluent 셀 와트와 시드 시 조각화 됩니다.

2입니다. 기동 장치의 준비

  1. 준비 몇 10 mL aliquots의 1 x 행 크의 균형 소금 솔루션 (HBSS); 여분의 볼륨 번호판의 원하는 수 만큼 준비 합니다.
  2. 스와트 시드에 플런저 장치를 준비 합니다. 줄기는 둥근 디스크에 연결 된로 구성 된 간단한 아크릴 플라스틱을 사용 하 여 플런저를 생성 합니다. 그것은 조직 문화 우물의 둘레에 맞는지 확인 (직경: < 6 cm 접시, 6 cm < 6 잘 플레이트에 대 한 3.5 c m, 대략적인 질량: 6 cm 접시, 6 잘 플레이트에 대 한 5.1 g 6.7 g).
    1. 프로시저 실행 것을 원활 하 게 경우에 어떤 개별 플런저와 함께 문제가 되도록 추가 plungers를 준비 합니다.
    2. 플런저 디스크의 가장자리 주위 랩 테이프 감아 젤라틴 솔루션의 누설을 방지 하기 위해 적어도 2 배.
    3. 스프레이 biosafety 내각 (BSC) 70 %EtOH. 스프레이로 빈, 세척제 15 mL 원뿔 튜브; BSC 내부 15 mL 원뿔 튜브 랙 튜브는 젤라틴 plungers의 위치를 확보 하는 데 도움이 됩니다.
    4. 스프레이 각 테이프 포장 플런저 철저 하 게 70 %EtOH 장소 선반에 15 mL 원뿔 튜브로. 금속 와셔 (대략적인 질량 6.3 g)를 살포 하 고 한 쌍의 갈고리 집게; 함께 선반에 그들을 두십시오 와셔 기동 시드 중는 plungers에 무게를 추가 합니다.
    5. BSC 창틀 닫고 UV 빛 건조 및 살 균을 설정 합니다.
      참고: 이상적으로, 기동 뿌리기 전에 24 h이이 단계를 수행 합니다. 또는, 과정 조직 컬렉션/기동 시드; 요일에 실시 그러나,이 경우에, UV 건조/살 균에 대 한 15-45 분 수 있습니다.

3. 젤라틴 Plungers 준비-상단 셀 시트 응용 프로그램

  1. 75 ° c 물 목욕을 열
  2. 1 x HBSS의 10 mL 재고 젤라틴 분말의 0.75 g을 추가 하 여 젤라틴 솔루션을 준비 합니다. 증기 두건에서 1 M NaOH 솔루션의 산도 균형의 100 µ L를 추가 합니다.
    1. 물 목욕을 10 mL 주식을 추가 하 고 분말 솔루션으로 해소 될 때까지 5 분에 적극적으로 악수. 가루 젤라틴 온수 물 목욕에 추가 후 곧 해산을 목표로 합니다.
    2. BSC 송풍기, UV 빛 해제 켜고 틀 마련. BSC 표면 스프레이 공급 (5 mL luer 잠금 주사기와 0.2 µ m 주사기 필터) 필터를 준비. 효율적으로 변형 적용할 plungers 젤라틴의 충분 한 볼륨에 여러 개의 필터를 준비 합니다.
  3. 젤라틴 솔루션 도달할 때 동질적인 일관성, 필터링 솔루션을는 plungers에 적용 됩니다. 젤라틴으로 주사기를 로드 합니다. (6-잘 접시 ~2.5 mL, 6 cm 요리에 대 한 ~4.5 mL) 주사기 필터를 통해 플라스틱 plungers를 젤라틴을 적용 하 고 (~ 20 분)을 강화 하기 위해 허용.
  4. 젤라틴은 고체, 일단은 plungers의 가장자리에서 테이프를 풀 다. 갈고리 집게와 플런저의 외부 가장자리에서 젤라틴을 제거 (즉, 초승달 모양의 제기 가장자리). 플런저의 센터에 남아 있는 젤라틴 완전히 수준 인지 확인 ADSC 시트와 접촉을 최대화 하기 위해.
  5. 일단 초과 젤라틴을 제거 하 고, 부드럽게 ADSC pNIPAAm 코팅 판 젤라틴 plungers 적용 됩니다. 금속 와셔를 사용 하 여 플런저를 누르다. plungers를 적용 하는 동안 셀 시트를 전단 하지 마십시오.
  6. 실 온에서 1.5 h에 대 한 셀 시트에는 plungers를 둡니다. 접시/plungers pNIPAAm 코팅 판 표면에서 셀 시트의 분리를 완료 하는 데 1.5 h에 대 한 얼음 물 목욕에서 품 어.
    1. 얼음 목욕; 잠복기 동안 주의 인큐베이션 기간 동안 셀 미디어 오염 얼음 목욕을 허용 하지 않습니다.
    2. 부 화 완료 후 비 살 균 물 제거 pNIPAAm 코팅 접시의 바닥을 청소.

4. 백색 지방 조직 처리

  1. 수술 실에서 인간 지방 조직 때, 기동 시드할 수 때까지 얼음에 있는 무 균 용기에 모든 샘플을 계속. 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS), 등의 살 균 유지 보수 미디어 조직 안정성에 대 한 지방 조직 컨테이너를 추가 합니다.
  2. 추가 될 각 잘/요리 1.5 mL microcentrifuge 관에 찬 세포 배양 시드 (6-잘 접시 100 µ L, 6 cm 요리 200 µ L).
  3. 지방이 많은 직물을 말하다.
    1. 단단한 지방 조직 세그먼트에 대 한 다음과 같은 할.
      1. 지방이 많은 직물 3의 큰 세그먼트를 세척 살 균 PBS에 x 제거 가능한 많은 PBS.
      2. 개의 집게와 면도기 살 균 티슈를 말하다 고 많은 맥 관 구조 및 가능한 근 막 제거 (자세한 내용 참조).
      3. 잘게 다진된 조직 두께, 액체 일관성에 때까지 면도칼으로 지방을 말하다.
        참고: 이상적으로 조직이 나타납니다 와트의 없음 표시 개별 세그먼트와 동질적인이 항상 가능한.
    2. Lipoaspirate를 다음과 같이 처리 합니다.
      1. BSC에서 비 커, 위에 멸 균 거 즈 테이프 하 고 모든 초과 액체를 수집 하는 큰 비 커에이 비이 커를 배치 합니다.
      2. 25 mL 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여, 필요에 따라 많은 lipoaspirate 그리고 멸 균 거 즈의 표면에 그것을 적용. Lipoaspirated 지방 질을 세척 하 고 과잉 혈액 및 지질 잔류물 제거 하이 표면에 직접 PBS를 적용 합니다.
      3. 집게를 사용 하 여 물기 조직 복구, 살 균 고기 저 미 표면에 그것을 전송 하 고는 lipoaspirate를 말하다.
  4. 살 균 면도기를 사용 하 여 전송 다진된 조직; p1000 피 펫 팁의 선단부를 잘라 이 체형 lysis로 이어질 수 있는 전단 응력을 최소화 합니다. 일단 적절 한 조직의 일관성 (300-400 µ L 6-잘 접시, 6 cm 접시 500-600 µ L) 각 1.5 mL 튜브에 다진 조직의 원하는 볼륨을 전송. 다진 와트와 튜브에 짧게 미디어 믹스.
  5. 기본 ADSC 격판덮개를가지고 고 가만히 따르다 aspirate 미디어. 각 1.5 mL 튜브에서 와트/미디어 혼합물에 미디어를 바꿉니다.
    1. 부드럽게 pNIPAAm 코팅 접시에서 젤라틴 plungers를 제거 하 고 기본 ADSC 접시에 와트 혼합물에 적용. 세포질 분리 확인 현미경 pNIPAAm 코팅 접시의 단층을 검사 합니다.
  6. BSC에서 약 37-40 ° C에 열 블록을 설정 합니다. 장소에 아직도 plungers, 번호판 열 블록의 표면에 이동. 셀을 품 어 젤라틴 용 해 촉진을 따뜻하게 문화 미디어의 2-3 mL를 추가 합니다.
  7. ~ 30 분 후 부드럽게 플레이트 표면에서는 plungers를 제거 합니다. 기본 조직 문화 접시의 뚜껑을 대체 하 고 셀 문화 인큐베이터로 이동. 젤라틴은 37 ° C에서 완전 하 게 액 화, 일단 발음 하 고 세포 배양을 바꿉니다.
  8. 37 ° C, 5% CO2 에 7 µ M 인슐린, 30 µ M dexamethasone, 1 x 페 놀 레드 무료 M199 매체에 유지 하는 기동 페니실린/스. 약 2 mL 미디어 6 잘 플레이트 및 6 cm 요리 3 mL에에서 유지 합니다. 미디어 매 2 일 변경.

5. 기동 수확

  1. 콜라 (0.5 mg/mL 콜라, PBS에 500 nM 아데노신) 준비 15 mL 원뿔 튜브 (10 mL의 대략적인 볼륨)에서 aliquots. 튜브를 고정 하 고-20 ° c.에서 그들을 저장합니다
  2. 셀에서 모든 문화 매체를 발음, PBS, 1 x를 세척 하 고 PBS 발음. 37 ° C 물 욕조에 녹고에 의해 콜라 aliquots를 준비.
    참고: 이상적으로, 콜라 솔루션 도달 37 ° C; 즉시 그 후, 조직을 추가 합니다.
  3. 스와트 접시에서 개별 aliquots 모든 조직을 추가 합니다. 스와트 멸 균 셀 scrapper를 사용 하 여 수확 하 고 잘라 p1000 피 펫 팁 콜라 aliquots에 전송. 조직 콜라 솔루션을 포함 하는 15 mL 원뿔 튜브에 직접 추가 합니다.
    1. 또는, 50 mL 원뿔 튜브; 조직/콜라 혼합물을 품 어 증가 된 노출 영역 추가 효소 소화를 촉진 한다.
  4. 45 ° 각도로 incubated 궤도 셰이 커에 샘플 튜브를 배치 합니다. 30-60 분 동안 37 ° C에서 200 rpm에서 품 어.
  5. 장소는 250 µ m 컬렉션에 대 한 새로운 15 mL 원뿔 튜브로 필터 메쉬. 필터를 통해 소화 체형 솔루션을 붓는 다.
    참고:이 섬유 조직에 밖으로 필터링 하는 동안 통과 하는 모든 셀을 허용할 것 이다.
  6. 단계 분리 수 있도록 실 온에서 5 분 동안 앉아 통해 흐름 수 있습니다.
    참고:는 adipocytes 됩니다 플 로트 솔루션의 상단에 지방 stromal 세포 (ASCs) 낮은 단계에 정착 하는 동안. 500 x g 에 5 분 동안 원심 분리 세포 분리 또는 펠 릿에 줄기를 둘러싼 수확에도 극대화할 수 있습니다.
  7. 컷오프 p1000 피 펫 팁을 사용 하 여, 1.5 mL microcentrifuge 컬렉션 튜브 adipocytes (콜라 솔루션의 상단에 떠 있는 레이어) 전송. 한 번에 ~ 250 µ L를 복용, 플라스틱 튜브를 수집 하는 adipocytes의 가장자리를 따라 천천히.
    1. 셀 내부에 준수의 복구를 최대화 하기 위해 adipocytes 수집 하면서 튜브를 천천히 회전 합니다. 1.5 mL microcentrifuge 튜브 전체 때까지 더 많은 셀을 그리기 유지.
  8. 바늘 (~ 21 G)에 부착 된 주사기를 사용 하 여 격리 adipocytes에서 과잉 액체를 제거 합니다. 부동 체형 레이어에서 바늘 잠수함 짧게 준수 니 들 축 하 셀을 꺼내 려 니 들 선동 하 상단에 떠 빠질된 adipocytes에 대 한 기다립니다.
  9. 천천히 adipocytes의 의도 하지 않은 제거 되지 않도록 주의 하면서 초과 액체를 그립니다. Microcentrifuge 튜브 졸업식 지속적으로 샘플 볼륨을 사용 하 여 (예:. 0.1 mL 각 샘플에 대 한)입니다.
  10. 격리 된 셀을 사용 하 여 DNA/RNA 추출, 포도 당 통풍 관 분석 결과, 분석 결과 lipolysis, 등

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결과

SWAT의 처음 개별 와트 클러스터의 직렬 명시 화상 진 찰에 의해 평가 되었다 (n = 12) 약 7.6 주 동안. 클러스터에이 시간에 걸쳐 단층에 보안 남아 있었다. 약간의 형태학 상 변화는 개별 adipocytes 약간 휘게 하거나 위치 이동으로 관찰 되었다. 그러나, adipocytes도 될 multilocular 시간이 지남에 dedifferentiation의 부족을 나타내는 그들은 셀룰러 blebbing, 세포, 또는 조각화 (그림 2)와 같은 세포 죽음의 가능한 증상을 전시 했 어. 클러스터의 체형 id 2 주 오래 된 지질 얼룩 나 일 빨강 (NR)과 특수 기동 대에 확인 되었다. 이들은 실제로 그대로 막 보다는 유물, cysts, 또는 죽은 adipocytes adipocytes 표시 분명 NR 단원제의 체형 클러스터의 얼룩. NR 주변 ADSC 시트에 얼룩의 부재는 이러한 셀 하지 지질 축적 하 고 ...

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토론

이 프로토콜 세부 샌드위치 인간의 흰색 adipose 조직; 줄기를 사용 하 여 인간의 ADSC 셀 라인 잘 설립 프로토콜15를 통해 격리 된 수 있습니다. 그러나, 시스템 (3T3L-1 셀 샌드위치 마우스 와트를 사용 하 여) 등 개별된 연구 요구 사항에 맞게 수 있습니다. 이 프로세스는 기본 인간의 조직 처리 해야 합니다. 표준 안전 예방 조치를 고용 한다; 인간의 조직 BSL-2 병원 체 (예: HIV, HepC)로 처리 합니다. 만 조직 BSC에서 직접 처리 합니다. 기관 안전 표준에 의해 규정으로 모든 적절 한 보호구를 착용-이중 장갑 사용 하지 않는 것이 좋습니다. 제대로 모든 공급을 소독 하 고 폐기물 10% 표 백제 솔루션 또는 70% 에탄올 솔루션 재사용 하거나 처분 하기 전에.

스와트 문화에서 중요 한 첫걸음 조달 이며 pNIPAAm 코팅 조직 배양 배지를 유지. 이러한 플레이트 상업적으로 사용할 수 있...

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

저자는 프로젝트 자금 LSU 건강 과학 센터에 의해 제공 하는 제도적 지원 인정 하 고 싶습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
10x HBSS써모피셔14185052
젤라틴시그마-알드리치G9391
콜라겐분해효소시그마-알드리치C5138
아데노신시그마-알드리치A9251
DMEM써모피셔11995065
M199 미디어써모피셔11043023페놀 무함유 
250 &마이크로; m 메쉬 필터피어싱87791
0.2 &마이크로; m 주사기 필터Celltreat229747
5 mL Luer-Lok 주사기 BD309646
금속 와셔이것은 간단한 금속 와셔이며 모든 철물점에서 구입할 수 있습니다. 그들은 단순히 세포와 젤라틴 사이의 균일한 접촉을 보장하기 위해 플러그의 뒷면에 leight 무게를 추가하면서 재고 및 살균이 용이합니다. 대략적인 질량 : 6.3 g 
NameCompany카탈로그 번호Comments
Heated Equipment
Incubated Orbital ShakerVWR 10020-988샘플은 콜라겐 분해 효소 분해를 촉진하기 위해 45도 각도로 투구해야 합니다.
블록37-40으로 설정 ° C 및 Biosafety Cabinet
Water Bath~ 75 °로 설정합니다. C
NameCompany카탈로그 번호Comments
Specialized Plastics
Upcell Dishes 6cm of 6-multiwellNunc174902  또는 174901이들은 ADSC의 상부 시트를 성장시키는 데 사용할 수 있는 상업적으로 이용 가능한 pNIPAAm 코팅 접시입니다. 또는 pNIPAAm 코팅 플레이트를 실험실에서 생산할 수 있습니다. 지름: < 6cm 용 6cm 접시, < 6웰 플레이트의 경우 3.5cm; 대략적인 질량 : 6cm 접시의 경우 6.7g, 6 웰 플레이트의 경우 5.1g
플라스틱 플런저 장치이들은 원하는 pNIPAAm 코팅 플라스틱 (멀티 웰 플레이트, 페트리 접시)에 맞게 만들 수 있습니다. 그들은 원형 디스크에 부착 된 간단한 줄기로 구성됩니다. 실험실에서 생산하거나 아크릴 플라스틱을 만들 수 있는 모든 시설에서 생산할 수 있습니다
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참고문헌

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  17. Fried, S. K., Russell, C. D., Grauso, N. L., Brolin, R. E. Lipoprotein lipase regulation by insulin and glucocorticoid in subcutaneous and omental adipose tissues of obese women and men. Journal of Clinical Investigation. 92 (5), 2191-2198 (1993).
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