Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Behavior
Click here for the English version

Behavior

פלטפורמה Microphysiologic שומן אנושי: דחוקה שומן לבן

Published: August 15, 2018 doi: 10.3791/57909
Automatic Translation
1, 2, 2, 2
1Department of Pharmacology, Louisiana State University Health Sciences Center, 2Department of Surgery, Louisiana State University Health Sciences Center

Summary

שומן לבן (וואט) יש ליקויים קריטי הדגמים תרבות הראשי הנוכחי שלה, הפרעה מטבולית מחקרים ופיתוח תרופתי. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לייצר מערכת microphysiological אדיפוז מאת וואט sandwiching בין גליונות של תאי סטרומה. מבנה זה מספק פלטפורמה יציבה וניתנת להתאמה לתרבות וואט העיקרי.

Abstract

שומן לבן (וואט) ממלא תפקיד חשוב בוויסות משקל ובריאות כל יום. עדיין, ישנם מגבלות משמעותיות דגמי התרבות העיקריים הזמינים, אשר כולם נכשלו בנאמנות לסכם את microenvironment אדיפוז או להרחיב את הכדאיות וואט מעבר שבועיים. העדר מודל אמין תרבות ראשי פוגעת קשות במחקר וואט חילוף החומרים, פיתוח תרופות. למטרה זו אנו מסויימת סטנדרטים של NIH של מערכת microphysiologic לפתח פלטפורמה חדשנית לתרבות העיקרי וואט בשם 'ימ מ' (דחוקה שומן לבן). לנו להתגבר על ציפה טבעית של adipocytes על ידי sandwiching טחון אשכולות וואט בין גליונות של שומן-derived תאי סטרומה. את המבנה הזה, הם דוגמאות וואט קיימא מעל שמונה שבועות בתרבות. הימ מ מקיים את ECM ללא פגע, מתא לתא אנשי לחצים פיזיים של ויוו תנאים וואט; בנוסף, הימ מ מתחזקת פרופיל תעתיק עמיד, רגישות איתות כימי אקסוגני, תפקוד הרקמות שלם. הימ מ מייצג שיטה פשוטה, לשחזור ויעיל של תרבות אדיפוז העיקרי. פוטנציאל זה פלטפורמה ישים בקנה מידה נרחב לחקר וואט פיזיולוגיה, פתופיזיולוגיה, חילוף החומרים ופיתוח תרופות.

Introduction

רקמת שומן הוא האיבר הראשי של השמנת יתר, אשר נושאת הוצאות רפואיות שנתיות ישיר בין 147 מיליארד דולר ל- 210 מיליארד דולר ארה ב1. ההצטברות של רקמת שומן תורם גם גורמים נוספים המובילים למוות כגון מחלות לב, מסוכרת מסוג II, סוגים מסוימים של סרטן2. In vitro לקשרי תרבות מודלים הם חיוניים עבור מחקרים מטבולית, פיתוח תרופות, אבל המחקר הנוכחי, דגמי רקמת שומן יש ליקויים עיקריים. Adipocytes עדין, קליל, סופני הבדיל תאים לא דוגלים תא תרבות פלסטיק, ותרבותית ולכן לא יכול להיות בשיטות תרבות תא קונבנציונלי. מאז שנות השבעים, מספר שיטות השתמשו בתיבה נסיונות כדי להתגבר על מחסומים אלה, לרבות השימוש coverslips זכוכית דקה, התקרה תרבות, תרבות השעיה ו מטריצה חוץ-תאית3,4,5, 6 , 7. עם זאת, שיטות אלה סומנו על ידי מוות של תאים dedifferentiation, הם משמשים בדרך כלל לא יותר מאשר תקופת לימודים שבועיים. יתר על כן, מודלים אלה אל תנסה לסכם את microenvironment אדיפוז מקורי כפי שהם לא לשמור על ECM ללא פגע את, לתמוך האינטראקציות בין adipocytes לבין סטרומה תאים, ולא התאים כוחות כויץ להפעיל אחד על השני ב ויוו וואט.

בהיעדר שיטת תרבות אדיפוז העיקרי תקן הזהב, מחקר אדיפוז הסתמכה בעיקר על הבדיל טרום adipocytes (diffAds). DiffAds הם multilocular, חסיד, ועל פעילות סמויה. לעומת זאת, ראשי adipocytes לבן הן unilocular, nonadherent, להדגים מטבוליזם נמוך יחסית. הכישלון של המודלים הנוכחיים של אדיפוז התרבות רוצה להתרכז הפיזיולוגיה של רקמת שומן בוגרת בריאה הוא כנראה גורם מרכזי בהיעדרו של תרופות שאושרו על-ידי ה-FDA שכוונו ישירות adipocytes. למעשה, חוסר הפיזיולוגיות במבחנה איברים מודלים היא בעיה רצינית על פני רוב האיברים ומחלות.

בנייר העמדה שלו מכריזים על הקמתה של תכנית Microphysiological מערכות (MPS) שלה, במכון הלאומי של בריאות (NIH) דיווחו כי שיעור ההצלחה 2013 על פני כל ניסויים קליניים בבני התרופות רק 18% עבור שלב II ו 50% עבור שלב III ניסויים קליניים8. התוכנית MPS מיועד לפנות ישירות היא חוסר מונוקולטורה במבחנה על הפיזיולוגיה האנושית מודל. NIH מגדירה MPSs מערכות התרבות המורכב ראשית אנושי או בתאי גזע multicellular מבנים תלת-ממד זה מסכם את הדברים תפקוד איברים. בניגוד רדיוקציוניסטי מודלים של תרבויות הומוגניות, מונצחים תא, MPSs צריך באופן מדויק תאים תאים, סמים-תא, -תרופתיים ו עוגב תרופתיים אינטראקציות9. שלא כמו שיטות התרבות העיקרי לטווח קצר, תקנים NIH להכתיב MPS קיימות מעל 4 שבועות ב תרבות8. ניתן למצוא פרטים נוספים על התוכנית MPS של NIH RFAs (#RFA-TR-18-001)10.

פיתחנו פשוטה, רומן, יכולת הסתגלות, חברי הפרלמנט אדיפוז זול כינה "דחוקה שומן לבן" (ימ מ)11. לנו להתגבר על ציפה טבעית של adipocytes על ידי "sandwiching" טחון העיקרי רקמת שומן בין גליונות של שומן-derived סטרומה תאים (ADSCs) (איור 1). הבונה 3D שנוצר recapitulates הקשר תא-תא, microenvironment של אדיפוז מקורי על-ידי תחימת adipocytes בוגרת עם אוכלוסיה תא תמיכה adipocyte טבעי. הימ מ אומתה על ידי הפגנת 8 שבועות הכדאיות, תגובה ל אקסוגניים איתות, הפרשת adipokine ו- engraftment לתוך במודל חיה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הפעילויות בוצעו המותרים של פרוטוקולים #8759, #9189, כפי שאושרו על-ידי Office IRB של LSUHSC-NO. כל בעלי החיים העבודה בוצעה ב ההקפדה פרוטוקול 3285 # שאושרו על-ידי המשרד IACUC ב LSUHSC-. לא-

1. זריעה של Sandwiching תא גליונות

הערה: ראה איור 1.

  1. ADSCs זרע אצל כ 80% confluency ב צלחות תרביות רקמה (6 ס"מ או ובכן 6 צלחות). עבור כל טוב של הימ מ הרצוי, זרע 1 תרביות רקמה קונבנציונלי טוב וכל 1 בגודל המתאים בצלחת פלסטיק מצופה poly(N-isopropylacrylamide (pNIPAAm) תרביות רקמה.
    הערה: בהתאם לכך, צלחת 6-טוב של הימ מ ידרוש זריעה תאים בצלחת תקן 6-ובכן תרביות רקמה (שכבת הבסיס) וצלחת אחת 6-טוב pNIPAAm-מצופה תרביות רקמה (השכבה העליונה). צלחות מצופה pNIPAAm ניתן לקנות מסחרית או יוצרו במעבדה12,13,14.
  2. לשמור על ADSCs-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 של Dulbecco ששינה נשר בינוני (DMEM) בתוספת 10% FBS ו- 1 x פניצילין/סטרפטומיצין. לשנות מדיה כל יומיים.
  3. לאפשר תאים מתמזגים עד שהם הופכים 100% confluent ולקחת על דפוס מפוספס (כ 6-8 ימים).
    הערה: תאים אלה יצטרכו לתפקד כמו סדין תא שלם בודד על מנת לייצב את רקמת שומן קליל. לתאים דיו confluent קטע על זריעת עם וואט.

2. הכנת הימ מ אספקה

  1. הכינו 10 מ"ל במספר aliquots מאוזן מלח פתרון (HBSS של האנק x 1); להכין מספיק עבור המספר הרצוי של צלחות עם נפח מיותר.
  2. להכין את המנגנון. קפיץ הימ מ זריעה. לבנות על הבוכנה באמצעות פשוטה פלסטיק אקרילי, המורכב גבעול מצורף דיסק עגול. להבטיח כי זה מתאים במסגרת היקף הבארות תרביות רקמה (קוטר: < 6 ס מ על צלחת 6 ס מ, < 3.5 ס"מ לצלחת. ובכן 6; מסה משוער: 6.7 g עבור מנה 6 ס מ, g 5.1 לצלחת 6-טוב).
    1. להכין בוכנות נוספת כדי לוודא כי ההליך יפעל בצורה חלקה במקרה שיש בעיה עם כל הבוכנה בודדים.
    2. לעטוף את הקלטת למעבדה סביב שפת הדיסק הבוכנה, לפחות 2 x, כדי למנוע דליפה של ג'לטין פתרון.
    3. תרסיס ארון אבטחה (BSC) עם 70% EtOH. לרסס את מתלה צינור חרוטי 15 מ"ל פנימה BSC עם צינורות חרוט ריקה, uncapped 15 mL; צינורות יסייע להבטיח הצבת בוכנות ג'לטין.
    4. תרסיס כל קלטת עטוף הבוכנה ביסודיות עם 70% EtOH והמקום לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל על המדף. תרסיס דיסקיות מתכת (משוער מסה 6.3 g) ומניחים אותם על המדף יחד עם זוג מלקחיים מכור; הדיסקיות תוסיף משקל בוכנות במהלך הסתערות זריעה.
    5. לסגור את סאש BSC והפעל UV אור להקל על ייבוש, סטריליזציה.
      הערה: באופן אידיאלי, לנהל את שלב 24 שעןת לפני זריעה הימ מ. לחלופין, לנהל את התהליך ביום של רקמות אוסף/ימ מ זריעה; עם זאת, במקרה זה, יאפשר 15-45 דקות עבור UV ייבוש/עיקור.

3. הכנת בוכנות ג'לטין – יישום גליונות העליון

  1. מחממים באמבט מים כדי 75 מעלות צלזיוס.
  2. הכינו את הפתרון ג'לטין על-ידי הוספת 0.75 גר' אבקת ג'לטין 10 מ"ל מלאי של 1 x HBSS. תחת ברדס fume להוסיף 100 µL של NaOH M 1 כדי לאזן את ה-pH של התמיסה.
    1. להוסיף המים הרותחים את המניות 10 מ"ל ומנערים נמרצות כל 5 דקות עד האבקה מתמסמס פתרון. במטרה לפזר אבקת הג'לטין מיד לאחר הוספת לאמבט מים מחוממות.
    2. להפעיל את המצלצל BSC, לכבות את האור האולטרה סגול, להעלות את השמשה. לרסס את השטח BSC ולהכין המסנן אספקה (5 מ ל זכוכית-lock מזרקים ו- 0.2 µm סביבונים). להכין מסננים מרובים לאמץ ביעילות כמויות מספיקות של ג'לטין כדי להחיל על בוכנות.
  3. הפתרון ג'לטין מגיעה עקביות הומוגנית, לסנן את הפתרון ואת להחילו בוכנות. לטעון את המזרק עם ג'לטין. חלות הג'לטין בוכנות פלסטיק דרך המסנן מזרק (~2.5 mL לצלחת 6-ובכן, ~4.5 mL עבור מנה 6 ס מ) ולאפשר לגבש (~ 20 דקות).
  4. לאחר שהג'לטין מוצק, לפתוח את הקלטת מקצה בוכנות. עם מלקחיים מכור, להסיר את הג'לטין הקצה החיצוני של הבוכנה (קרי, קצות העלה מניסקוס). לוודא שהג'לטין שנותרו במרכז של הבוכנה לחלוטין ברמה כדי למקסם את הקשר עם סדין ADSC.
  5. ברגע ג'לטין עודף מוסר, בעדינות להחיל את הג'לטין בוכנות הלוחות מצופים pNIPAAm ADSC. להשתמש את דיסקיות מתכת שמכבידים על הבוכנה. לא להטות את הסדינים תא תוך יישום של בוכנות.
  6. להשאיר את בוכנות הסדינים תא עבור 1.5 שעות בטמפרטורת החדר. דגירה צלחות/בוכנות באמבט קרח מים עבור 1.5 h כדי להשלים את הדיסוציאציה של הגיליון תאים מפני השטח מצופים pNIPAAm צלחת.
    1. זהירות מכלי המקננת באמבט קרח; אל תאפשר את אמבטיית קרח לזהם התקשורת בתא בתקופת הדגירה.
    2. לאחר השלמת דגירה, לנקות התחתון של הלוחות מצופים pNIPAAm כדי להסיר מים שאינו סטרילי.

4. עיבוד שומן לבן

  1. בעת איסוף רקמת שומן אנושי של חדר הניתוח, לשמור על כל דוגמאות במיכל סטרילי זה על הקרח עד ימ מ זה כדי להיות נזרע. הוסף מדיה תחזוקה סטרילי, כגון באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS), רקמת שומן מיכל ליציבות רקמות.
  2. להוסיף תא קר תרבות בינוניים עד 1.5 מ ל צינורות microcentrifuge עבור כל מנה/טוב להיות נזרע (µL 100 תמורת צלחת 6-ובכן, µL 200 עבור מנה 6 ס מ).
  3. מינצ ובינות לרקמה.
    1. מקטעי רקמת שומן מוצק, לעשות כדלקמן.
      1. לשטוף מגזרים רחבים של רקמת שומן 3 x ב- PBS סטרילי ולהסיר כמה שיותר PBS ככל האפשר.
      2. גס מינצ רקמות עם מלקחיים, גילוח סטרילי, להסיר כמה שיותר להערכת fascia ככל האפשר (ראה דיון מפורט יותר).
      3. דק מינצ שומן עם גילוח עד טחון הרקמה לוקח על וסמיך, עקביות.
        הערה: באופן אידיאלי רקמות יופיעו הומוגני עם אין מקטעים בודדים גלוי של וואט למרות שזה לא תמיד אפשרי.
    2. תהליך lipoaspirate כדלקמן.
      1. תחת BSC, קלטת גזה סטרילית מעל החלק העליון של גביע, ולמקם את הספל הזה גביע גדול יותר כדי לאסוף את כל נוזל עודף.
      2. באמצעות פיפטה סרולוגית 25 מ ל, לצייר כמה שיותר lipoaspirate כנדרש ולהחיל אותו על פני השטח של גזה סטרילית. חלות PBS ישירות על המשטח הזה לשטוף lipoaspirated שומן וכדי להסיר את עודף דם ושיירי השומנים.
      3. להשתמש מלקחיים כדי לשחזר את רקמת סחוט, להעביר אותו mincing משטח סטרילי, מינצ את lipoaspirate.
  4. להשתמש בסכין גילוח סטרילי לחתוך את הקצה דיסטלי של p1000 טיפים פיפטה על העברת רקמות טחון; הדבר יצמצם את מאמץ גזירה שיכול להוביל adipocyte פירוק. לאחר שהגעת עקביות הרקמה הנכונה היא להעביר האחסון הרצוי של רקמות טחון כל שפופרת 1.5 mL (µL 300 – 400 לצלחת 6-ובכן, 500-600 µL עבור מנה 6 ס מ). מערבבים טחון וואט ומדיה בקצרה בתוך הצינורות.
  5. קח את לוחות ADSC הבסיס, decant/וביופסיה של התקשורת. החלף את המדיה התערובת וואט/מדיה מהצינור כל 1.5 מ.
    1. בעדינות להסיר את הג'לטין בוכנות הלוחות מצופים pNIPAAm ולהחיל אותם לתערובת וואט על לוחות הבסיס ADSC. לבחון את טפט של הלוחות מצופים pNIPAAm תחת מיקרוסקופ כדי לאשר ניתוק הסלולר.
  6. הגדר גוש חום כ 37-40 ° C תחת BSC. עם בוכנות עדיין במקום, להעביר את הצלחות המשטח, הרחוב חום. להוסיף 2-3 מ"ל של מדיה תרבות ומחוממת דגירה התאים וכדי להקל על הג'לטין נמס.
  7. לאחר ~ 30 דקות, להסיר בעדינות את בוכנות מהמשטח צלחת. להחליף את המכסים של הלוחות תרביות רקמה הבסיס ולהעביר אל חממה תרבות התא. לאחר שהג'לטין יש נוזלי לגמרי ב 37 מעלות צלזיוס, תשאף ולהחליף מדיה התרבות תאים.
  8. לשמור על הימ מ- 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 ללא פנול אדום בינוני M199 עם אינסולין מיקרומטר 7, 30 מיקרומטר דקסאמתאזון, 1 x פניצילין/סטרפטומיצין. לשמור על 2 מ ל מדיה עבור לוחות 6-ובכן, mL 3 מנות 6 ס מ. לשנות מדיה כל יומיים.

5. הימ מ קציר

  1. הכנת collagenase (collagenase 0.5 מ"ג/מ"ל, 500 ננומטר אדנוזין, ב- PBS) aliquots 15 mL חרוט צינורות (נפח של 10 מ ל). להקפיא את הצינורות ואחסן אותם ב-20 ° C.
  2. תשאף בכל אמצעי התרבות תאים, לשטוף 1 x עם PBS, ואז האחות PBS. תכינו את aliquots collagenase על ידי מפשיר אותם בתוך אמבט מים 37 º C.
    הערה: באופן אידיאלי, הפתרון collagenase יגיעו 37 ° C; מיד לאחר מכן, להוסיף רקמה.
  3. להוסיף כל רקמות מהצלחת הימ מ aliquots בודדים. הקציר הימ מ באמצעות דבקנית תא סטרילי, להעביר אותו aliquots collagenase עם טיפ פיפטה ניתוק p1000. להוסיף רקמה ישירות 15 מ"ל הצינורות חרוט המכיל collagenase פתרון.
    1. לחלופין, דגירה התערובת רקמות/collagenase צינור חרוטי 50 מ; פני השטח גדל עוד יותר יקל על עיכול אנזימטי.
  4. מניחים צינורות מדגם שייקר מסלולית incubated בזווית של 45°. דגירה-200 סל ד, ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30-60 דקות.
  5. המקום מיקרומטר 250 רשת שינוי מסנן לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל חדש לאוסף. יוצקים את הפתרון adipocyte מתעכל דרך המסנן.
    הערה: זה יאפשר כל התאים לעבור תוך סינון סיבי רקמת.
  6. לאפשר זרימה דרך לשבת 5 דקות בטמפרטורת החדר, כדי לאפשר את שלב ההפרדה.
    הערה: adipocytes יצוף לחלק העליון של הפתרון תוך תאי סטרומה אדיפוז (השיקופיים) שתפתור לשלבים נמוכים יותר. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 500 x g יכול למקסם גם למחקר או הקציר שמסביב ADSCs ב בגדר.
  7. באמצעות טיפ פיפטה ניתוק p1000, להעביר את adipocytes (השכבה צף בחלק העליון של פתרון collagenase) צינור אוסף 1.5 mL microcentrifuge. לוקח ~ 250 µL במועד, פיפטה באיטיות לאורך הקצה של הצינור כדי לאסוף את adipocytes.
    1. לסובב את הצינור לאט תוך איסוף של adipocytes על מנת למקסם את ההתאוששות של תאים הקפדה הפנימי. שמור ציור יותר תאים עד הצינור microcentrifuge 1.5 mL יהיה עמוס.
  8. להסיר עודפי נוזלים adipocytes מבודדים באמצעות מזרק מצורף מחט (~ 21 G). להטביע את המחט מתחת לשכבת adipocyte צף. להתסיס את המחט לזמן קצר כדי לסלק תאים הקפדה על מוט המחט ולאחר מכן המתן adipocytes משתחררים ממקומם לצוף למעלה.
  9. לאט לאט לצייר את הנוזל העודף, נזהר למנוע הסרה לא מכוונות של adipocytes. להשתמש microcentrifuge צינור טקסי לבודד בעקביות מדגם כרכים (, למשל- 0.1 מ"ל עבור כל דגימה).
  10. השתמש בתאים מבודדים על מיצוי DNA/RNA, וזמינותו ספיגת הגלוקוז, וזמינותו lipolysis, וכו '

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הכדאיות של הימ מ הוערך בתחילה על ידי טורי brightfield הדמיה של אשכולות וואט בודדים (n = 12) כ 7.6 בשבועות. אשכולות נשארו מאובטחת במקום על טפט לאורך כל הזמן הזה. שינויים מורפולוגיים קלה נצפו עם adipocytes בודדים עיקום מעט או הסטה עמדות. עם זאת, adipocytes גם להפוך multilocular לאורך זמן, ומעידה על חוסר dedifferentiation, ולא עשה שהם מייצגים את כל סימנים גלויים של מוות של תאים כמו blebbing הסלולר, פירוק או פיצול (איור 2). Adipocyte זהותו של אשכולות אושר לימ בת שבוע שני עם השומנים הכתם האדום הנילוס (ע נ). NR ברור מכתים של אשכולות unilocular adipocyte ציין כי אכן היו אלה adipocytes עם ממברנות ללא פגע, יותר מאשר חפץ, ציסטות או adipocytes מת. העדר NR מכתים את המצעים ADSC שמסביב מציין כי תאים אלה הם לא צבירת שומנים בדם, ולכן לא המבדילים לכיוון השושלת adipogenic עצמם (איור 3 א). Propidium יודיד מכתים בוצעה לימ בת 53. אי-הכללה של הכתם בתוך אשכולות adipocyte timepoints מתקדם מדגים חוסר מוות תאי (איור 3b). כתם שמן-אדום-O (אורו) בוצעה לימ מ 51 מיושן עם לוקליזציה הכתם השומנים בתוך האשכולות adipocyte קבוע, המציין כי הימ מ adipocytes לשמור על יכולת הקיום עם שלם adipocytes אפילו ב timepoints מתקדם (איור 3 c).

Immunocytochemistry (ICC) בוצעה להפגין ביטוי חלבון הצפוי ולוקליזציה של סמני adipocyte בוגרת בתוך יחידת הימ מ. צלחות הימ מ שלם היו מוכתמים נוגדנים נגד perilipin (ab3526, דילול 1:200), PPARγ2 (sc-166731, בטחונות דילול), ו- FABP4 (ab92501, 1:1,000 דילול). תמונות קונאפוקלית של הימ מ בת 12 הפגינו לוקליזציה הצפוי של perilipin סביב השומנים droplet פני השטח (איור 4a). קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופיה של הימ מ 3 מיושן עם הכתם מונה השומנים BODIPY הפגינו לוקליזציה FABP4 בתוך הציטופלסמה (איור 4b), והפגינו חופפים האיתות PPARG, דאפי מכתים לוקליזציה PPARG את הגרעין ( איור 4 c).

פרופיל תעתיק הימ מ הוערך ברקמת נזרע מן הנבדקים מרובים (n = 4 תורמים). על אוסף, חלק של רקמת שומן שימש בסיס החילוץ-RNA (d0), ואילו השאר שימש ללוחות הימ מ זרע. הצלחות האלה ואז נבצרו ב- 24 שעות, 14 ימים, ו- 28 ימים בתרבות הימ מ. תגובת שרשרת של פולימראז שעתוק במהופך כמותית בשלב אחד (RT-qPCR) בוצע כדי לקבוע רמות שעתוק. בשישה גנים adipocyte מפתח נבחנו: PPARG, FABP4, LPL, CEBPA, HSL ו- ADIPOQ (איור 5). ACTB שימש על בקרה פנימית, רמות תעתיק שבאו לידי ביטוי כאחוז ביטוי בסיסית מתאימים-נושא (d0). כל הגנים הפגינו תעתיק עמיד את הימ מ, למרות רמות המגמה כלפי מטה לאורך זמן. אנו מאמינים כי נצפתה פרופילים תעתיק יכולים להשתפר עם נוספים מיטוב התקשורת כפי שאנחנו לפרט במקטע דיון.

תפקוד המערכת האנדוקרינית הבזליים הוערך על התרבויות באותה משמשים את הפרופיל תעתיק. תגובת שיקוע נאסף מתוך לוחות הימ מ, נמדדו רמות לפטין ניצול מקושרים-אנזים immunosorbent assay (אליסה) (ab100581). הימ מ מוצגת הפרשת לפטין הבזליים ימים 1, 14 ו- 28 (איור 6a). גליונות ADSC היו מתוחזקים במקביל הימ מ צלחות כפקד (קרי, גליונות ADSC ללא דחוקה וואט). לפטין המופרש שאין אפשרות לזהות בפקדים אלה (נתונים לא מוצג).

כדי לקבוע אם הימ מ יוכל לשמור על יכולת מענה inducible לאורך זמן, נבחנה lipolysis (n = 4). כדי להעריך קיבולת lipolytic inducible, חלק טריים שנאספו וואט (d0) היה טחון, adipocytes enzymatically היו מבודדים (בדומה הימ מ הקציר פרוטוקול בסעיף5), ואילו השאר שימש זרע צלחות הימ מ. Adipocytes מבודד היו מודגרות עבור h 3-37 מעלות צלזיוס ב 300 µL של 2% שומן-חומצה נטול שור אלבומין ב HBSS עם 100 מיקרומטר forskolin, אפינפרין 1 מיקרומטר, או מאגר שליטה. גליצרול רמות התקשורת שנאספו נמדדה עם ריאגנט גליצרול חינם. הימ מ היה אז נקצרו ימים קיבולת 1 ו 5 ו lipolytic הוערכו באופן זהה. גירוי כימי גדל גליצרול שחרור משמעותי בשלושת timepoints (איור 6b): שחרור גליצרול adipocytes שטופלו היה גדל בוואט d0 82 ± 46% (p = 0.01), 1-יום SWAT-577 ± 387% (p = 0.02), מצד הימ מ חמישה ימים מאת 348 ± 343% (p = 0.03). מתכוון גליצרול רמות adipocytes מגורה היו דומים מאוד על פני כל timepoints שלושה: 5.2 וואט העיקרי ± 0.8, 1-יום ימ מ 4.4 ± 1.9 ו- 5 ימים 4.8 ימ מ ± 1.8 µg גליצרול/mg הכולל חלבון. גליצרול רשע רמות בשליטה (קרי, הבסיס lipolysis) היו גבוהות יחסית טרי שנאספו וואט (d0) לעומת תאים שנקטפו הימ מ. זה עשוי להיות בשל הלחץ המוגבר כדי וואט ברקמות d0 במהלך כריתה כירורגית, תחבורה אל המעבדה, ואת לקמץ. עם זאת, ניסויים אלה מדגימים אין diminishment בתפקיד lipolytic את הימ מ- 1 או 5 ימים לעומת וואט טרי שנאספו.

הימ מ הודגם להיות מסוגל השתלת ושחזור במודל של עכברים (n = 4) כמו הפגנה של פונקציה מורכבת, כל רקמה. זה גם שיישום אפשרי של פלטפורמת צריך משאלה חוקר לנצל את הימ מ לתמרן וואט במבחנה לפני משתילים רקמה לתוך במודל חיה. הימ מ היה בתרבית למשך 10 ימים וקצרו ניצול הפרוטוקול הסטנדרטי; adipocytes מבודדים של הימ מ הצלחות היו אז נטען מזרק 1 מ"ל (ללא מחט). חתך נעשתה תחת העור בצד הגבי של immunocompromised לבטא eGFP עכברים (הנהון. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl Tg(CAG-EGFP)1Osb/SzJ). כך נוצר הגבי תת עורית כיס קטן שאליו adipocytes תרבותי הימ מ הוזרקו המזרק, הכיס היה אז sutured סגורים. לאחר 10 ימים שלאחר ההשתלה, הוקרבו עכברים. השתלות נראו בבירור ושוחזר בקלות (איור 7 א). ההשתלה התאושש והן מחסן השמן contralateral העכבר היו קבועים, פרפין מוטבע, למחלקה. אימונוהיסטוכימיה בוצעה בשקופיות משרטוטי עם ראשי נוגדנים נגד GFP (A10262, דילול מטריים) ולאחר PLIN האנושית (sc-390169, דילול מטריים). נוגדן anti-PLIN שנבחר אומתה השפעול כתם PLIN האנושי אבל לא עכבר. Adipocytes של ההשתלה התאושש היו כ- 50-120 מיקרומטר בגודלם, המהווה הטווח הצפוי עבור adipocytes האנושי, והיו שלילי לחלוטין עבור ה-GFP, (איור 7 ב). אולם כ- 31% adipocytes היו חיוביים עבור PLIN האנושי, המציין מוצלח engraftment לתוך המחשב המארח. Adipocytes של המחסנים שומן העכבר היו בגודל של 20 – 40 µm, דבר העולה בקנה אחד עם העכבר adipocytes, בזמן צביעת חיובי לחלוטין עבור ה-GFP, לגמרי שלילי PLIN האנושית (איור 7c). ADSC גיליונות (עם אין וואט sandwiched) היו נקרע מתוך מבחר התרבות תאים, מושתלים לתוך עכברים כפקד. עם זאת, אלה לא נכנע כל רקמות ההשבה (נתונים לא מוצג). זה יצוין כי adipocytes התאושש היו מן בוגרת הימ מ תרבותי, ולא התוצאה של הבדיל ADSCs האנושית.

Figure 1
איור 1: שיטה הימ מ. () סכמטי של הימ מ מציג את העברת גיליון של התווית על-ידי eGFP השיקופיים מתוך קערה מצופה pNIPAAm תרביות רקמה על גבי גיליון השני ללא תווית של השיקופיים גדל על צלחת רגילה תרביות רקמה. וואט אנושי ראשוני טחון, דחוקה בין הסדינים השיקופיים 2. מיקרוסקופ (b) זריחה הוכחת Brightfield, ה-GFP, וערוצי הממוזג של מלבדך שנוצרו על-ידי בטכניקה המתוארת ב (א). סרגל קנה מידה = 100 דיגיטלי צילום מיקרומטר. (c) של נציג, הימ מ בת 5 תרבותי בצלחת 6-ובכן סטנדרטי. הנפח הגדול של וואט stably מאובטח בתחתית הבאר. איור משתנה מלאו ואח. 11 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: הימ מ נשאר קיימא 8 שבועות בתרבות. Brightfield טורי הדמיה של אשכול הימ מ יחיד מעל 55 ימים מדגים שינויים מורפולוגיות לא עקבי עם מוות של תאים. גודל ברים = 100 מיקרומטר. איור הוא שונה מלאו ואח. 11 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: הימ מ נשאר קיימא-גדול מ- 50 ימים. () הנילוס אדום מכתים מדגים צביעת ההגבלה כדי להצליף תרבותי במשך 15 ימים, המציין adipocytes קיימא בשידור חי. סטרומה תאים המקיפים מכתים. איור הם בגיל 40 X הגדלה וסרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. (b) Propidium יודיד (PI) צביעת של הימ מ תרבותי עבור 53 יום מגלה להשלים PI הדרה, המציין אין מוות adipocyte; סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. (ג) שמן-אדום-O כתמים 51 בת ימ מ מדגים ההגבלה של ליפידים ניטראלי adipocytes, המציין את יציבות לטווח ארוך של קרום התא adipocyte. איור משתנה מלאו ואח. 11 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: Immunocytochemistry מדגים הימ מ כתמים באופן חיובי עבור סמני תא adipocyte בוגרת עם לוקליזציה הצפוי. () Confocal מיקרוסקופיה של הימ מ בת שבוע 2 חשף PLIN + unilocular תאים אנושיים עם לוקליזציה למשטח droplet השומנים. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. (b) מיקרוסקופ פלואורסצנטי של הימ מ 3 בת גילה האדם FABP4 + תאים עם לוקליזציה אל הציטופלסמה ו- (ג) PPARγ + תאי עם לוקליזציה אל גרעין התא. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. איור הוא שונה מלאו. et al. 11 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5: הימ מ שומרת על ביטוי גנים adipocyte מפתח זהות. הימ מ אשכולות היו collagenase מתעכל לאחר 1, 14, ו- 28 ימים בביטוי תרבות, גנים נקבע על ידי RT-qPCR. RT-qPCR מדגים הימ מ 1 בת ולא בן יום-14 לשמור על רמות גבוהות של () PPARG, (b) FABP, (ג) HSL, (ד) CbEBPA, (e) LPL ו (f) ADIPOQ. ACTB שימש הפניה ג'ין. קווי שגיאה = שגיאה סטנדרטית. איור הוא שונה מלאו ואח. 11. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 6
איור 6: הימ מ basally מפריש adipokines, מגיב פיזיולוגית קטכולאמין גירוי. () אליסה כימות של 24 שעות הבסיס לפטין הפרשת מראה שום שינוי משמעותי לאחר 28 יום בתרבות. (b) Adrenergic גירוי עם אפינפרין, forskolin יוצר תגובה glycolytic משמעותי בוואט העיקרי שנקטפו זה עתה (1.7 x) ותואמים נושא-הימ מ ב 1 ו 5 ימים בתרבות. יום 1 SWAT הגיב קטכולאמין גירוי עם עלייה 6.3-fold מעל גליקוליזה הבזליים בעוד יום 5 SWAT הראו עלייה 3.3-fold מעל גליקוליזה הבזליים. גליקוליזה מגורה לא היתה שונה באופן משמעותי את הימ מ לעומת וואט טריים מתאימים (p = 0.53, n = 4). קווי שגיאה = שגיאה סטנדרטית. נתון זה לאו. ששונה et al. 11. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 7
איור 7: הימ מ יכול להיות reimplanted ויוו, הוכחת לשימור תפקוד הרקמות כל. () הימ מ היה ברצון מטמיעים 10 ימים לאחר השתלת לתוך העכבר immunocompromised (כוכבית). היה הימ מ לא בהצלחה קטנטנים, על ידי 10 ימים נמק הימ מ יש כבר מעובה. (b) סעיפים הימ מ התאושש הפגינו גדול, unilocular adipocytes (קטרים 50 עד 120 מיקרומטר) שהיו eGFP-. 31.3% adipocytes היו בני אדם PLIN +. האדם PLIN + adipocytes נטו להיות קטנים יותר, אשר יתאים עם תצפיות קליניות של הרכבה השמן בבני איפה adipocytes קטנים יותר הם נוטים יותר שורדים את המעבר. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר, 200 X הגדלה. רפידות (c) Contralateral שומן שנלקחו העכברים אותו הפגינו קטן בהרבה adipocytes (20-40 מיקרומטר), היו PLIN אנושי-. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר, 200 X הגדלה. איור הוא שונה מלאו. et al. 11. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פרוטוקול זה מפרט את השימוש ADSCs כדי סנדוויץ האנושי שומן לבן; שורות תאים ADSC האנושי ניתן לבודד באמצעות פרוטוקולים ומבוססת15. עם זאת, המערכת ניתן להתאים לדרישות המחקר תגובותיהם (כגון שימוש 3T3L-1 תאים כריך העכבר וואט). תהליך זה כרוך הטיפול העיקרי רקמה אנושית. צריך להיות מועסק סטנדרט זהירות; לטפל ברקמות אנושיות כמו BSL-2 פתוגנים (למשל, HIV, HepC). מטפלים רק רקמות ישירות מתחת BSC. ללבוש בהתאם עיקרון השוויון הפוליטי כפי שמכתיבה תקני בטיחות מוסדית – כפפות כפול מומלץ מאוד. כראוי לחטא כל ציוד, פסולת עם 10% מלבין פתרון או אתנול 70% פתרון לפני שימוש חוזר או השמטה.

השלב הקריטי הראשון בתרבות הימ מ תקוות גדולות, שמירה על צלחות מצופה pNIPAAm תרביות רקמה. צלחות כאלה זמינים מסחרית, או שהם יכול להיות מיוצר באמצעות שיטות הוקמה12,13,14. הצלחות האלה הם מגיבים טמפרטורת תא תרבות משטחים. מעל הטמפרטורה הקריטית (~ 32 ° C), פני השטח הידרופוביות, התאים מקנא, הדומה חומרים פלסטיים אחרים שטופלו על תרביות רקמה. עם זאת, מתחת לטמפרטורה זו קריטית, פני השטח הופך הידרופיליות, התאים מביצועם של ה משטח פלסטיק16. . As a result, להקפיד להקים: 1) כיצד מהר סוג תא נתון מביצועם של טפט לפני שהגיע confluency מלא (קרי, במהלך שינויים מדיה רגיל) ו- 2) את הזמן הדרוש להורדת הטמפרטורה עם הג'לטין הבוכנה מוחל על הלוח מצופים pNIPPAm, כדי להבטיח כי הגיליון התא כולו dissociates. שינויים מדיה יש לבצע עם מדיה התחמם עד 37 ° C; אם התאים נוטים דיסוציאציה מהירה, לבצע שינויים מדיה על גוש חום מוגדר כ- 37 מעלות צלזיוס מתחת BSC.

השלב הקריטי השני הוא עיבוד של רקמת שומן כדי להתכונן הימ מ זריעה. אנו לבצע אפיון שלנו הא וואט עם מלקחיים מעוקר, סכיני גילוח מעוקר. עם זאת, fascia האנושי אי אפשר לנתק בקלות עם סכין גילוח. הגדלת היחס adipocyte-כדי-fascia חשוב לשמור על כמה שיותר שומן בתוך הימ מ ככל האפשר במשך תקופה ארוכת טווח. חתיכות גדולות של fascia שלם תמנע תא-תא קשר בין ADSCs לבין adipocytes, שהוא חיוני לשמירה הימ מ ביחד. עודפות של fascia יכולה להיות גם השפעה "מושך על בלימה". ואילו אשכול וואט בודד יכול מביצועם מצלחת מבלי להשפיע על האשכולות שכנות, אשכולות מרובים המחוברים באמצעות fascia למשוך מספיק אשכולות הנחה טפט לעיבוד מלבדך. ובכן שמיש. שאיבת שומן, אשר מערבת את הא ממוכן של וואט, ניתן לעקוף בעיה זו, כפי fascia הוא טחון דק במהלך הניתוח. עם זאת, במהלך שאיבת שומן, חולים באופן שגרתי מטופלים במינונים גבוהים של אפינפרין; ההשלכות של טיפול זה על רקמות (ועל הניסויים הבאים) חייב להיות אחראים במהלך מחקר.

השלב הקריטי הסופי בתרבות הימ מ הוא בחירת מדיה ניסיוני של תרבות. אנחנו ביצע ניסויים משלב האפיון הראשוני שלנו ניצול ניסוח תרבות תא סטנדרטי (10% FBS, 1 x פניצילין/סטרפטומיצין ב- DMEM). עם זאת, בהתבסס על הספרות זמין לגבי למקסם שעתוק adipocyte, השתמשנו ניסוח מיוחדות (אינסולין מיקרומטר 7, 30 מיקרומטר דקסאמתאזון, 1 x פניצילין/סטרפטומיצין בתקשורת M199)17. ניסוח זה שיפור רמות מוקדם של שעתוק, אך רמות ירד לאורך זמן. אנו מאמינים שכי בגוף, adipocytes חשופים למגוון רחב של אותות כימיים, לעיתים קרובות על אופניים בין מהבולשת, מורעבים מצבים במהלך יום. לכן, זה צריך להיות אפשרי לשפר את פרופיל תעתיק נצפתה לאורך זמן על-ידי נוספים מיטוב את תוספי למדיה התרבות שלנו תא.

הימ מ הקציר (פרוטוקול, סעיף 5) מבודד adipocytes מתרבות, מקטין את נפח דגימה, ומסירה הפרעות של הסדינים ADSC שמסביב. זה יכול להקדים המגון adipocyte (אשר יש צורך בידוד חלבון או חומצות גרעין), או מבחני פונקציונליות של ללא פגע adipocytes (כגון מבחני ספיגת גליקוליזה או גלוקוז). לחלופין, הצלחת הימ מ שלם ניתן לקצור עבור immunocytochemical מכתים, מה שמאפשר את הסדינים ADSC לאבטח את האשכולות וואט טפט לאורך כל תהליך צביעת. במקרה זה, תשאף התקשורת תרבות ולתקן את תרבות שלמה באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים. עם זאת, מומלץ להוסיף coverslip של זכוכית לפני הדמיה כדי לשטח את האשכולות 3D adipocyte ולשפר את איכות התמונה המתקבלת.

אנו מאמינים שלימ מ יש פוטנציאל גדול כסם הקרנת פלטפורמה. הטכניקה פשוטה, לשחזור, מנצל לוחות קונבנציונלי תרביות רקמה. לכן, סמים ההקרנה ניסויים הם להפעלה על-ידי הוספת תרכובת פעילות פרמקולוגית המדיום תרבות. ניתן לקצור adipocytes ואז לבחון את ההשפעה של המתחם על ביטוי גנים, פרופיל epigenetic, הרגישות לאינסולין, ועוד שהתוספת של רעלנים סביבתיים לבינונית תרבות באופן דומה ניתן להשתמש כדי לבחון את ההשפעה שלהם על adipocytes. מכיוון הימ מ מאפשר החוקר לעקוב אחר אשכולות adipocyte בודדים לאורך זמן, זה לצורכיכם להערכת טיפול יבצע שינוי פנוטיפי הגלויים adipocytes. דוגמה בולטת יהיה adipocyte האנושי ", בראונינג," שבו adipocyte לבן, אחסון השומנים הופכת "מושחם" או דומה לזה adipocyte חום תרמוגנית, multilocular18. זוהי תופעה של פוטנציאל מרכזי הרלוונטיות הקלינית כי הוכח במודלים של העכבר, אך לא בבני-אדם. וריאציות תרבותי משותף על הימ מ החזק גם מחקר אדיר פוטנציאליים. הימ מ היא מערכת תרבות שותף טבעי אשר מנצל תא סטנדרטי תרבות בארות. לכן, אחד יכול לשמור את adipocytes בין סוגי תאים הרלוונטית קלינית אחרים על-ידי שינוי התאים sandwiching או על-ידי ניצול מוסיף ממברנה תרביות רקמה. לדוגמה, hepatocytes יכול לשמש הגיליון תא sandwiching העליון למסך סם מסונן דרך הכבד לפני שהגיע ובינות לרקמה. באופן דומה, תאים סרטניים יכולים להיות גדל על הוספה של קרום על הימ מ לבחון כיצד adipocytes לתרום הפתולוגיה סרטן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

המחברים רוצה להכיר את התמיכה המוסדי שמספק LSU למדעי הבריאות מרכז, אשר מימנה את הפרויקט.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x HBSS Thermofisher 14185052
Gelatin Sigma-aldrich G9391
Collagenase Sigma-aldrich C5138
Adenosine Sigma-aldrich A9251
DMEM Thermofisher 11995065
M199 Media Thermofisher 11043023 Phenol red-free 
250 µm Mesh Filter Pierce 87791
0.2 µm Syringe Filter Celltreat 229747
5 mL Luer-Lok syringes  BD 309646
Metal Washers These are simple metal washers and can be bought at any hardware store. They simply add leight weight to the backs of the plugers to ensure even contact between cells and gelatin, while being easy to stock and sterilize. Approximate mass: 6.3 g 
Name Company Catalog Number Comments
Heated Equipment
Incubated Orbital Shaker VWR 10020-988 Samples should be pitched at 45° angle to facilitate collagenase digestion
Heat Block Set to 37-40 °C and placed under Biosafety Cabinet
Water Bath Set to ~75 °C
Name Company Catalog Number Comments
Specialized Plastics
Upcell Dishes 6cm of 6-multiwell Nunc 174902  or 174901 These are commerically available pNIPAAm-coated dishes which can be used to grow the upper sheet of ADSCs. Alternatively, pNIPAAm-coated plates can be produced in-lab. diameter: <6 cm for 6 cm dish, <3.5 cm for 6-well plate; approximate mass: 6.7g for 6 cm dish, 5.1 g for 6-well plate
Plastic Plunger Apparatus These can be fashioned to fit within desired pNIPAAm-coated plastics (multiwell plates, petri dishes). They are comprised of a simple stem attached to a circular disk. They can be produced in-lab or by any facility that can fashion acrylic plastics

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cawley, J., Meyerhoefer, C. The medical costs of obesity: An instrumental variables approach. Journal of Health Economics. 31 (1), 219-230 (2012).
  2. Pi-Sunyer, X. The Medical Risks of Obesity. Postgraduate Medicine. 121 (6), 21-33 (2009).
  3. Smith, U. Morphologic studies of human subcutaneous adipose tissue in vitro. Anatomical Record. 169 (1), 97-104 (1971).
  4. Sugihara, H., Yonemitsu, N., Miyabara, S., Yun, K. Primary cultures of unilocular fat cells: characteristics of growth in vitro and changes in differentiation properties. Differentiation. 31 (1), 42-49 (1986).
  5. Sugihara, H., Yonemitsu, N., Toda, S., Miyabara, S., Funatsumaru, S., Matsumoto, T. Unilocular fat cells in three-dimensional collagen gel matrix culture. The Journal of Lipid Research. 29, 691-697 (1988).
  6. Hazen, S. A., Rowe, W. A., Lynch, C. J. Monolayer cell culture of freshly isolated adipocytes using extracellular basement membrane components. The Journal of Lipid Research. 36, 868-875 (1995).
  7. Fried, S. K., Kral, J. G. Sex differences in regional distribution of fat cell size and lipoprotein lipase activity in morbidly obese patients. International Journal of Obesity. 11 (2), 129-140 (1987).
  8. Sutherland, M. L., Fabre, K. M., Tagle, D. A. The National Institutes of Health. Microphysiological Systems Program focuses on a critical challenge in the drug discovery pipeline. Stem Cell Research and Therapy. 4, (2013).
  9. Wikswo, J. P. The relevance and potential roles of microphysiological systems in biology and medicine. Experimental Biology and Medicine. 239 (9), 1061-1072 (2014).
  10. National Institutes of Health. NIH-CASIS Coordinated Microphysiological Systems Program for Translational Research in Space (#RFA-TR-18-001). , Available from: https://grants.nih.gov/grants/guide/rfa-files/RFA-TR-18-001.html (2017).
  11. Lau, F. H., Vogel, K., Luckett, J. P., Hunt, M., Meyer, A., Rogers, C. L., Tessler, O., Dupin, C. L., St Hilaire, H., Islam, K. N., Frazier, T., Gimble, J. M., Scahill, S. Sandwiched White Adipose Tissue: A Microphysiological System of Primary Human Adipose Tissue. Tissue Engineering Part C: Methods. 24 (3), (2018).
  12. Ebara, M., Hoffman, J. M., Stayton, P. S., Hoffman, A. S. Surface modification of microfluidic channels by UV-mediated graft polymerization of non-fouling and 'smart' polymers. Radiation Physics and Chemistry. 76, 1409-1413 (2007).
  13. Lin, J. B., Isenberg, B. C., Shen, Y., Schorsch, K., Sazonova, O. V., Wong, J. Y. Thermo-responsive poly(N-isopropylacrylamide) grafted onto microtextured poly(dimethylsiloxane) for aligned cell sheet engineering. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 99, 108-115 (2012).
  14. Turner, W. S., Sandhu, N., McCloskey, K. E. Tissue Engineering: Construction of a Multicellular 3D Scaffold for the Delivery of Layered Cell Sheets. Journal of Visualized Experiments. (92), e51044 (2014).
  15. Bunnell, B., Flaat, M., Gagliardi, C., Patel, B., Ripoll, C. Adipose-derived stem cells: Isolation, expansion and differentiation. Methods. 45 (2), 115-120 (2008).
  16. Akiyama, Y., Kikuchi, A., Yamato, M., Okano, T. Ultrathin poly(N-isopropylacrylamide) grafted layer on polystyrene surfaces for cell adhesion/detachment control. Langmuir. 20 (13), 5506-5511 (2004).
  17. Fried, S. K., Russell, C. D., Grauso, N. L., Brolin, R. E. Lipoprotein lipase regulation by insulin and glucocorticoid in subcutaneous and omental adipose tissues of obese women and men. Journal of Clinical Investigation. 92 (5), 2191-2198 (1993).
  18. Keipert, S., Jastroch, M. Brite/beige fat and UCP1 - is it thermogenesis? Biochimica et Biophysica Acta. 1837 (7), 1075-1082 (2014).

Tags

התנהגות גיליון 138 רקמת שומן adipocytes השמנת יתר microphysiological מערכות איברים על צ'יפס והתרופות הקרנה פיתוח תרופות רעילות איכות הסביבה תרבות ראשי סוכרת חילוף החומרים
פלטפורמה Microphysiologic שומן אנושי: דחוקה שומן לבן
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Scahill, S. D., Hunt, M., Rogers, C. … More

Scahill, S. D., Hunt, M., Rogers, C. L., Lau, F. H. A Microphysiologic Platform for Human Fat: Sandwiched White Adipose Tissue. J. Vis. Exp. (138), e57909, doi:10.3791/57909 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter