Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Behavior
Click here for the English version

Behavior

Microphysiologic платформа для человеческого жира: зажатой белой жировой ткани

Published: August 15, 2018 doi: 10.3791/57909
Automatic Translation
1, 2, 2, 2
1Department of Pharmacology, Louisiana State University Health Sciences Center, 2Department of Surgery, Louisiana State University Health Sciences Center

Summary

Белой жировой ткани (Ват) имеет критические недостатки в его текущей модели основной культуры, препятствуют развитию фармакологического и метаболических исследованиях. Здесь мы представляем протокол для получения жировых microphysiological системы сэндвич Ват между листами стромальных клеток. Эта конструкция обеспечивает стабильной и гибкой платформой для первичного Ват культуры.

Abstract

Белой жировой ткани (Ват) играет решающую роль в регулировании веса и повседневной здоровья. Тем не менее существуют значительные ограничения для моделей доступны основной культуры, все из которых не удалось точно охарактеризовать жировой микроокружения или продлить жизнеспособность Ват за две недели. Отсутствие надежной первичной культуры модели серьезно препятствует исследования в Ват метаболизм и разработки лекарств. С этой целью мы использовали стандарты NIH в microphysiologic системы для разработки Роман платформы для Ват основной культуры под названием «SWAT» (слоеное белой жировой ткани). Мы преодолеть естественным плавучести адипоцитов сэндвич фарша Ват кластеры между листами жировой производные стромальных клеток. В этой конструкции Ват образцы являются жизнеспособной более чем восемь недель в культуре. SWAT сохраняет нетронутыми ECM, к ячейке контактов и физического давления в естественных условиях Ват условий; Кроме того Сват поддерживает надежные транскрипционный анализ профиля, чувствительность к экзогенных химических сигналов и функция цельной ткани. SWAT представляет простой, воспроизводимые и эффективный метод первичной жировой культуры. Потенциально это широко применимые платформы для научных исследований в физиологии Ват, Патофизиология, метаболизм и фармацевтических разработок.

Introduction

Жировой ткани является основным органом, ожирения, которая осуществляет прямые ежегодные медицинские расходы между 147 миллиардов долларов и 210 миллиардов долларов в США1. Накопления жировой ткани также способствует других ведущих причин смерти, такие как болезни сердца, диабета II типа и некоторых видов рака2. В vitro культуры модели необходимы для метаболических исследований и разработки лекарств, но текущие исследования модели жировой ткани имеют серьезные недостатки. Адипоцитов хрупкие, жизнерадостный и неизлечимо дифференцированных клеток, которые не будут придерживаться пластмассы культуры клеток и поэтому не может быть культивировали, с использованием обычных клеток культуры методов. Начиная с 1970-х годов были использованы в попытках несколько методов для преодоления этих препятствий, включая использование стекла coverslips, потолок культуры, подвеска культуры и внеклеточной матрицы3,4,5, 6 , 7. Однако, эти методы были отмечены гибель клеток и дифференцировке, и они обычно используются для не более чем в течение двух недельного исследования. Кроме того, эти модели не пытайтесь повторить родной жировой микроокружения, поскольку они не поддерживают нетронутыми ECM, поддержки взаимодействия между адипоциты и стромальные клетки, ни клетки сократительной силы оказывают друг на друга в в естественных условиях Ват.

В отсутствие метода золотой стандарт начального жировой культуры жировой исследования опирается главным образом на дифференцированной предварительно адипоцитов (diffAds). DiffAds многокамерный, сторонником и метаболически активные. Напротив основной белый адипоцитов однокамерные, nonadherent и демонстрируют сравнительно низкий метаболизм. Текущего жировых культуры моделей неспособность пилки физиологии здоровых зрелых жировой ткани, вероятно, основным фактором в отсутствие утвержденных FDA лекарства, которые непосредственно нацелены адипоцитов. В самом деле отсутствие физиологического в vitro моделей органа является серьезной проблемой на большинство органов и болезни.

В своем позиционном документе, объявив о создании своей программы Microphysiological системы (MPS) национальные институты здравоохранения (NIH) сообщили, что 2013 успеха во всех фармацевтических клинические испытания на человеке только 18% для этапа II и 50% для фазы III Клинические испытания8. Программе MPS предназначена для непосредственного решения неспособность в vitro монокультуры модели физиологии человека. НИЗ определяет MPSs как культура системы, состоящей из человека первичной или стволовых клеток многоклеточного 3D конструкций, которые пилки функционирования органа. В отличие от модели редукционистской однородной, увековечен клеточных культур MPSs должен точно модель ячеек, наркотиков клеток, лекарственного препарата и орган наркотиков взаимодействий9. В отличие от краткосрочных методов первичной культуры низ стандартов диктовать м/с устойчивости более 4 недель культуры8. Более подробная информация о программе MPS можно найти на низ RFAs (#RFA-TR-18-001)10.

Мы разработали простой, Роман, адаптации, и недорогой жировой м/с называют «зажатая белой жировой ткани» (SWAT)11. Мы преодолеть естественным плавучести адипоциты, «сэндвич» рубленый первичной жировой ткани между листами жировой производные стромальных клеток (ADSCs) (рис. 1). Результирующая 3D конструкции резюмирует контакт ячеек и родной жировой микроокружения, окружая Зрелые адипоцитов с населением клетки естественным Адипоцит поддержки. SWAT протестирована, демонстрируя 8-недельного жизнеспособности, ответ на экзогенные сигнализации, секрецию Ади­по­Кин и приживления в животной модели.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все задачи были выполнены в присоединение к протоколам #8759 и #9189, как одобрено IRB отделение LSUHSC-NO. Все животные работа была выполнена в присоединение к протоколу #3285 утверждения IACUC Управлением по LSUHSC-NO.

1. Заполнение сэндвич ячеек листов

Примечание: Смотрите Рисунок 1.

  1. Семя ADSCs на приблизительно 80% confluency в культуре ткани пластины (6 см или 6-ну пластины). Для каждой скважины SWAT желаемого, семян 1 обычных культуры ткани хорошо и 1 хорошо соответствующего размера на пластиковые пластины с покрытием poly(N-isopropylacrylamide (pNIPAAm) культуры ткани.
    Примечание: Соответственно, 6-ну тарелку SWAT потребует заполнение ячеек на один стандартный 6-ну культуры ткани пластины (базовый уровень) и один 6-ну pNIPAAm покрытием культуры ткани пластины (верхний слой). pNIPAAm покрытием плиты могут быть куплены коммерчески или производится в лаборатории12,,1314.
  2. Сохранить ADSCs при 37 ° C и 5% CO2 в Дульбекко изменение Eagle среднего (DMEM) с 10% FBS и 1 x пенициллина/стрептомицина. Изменить СМИ каждые 2 дня.
  3. Разрешить клетки сливаются до тех пор, пока они становятся 100% притока и взять на полосатый узор (примерно 6-8 дней).
    Примечание: Эти клетки нужно будет функционировать в качестве одной неповрежденной ячейки листа с целью стабилизации плавучесть жировой ткани. Недостаточно вырожденная клетки будет фрагмент после посева с Ват.

2. Подготовка СПЕЦНАЗА поставок

  1. Подготовьте несколько 10 мл аликвоты из 1 x Хэнк сбалансированный соли раствора (HBSS); Подготовьте достаточно для желаемое количество пластин с объемом для запасных.
  2. Подготовьте поршень аппарат для посева SWAT. Постройте поршень, используя простые акриловые пластмассы, состоит из ствола, придает круглый диск. Убедитесь, что она вписывается в окружности культуры ткани скважины (диаметр: < 6 см на 6 см блюдо, < 3,5 см для 6-ну плиты; Приблизительная масса: 6.7 g для 6 см блюдо, 5,1 g для 6-ну плиты).
    1. Подготовка дополнительных плунжеров для обеспечения, что процедура будет работать гладко в случае, что есть проблема с любой индивидуальный поршень.
    2. Обернуть ленту лаборатории вокруг обода диска поршень, по крайней мере 2 x, для предотвращения утечки раствора желатина.
    3. Спрей биобезопасности кабинета (BSC) с 70% EtOH. Спрей вниз 15 мл конические пробки стойки внутри BSC с пустым, раскрытый 15 мл конические трубы; трубы поможет обеспечить размещение плунжеров желатина.
    4. Тщательно распылите каждый поршень намоткой ленты с 70% EtOH и место в 15 мл Конические трубки на стойке. Брызги металла шайбы (Приблизительная масса 6,3 g) и поместите их на решетку вместе с парой подключили щипцами; шайба будет добавить вес к плунжеров во время посева SWAT.
    5. Закройте створки BSC и включите УФ света для облегчения сушки и стерилизации.
      Примечание: В идеале, провести этот шаг за 24 часа до посева SWAT. Кроме того проводить процесс в день ткани коллекции/SWAT посева; Однако в этом случае, позволяют 15 – 45 мин для УФ сушки и стерилизации.

3. Подготовка плунжеров желатин — приложение к верхней ячейки листов

  1. Нагреть на водяной бане до 75 ° C.
  2. Приготовляют раствор желатина, добавив 0,75 г порошка желатина 10 мл бульона 1 x HBSS. Под зонт мкл 100 1 M NaOH сбалансировать рН раствора.
    1. Добавьте 10 мл запасов на водяной бане и shake энергично каждые 5 мин до тех пор, пока порошок растворяется в раствор. Цель для растворения порошка желатина вскоре после добавления в ванну с подогретой водой.
    2. Включите вентилятор BSC, выключить свет УФ и поднять створку. Брызг поверхность BSC и подготовить фильтр поставок (5 мл luer-lock шприцы и 0,2 мкм шприц фильтры). Подготовьте несколько фильтров, чтобы эффективно штамм достаточных объемов желатин для применения к поршни.
  3. Когда раствор желатина достигает однородной консистенцией, фильтр решения и применить его к плунжеров. Загрузите шприц с желатином. Применить желатин для пластиковых плунжеров через шприц фильтр (~2.5 для 6-ну пластина, ~4.5 мл на 6 см блюдо) и позволяют укрепить (~ 20 мин).
  4. Когда желатин твердый, берем ленту от края плунжеров. Увлеченные пинцетом удалить желатин от внешнего края плунжера (т.е., поднятые края мениска). Убедитесь, что оставшийся желатин в центре поршень полностью уровня для максимального контакта с ADSC лист.
  5. Когда удаляется избыток желатина, осторожно применять желатин плунжеров для пластин с покрытием pNIPAAm ADSC. Используйте шайбы металла, чтобы весить вниз плунжера. Не срез ячеек листов при применении плунжеров.
  6. Оставьте плунжеров на листах ячейки для 1,5 ч при комнатной температуре. Инкубируйте пластины/поршни в ледяной воде ванны для 1,5 h завершить диссоциации клеток листа от поверхности пластины с покрытием pNIPAAm.
    1. Проявлять осторожность при инкубации в ледяной ванне; не позволяйте ледяной ванне загрязнить ячейки СМИ во время инкубации.
    2. После окончания инкубации, очистите в нижней части пластины с покрытием pNIPAAm удалить нестерильные воды.

4. белой жировой ткани обработка

  1. При сборе жировых тканях человека от операционной комнате, держите все образцы в стерильный контейнер, который является на льду пока SWAT должна быть заполнена. Добавьте стерильные обслуживания средств массовой информации, таких как фосфат амортизированное saline (PBS), контейнер жировой ткани стабильности.
  2. Добавьте холодной камере питательной среды для 1.5 мл пробирок microcentrifuge для каждого блюдо хорошо, чтобы быть посеяны (100 мкл 6-ну пластины, промаркированные на 6 см блюдо).
  3. Фарш жировой ткани.
    1. Для твердых жировой ткани сегментов выполните следующее.
      1. Вымойте значительная часть жировой ткани 3 x в стерильных PBS и удалить столько PBS как можно скорее.
      2. Крупно фарш ткани с щипцами и стерильные бритвы и удалить столько сосудистую и фасции как можно скорее (см. обсуждение более подробно).
      3. Мелко фарш жира с бритвой, пока фарш ткани берет на толстые, жидкой консистенции.
        Примечание: В идеале ткани появится однородных с не видны отдельные сегменты Ват хотя это не всегда возможно.
    2. Процесс lipoaspirate следующим образом.
      1. В BSC лента стерильные марлевые над верхней части стакан и место этот стакан в больших стакан для сбора любой избыток жидкости.
      2. С помощью Пипетки серологические 25 мл, привлечь столько lipoaspirate как необходимое и применить его к поверхности стерильной марлей. Применяйте PBS непосредственно на поверхность мыть lipoaspirated жира и удалить избыток крови и остатков липидов.
      3. Используйте щипцы для восстановить осушенных ткани, передача его в стерильных размола поверхности и фарш lipoaspirate.
  4. Используйте стерильные бритвой отрезать дистального конца p1000 наконечники для передачи фарш из ткани; Это сведет к минимуму касательное напряжение, что может привести к Адипоцит лизис. По достижении соответствия надлежащего ткани передачи желаемый объем фарш из ткани для каждого 1,5 мл (300 – 400 мкл 6-ну пластины, 500 – 600 мкл 6 см блюдо). Смешайте фарш Ват и СМИ кратко в трубах.
  5. Возьмите опорные плиты ADSC и сцеживаться/аспирационная средств массовой информации. Замените Ват/СМИ смесь от каждого 1,5 мл средства массовой информации.
    1. Аккуратно удалите желатин плунжеров из пластины с покрытием pNIPAAm и применить их к Ват смесь на опорные плиты ADSC. Изучите однослойные пластины с покрытием pNIPAAm под микроскопом, чтобы подтвердить сотовой отряда.
  6. Установка блока тепла приблизительно 37 – 40 ° c под BSC. С плунжеров еще на месте переместите плиты поверхности блока тепла. Добавьте 2-3 мл утепленные культуры средств массовой информации для инкубации клеток и облегчения плавления желатина.
  7. После ~ 30 мин осторожно удалите плунжеров из поверхности пластины. Замените крышки базовой культуры ткани пластины и перейти к инкубатор культуры клеток. Когда желатин полностью сжиженных при 37 ° C, аспирационная и заменить средства массовой информации культуры клеток.
  8. Поддерживать SWAT при 37 ° C и 5% CO2 в среде M199 свободного фенола красного с 7 мкм инсулина, дексаметазон 30 мкм, 1 x пенициллина/стрептомицина. Сохраняйте в примерно 2 мл средства массовой информации для 6-ну пластин и 3 мл для блюд, 6 см. Изменить СМИ каждые 2 дня.

5. SWAT урожай

  1. Подготовить коллагеназы (коллагеназа 0.5 мг/мл, 500 Нм аденозина, в PBS) аликвоты в 15 мл конические трубы (примерный объем 10 мл). Замораживание труб и хранить их при-20 ° C.
  2. Аспирационная любой питательной среды от клеток, вымыть 1 x с PBS и затем аспирационная PBS. Подготовьте коллагеназы аликвоты, размораживание их в ванну воды 37 ° C.
    Примечание: В идеале, решение коллагеназы достигнет 37 ° C; сразу же после этого добавьте ткани.
  3. Добавьте все ткани от пластины SWAT в отдельных аликвоты. Урожай SWAT, с помощью стерильных клеток лавный и перенести его на аликвоты коллагеназы с кончиком пипетки p1000 отсечения. Добавьте ткани непосредственно в 15 мл конические пробирки, содержащие коллагеназы решение.
    1. Кроме того Инкубируйте в ткани/коллагеназы смесь в 50 мл Конические трубки; увеличение площади поверхности будет и далее содействовать ферментативного пищеварения.
  4. Место пробоотборные трубки в инкубирован орбитальный шейкер под углом 45°. Инкубируйте на 200 об/мин, при 37 ° C за 30-60 мин.
  5. Место 250 мкм сетчатый фильтр в новой 15 мл Конические трубки для коллекции. Залейте раствор переваривается Адипоцит через фильтр.
    Примечание: Это позволит все клетки проходят через время фильтрации фиброзной ткани.
  6. Разрешить поток через сидеть в течение 5 мин при комнатной температуре для этапа разъединения.
    Примечание: Адипоцитов будет плавать в верхней части решения, в то время как жировых клеток стромы (ИСС) будет располагаться ниже этапов. Центрифугирование за 5 мин на 500 x g также может максимизировать разделения клеток или урожай вокруг ADSCs в гранулах.
  7. С помощью кончика пипетки p1000 отсечения, адипоциты (плавающий слой в верхней части решения коллагеназы) передать microcentrifuge коллекции 1,5 мл. Принимая на время ~ 250 мкл, Пипетка медленно вдоль края трубки для сбора адипоцитов.
    1. Медленно вращайте трубки во время сбора адипоциты для максимального восстановления клеток, придерживаясь внутри. Сохраните рисунок больше клеток до 1,5 мл пробки microcentrifuge.
  8. Удалите лишнюю жидкость из изолированных адипоциты, с помощью шприца придает иглы (~ 21 G). Потопить иглу под плавающий слой Адипоцит. Агитировать кратко к выбить любой клетки, придерживаясь оси иглы иглы, а затем ждать выбили адипоцитов плавать в верхней.
  9. Медленно нарисуйте лишнюю жидкость, стараясь избежать непреднамеренного удаления адипоцитов. Используйте градации пробки microcentrifuge последовательно изолировать образца томов (например,. 0,1 мл для каждого образца).
  10. Использование изолированных клеток для экстракции ДНК/РНК, пробирного поглощение глюкозы, липолиз пробирного и т.д.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Жизнеспособность SWAT первоначально оценивалась путем последовательного brightfield изображений отдельных кластеров Ват (n = 12) приблизительно 7,6 недель. Кластеры оставался обеспеченным в месте на монослое на протяжении этого времени. Незначительные морфологические изменения наблюдались с отдельными адипоцитов слегка сновать или смещение позиции. Однако адипоциты ни многокамерный со временем стать, что указывает на отсутствие дифференцировке, ни сделал они проявляют каких-либо видимых признаков смерти клетки клеточных блеббинг, лизис или фрагментации (рис. 2). Адипоцит личность кластеров было подтверждено на двух недельных SWAT с липидные пятна Нила красный (NR). Четкие NR окрашивание однокамерные Адипоцит кластеров указали, что они действительно были адипоцитов с интактным плодным пузырем, а не артефакт, кисты или мертвых адипоцитов. Отсутствие NR пятнать в близлежащих листов ADSC указывает, что эти клетки являются не накопления липидов и поэтому не дифференцировать к линии адипогенном сами (Рисунок 3А). В 53 дневных Сват была выполнена окрашиванию пропидий йодидом. Исключение пятно в пределах Адипоцит кластеров на передовых timepoints демонстрирует отсутствие клеточной смерти (рис. 3b). Пятно нефти-красный-O (Оро) была исполнена на 51 день старый SWAT с локализацией пятно липидов в пределах фиксированной Адипоцит кластеров, указав, что SWAT адипоцитов поддержания жизнеспособности с нетронутыми адипоцитов даже в передовых timepoints (рис. 3 c).

Immunocytochemistry (ICC) была исполнена продемонстрировать ожидаемых белков и локализации зрелых Адипоцит маркеров в долине Сват. Нетронутыми SWAT пластины окрашивали антител против perilipin (ab3526, разведение 1: 200), PPARγ2 (sc-166731, разведение 1: 100) и FABP4 (ab92501, 1:1,000 разрежения). Конфокальный изображения 12 день старый SWAT продемонстрировал ожидаемые локализации perilipin вокруг липидного капель поверхности (рис. 4a). Микроскопии флуоресцирования 3 дневных Сват с липидов счетчика пятно BODIPY показал FABP4 локализации в цитоплазме (Рисунок 4b), и перекрытия сигнала от PPARG и DAPI пятнать продемонстрировал локализации PPARG в ядро ( Рисунок 4 c).

SWAT транскрипционный анализ профиля оценивалась в ткани, отобранный из нескольких предметов (n = 4 доноров). После сбора часть жировой ткани использовался для базового извлечение RNA (d0), в то время как остальные был использован для семян SWAT пластины. Эти плиты были затем собирают на 24 ч, 14 дней и 28 дней в долине Сват культуры. Одношаговая Количественная обратная транскрипция полимеразной цепной реакции (RT-ПЦР) была проведена для определения уровней транскрипции. Были рассмотрены шесть ключевых Адипоцит генов: PPARG, FABP4, LPL, CEBPA, HSL и ADIPOQ (рис. 5). ACTB был использован в качестве внутреннего контроля и transcriptional уровни были выражены в процентах от выражения соответствует теме базовых (d0). Все гены продемонстрировали надежные транскрипции в долине Сват, хотя уровни вниз тенденцию с течением времени. Мы считаем, что наблюдаемые транскрипционный анализ профиля может быть улучшена с дальнейшей оптимизации средств массовой информации, как мы подробно в разделе обсуждения.

Базальная Эндокринная функция была оценена на же культур, используемых для транскрипционный анализ профиля. Супернатант была собрана из знаков Сват и лептина были измерены используя энзим соединенный assay иммуносорбента (ELISA) (ab100581). SWAT отображается секреция лептина базальной в дней 1, 14 и 28 (рис. 6a). ADSC листы велись параллельно с знаков Сват как элемент управления (то есть, ADSC листы без зажатой Ват). Выделяется лептина не могут быть обнаружены в этих элементах управления (данные не показаны).

Чтобы определить ли SWAT может поддерживать потенциал для ответа индуцибельной со временем, был рассмотрен липолиз (n = 4). Для оценки индуцибельной липолитических способности, фарш часть свеже собранных Ват (d0) и адипоцитов ферментативно были изолированы (аналогично SWAT урожай в протокол раздел 5), в то время как остальные был использован для заполнения знаков Сват. Изолированные адипоцитов инкубировали за 3 ч при 37 ° C в 300 мкл 2% бесплатно жирные кислоты бычьим сывороточным альбумином в HBSS с 100 мкм форсколин, эпинефрин 1 мкм либо управления буфера. Глицерин уровни в собранных средств массовой информации была измерена с свободный глицерин реагента. SWAT был затем собирают на дни, 1 и 5 и липолитических потенциала были оценены таким же образом. Химические стимуляции увеличилась Глицерин выпуска значительно на всех трех timepoints (Рисунок 6b): Глицерин выпуска очищенных адипоцитов был увеличен в d0 Ват на 82 ± 46% (p = 0,01), 1-день SWAT 577 387% ± (p = 0.02) и SWAT 5 дневный 348 ± 343% (p = 0.03). означают уровни глицерина в стимулированных адипоцитов были очень похожи во всех трех timepoints: первичный Ват 5.2 ± 0,8, 1-день SWAT 4.4 ± 1,9 и 5-дневный SWAT 4,8 ± 1,8 мкг глицерина/мг общего белка. Означает глицерола уровни управления (т.е. базальный липолиз) были относительно высокими в свеже собранных Ват (d0) по сравнению с SWAT-собирают клетки. Это может быть связано увеличение стресса Ват ткани в d0 во время хирургического иссечения, транспорт в лаборатории и мясорубки. Однако эти эксперименты демонстрируют не уменьшение объема липолитических в Сват на 1 или 5 дней по сравнению с свеже собранных Ват.

Сват была продемонстрирована быть способны трансплантации и восстановления в модели мыши (n = 4) как проявление функции сложных, целые тканей. Это также возможно применение платформы следует исследователя желание использовать SWAT для манипулирования Ват в vitro перед пересадкой тканей в животной модели. Сват была культивировали в течение 10 дней и собирают, используя стандартный протокол; изолированные адипоцитов от знаков Сват были затем загружается в 1 мл шприц (без иглы). Разрез был сделан под кожу на спинной стороне ослабленным eGFP выражая мышей (Нод. CG-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl Tg(CAG-EGFP)1Osb/SzJ). Это создало спинной подкожной небольшой карман в который культивированный SWAT адипоцитов вводили с шприц, и карман был затем зашивается закрыт. После 10 дней после пересадки мышей были принесены в жертву. Пересадки были хорошо видны и легко восстановлены (рис. 7a). Восстановленные трансплантации и мыши контралатеральной жировых депо были исправлены, парафин встроенные и секционного. Иммуногистохимия была исполнена на секционного слайды с первичных антител против GFP (A10262, разведение 1: 100) и человека PLIN (sc-390169, разведение 1: 100). Выбранный анти PLIN антитела экспериментально был апробирован пятно человека PLIN но не мыши. Адипоцитов от восстановленных пересадки были примерно 50 – 120 мкм в размер, который представляет ожидаемый диапозон для человека адипоциты, и полностью отрицательным для GFP (рис. 7b). Однако приблизительно 31% адипоцитов были положительными для человека PLIN, указанием успешного приживления в хозяина. Адипоцитов в жировых депо мыши были размером 20 – 40 мкм, которая согласуется с адипоцитов мыши, в то время как окрашивание полностью позитивные для GFP и полностью отрицательным для человека PLIN (рис. 7 c). ADSC листы (с не слоеное Ват) были царапины от блюда культуры клеток и пересадили мыши как элемент управления. Однако эти не дали каких-либо для восстановления ткани (данные не показаны). Это сообщили, что восстановленные адипоцитов от зрелых культивировали SWAT и не в результате дифференцированной человеческого ADSCs.

Figure 1
Рисунок 1: SWAT метод. () схема из СПЕЦНАЗА показаны передачи листа eGFP меченых ИСС от культуры ткани с покрытием pNIPAAm блюдо на второй, неподписанном лист ИСС, выращенных на стандартные ткани культуры блюдо. Фарш, первичный человека Ват зажата между 2 листов ИСС. (b) флуоресцентной микроскопии демонстрации Brightfield, GFP и Объединенные каналы Сват, созданного метода, описанного в подпункте (a). Шкалы бар = 100 µm. (c) цифровой фотографией представителя, 5 дневных SWAT, культивируемых в стандартной 6-ну пластине. Большой объем Ват стабильно крепится к нижней части колодца. Рисунок изменяется от Лау и др. 11 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: SWAT остается жизнеспособной в 8 недель культуры. Серийный brightfield изображений одного кластера SWAT свыше 55 дней демонстрирует не морфологических изменений в соответствии с клеточной смерти. Масштаб баров = 100 µm. фигура изменяется от Лау и др. 11 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: SWAT остается жизнеспособной в более чем 50 дней. () Нила красного окрашивания демонстрирует окрашивание ограничение для SWAT, культивируемых на 15 дней, указывающее живой жизнеспособных адипоцитов. Окружающие стромальные клетки сделал не оставляет пятен. Рисунок находятся на 40 X увеличение и шкалы бар = 100 µm. (b) пропидий йодид (PI) пятная Сват культивировали для 53 дней показывает полный Пи исключение, указывающее смерти не Адипоцит; Шкалы бар = 100 µm. (c) масло-красный-O окрашивание 51 день старый SWAT демонстрирует ограничение нейтральные липиды адипоциты, указывающее долгосрочной стабильности Адипоцит клеточных мембран. Рисунок изменяется от Лау и др. 11 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: Immunocytochemistry демонстрирует, что SWAT пятна положительно для зрелой Адипоцит ячейки маркеры с ожидаемой локализации. () Confocal микроскопии 2 недели старый SWAT показали клетки человека PLIN + однокамерные с локализацией поверхности капли липидов. Шкалы бар = 100 µm. (b) флуоресцентной микроскопии 3 дневных Сват показали человека FABP4 + клетки с локализацией в цитоплазме и (c) PPARγ + клетки с локализации клеточное ядро. Шкалы бар = 100 µm. фигура изменяется от Лау и др. 11 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5: SWAT поддерживает ключевые Адипоцит экспрессии генов в личность. Кластеры SWAT были коллагеназы, переваривается после 1, 14 и 28 дней в культуре и гена выражении определяется RT-ПЦР. RT-ПЦР показывает, что 1-дневных и 14-дневных SWAT сохранить высокий уровень () PPARG, (b) FABP, (c) HSL, (d) CbEBPA, (e) LPL и (f) ADIPOQ. ACTB был использован как ссылка ген. Баров ошибка стандартная ошибка =. Рисунок изменяется от Лау и др. 11. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 6
Рисунок 6: SWAT basally выделяет адипокинов и физиологически реагирует на стимуляции катехоламинов. () ELISA количественной 24 h лептина базальной секреции показывает никаких существенных изменений после 28 дней в культуре. (b) адренергической стимуляции с адреналина и форсколин генерирует значительные гликолитических ответ в свежеубранных первичной Ват (1.7 x) и тема соответствует SWAT в 1 и 5 дней в культуре. День 1 SWAT ответ катехоламинов стимул с 6.3-fold увеличением базальной гликолиза в то время как SWAT 5 день продемонстрировали 3,3 раза увеличить над базальной гликолиза. Стимулируется гликолиз не был значительно отличается в Сват, по сравнению с соответствием свежие Ват (p = 0,53, n = 4). Баров ошибка стандартная ошибка =. Фигура-изменение Лау и др. 11. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 7
Рисунок 7: SWAT может быть имплантированных в естественных условиях, демонстрируя сохранены функции всей ткани. () SWAT был легко визуализировать через 10 дней после трансплантации в ослабленным мышь (звездочка). Был имплантирован успешно не Сват, на 10 дней некротические SWAT бы был сжиженный. (b) разделы восстановленные SWAT продемонстрировал большой, однокамерные адипоцитов (диаметров 50 до 120 мкм), которые были eGFP-. 31,3% адипоцитов были человеческие PLIN +. Человека PLIN + адипоциты, как правило, меньше, которое будет соответствовать с клинических наблюдений приживления жира в организме человека где меньше адипоцитов больше шансов выжить передачи. Шкалы бар = 100 мкм, 200 крат. (c) контралатеральной жира колодки, взяты из же мышей продемонстрировали гораздо меньше адипоцитов (20 – 40 мкм) и человека PLIN-. Шкалы бар = 100 мкм, 200 крат. Рисунок изменяется от Лау и др. 11. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Этот протокол подробности использования ADSCs для сэндвич человека белой жировой ткани; человеческого ADSC клеточных линий могут быть изолированы через устоявшихся протоколы15. Однако система может быть адаптирована для удовлетворения потребностей индивидуальных исследований (например, использование 3T3L-1 клетки мыши сэндвич Ват). Этот процесс включает в себя обработку первичных человеческих тканей. Стандартные меры предосторожности должны применяться; обрабатывать ткани человека как BSL-2 патогены (например, ВИЧ, гепатита). Обрабатывать только ткани непосредственно под BSC. Одежда всех соответствующих СИЗ, диктуемые стандартами институциональной безопасности — двойных перчаток настоятельно рекомендуются. Правильно лечить все поставки и переработки отходов с 10% отбеливателя или 70% этанола решения до повторного использования или утилизации.

Первым важным шагом в культуре SWAT сводничество и поддержание культуры ткани с покрытием pNIPAAm пластины. Такие плиты доступны коммерчески, или они могут быть произведены через установленные методы12,,1314. Эти пластины являются температура отзывчивым клетки культуры поверхности. Выше критической температуры (~ 32 ° C) поверхности гидрофобные и клетки будет придерживаться, похож на других обработанных пластмасс для культуры ткани. Однако ниже этой критической температуры, поверхность становится гидрофильным и клетки будут отмежеваться от пластиковой поверхности16. As a Result, следует установить: 1) как быстро тип заданной ячейки будет отмежеваться от монослое до достижения полной confluency (т.е., во время изменения нормальных средств массовой информации) и 2) время, необходимое для снижения температуры с желатином поршень применяется к пластине с покрытием pNIPPAm, чтобы обеспечить, что разъединяет всю ячейку листа. Средства массовой информации изменения должны выполняться с носителя нагревают до 37 ° C; Если клетки склонны к быстрой диссоциации, выполните изменения СМИ на блоке тепла, набор до 37 ° C под BSC.

Второй важный шаг обработки жировой ткани для подготовки посева SWAT. Мы провели нашу характеристику путем измельчения Ват с стерильный пинцет и стерилизованные бритвы. Однако человека фасции нельзя вырезать легко с бритвой. Максимальное соотношение Адипоцит фасции имеет важное значение для сохранения столько жировой ткани в SWAT как можно более длительный период времени. Большие куски нетронутыми фасции предотвратит ячеек контакт между ADSCs и адипоциты, который необходим для поддержания SWAT вместе. Чрезмерное количество фасция также может иметь эффект «тянет на поток». В то время как единый кластер Ват может отмежеваться от плиты не затрагивая соседние кластеров, несколько кластеров, соединены фасции может тянуть достаточно кластеры покинуть монослоя оказать SWAT хорошо непригодным для использования. Липосакция, который включает в себя, механизированной мясорубки Ват, может обойти этот вопрос, как фасции мелко рубленый во время операции. Однако во время липосакции, обычно лечат больных с высокими дозами адреналина; возможные последствия этого лечения на ткани (и последующих экспериментов) должны учитываться в ходе исследования.

Последний важный шаг в SWAT культуры является выбор экспериментальных носителей культуры. Мы провели наши первоначальные характеристики эксперименты, используя формулировку культуры стандартная ячейка (10% FBS, 1 x пенициллина/стрептомицина в среде DMEM). Однако, основанный на имеющейся литературе относительно максимального Адипоцит транскрипции, мы использовали специализированные разработки (7 мкм инсулин, дексаметазон 30 мкм, 1 x пенициллина/стрептомицина в СМИ M199)17. Эта формулировка улучшить уровень ранней транскрипции, но уровни снизились со временем. Мы считаем, что это потому, что в организме, адипоциты подвергаются широкий спектр химических сигналов, часто Велоспорт между государствами кормили и голода в течение дня. Таким образом это должно быть возможность улучшить наблюдаемых транскрипционный анализ профиля со временем путем дальнейшей оптимизации добавки для наших СМИ культуры клеток.

SWAT урожая (протокол, раздел 5) изолирует адипоцитов от культуры, уменьшает объем образца и удаляет помехи от окружающих ADSC листов. Это может предшествовать Адипоцит гомогенизации, (который является необходимым для белков и нуклеиновых кислот изоляции), или функциональные assays нетронутыми адипоцитов (например гликолиз или Глюкоза поглощения анализов). Кроме того нетронутыми SWAT пластины могут быть собраны для иммуноцитохимическое окраски, которая позволяет ADSC листы для обеспечения Ват кластеров в монослое на протяжении всего процесса окрашивания. В этом случае аспирационная культуры средств массовой информации и исправить всю культуру через стандартные протоколы. Однако мы рекомендуем добавить coverslip стекла перед изображений для выравнивания 3D Адипоцит кластеры и улучшить в результате качество изображения.

Мы считаем, что SWAT имеет огромный потенциал как наркотик, скрининг платформы. Техника проста, воспроизводимые и использует обычные культуры ткани пластины. Таким образом наркотиков скрининг эксперименты исполняемый путем добавления фармакологически активного соединения к питательной среды. Адипоцитов затем могут быть собраны для изучения влияния комплекса на экспрессию генов, эпигеномные профиль, чувствительность инсулина, и т.д. , помимо экологических токсинов для культуры среднего аналогичным образом могут быть использованы для изучения их влияния на адипоциты. Потому что SWAT позволяет исследователю отслеживать отдельные Адипоцит кластеры с течением времени, это однозначно подходит для оценки лечения, что делает видимые фенотипические изменения адипоцитов. Ярким примером бы человека Адипоцит «Браунинг», где белый, липидов хранение Адипоцит становится «коричневого цвета» или аналогичные термогенный, многокамерный коричневый Адипоцит18. Это явление потенциально крупные клинической значимости, которая была продемонстрирована в моделях мыши, но не в человека. Совместно культивируемых вариации на SWAT также занимают огромные исследования потенциальных. SWAT является естественным Сопредседатель культуры системы, которая использует стандартные ячейки культуры скважин. Таким образом один можно поддерживать адипоцитов среди других типов клинически значимых клеток, изменив sandwiching клетки или используя вставки мембраны культуры ткани. К примеру гепатоциты может функционировать в качестве верхней sandwiching клеток листа на экране наркотиков, которая фильтруется через печень до достижения жировой ткани. Кроме того раковые клетки можно выращивать на вставке мембраны над SWAT для изучения, как адипоцитов способствовать онкологической патологии.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Авторы хотели бы признать институциональной поддержки, оказываемой LSU медицинских наук центр, который финансировал проект.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x HBSS Thermofisher 14185052
Gelatin Sigma-aldrich G9391
Collagenase Sigma-aldrich C5138
Adenosine Sigma-aldrich A9251
DMEM Thermofisher 11995065
M199 Media Thermofisher 11043023 Phenol red-free 
250 µm Mesh Filter Pierce 87791
0.2 µm Syringe Filter Celltreat 229747
5 mL Luer-Lok syringes  BD 309646
Metal Washers These are simple metal washers and can be bought at any hardware store. They simply add leight weight to the backs of the plugers to ensure even contact between cells and gelatin, while being easy to stock and sterilize. Approximate mass: 6.3 g 
Name Company Catalog Number Comments
Heated Equipment
Incubated Orbital Shaker VWR 10020-988 Samples should be pitched at 45° angle to facilitate collagenase digestion
Heat Block Set to 37-40 °C and placed under Biosafety Cabinet
Water Bath Set to ~75 °C
Name Company Catalog Number Comments
Specialized Plastics
Upcell Dishes 6cm of 6-multiwell Nunc 174902  or 174901 These are commerically available pNIPAAm-coated dishes which can be used to grow the upper sheet of ADSCs. Alternatively, pNIPAAm-coated plates can be produced in-lab. diameter: <6 cm for 6 cm dish, <3.5 cm for 6-well plate; approximate mass: 6.7g for 6 cm dish, 5.1 g for 6-well plate
Plastic Plunger Apparatus These can be fashioned to fit within desired pNIPAAm-coated plastics (multiwell plates, petri dishes). They are comprised of a simple stem attached to a circular disk. They can be produced in-lab or by any facility that can fashion acrylic plastics

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cawley, J., Meyerhoefer, C. The medical costs of obesity: An instrumental variables approach. Journal of Health Economics. 31 (1), 219-230 (2012).
  2. Pi-Sunyer, X. The Medical Risks of Obesity. Postgraduate Medicine. 121 (6), 21-33 (2009).
  3. Smith, U. Morphologic studies of human subcutaneous adipose tissue in vitro. Anatomical Record. 169 (1), 97-104 (1971).
  4. Sugihara, H., Yonemitsu, N., Miyabara, S., Yun, K. Primary cultures of unilocular fat cells: characteristics of growth in vitro and changes in differentiation properties. Differentiation. 31 (1), 42-49 (1986).
  5. Sugihara, H., Yonemitsu, N., Toda, S., Miyabara, S., Funatsumaru, S., Matsumoto, T. Unilocular fat cells in three-dimensional collagen gel matrix culture. The Journal of Lipid Research. 29, 691-697 (1988).
  6. Hazen, S. A., Rowe, W. A., Lynch, C. J. Monolayer cell culture of freshly isolated adipocytes using extracellular basement membrane components. The Journal of Lipid Research. 36, 868-875 (1995).
  7. Fried, S. K., Kral, J. G. Sex differences in regional distribution of fat cell size and lipoprotein lipase activity in morbidly obese patients. International Journal of Obesity. 11 (2), 129-140 (1987).
  8. Sutherland, M. L., Fabre, K. M., Tagle, D. A. The National Institutes of Health. Microphysiological Systems Program focuses on a critical challenge in the drug discovery pipeline. Stem Cell Research and Therapy. 4, (2013).
  9. Wikswo, J. P. The relevance and potential roles of microphysiological systems in biology and medicine. Experimental Biology and Medicine. 239 (9), 1061-1072 (2014).
  10. National Institutes of Health. NIH-CASIS Coordinated Microphysiological Systems Program for Translational Research in Space (#RFA-TR-18-001). , Available from: https://grants.nih.gov/grants/guide/rfa-files/RFA-TR-18-001.html (2017).
  11. Lau, F. H., Vogel, K., Luckett, J. P., Hunt, M., Meyer, A., Rogers, C. L., Tessler, O., Dupin, C. L., St Hilaire, H., Islam, K. N., Frazier, T., Gimble, J. M., Scahill, S. Sandwiched White Adipose Tissue: A Microphysiological System of Primary Human Adipose Tissue. Tissue Engineering Part C: Methods. 24 (3), (2018).
  12. Ebara, M., Hoffman, J. M., Stayton, P. S., Hoffman, A. S. Surface modification of microfluidic channels by UV-mediated graft polymerization of non-fouling and 'smart' polymers. Radiation Physics and Chemistry. 76, 1409-1413 (2007).
  13. Lin, J. B., Isenberg, B. C., Shen, Y., Schorsch, K., Sazonova, O. V., Wong, J. Y. Thermo-responsive poly(N-isopropylacrylamide) grafted onto microtextured poly(dimethylsiloxane) for aligned cell sheet engineering. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 99, 108-115 (2012).
  14. Turner, W. S., Sandhu, N., McCloskey, K. E. Tissue Engineering: Construction of a Multicellular 3D Scaffold for the Delivery of Layered Cell Sheets. Journal of Visualized Experiments. (92), e51044 (2014).
  15. Bunnell, B., Flaat, M., Gagliardi, C., Patel, B., Ripoll, C. Adipose-derived stem cells: Isolation, expansion and differentiation. Methods. 45 (2), 115-120 (2008).
  16. Akiyama, Y., Kikuchi, A., Yamato, M., Okano, T. Ultrathin poly(N-isopropylacrylamide) grafted layer on polystyrene surfaces for cell adhesion/detachment control. Langmuir. 20 (13), 5506-5511 (2004).
  17. Fried, S. K., Russell, C. D., Grauso, N. L., Brolin, R. E. Lipoprotein lipase regulation by insulin and glucocorticoid in subcutaneous and omental adipose tissues of obese women and men. Journal of Clinical Investigation. 92 (5), 2191-2198 (1993).
  18. Keipert, S., Jastroch, M. Brite/beige fat and UCP1 - is it thermogenesis? Biochimica et Biophysica Acta. 1837 (7), 1075-1082 (2014).

Tags

Поведение выпуск 138 жировой ткани адипоциты ожирение microphysiological систем органов на фишки наркотиков скрининг разработки лекарственных средств токсичности для окружающей среды основная культура диабет метаболизм
Microphysiologic платформа для человеческого жира: зажатой белой жировой ткани
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Scahill, S. D., Hunt, M., Rogers, C. … More

Scahill, S. D., Hunt, M., Rogers, C. L., Lau, F. H. A Microphysiologic Platform for Human Fat: Sandwiched White Adipose Tissue. J. Vis. Exp. (138), e57909, doi:10.3791/57909 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter