Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Behavior
Click here for the English version

Behavior

İnsan yağı için bir Microphysiologic Platform: beyaz yağ dokusu sandviç

Published: August 15, 2018 doi: 10.3791/57909
Automatic Translation
1, 2, 2, 2
1Department of Pharmacology, Louisiana State University Health Sciences Center, 2Department of Surgery, Louisiana State University Health Sciences Center

Summary

Beyaz Yağ dokusundan (WAT) farmakolojik geliştirme ve metabolik çalışmalar engelleyen onun geçerli birincil kültür modelleri içinde önemli eksiklikleri vardır. Burada, bir yağ microphysiological sistem tarafından sandviç WAT levha stromal hücreler arasında üretmek için bir protokol mevcut. Bu yapıyı birincil WAT kültür için istikrarlı ve uyarlanabilir bir platform sağlar.

Abstract

Beyaz Yağ dokusundan (WAT) ağırlık ve her gün sağlık düzenlenmesinde önemli bir rol oynar. Yine de, mevcut birincil kültür modelleri, tüm bunların sadakatle adipose microenvironment özetlemek veya WAT canlılık iki hafta ötesinde genişletmek için başarısız olmuş önemli sınırlamalar vardır. Güvenilir birincil kültür manken eksikliği ciddi araştırma WAT metabolizma ve ilaç geliştirme engellemektedir. Bu amaçla NIH'ın standartları için WAT birincil kültür 'SWAT' (gözükeceksin beyaz yağ dokusu) adı verilen yeni bir platform geliştirmek için bir microphysiologic sisteminin kullanılan. Adiposit doğal yüzdürme kıyılmış WAT kümeleri stromal hücreler yağ kaynaklı levha arasında sandviç tarafından üstesinden gelmek. Bu yapıyı kültür uygun üzerinde sekiz hafta WAT örnekleri var. SWAT sağlam ECM, hücre hücre kişiler ve in vivo WAT koşullardan fiziksel baskılara tutar; Ayrıca, SWAT sağlam bir transkripsiyon profil eksojen kimyasal sinyal ve bütün doku fonksiyon duyarlılık korur. SWAT birincil adipose kültür basit, tekrarlanabilir ve etkili bir yöntem temsil eder. Büyük olasılıkla, WAT fizyolojisi, patofizyolojisi, metabolizma ve ilaç geliştirme araştırmaları genel olarak uygun bir platformdur.

Introduction

Yağ dokusu içinde ABD1147 milyar dolar ve 210 milyar dolar arasında doğrudan yıllık tıbbi maliyeti taşır obezite birincil organıdır. Yağ doku birikimi de önde gelen diğer kalp hastalığı, tip II diyabet ve kanser2belirli türleri gibi ölüm nedenleri katkıda bulunur. Vitro kültür modelleri metabolik çalışmaları ve ilaç geliştirme için gerekli olan, ama yağ dokusu geçerli araştırma modelleri büyük eksiklikleri var. Adiposit kırılgan, neşeli ve ölümcül hücre kültür plastikler için uygun olmaz ve bu nedenle geleneksel hücre kültür yöntemleri kullanarak kültürlü cant hücreleri Ayrıştırılan. Cam coverslips, tavan kültür, süspansiyon kültür ve ekstraselüler matrisler3,4,5, kullanımı da dahil olmak üzere bu engelleri aşmak için girişimleri birkaç yöntem kullanılmıştır 1970'lerden beri 6 , 7. ancak, bu yöntemlerin hücre ölümü ve dedifferentiation tarafından işaretlenmiş ve genellikle en fazla bir iki haftalık çalışma dönemi için kullanılır. Ayrıca, bu modeller yapmak değil kalkışmak gibi sağlam ECM korumak değil, etkileşimleri adiposit arasında ve stromal hücreler destek, ne de contractile kuvvetleri hücrelerin birbirlerine içinde içinde vivo sarfetmek yerli adipose microenvironment özetlemek WAT.

Altın standart birincil adipose kültür yöntemi yokluğunda, öncelikle farklılaştırılmış öncesi adiposit üzerinde (diffAds) yağ araştırma güvendi. DiffAds multilocular, yapışık ve metabolik olarak aktif. Buna karşılık, birincil beyaz adiposit üniloküler, nonadherent ve nispeten düşük metabolizma göstermek. Sağlıklı Olgun yağ dokusu fizyolojisi özetlemek için geçerli adipose kültür modellerin büyük olasılıkla doğrudan hedef adiposit FDA onaylı ilaçlar yokluğunda önemli bir faktör başarısızlıktır. Aslında, fizyolojik vitro organ modelleri büyük bir sorun birçok organ ve hastalık olmaması.

Onun pozisyon kağıt, Microphysiological sistemleri (MPS) programın yaratılması duyurmak Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) tüm insan ilaç klinik çalışmalar arasında 2013 başarı oranı sadece %18 için faz II ve Evre III için % 50 olduğunu bildirdi Klinik çalışmalarda8. MPS programı doğrudan vitro Monokültür yetersizlik modeli insan fizyolojisi için karşılayacak şekilde tasarlanmıştır. NIH MPSs insan birincil veya kök hücreler organ işleyen özetlemek çok hücreli 3D yapıları içinde oluşan kültür sistemleri olarak tanımlar. Homojen, ölümsüzleştirdi hücre kültürleri indirgemeci modellerinin MPSs doğru bir şekilde hücre-hücre, hücre içi uyuşturucu, ilaç-ilaç ve organ-ilaç etkileşimleri9modeli. Kısa vadeli birincil kültür yöntemlerinden farklı olarak, NIH standartları 4 haftadan kültür8MPS sürdürülebilirlik dikte. NIH'ın RFAs (#RFA-TR-18-001)10, MPS programının daha fazla bilgi bulunabilir.

Basit, bir roman, uyarlanabilir, geliştirdiğimiz ve ucuz yağ MPS olarak adlandırdığı "beyaz yağ dokusu sandviç" (SWAT)11. "Sandviç" kıyılmış birincil yağ dokusu stromal hücreler (ADSCs) (resim 1) yağ kaynaklı levha arasında tarafından adiposit doğal yüzdürme üstesinden gelmek. Elde edilen 3D yapı hücre-hücre iletişim ve doğal yağ microenvironment bir doğal adipocyte destek hücre popülasyonu içeren olgun adiposit çevreleyen tarafından beyannamedir. SWAT 8 haftalık canlılığı, eksojen sinyal, adipokine salgılanması ve engraftment bir hayvan modeli içine yanıt gösteren tarafından doğrulandı.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm görevler uyum içinde #8759 ve #9189, iletişim kuralları için gerçekleştirilen IRB Office LSUHSC-NO. tarafından onaylanmış Uyum içinde iletişim kuralı # LSUHSC-No IACUC ofiste tarafından onaylanmış 3285 için gerçekleştirilmiş tüm hayvan işleri

1. hücre sayfaları sandviç tohum

Not: Bkz. Şekil 1.

  1. Tohum ADSCs, yaklaşık % 80'i confluency doku kültürü tabak (6 cm veya 6-şey tabak) içinde. 1 geleneksel doku kültürü iyi ve 1 kuyusu doku kültürü poly(N-isopropylacrylamide (pNIPAAm) kaplı plastik plaka üzerinde karşılık gelen boyut SWAT istenen her şey için tohum.
    Not: Buna göre bir 6-şey tabak SWAT hücreleri bir 6-şey standart doku kültürü plaka (temel katman) ve bir doku kültürü 6-şey pNIPAAm kaplı levha (üst katman) tohum gerektirir. pNIPAAm kaplamalı plakalar ticari olarak satın alınabilir veya laboratuvar12,13,14üretilen.
  2. 37 ° C ve % 5 CO2 içinde Dulbecco'nın modifiye kartal Orta (10 ile desteklenmiş DMEM) ADSCs korumak % FBS ve 1 x penisilin/streptomisin. Medya 2 günde değiştirin.
  3. Onlar % 100 birleşmesi olmak ve bir çizgili desen (yaklaşık 6-8 gün) almak kadar birleşim hücrelere izin.
    Not: Bu hücreler batmaz yağ dokusu stabilize etmek için bir tek sağlam hücre sayfası çalışması gerekir. Yeterince konfluent hücreleri WAT ile tohum üzerine parçası.

2. SWAT malzemeleri hazırlanması

  1. Birkaç 10 mL aliquots, 1 x Hank'in dengeli tuz çözüm (HBSS) hazırlamak; yedek birim ile plakalar için istediğiniz sayıyı yetecek hazırlayın.
  2. Dalgıç aparatı SWAT tohum için hazırlayın. Yuvarlak bir diske bağlı bir kök oluşur, basit akrilik plastikler kullanarak pistonu oluşturmak. Doku kültürü wells çevresi içinde sığdığından emin olun (çapı: < için 6 cm çanak, 6 cm < 6-şey plaka için 3,5 cm; yaklaşık kitle: 6 cm yemek, bir 6-şey plaka için 5,1 g için 6,7 g).
    1. Yordamı sorunsuz durumda herhangi bir bireysel pistonu ile ilgili bir sorun çalışır emin olmak için ekstra itici hazırlayın.
    2. Laboratuvar bant dalgıç diskin kenarında etrafında sarın jelatin çözüm kaçağı önlemek için en az 2 x.
    3. Biyogüvenlik kabini (BSC) % 70 ile sprey alkol. 15 mL konik tüp raf BSC boş, kapağını 15 mL konik tüpler içinde aşağı sprey; tüpler jelatin itici yerleşimini güvenli yardımcı olacaktır.
    4. Her bant sarılmış dalgıç iyice %70 alkol ve yer ile raf bir 15 mL konik tüp içine sprey. Metal rondelalar (yaklaşık kitle 6.3 g) sprey ve bir çift çengel forseps ile birlikte rafta koyun; contalar ağırlık-ecek eklemek için itici SWAT tohum sırasında.
    5. BSC kanat ve UV kurutma ve sterilizasyon kolaylaştırmak ışık.
      Not: İdeal olarak, bu adım SWAT tohum önce 24 h kuralları. Alternatif olarak, işlem doku toplama/SWAT tohum günde yapmak; Ancak, bu durumda, 15-45 dk UV kurutma/sterilizasyon için izin verir.

3. jelatin itici hazırlanması — üst hücre sayfalara uygulama

  1. Bir su banyosu ile 75 ° c ısı
  2. Jelatin çözüm 1 x HBSS 10 mL hisse senedi için 0.75 g jelatin tozu ekleyerek hazırlayın. Bir duman başlık altında çözüm pH dengelemek için 1 M NaOH 100 µL ekleyin.
    1. 10 mL hisse senetleri için su banyosu ekleyin ve çözüm toz eriyene kadar şiddetle her 5 dk sallamak. Yakında sıcak su banyosu ekledikten sonra toz jelatin boşanmak hedefliyoruz.
    2. BSC üfleyici açmak, UV ışığı söndür ve kanat yükseltmek. BSC yüzey sprey ve filtre malzemeleri (5 mL radarı-kilit şırınga ve 0.2 µm şırınga filtreler) hazırlamak. Verimli bir şekilde jelatin itici için uygulamak için yeterli miktarda zorlanma için birden çok filtre hazır olun.
  3. Jelatin çözüm homojen bir tutarlılık ulaştığında, çözüm filtre ve itici için uygulayın. Jelatin şırınga yükleyin. Jelatin şırınga filtresi (~2.5 mL 6-şey tabağı, 6 cm yemek için ~4.5 mL) ile plastik itici uygulayın ve (~ 20 dk) kuvvetlendirmek için izin.
  4. Jelatin katı olduğunda, itici kenarından teyp paketini açmak. Çengel forseps ile jelatin pistonu dış kenarından kaldırmak (Yani, menisküs yükseltilmiş kenarlarını). Pistonu merkezinde kalan jelatin tamamen düzeyde olduğundan emin olun iletişim ADSC levha ile en üst düzeye çıkarmak için.
  5. Yavaşça bir kez aşırı jelatin kaldırılır, jelatin itici pNIPAAm kaplı ADSC plakaları için geçerlidir. Metal rondelalar pistonu tartmak için kullanın. Hücre sayfaları itici uygulanırken kesme değil.
  6. Oda sıcaklığında 1,5 saat için hücre sayfalardaki itici bırakın. Plakalar/itici ayrılma pNIPAAm kaplı plaka yüzeyinden hücre sayfasının tamamlamak 1,5 saat için bir buzlu su banyosunda kuluçkaya.
    1. Buz banyosunda kuluçka sırasında dikkatli olun; Kuluçka sırasında hücre medya kirletmek buz banyosu izin vermez.
    2. Kuluçka tamamladıktan sonra alt non-steril su kaldırmak için pNIPAAm kaplı plakaların temiz.

4. beyaz yağ doku işleme

  1. İnsan yağ dokusu işletim odasından toplarken, tüm örnekleri buza SWAT seribaşı kadar olan steril bir kap içinde tutun. Steril bakım medya, fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS), gibi doku istikrar için yağ dokusu kapsayıcı ekleyin.
  2. 1.5 mL microcentrifuge tüpler olmak her şey/yemek için soğuk hücre kültür ortamına seribaşı (6-şey plaka için 100 µL, 6 cm yemek için 200 µL) ekleyin.
  3. Yağ dokusu kıyma.
    1. Katı yağ dokusu kesimine yönelik aşağıdaki gibi yapın.
      1. Yağ dokusu 3 büyük parçalarını yıkayın steril PBS x ve mümkün olduğu kadar PBS kaldırın.
      2. Kaba doku forseps ve steril ustura ile kıyma ve çok damarlara ve fasya mümkün olduğunca kaldırın (daha fazla ayrıntı için konuya bakın).
      3. İnce kadar kıyılmış doku üzerinde kalın, sıvı tutarlılık alır ustura ile yağlı kıyma.
        Not: Bu her zaman mümkün olmasa da ideal doku WAT görünür hiçbir bireysel parçaları ile homojen görünür.
    2. Lipoaspirate aşağıdaki gibi işlem.
      1. BSC altında bir ölçek üst üzerinde steril gazlı bez bant ve bu kabı herhangi bir aşırı sıvı toplamak için daha büyük bir ölçek içinde yer.
      2. 25 mL serolojik pipet kullanarak, fazla lipoaspirate gerektiği gibi çizmek ve steril gazlı bez yüzey için geçerlidir. PBS doğrudan bu yüzey için lipoaspirated yağ yıkamayı ve aşırı kan ve lipid kalıntı kaldırmak için geçerlidir.
      3. Forseps süzülmüş doku kurtarmak, steril bir kıyma yüzeye aktarmak ve lipoaspirate bin dereden su getirmek için kullanın.
  4. Steril bir ustura p1000 pipet ipuçları kıyılmış doku aktarmak için distal ucunu kesmek için kullanın; Bu adipocyte lizis yol açabilir kesme stres en aza indirmek olacaktır. Uygun doku tutarlılık ulaşıldığında kıyılmış doku istenen hacmi her 1,5 mL tüp (300-400 µL 6-şey plaka için 500-600 µL 6 cm yemek için) aktarın. Kıyılmış WAT ve tüpler medyada kısaca karıştırın.
  5. Taban ADSC plakaları almak ve medya dikkatle boşaltmak/Aspire edin. WAT/medya karışımı her 1,5 mL tüp ile ortamı değiştirin.
    1. Yavaşça jelatin itici pNIPAAm kaplı plakalar kaldır ve WAT karışıma taban ADSC plakaları üzerinde uygulayabilirsiniz. Hücresel dekolmanı onaylamak için bir mikroskop altında pNIPAAm kaplı plakaların monolayer inceleyin.
  6. Yaklaşık olarak 37-40 ° c lisans altında bir ısı blok ayarlayın. Hala yerinde itici ile tabakalar ısı bloğunun yüzeye hareket. 2-3 mL ılık kültür hücreleri kuluçkaya ve jelatin erime kolaylaştırmak için medya ekleyin.
  7. ~ 30 dakika sonra plaka yüzeyinden itici yavaşça çıkarın. Temel doku kültürü tabak kapakları yerine ve bir hücre kültür kuluçka taşıyın. Jelatin tamamen 37 ° C'de sıvılaşmış, Aspire edin ve hücre kültür ortamı değiştirin.
  8. Fenol red-Alerjik M199 orta 7 µM insülin, 30 µM deksametazon, 1 x 37 ° C ve % 5 CO2 ' de SWAT korumak penisilin/streptomisin. Ortamda yaklaşık 2 mL 6-şey plakaları için ve 3 mL 6 cm yemekler için korumak. Medya 2 günde değiştirin.

5. SWAT hasat

  1. Collagenase (0,5 mg/mL collagenase, 500 nM Adenozin, PBS) hazırlamak aliquots 15 mL konik tüpler (yaklaşık hacmi 10 mL). Tüpler donma ve onları-20 ° C'de depolayın
  2. Herhangi bir kültür ortamından hücreleri Aspire edin, 1 x PBS ile yıkayın ve PBS Aspire edin. Collagenase aliquots bir 37 ° C su banyosunda çözdürme tarafından hazırlayın.
    Not: İdeal olarak, 37 ° C collagenase çözüm ulaşacak; hemen sonra doku ekleyin.
  3. Tüm doku SWAT plaka için bireysel aliquots ekleyin. Bir steril hücre kavgacı tip kullanarak SWAT hasat ve collagenase aliquots kesme p1000 pipet ucu ile aktarmak. Doku collagenase solüsyon içeren doğrudan 15 mL konik tüpler için ekleyin.
    1. Alternatif olarak, bir 50 mL konik tüp doku/collagenase karışımı kuluçkaya; artan yüzey alanı daha fazla enzimatik sindirim kolaylaştıracaktır.
  4. Örnek tüpler bir inkübe orbital çalkalayıcı 45 ° açıyla yerleştirin. 30-60 dk 37 ° C'de 200 devirde kuluçkaya.
  5. Yer 250 µm koleksiyonu için yeni 15 mL konik tüp içine filtre kafes. Filtre sindirilmiş adipocyte solüsyonu dökün.
    Not: Bu tüm hücreleri fibröz doku filtreleme süre geçmesine izin verir.
  6. Faz ayrılması için izin vermek için oda sıcaklığında 5 min için oturmak akışı aracılığıyla izin.
    Not: yağ stromal hücreler (ASCs) alt aşamalar halinde razı olacak iken adiposit çözüm dön yüzer olacak. Santrifüjü 500 x g de 5 min için Ayrıca hücre ayırma veya ADSCs Pelet çevreleyen hasat maksimize edebilirsiniz.
  7. Bir kesme p1000 pipet ucu kullanarak, adipositler (collagenase çözüm üst yüzen tabaka) 1.5 mL microcentrifuge toplama tüp aktarın. Yavaş yavaş adiposit toplamak için tüp kenarı boyunca pipet ~ 250 µL teker teker alarak.
    1. Tüpü yavaşça içeriye doğru kalarak hücre kurtarma maksimize etmek için adiposit toplarken döndürün. 1.5 mL microcentrifuge tüp dolu olduğu kadar daha fazla hücre çizim tutmak.
  8. Aşırı sıvı bir iğne (~ 21 G) bağlı bir Ģırınga kullanarak izole adiposit kaldırın. İğneyi yüzen adipocyte tabaka altında daldırın. Kısa bir süre için iğne mili kalarak hücreler çıkarmak için iğne kışkırtmak ve sonra dön yüzer yerinden çıkar adiposit bekleyin.
  9. Yavaş yavaş adiposit istenmeyen kaldırılmasını önlemek için dikkatli olmak aşırı sıvı çizin. Microcentrifuge tüp mezuniyet sürekli örnek birimleri belirlemek için kullanın (Örneğin,. 0.1 mL her örnek için).
  10. İzole hücre DNA/RNA ayıklama, Glikoz alımı tahlil, lipoliz tahlil, vb için kullanın

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

SWAT canlılığı başlangıçta bireysel WAT kümeleri seri aydınlık alan görüntüleme tarafından değerlendirildi (n = 12) yaklaşık 7.6 hafta içinde. Kümeleri güvenli monolayer bu süre boyunca üzerinde yerinde kaldı. Hafif morfolojik değişiklikler ile biraz çözgü veya konumları değişen bireysel adiposit gözlendi. Ancak, adipositler de zamanla dedifferentiation eksikliği gösteren multilocular haline, ne de herhangi bir görünür işaretleri hücresel blebbing, lizis veya parçalanma (Şekil 2) gibi hücre ölümü sergilemek mi. Adipocyte kimliği kümelerinin 2 hafta önceki SWAT lipid leke Nil kırmızı (NR) ile teyit edildi. Açık NR üniloküler adipocyte kümeleri boyama bunlar gerçekten sağlam membranlar, yerine artifakı, kist veya ölü adiposit adiposit olduğunu belirtti. NR çevreleyen ADSC sayfalarında boyama yokluğu bu hücreler değil lipid birikimi ve bu nedenle doğru bir Adipojenik lineage kendilerini (Şekil 3a) ayırt değil gösterir. Propidium iyodür boyama 53 bayat SWAT üzerinde gerçekleştirildi. Gelişmiş timepoints, adipocyte kümeleri içinde leke dışlanması hücre ölümü (Şekil 3b) eksikliği gösterir. Petrol-kırmızı-O (ORO) leke SWAT adiposit canlılığı ile gelişmiş timepoints (Şekil 3 c), bile bozulmamış adiposit korumak gösteren lipid leke sabit adipocyte kümeleri içinde yerelleştirme ile 51 bayat SWAT üzerinde gerçekleştirildi.

Immunocytochemistry (ICC) beklenen protein ifade ve yerelleştirme olgun adipocyte işaretleri SWAT içinde göstermek için gerçekleştirildi. Sağlam SWAT tabak lekeli perilipin (ab3526, 1: 200 seyreltme), karşı antikor ile PPARγ2 (sc-166731, 1: 100 seyreltme) ve FABP4 (ab92501, 1:1,000 seyreltme). 12 günlük eski SWAT confocal görüntüleri perilipin lipid damlacık yüzeyi (Şekil 4a) çevresine beklenen yerelleştirme gösterdi. Floresans mikroskobu 3 bayat SWAT lipid sayaç leke BODIPY ile FABP4 yerelleştirme (4b rakam) sitoplazma içinde gösterdi ve sinyal PPARG ve DAPI örtüşen boyama PPARG yerelleştirme için çekirdek ( gösterdi Şekil 4 c).

SWAT transkripsiyon profil değerlendirilen birden fazla konu seribaşı doku (n = 4 bağış). Dinlenme kullanılır iken koleksiyon yağ dokusu bir kısmını için bir temel RNA ayıklama (d0), tohum SWAT plakaları için kullanıldı. Bu levhalar, 24 h, 14 gün ve SWAT kültürünün 28 gün sonra hasat edildi. Tek adımlı nicel Ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPCR) transkripsiyon düzeylerini belirlemek için gerçekleştirildi. Altı anahtar adipocyte genler inceledi: PPARG, FABP4, LPL, CEBPA, HSL ve ADIPOQ (Şekil 5). ACTB bir iç denetimi olarak kullanıldı ve transkripsiyon düzeyleri temel (d0) konu eşlemeli ifade bir yüzdesi olarak ifade edildi. Seviyeleri aşağı zaman içinde eğilim, ancak tüm genler SWAT, sağlam transkripsiyon gösterdi. Tartışma bölümünde ayrıntılı olarak transkripsiyon profilleri daha fazla medya optimizasyon ile geliştirilebilir gözlenen inanıyorum.

Bazal endokrin işlevi transkripsiyon profil için kullanılan aynı kültürü üzerinde değerlendirilmiştir. Süpernatant SWAT plakalar toplanan ve leptin düzeyleri enzim bağlı immunosorbent assay (ELISA) (ab100581) kullanılarak ölçüldü. SWAT bazal leptin salgı gün 1, 14 ve 28 (Şekil 6a) görüntülenir. ADSC sayfaları SWAT plakalı paralel denetimi (Yani, sandviç WAT olmadan ADSC çarşaf) olarak muhafaza. Salgılanan leptin (veri gösterilmez) bu denetimlerde tespit edilemedi.

SWAT kapasite indüklenebilir müdahale için zaman içinde korumak olabilir olup olmadığını belirlemek için lipoliz incelenmiştir (n = 4). İndüklenebilir lipolytic kapasitesini değerlendirmek için taze toplanan WAT (d0) bir kısmı kıyılmış ve diğer SWAT plakaları tohum için kullanılan süre adiposit enzimatik (SWAT hasat Protokolü bölüm5 benzer), izole. İzole adiposit 3 h %2 yağ asit içermez Sığır serum albümin HBSS içinde 100 µM forskolin, 1 µM epinefrin veya denetimi arabellek ile 300 µL 37 ° C'de inkübe. Gliserol düzeyleri toplanan medya ücretsiz gliserol reaktif ile ölçülen. SWAT sonra 1 ve 5 ile lipolytic kapasite aynı şekilde değerlendirilmiştir gün hasat. Kimyasal uyarımı arttı gliserol yayın önemli ölçüde üç timepoints (Şekil 6b): tedavi adiposit sürümü gliserol d0 WAT 82 ± 46 oranında artış oldu (p 0,01 =), 1 gün SWAT 577 ± 387 oranında (p = 0.02) ve beş gün SWAT 348 ± %343 (p = 0,03). uyarılmış adiposit gliserol düzeyleri arasında tüm üç timepoints çok benzer olduğu anlamına: birincil WAT 5.2 ± 0.8, 1 günlük SWAT 4.4 ± 1.9 ve 5 günlük SWAT 4,8 ± 1.8 µg gliserol/mg toplam protein. Ortalama gliserol düzeyleri kontrol (Yani, bazal lipoliz) nispeten taze toplanan WAT (d0) SWAT hasat hücreleri ile karşılaştırıldığında yüksekti. Bu WAT doku d0, artan stres nedeniyle cerrahi eksizyon, laboratuvar ve kıyma taşıma sırasında olabilir. Ancak, bu deneyler SWAT 1 veya 5 gün taze toplanan WAT ile karşılaştırıldığında, lipolytic kapasite yok düşüklüğü göstermektedir.

SWAT gösterdi nakli ve bir fare modeli kurtarma kapasitesine sahip olmak için (n = 4) karmaşık, Bütün doku fonksiyon bir gösteri olarak. Ayrıca olası bir uygulama platformu araştırmacı hayvan bir modele doku nakli önce WAT vitro işlemek için SWAT yararlanmak isteyen gerekir 's. SWAT 10 gün boyunca kültürlü ve standart protokolü kullanan hasat; SWAT plakalar üzerinden izole adiposit sonra 1 mL şırınga (olmadan bir iğne) içine doluydu. Bir kesik bir immün eGFP ifade fareler (NOD. sırt tarafındaki derinin altında yapıldı CG-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl Tg(CAG-EGFP)1Osb/SzJ). Bu içine SWAT kültürlü adiposit şırınga ile enjekte edildi ve cep sonra sütüre küçük bir dorsal subkutan cep oluşturulan kapalı. 10 gün sonra sonrası nakli, fareler kurban edildi. Nakli açıkça görülebilir ve kolayca (şekil 7a) kurtarıldı. Kurtarılan nakli ve bir fare kontralateral yağ deposu sabit, gömülü ve kesitli parafin. İmmünhistokimya kesitli slaytlara GFP (A10262, 1: 100 seyreltme) ve insan PLIN (sc-390169, 1: 100 seyreltme) karşı birincil antikorlar ile gerçekleştirildi. Seçili anti-PLIN antikor deneysel olarak insan PLIN ama değil fare leke doğrulandı. Adiposit kurtarılan nakli üzerinden yaklaşık 50-120 µm boyutunda insan adiposit için beklenen Aralık olan ve tamamen GFP (şekil 7b) için negatif vardı. Ancak, adipositler % 31'i ev sahibi içine başarılı engraftment gösteren insan PLIN için olumlu idi. Adiposit fare yağ depoları içinde 20-40 GFP ve tamamen tamamen pozitif boyama iken fare adiposit ile tutarlıdır µm negatif insan PLIN (Şekil 7 c) ölçekli. ADSC sayfalarıyla (gözükeceksin hiçbir WAT) hücre kültür yemekleri dan alıntı ve fareler denetimi olarak nakledilen. Ancak, bunlar kurtarılabilir herhangi bir doku (veri gösterilmez) vermemiştir. Bu kurtarılan adiposit olgun kültürlü SWAT ve farklılaştırılmış insan ADSCs değil sonucu olduğunu belirtti.

Figure 1
Şekil 1: SWAT yöntemi. (bir) şematik olarak ASCs eGFP etiketli bir levha transfer pNIPAAm kaplı doku kültürü gösterilen SWAT bir standart doku kültürü çanak üzerinde yetiştirilen ASCs ikinci ve etiketlenmemiş yaprağının üzerine çanağı. Kıyılmış, birincil insan WAT 2 ASCs çarşafların arasında sandviç olduğunu. (b) floresan mikroskopi aydınlık alan, GFP ve açıklanan tekniği ile oluşturulan bir SWAT birleştirilmiş kanallarını gösteren içinde (a). Ölçek çubuğu 100 µm. (c) dijital fotoğraf bir temsilcisi, kültürlü bir standart 6-şey tabak içinde 5 bayat SWAT =. WAT büyük miktarda stabil kuyunun için güvenli. Şekil Lau ve arkdeğiştirilir. 11 Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: SWAT kalır uygun 8 hafta kültür. Seri aydınlık alan 55 gün içinde tek bir SWAT kümesi görüntüleme hücre ölümü ile tutarlı morfolojik değişiklik gösterir. Ölçek çubukları = 100 µm. Şekil Lau ve arkdeğiştirilmiş. 11 Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: SWAT 50 gün daha büyük, uygun kalır. (bir) Nil kırmızı boyama boyama kısıtlama canlı canlı adiposit gösteren 15 gün, kültürlü SWAT için gösterir. Stromal hücreler çevreleyen leke değil. Şekil vardır 40 X büyütme ve ölçek çubuğu 100 µm. (b) Propidium iyodür (PI) boyama 53 günüm ortaya PI dışlama, tamamlamak için kültürlü SWAT gösteren adipocyte ölüm yok; = Ölçek çubuğu 100 µm. (c) yağ-kırmızı-O = Toplam 51 boyama bayat SWAT kısıtlama adiposit için nötr lipitler ve adipocyte hücre zarlarında uzun vadeli istikrar gösteren gösterir. Şekil Lau ve arkdeğiştirilir. 11 Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: Immunocytochemistry gösterir SWAT olumlu olgun adipocyte hücre işaretleri ile beklenen yerelleştirme için lekeleri. 2 haftalık SWAT (bir) Confocal mikroskobu insan PLIN + üniloküler hücreler ile yerelleştirme lipid damlacık yüzeye olduğu ortaya çıktı. Ölçek çubuğu = 100 µm. (b) floresan mikroskopi 3 bayat SWAT, insan FABP4 + hücre sitoplazma ve (c) PPARγ + hücrelere yerelleştirme yerelleştirme için hücre çekirdeği ile birlikte ortaya çıkar. Ölçek çubuğu = 100 µm. Şekil Lau ve ark. değiştirilmiş 11 Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5: SWAT tutar anahtar adipocyte kimlik gen ekspresyonu. SWAT kümeleri 1 sonra 14 ve 28 gün kültür ve gen ifadesinde RT-qPCR tarafından belirlenen sindirilmiş collagenase vardı. RT-qPCR gösterir 1 bayat ve 14 günlük eski SWAT yüksek düzeyde (bir) PPARG, (b) FABP, (c) HSL, (d) CbEBPA, (e) LPL korumak ve (f) ADIPOQ. ACTB referans gen kullanıldı. Hata çubukları standart hata =. Şekil Lau ve ark. modifiye 11. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 6
Şekil 6: SWAT basally adipokines salgılar ve fizyolojik katekoiamin uyarmaya yanıt. 24 h bazal leptin salgı (bir) ELISA miktar kültüründe 28 gün sonra önemli bir değişiklik gösterir. (b) epinefrin ve forskolin ile Adrenergic stimülasyon oluşturur önemli bir glycolytic yanıt taze hasat birincil WAT (1.7 x) ve konu 1 ile 5 gün kültür SWAT eşleştirdi. 5 gün SWAT 3.3-fold bir artış gösterdi üzerinde bazal glikoliz iken 1 gün SWAT 6.3-fold bir artış katekoiamin uyarıcı üzerinde bazal glikoliz karşılık verdiler. Uyarılan glikoliz SWAT için eşleşen taze WAT karşılaştırıldığında önemli ölçüde farklı değildi (p = 0,53, n = 4). Hata çubukları standart hata =. Bir rakamdır tarihinde Lau vd. 11. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 7
Şekil 7: SWAT-ebilmek var olmak reimplanted içinde vivo, korunmuş bütün doku fonksiyon gösteren. (bir) SWAT kolayca görüntülenmeyecektir 10 gün sonra bir immün fare (yıldız işareti) içine nakli yapıldı. SWAT başarıyla implante vardı, tarafından 10 gün nekrotik SWAT sıvılaşmış. Kurtarılan SWAT bölümlerini (b) eGFP - vardı en büyük, üniloküler adiposit (çapı 50-120 µm) gösterdi. 31.3 adiposit % insan PLIN + idi. İnsan PLIN + adiposit daha küçük, hangi şişman insanlarda aşılama klinik gözlemleri ile daha küçük adiposit transfer hayatta kalmak daha büyük olasılıkla nerede uyabilecek eğiliminde. Ölçek çubuğu = 100 µm, 200 X büyütme. (c) kontralateral yağ yastıkları aynı fare alınan çok daha küçük adiposit (20-40 µm) gösterdi ve insan PLIN - vardı. Ölçek çubuğu = 100 µm, 200 X büyütme. Şekil Lau ve ark. değiştirilir 11. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu iletişim kuralı sandviç insan beyaz yağ dokusu ADSCs kullanımına detayları; insan ADSC hücre hatları via köklü protokolleri15ayrılmış olabilir. Ancak, sistem (örneğin sandviç fare WAT hücrelere 3T3L-1 kullanarak) bireyselleştirilmiş araştırma gereksinimleri için adapte edilebilir. Bu işlem birincil insan dokusu işleme içerir. Standart güvenlik önlemlerini istihdam edilmelidir; insan doku (Örneğin, HIV, HepC) BSL-2 patojen işlemek. Sadece doğrudan bir lisans altında doku başa. Kurumsal güvenlik standartları tarafından dikte edildiği gibi tüm uygun KKE giymek — çift eldiven dağlık salık vermek. Düzgün tüm malzemeleri dezenfekte ve atıkların % 10 ile çözüm veya % 70 etanol çözüm yeniden kullanım veya elden çıkarma önce çamaşır suyu.

SWAT kültürünün ilk kritik adım tedarik ve doku kültürü pNIPAAm kaplı levhalar korumak. Böyle plakaları ticari olarak kullanılabilir veya kurulan yöntemleri12,13,14üretilebilir. Bu tabakları sıcaklık duyarlı hücre kültür yüzeyler vardır. Kritik sıcaklık (~ 32 ° C), yukarıda hidrofobik yüzeydir ve hücreleri, benzer diğer işlem görmüş plastikler için doku kültürü uygun olacaktır. Ancak, bu kritik sıcaklık altında yüzey hidrofilik olur ve hücreleri plastik yüzey16ayırmak. As a result, kurmaya özen gösterilmelidir: 1) ne kadar çabuk belli bir hücre türü tam confluency (Yani, normal ortam değişiklikleri sırasında) ve 2) jelatin ile sıcaklığı düşürmek için gerekli zaman ulaşmadan önce monolayer ayırmak dalgıç pNIPPAm kaplı plakasına uygulanan tüm hücre sayfası ayrışıp emin olmak için. Medya değişikliklerini 37 ° C sıcak medya ile yapılmalıdır; hücreler için hızlı ayrılma yatkındır, 37 ° C altında lisans kümesine bir ısı blokta ortam değişiklikleri gerçekleştirin.

İkinci önemli adım SWAT tohum için hazırlamak için yağ dokusu işliyor. Biz bizim karakterizasyonu sterilize forseps ve steril jilet ile WAT kıyma tarafından gerçekleştirilen. Ancak, insan fasya kolayca bir ustura ile kesilemiyor. Adipocyte fasya oranı en üst düzeye kadar yağ dokusu SWAT içinde uzun vadeli bir süre içinde mümkün olduğunca korumak önemlidir. Sağlam fasya parça büyük SWAT bir arada tutmak için gerekli olan hücre-hücre iletişim ADSCs ve adipositler, arasındaki engeller. Fasya aşırı miktarda da "bir iş parçacığı üzerinde çekerek" bir etkiye sahip olabilir. Tek bir WAT küme komşu kümeleri etkilemeden bir tabaktan ayırmak, ancak, birden çok küme fasya tarafından bağlı yeterli kümeleri bir monolayer bir SWAT de kullanılamaz hale gelmesine neden kapalı indirebiliriz. Fasya ameliyat sırasında ince kıyılmış olarak liposuction, mekanize kıyma Wat içerir, bu sorun değiştirebilir. Ancak, liposuction sırasında hastalara rutin olarak yüksek doz epinefrin ile kabul edilir; Bu tedavinin doku (ve sonraki deneyler) olası sonuçları için bir çalışma sırasında muhasebesi gerekir.

SWAT kültürünün son kritik adım deneysel bir kültür ortamı seçimi. Standart hücre kültür formülasyonu kullanmak bizim ilk karakterizasyonu deneyler yapılır (% 10 FBS, 1 x penisilin/streptomisin DMEM içinde). Ancak, mevcut edebiyat dayalı ile ilgili olarak adipocyte transkripsiyon en üst düzeye çıkarma, biz özel bir formülasyon kullanılan (7 µM insülin, 30 µM deksametazon, 1 x penisilin/streptomisin M199 medya)17. Bu formülasyon transkripsiyon erken düzeyleri, ancak zamanla azaldı düzeylerini geliştirmek. Bunun nedeni, vücutta, çok çeşitli kimyasal sinyalleri, adipositler maruz kez bir gün boyunca aç ve beslenen devletler arasında Bisiklete binme inanıyorum. Böylece, daha fazla takviyeleri hücre kültür medya için optimize ederek zaman içinde gözlenen transkripsiyon profil geliştirmek mümkün olacaktır.

SWAT hasat (protokol, Bölüm 5) adiposit kültüründen izole, numune hacmi azaltır ve girişim çevreleyen ADSC sayfalarından kaldırır. Bu (protein veya nükleik asit yalıtım için gerekli olan) adipocyte homojenizasyon öncesinde veya fonksiyonel, bozulmadan deneyleri adiposit (örneğin glikoliz veya glikoz alımı deneyleri). Alternatif olarak, bozulmamış SWAT plaka immunocytochemical için boyama, boyama işlemi boyunca monolayer WAT kümelere güvenliğini sağlamak ADSC sayfaları sağlayan hasat edilebilir. Bu durumda, Kültür medya Aspire edin ve standart protokolleri üzerinden tüm kültür düzeltin. Ancak, bir cam coverslip 3D adipocyte kümeleri düzleştirmek ve sonuçta elde edilen görüntü kalitesini artırmak için görüntüleme önce eklemenizi öneririz.

SWAT büyük bir potansiyele platformu eleme bir ilaç olarak inanıyoruz. Tekniği basit, tekrarlanabilir ve geleneksel doku kültürü plakaları kullanır. Bu nedenle, uyuşturucu tarama deneyler kültür ortamına farmakolojik aktif bir bileşik ekleyerek yürütülebilir. Adiposit sonra bileşik gen ekspresyonu, epigenetik profil, insülin duyarlılık, çevresel toksinler kültür ortamına ilavesi benzer şekilde adiposit üzerindeki etkileri incelemek için kullanılan vb üzerindeki etkisini incelemek için hasat edilebilir. SWAT bireysel adipocyte kümeleri zaman içinde izlemek araştırmacı verdiğinden, adiposit için görünür fenotipik değişiklik bir tedavi değerlendirmek için benzersiz olarak uygundur. Önemli bir örnek insan adipocyte "esmerleşme," neyin "usanmış" veya benzer bir termojenik, multilocular kahverengi adipocyte18beyaz, lipid depolama adipocyte olur olacaktır. Bu fare modelleri, ama asla bir insan göstermiştir potansiyel olarak büyük klinik önemi bir olgudur. SWAT Co kültürlü varyasyonları da büyük araştırma potansiyel tutun. SWAT standart hücre kültür wells kullanan bir doğal ortak kültür sistemidir. Bu nedenle, bir sandwiching hücreleri değiştirerek veya doku kültürü membran ekler kullanan diğer klinik hücre tipleri arasında adiposit koruyabilirsiniz. Örneğin, hepatosit karaciğer yağ dokusu ulaşmadan önce süzülür bir uyuşturucu ekran için üst sandwiching hücre sayfa olarak işlev olabilir. Aynı şekilde, kanser hücrelerinin bir membran eklemek nasıl kanser patolojiye adiposit katkıda incelemek için SWAT üzerinde büyümüş olabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Yazarlar LSU Sağlık Bilimleri proje finanse Merkezi tarafından sağlanan kurumsal destek kabul etmek istiyorum.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x HBSS Thermofisher 14185052
Gelatin Sigma-aldrich G9391
Collagenase Sigma-aldrich C5138
Adenosine Sigma-aldrich A9251
DMEM Thermofisher 11995065
M199 Media Thermofisher 11043023 Phenol red-free 
250 µm Mesh Filter Pierce 87791
0.2 µm Syringe Filter Celltreat 229747
5 mL Luer-Lok syringes  BD 309646
Metal Washers These are simple metal washers and can be bought at any hardware store. They simply add leight weight to the backs of the plugers to ensure even contact between cells and gelatin, while being easy to stock and sterilize. Approximate mass: 6.3 g 
Name Company Catalog Number Comments
Heated Equipment
Incubated Orbital Shaker VWR 10020-988 Samples should be pitched at 45° angle to facilitate collagenase digestion
Heat Block Set to 37-40 °C and placed under Biosafety Cabinet
Water Bath Set to ~75 °C
Name Company Catalog Number Comments
Specialized Plastics
Upcell Dishes 6cm of 6-multiwell Nunc 174902  or 174901 These are commerically available pNIPAAm-coated dishes which can be used to grow the upper sheet of ADSCs. Alternatively, pNIPAAm-coated plates can be produced in-lab. diameter: <6 cm for 6 cm dish, <3.5 cm for 6-well plate; approximate mass: 6.7g for 6 cm dish, 5.1 g for 6-well plate
Plastic Plunger Apparatus These can be fashioned to fit within desired pNIPAAm-coated plastics (multiwell plates, petri dishes). They are comprised of a simple stem attached to a circular disk. They can be produced in-lab or by any facility that can fashion acrylic plastics

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cawley, J., Meyerhoefer, C. The medical costs of obesity: An instrumental variables approach. Journal of Health Economics. 31 (1), 219-230 (2012).
  2. Pi-Sunyer, X. The Medical Risks of Obesity. Postgraduate Medicine. 121 (6), 21-33 (2009).
  3. Smith, U. Morphologic studies of human subcutaneous adipose tissue in vitro. Anatomical Record. 169 (1), 97-104 (1971).
  4. Sugihara, H., Yonemitsu, N., Miyabara, S., Yun, K. Primary cultures of unilocular fat cells: characteristics of growth in vitro and changes in differentiation properties. Differentiation. 31 (1), 42-49 (1986).
  5. Sugihara, H., Yonemitsu, N., Toda, S., Miyabara, S., Funatsumaru, S., Matsumoto, T. Unilocular fat cells in three-dimensional collagen gel matrix culture. The Journal of Lipid Research. 29, 691-697 (1988).
  6. Hazen, S. A., Rowe, W. A., Lynch, C. J. Monolayer cell culture of freshly isolated adipocytes using extracellular basement membrane components. The Journal of Lipid Research. 36, 868-875 (1995).
  7. Fried, S. K., Kral, J. G. Sex differences in regional distribution of fat cell size and lipoprotein lipase activity in morbidly obese patients. International Journal of Obesity. 11 (2), 129-140 (1987).
  8. Sutherland, M. L., Fabre, K. M., Tagle, D. A. The National Institutes of Health. Microphysiological Systems Program focuses on a critical challenge in the drug discovery pipeline. Stem Cell Research and Therapy. 4, (2013).
  9. Wikswo, J. P. The relevance and potential roles of microphysiological systems in biology and medicine. Experimental Biology and Medicine. 239 (9), 1061-1072 (2014).
  10. National Institutes of Health. NIH-CASIS Coordinated Microphysiological Systems Program for Translational Research in Space (#RFA-TR-18-001). , Available from: https://grants.nih.gov/grants/guide/rfa-files/RFA-TR-18-001.html (2017).
  11. Lau, F. H., Vogel, K., Luckett, J. P., Hunt, M., Meyer, A., Rogers, C. L., Tessler, O., Dupin, C. L., St Hilaire, H., Islam, K. N., Frazier, T., Gimble, J. M., Scahill, S. Sandwiched White Adipose Tissue: A Microphysiological System of Primary Human Adipose Tissue. Tissue Engineering Part C: Methods. 24 (3), (2018).
  12. Ebara, M., Hoffman, J. M., Stayton, P. S., Hoffman, A. S. Surface modification of microfluidic channels by UV-mediated graft polymerization of non-fouling and 'smart' polymers. Radiation Physics and Chemistry. 76, 1409-1413 (2007).
  13. Lin, J. B., Isenberg, B. C., Shen, Y., Schorsch, K., Sazonova, O. V., Wong, J. Y. Thermo-responsive poly(N-isopropylacrylamide) grafted onto microtextured poly(dimethylsiloxane) for aligned cell sheet engineering. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 99, 108-115 (2012).
  14. Turner, W. S., Sandhu, N., McCloskey, K. E. Tissue Engineering: Construction of a Multicellular 3D Scaffold for the Delivery of Layered Cell Sheets. Journal of Visualized Experiments. (92), e51044 (2014).
  15. Bunnell, B., Flaat, M., Gagliardi, C., Patel, B., Ripoll, C. Adipose-derived stem cells: Isolation, expansion and differentiation. Methods. 45 (2), 115-120 (2008).
  16. Akiyama, Y., Kikuchi, A., Yamato, M., Okano, T. Ultrathin poly(N-isopropylacrylamide) grafted layer on polystyrene surfaces for cell adhesion/detachment control. Langmuir. 20 (13), 5506-5511 (2004).
  17. Fried, S. K., Russell, C. D., Grauso, N. L., Brolin, R. E. Lipoprotein lipase regulation by insulin and glucocorticoid in subcutaneous and omental adipose tissues of obese women and men. Journal of Clinical Investigation. 92 (5), 2191-2198 (1993).
  18. Keipert, S., Jastroch, M. Brite/beige fat and UCP1 - is it thermogenesis? Biochimica et Biophysica Acta. 1837 (7), 1075-1082 (2014).

Tags

Davranış sayı 138 yağ dokusu adipositler obezite microphysiological sistemleri cips uyuşturucu tarama ilaç geliştirme çevre toksisitesi birincil kültür diyabet metabolizma organları
İnsan yağı için bir Microphysiologic Platform: beyaz yağ dokusu sandviç
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Scahill, S. D., Hunt, M., Rogers, C. … More

Scahill, S. D., Hunt, M., Rogers, C. L., Lau, F. H. A Microphysiologic Platform for Human Fat: Sandwiched White Adipose Tissue. J. Vis. Exp. (138), e57909, doi:10.3791/57909 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter