Une plate-forme de Microphysiologic pour la graisse humaine : en sandwich le tissu adipeux blanc

Summary

Le tissu adipeux blanc (WAT) a des lacunes critiques dans ses modèles actuels de la culture primaire, qui entravent le développement pharmacologique et études métaboliques. Nous présentons ici un protocole visant à produire un système adipeux microphysiological par WAT intercaler entre deux feuilles de cellules stromales. Cette construction fournit une plateforme stable et adaptable pour la culture primaire de WAT.

Abstract

Le tissu adipeux blanc (WAT) joue un rôle crucial dans la régulation du poids et tous les jours de la santé. Néanmoins, il y a des limites importantes aux modèles disponibles culture primaire, qui n’ont pas fidèlement récapituler le microenvironnement adipeux ou prolonger la viabilité WAT au-delà de deux semaines. L’absence d’un modèle de culture primaire fiable entrave gravement recherche dans WAT du métabolisme et du développement des médicaments. À cette fin, nous avons utilisé des normes NIH d’un système de microphysiologic pour développer une nouvelle plate-forme pour la culture primaire de WAT appelée « SWAT » (sandwich le tissu adipeux blanc). Nous surmontons la flottabilité naturelle des adipocytes en intercalant hachées WAT grappes entre feuilles de cellules stromales dérivées d’adipeux. Dans cette construction, les échantillons WAT sont viables sur huit semaines de culture. SWAT maintient l’ECM intact, contacts cellule-cellule et les pressions physiques in vivo le conditions de WAT ; en outre, SWAT maintient un profil transcriptionnel robuste, sensibilité à la signalisation chimique exogène et fonction de tissus entiers. SWAT représente une méthode simple, reproductible et efficace de culture de tissu adipeuse primaire. Potentiellement, c’est une plateforme largement applicable pour la recherche en physiologie, physiopathologie, métabolisme et développement pharmaceutique WAT.

Introduction

Le tissu adipeux est le principal organe de l’obésité, qui transporte les coûts médicaux annuels directs entre $ 147 milliards et $ 210 milliards dans l’US¹. L’accumulation de tissu adipeux contribue également à d’autres causes principales de décès comme les maladies cardiaques, diabète de type II et certains types de cancer². Modèles de culture in vitro sont essentiels pour les études du métabolisme et le développement de médicaments, mais les modèles actuels de recherche du tissu adipeux ont des lacunes majeures. Les adipocytes sont fragiles, flottant et différencient en phase terminale des cellules qui ne peut pas adhérer aux plastiques de culture cellulaire et par conséquent ne peuvent pas être cultivées à l’aide de méthodes de culture cellulaire conventionnel. Depuis les années 1970, plusieurs méthodes ont été utilisés dans les tentatives pour surmonter ces obstacles, y compris l’utilisation de lamelles de verre, plafond culture, culture en suspension et matrices extracellulaires^{3,4,5, 6 , 7}. Toutefois, ces méthodes ont été marquées par la mort cellulaire et la dédifférenciation, et ils sont généralement utilisés pour pas plus d’une période d’étude de deux semaines. En outre, ces modèles ne pas récapituler le microenvironnement adipeux natif car ils ne conservent pas l’ECM intact, les interactions entre les adipocytes et stromales soutiennent les cellules, ni les cellules contractiles forces exercent les uns des autres en in vivo WAT.

En l’absence d’une méthode de culture de tissu adipeux primaire étalon-or, recherche adipeuse s’est appuyé principalement sur les pré-adipocytes différenciés (diffAds). DiffAds sont multiloculaire, adhérente et métaboliquement actives. En revanche, les adipocytes blancs primaires sont uniloculaires, non adhérentes et démontrent métabolisme relativement faible. L’échec des modèles actuels de culture de tissu adipeux à récapituler la physiologie des tissus sains d’adipeux mature est probablement un facteur important en l’absence de médicaments approuvés par la FDA qui ciblent directement les adipocytes. En fait, le manque de modèles d’organe physiologique in vitro est un problème majeur dans la plupart des organes et des maladies.

Dans son document annonçant la création de son programme de Microphysiological Systems (MPS), le National Institutes of Health (NIH) ont indiqué que le taux de réussite de 2013 à travers tous les essais cliniques pharmaceutiques humains était seulement 18 % pour la phase II et 50 % pour la phase III essais cliniques⁸. Le programme MPS est conçu pour traiter directement de l’incapacité de in vitro de la monoculture de la physiologie humaine modèle. Le NIH définit MPSs comme les systèmes de culture composés des humains primaires ou de cellules souches dans des constructions 3D multicellulaires qui récapitulent le fonctionnement des organes. Contrairement aux modèles réductionnistes de cultures de cellules immortalisées, homogène, MPSs devraient modeler exactement cellules, cellules drogue, médicamenteuses et orgue-drug interactions⁹. À la différence des méthodes de culture primaire à court terme, normes NIH dictent durabilité MPS pendant 4 semaines dans la culture⁸. On trouvera plus de détails sur le programme MPS à la NIH ad (#RFA-TR-18-001)¹⁰.

Nous avons développé un roman simple, adaptable, et peu coûteux MPS adipeuse appelé « en sandwich le tissu adipeux blanc » (SWAT)¹¹. Nous avons surmonté la flottabilité naturelle des adipocytes en « sandwich » haché primaire tissu adipeux entre les feuilles des cellules stromales dérivées d’adipeux (ADSCs) (Figure 1). La construction 3D résultante récapitule le contact de cellule-cellule et le microenvironnement adipeux natif en entourant les adipocytes matures avec une population de cellules de soutien naturel adipocyte. SWAT a été validé en démontrant la viabilité de 8 semaines, réponse à exogène de signalisation, sécrétion adipokine et greffe dans un modèle animal.

Protocol

Toutes les tâches ont été effectuées dans le respect des protocoles 8759 # et #9189, tel qu’approuvé par le Bureau de la CISR de LSUHSC-NO. Tous les animaux travaux ont été réalisés dans le respect du protocole #3285 approuvées par le Bureau de IACUC participant-no

1. ensemencement d’intercaler les feuilles de la cellule

Remarque : Voir la Figure 1.

1. ADSCs de semences à environ 80 % de confluence en plaques de culture de tissus (6 cm ou 6 plats). Pour chaque puits de SWAT désiré, graines 1 culture de tissus classique bien et 1 puits de taille correspondante sur la plaque de plastique de culture de tissu enduit de poly(N-isopropylacrylamide (pNIPAAm).
   Remarque : En conséquence, une plaque 6 puits de SWAT nécessiteront l’ensemencement des cellules sur une plaque standard 6 puits culture tissulaire (couche de base) et une plaque de culture de tissu enduit pNIPAAm 6 puits (couche supérieure). plaques de revêtement pNIPAAm peuvent être achetés dans le commerce ou produites en laboratoire^12,13,14.
2. Maintenir le ADSCs à 37 ° C et 5 % de CO₂ dans de Dulbecco modifié Eagle (DMEM) additionné de 10 % de SVF et 1 x pénicilline/streptomycine_. Modifier les médias tous les 2 jours.
3. Permettre aux cellules de fusionner jusqu'à ce qu’ils deviennent 100 % anastomosé et prennent un motif strié (environ 6 à 8 jours).
   Remarque : Ces cellules devra fonctionner comme une feuille unique cellule intacte afin de stabiliser le tissu adipeux flottant. Insuffisamment confluentes seront fragmenter après ensemencement avec WAT.

2. préparation des fournitures SWAT

1. Préparer plusieurs portions de 10 mL de 1 x Hank Balanced Salt Solution (HBSS) ; préparer suffisamment la quantité désirée de plaques avec volume à revendre.
2. Préparer l’appareil plongeur pour l’ensemencement de SWAT. Construire le piston à l’aide de simples plastiques acryliques, composés d’une tige attachée à un disque rond. Faire en sorte qu’elle s’inscrit dans la circonférence des puits de culture tissulaire (diamètre : < 6 cm pour 6 cm plat, < 3,5 cm pour plaque 6 puits ; masse approximative : 6,7 g pour un plat de 6 cm, 5,1 g pour une plaque 6 puits).
   1. Préparer les plongeurs supplémentaires pour s’assurer que la procédure se déroulera sans heurts en cas qu'il y a un problème avec n’importe quel plongeur individuel.
   2. Enroulez lab ruban sur le pourtour du disque piston, au moins 2 x, pour éviter les fuites de solution de gélatine.
   3. Vaporiser une armoire de sécurité biologique (BSC) avec 70 % EtOH. Pulvériser sur un support de tube à fond conique de 15 mL à l’intérieur de la BSC avec tubes coniques 15 mL de vide, non plafonnés ; tubes contribuera à garantir la mise en place des plongeurs de la gélatine.
   4. Vaporisez soigneusement chaque plongeur rubans avec 70 % EtOH et la place dans un tube conique 15mL sur la grille. Pulvériser les rondelles métalliques (masse approximative 6,3 g) et les placer sur la grille avec une paire de pinces crochu ; les rondelles ajoutera des poids pour les plongeurs lors de l’ensemencement de SWAT.
   5. Fermer la ceinture BSC et allumez la lampe à UV lumière pour faciliter le séchage et la stérilisation.
      NOTE : Idéalement, effectuer cette étape 24 h avant l’ensemencement de SWAT. Vous pouvez également diriger le processus sur le jour du tissu collection/SWAT ensemencement ; Toutefois, dans ce cas, laisser 15 – 45 min de séchage/stérilisation UV.

3. préparation de gélatine pistons — Application aux feuilles de cellule supérieure

1. Faire chauffer un bain d’eau à 75 ° C.
2. Préparer la solution de gélatine en ajoutant 0,75 g de poudre de gélatine à 10 mL de bouillon de 1 x HBSS. Sous une hotte aspirante ajouter 100 µL de 1 NaOH M pour équilibrer le pH de la solution.
   1. Ajouter les stocks de 10 mL pour le bain d’eau et agiter vigoureusement toutes les 5 min jusqu'à ce que la poudre se dissout dans la solution. But pour dissoudre la gélatine en poudre bientôt après l’ajout à la baignoire d’eau chaude.
   2. Mettre en marche le ventilateur BSC, éteindre la lumière UV et soulever le vantail. Vaporiser sur la surface de la BSC et préparer le filtre fournitures (seringues de 5 mL luer-lock et filtres de seringue 0,2 µm). Préparer plusieurs filtres pour filtrer efficacement des volumes suffisants de la gélatine à appliquer aux plongeurs.
3. Lorsque la solution de gélatine atteint une consistance homogène, filtrer la solution et l’appliquer sur les pistons. Charger la seringue avec de la gélatine. Appliquer les feuilles de gélatine pour les plongeurs en plastique à travers le filtre de seringue (~2.5 mL pour une plaque 6 puits, ~4.5 mL pour un plat de 6 cm) et laisser pour solidifier (~ 20 min).
4. Une fois la gélatine solide, déroulez le ruban du bord des plongeurs. Avec une pince crochetée, enlever les feuilles de gélatine du bord extérieur du piston (c.-à-d., les rebords du ménisque). S’assurer que les feuilles de gélatine restantes dans le centre du piston est absolument plat pour maximiser le contact avec la feuille de l’ADSC.
5. Une fois la gélatine excès est enlevé, appliquer doucement les plongeurs de la gélatine aux plaques ADSC pNIPAAm-enduit. Utiliser les rondelles métalliques à peser sur le piston. Pas cisaillement feuilles cellulaire tout en appliquant les plongeurs.
6. Laisser les plongeurs sur les feuilles de la cellule pendant 1,5 h à température ambiante. Incuber les plaques/pistons dans un bain d’eau glacée pendant 1,5 h terminer la dissociation de la plaque de cellules de la surface de la plaque de revêtement pNIPAAm.
   1. Faire preuve de prudence lors de l’incubation dans le bain de glace ; ne laissez pas le bain de glace contaminer les milieux cellulaires durant l’incubation.
   2. À l’issue de l’incubation, nettoyer le fond des plaques pNIPAAm-enduit pour enlever l’eau non stérile.

4. traitement de tissu adipeux blanc

1. Lors de la collecte des tissus adipeux humains de la salle d’opération, garder tous les échantillons dans un récipient stérile qui est sur la glace jusqu'à ce que le SWAT est pour l’ensemencement. Ajouter des éléments multimédias entretien stérile, comme une solution saline tamponnée au phosphate (PBS), au conteneur de tissu adipeux pour la stabilité des tissus.
2. Ajouter le milieu de culture de cellule glaciale à tubes de microcentrifuge de 1,5 mL pour chaque puits/plat à être ensemencé (100 µL pour une plaque 6 puits, 200 µL pour un plat de 6 cm).
3. Émincer le tissu adipeux.
   1. Cas de tissu adipeux plein, procédez comme suit.
      1. Laver les segments importants du tissu adipeux 3 x dans du PBS stérile et supprimer autant PBS que possible.
      2. Grossièrement hacher le tissu avec des pinces et rasoir stérile et supprimer autant de vascularisation et carénage que possible (voir pour plus de détails).
      3. Finement hacher gras avec le rasoir jusqu'à ce que le tissu haché prend une consistance épaisse et liquide.
         NOTE : Idéalement tissu paraîtra homogène avec les segments individuels pas visibles du WAT même si ce n’est pas toujours possible.
   2. Traiter les lipoaspirate comme suit.
      1. Sous le BSC, bande de gaze stérile sur le dessus d’un bol et placer ce bécher dans un plus grand bécher pour recueillir tout le liquide en excès.
      2. À l’aide d’une pipette sérologique de 25 mL, dessiner autant lipoaspirate selon les besoins et l’appliquer à la surface de la gaze stérile. Appliquer PBS directement sur cette surface à laver lipoaspirated de graisse et pour enlever le sang excédentaire et les résidus de lipides.
      3. Forceps permet de récupérer les tissus drainés, transférez-la sur une surface de hâchoir stérile et émincer le lipoaspirate.
4. Utiliser un rasoir stérile de couper l’extrémité distale du p1000 pointes de pipette de transfert tissu haché ; Cela réduira la contrainte de cisaillement qui peuvent conduire à la lyse adipocytaire. Après avoir atteint une consistance de bon tissu transfert le volume souhaité de tissu haché dans chaque tube de 1,5 mL (300 – 400 µL pour plaque 6 puits, 500 – 600 µL pour plat de 6 cm). Mélange haché WAT et médias brièvement dans les tubes.
5. Prenez les plaques ADSC et décanter/aspirer les médias. Remplacer les médias avec le mélange WAT/médias de chaque tube de 1,5 mL.
   1. Doucement, retirer les pistons de gélatine les plaques de revêtement pNIPAAm et appliquez-les au mélange WAT sur les embases ADSC. Examiner la monocouche des plaques pNIPAAm-enduit au microscope afin de confirmer le détachement cellulaire.
6. Définir un bloc chauffant à environ 37 – 40 ° C en vertu de la BSC. Avec les pistons toujours en place, déplacer les plaques à la surface du bloc de la chaleur. Ajouter 2 à 3 mL chauffé de milieux de culture pour Incuber les cellules et faciliter la fusion de la gélatine.
7. Après environ 30 min, retirez délicatement les plongeurs de la surface de la plaque. Remplacer les couvercles des plaques base culture de tissus et se déplacer dans un incubateur de culture cellulaire. Une fois que la gélatine a complètement liquéfié à 37 ° C, aspirer et remplacer les milieux de culture cellulaire.
8. Maintenir le SWAT à 37 ° C et 5 % de CO₂ dans un milieu M199 sans rouge de phénol avec 7 insuline µM, 30 dexaméthasone µM, 1 x pénicilline/streptomycine. Maintenir à environ 2 mL de milieu pour plaques 6 puits et 3 mL pour les plats de 6 cm. Modifier les médias tous les 2 jours.

5. récolte SWAT

1. Préparer la collagénase (collagénase de 0,5 mg/mL, 500 nM adénosine, dans du PBS) aliquotes dans des tubes coniques 15 mL (volume approximatif de 10 mL). Geler les tubes et les stocker à-20 ° C.
2. Aspirer à n’importe quel milieu de culture de cellules, laver 1 fois avec du PBS et aspirer puis PBS. Prép. les aliquotes de collagénase de les décongeler dans un bain-marie à 37 ° C.
   NOTE : Idéalement, la solution de collagènase atteindra 37 ° C ; immédiatement après, ajouter le tissu.
3. Ajouter tous les tissus de la plaque SWAT pour les portions individuelles. Récolter des SWAT à l’aide d’un racloir de cellule stérile et transférez-le vers les aliquotes de collagénase avec une pointe de pipette de coupure p1000. Ajouter le tissu directement sur les tubes coniques 15 mL contenant une solution de collagénase.
   1. Par ailleurs, incuber le mélange de tissus/collagénase dans un tube conique de 50 mL ; l’augmentent la surface facilitera davantage la digestion enzymatique.
4. Placer les tubes de l’échantillon dans un agitateur orbital incubé à un angle de 45°. Incuber à 200 tr/min, à 37 ° C pendant 30 à 60 min.
5. Place un 250 µm filtre mesh dans un nouveau tube conique 15 mL pour collection. Versez la solution adipocyte digérées par le filtre.
   Remarque : Cela permettra à toutes les cellules de traverser tout en filtrant les tissus fibreux.
6. Permettre accréditives à siéger pendant 5 min à température ambiante pour permettre à la séparation de phase.
   Remarque : Les adipocytes flottera jusqu’au sommet de la solution alors que les cellules stromales adipeuses (ASCs) seront déposent dans les phases plus bas. Centrifugation pendant 5 min à 500 x g peut également maximiser la séparation des cellules ou la récolte autour de ADSCs dans le culot.
7. À l’aide d’une pointe de pipette de coupure p1000, transférer les adipocytes (le calque flottant au dessus de la solution de collagènase) à un tube de prélèvement de microtubes de 1,5 mL. Prendre ~ 250 µL à la fois, Pipetter lentement le long du bord du tube pour recueillir les adipocytes.
   1. Tourner lentement le tube tout en collectant les adipocytes afin de maximiser la récupération des cellules adhérant à l’intérieur. Garder plus de cellules de dessin jusqu'à ce que le tube de microtubes de 1,5 mL est plein.
8. Retirer le liquide en excès les adipocytes isolés à l’aide d’une seringue jointe à une aiguille (~ 21). Immergez l’aiguille sous la couche flottante d’adipocytes. Agiter l’aiguille brièvement pour déloger les cellules adhérant à l’axe de l’aiguille et ensuite attendre les adipocytes délogées à flotter vers le haut.
9. Lentement, tirer le liquide en excès, en évitant la suppression involontaire des adipocytes. Graduations de tubes de microcentrifuge permet d’isoler systématiquement des volumes d’échantillon (par exemple. 0,1 mL pour chaque échantillon).
10. Utiliser les cellules isolées pour l’extraction de l’ADN/ARN, dosage de l’absorption de glucose, test de lipolyse, etc.

Representative Results

Viabilité de SWAT a été initialement évaluée par imagerie série fond clair de clusters individuels de WAT (n = 12) au cours des semaines environ 7,6. Les clusters est resté sécurisés en place sur la monocouche pendant tout ce temps. Légers changements morphologiques ont été observés avec les adipocytes individuels se déformant légèrement ou le déplacement des postes. Toutefois, les adipocytes ni devient multiloculaires au fil du temps, ce qui indique une absence de dédifférenciation, ni si ils montrent aucun signe visible d’apoptose cellulaire blebbing, lyse ou fragmentation (Figure 2). Adipocyte identité des grappes a été confirmée sur deux semaines SWAT avec tache lipidique du Nil rouge (NR). Claire NR coloration des grappes adipocyte uniloculaire, a indiqué qu’il s’agissait en effet d’adipocytes avec membranes intactes, plutôt que d’artefact, kystes ou adipocytes morts. L’absence de NR coloration dans les fiches environnantes de l’ADSC indique que ces cellules ne sont pas accumulation de lipides et par conséquent ne différenciant vers une lignée adipocytaire eux-mêmes (Figure 3 a). Iodure de propidium a été réalisée sur 53 jours SWAT. Exclusion de la tache au sein des groupes des adipocytes à avancé on montre une absence de mort cellulaire (Figure 3 b). Tache d’huile-rouge-O (ORO) a effectué 51 jours SWAT avec la localisation des tache lipidique dans les clusters de l’adipocyte fixe, indiquant que les adipocytes SWAT maintiennent la viabilité avec adipocytes intactes même à points avancés (Figure 3C).

Immunocytochimie (ICC) a été réalisée pour démontrer l’expression de la protéine attendue et localisation des marqueurs d’adipocytes matures au sein de SWAT. Plaques SWAT intacts ont été colorées avec les anticorps contre perilipin (ab3526, dilution de 1 : 200), PPARγ2 (sc-166731, dilution de 1 : 100) et FABP4 (ab92501, dilution de 1 : 1 000). Images confocales de 12 jours SWAT fait preuve attendue localisation de perilipin autour de surface de gouttelettes de lipides (Figure 4 a). Microscopie de fluorescence de 3 jours SWAT avec la tache de compteur de lipides BODIPY démontré FABP4 localisation dans le cytoplasme (Figure 4 b), et qui se chevauchent de signal de PPARG et DAPI coloration démontré localisation PPARG au noyau ( Figure 4C).

Profil transcriptionnel de SWAT a été évalué dans les tissus contenant des graines provenant de multiples sujets (n = 4 donateurs). Collection, une partie du tissu adipeux a servi d’une extraction de l’ARN (d0), la planification tandis que le reste a été utilisé aux plaques de SWAT de semences. Ces plaques ont été récoltés puis après 24 h, de 14 jours et 28 jours en culture SWAT. En une seule étape PCR quantitative de transcription inverse (RT-qPCR) a été réalisée pour déterminer les niveaux de transcription. Six gènes adipocytaires clés ont été examinés : PPARG, FABP4, LPL, CEBPA, HSL et ADIPOQ (Figure 5). ACTB a été utilisée comme témoin interne et des niveaux de transcription ont été exprimés en pourcentage d’expression appariés selon l’objet de base (d0). Tous les gènes ont démontré transcription robuste à SWAT, bien que les niveaux tendance vers le bas au fil du temps. Nous croyons qu’observé profils de transcriptionnelles pourraient être améliorées avec optimisation des médias que nous élaborons dans la section discussion.

Fonction endocrine basale a été évaluée sur les mêmes cultures utilisés pour le profil transcriptionnel. Surnageant a été recueillie dans des plaques de SWAT et les taux de leptine ont été mesurés en utilisant le dosage immuno-enzymatique (ELISA) (ab100581). SWAT affiche la sécrétion basale de la leptine au jour 1, 14 et 28 (Figure 6 a). Feuilles de l’ADSC ont été maintenus en parallèle avec des plaques SWAT comme témoin (c.-à-d., les feuilles de ADSC sans WAT sandwich). Leptine sécrétée n’a pas pu être détectée dans ces contrôles (données non présentées).

Pour déterminer si SWAT pourrait maintenir la capacité pour une réponse inductible au fil du temps, on a examiné la lipolyse (n = 4). Pour évaluer la capacité lipolytique inductible, une portion de WAT fraîchement prélevé (d0) a été hachée et adipocytes ont été isolés par voie enzymatique (semblable à la récolte SWAT au protocole point 5), tandis que le reste a été utilisé pour amorcer des plaques SWAT. Les adipocytes isolés ont été incubées pendant 3 h à 37 ° C à 300 µL de 2 % sans gras-acide sérum-albumine bovine dans HBSS avec 100 µM forskoline, épinéphrine 1µm ou tampon de contrôle. Niveaux de glycérol dans médias recueillies a été mesurée avec le réactif de glycérol libre. SWAT a été ensuite récolté aux jours 1 et 5 et lipolytique capacité ont été évalués de la même manière. La stimulation chimique a augmenté de glycérol libération significativement aux trois points (Figure 6 b) : libération de glycérol d’adipocytes traités a augmenté en d0 WAT 82 ± 46 % (p = 0,01), 1 jour SWAT par 577 ± 387 % (p = 0,02) et cinq jours SWAT par 348 ± 343 % (p = 0,03). glycérol concentrations moyennes dans les adipocytes stimulées ont été très similaires à travers tous les trois intervalles : primaire WAT 5,2 ± 0,8, 1 jour 4.4 SWAT ± 1,9 et 5 jours SWAT 4,8 ± 1,8 µg glycérol/mg de protéine totale. Glycérol moyenne niveau contrôle (c'est-à-dire, la lipolyse basale) est relativement élevé en WAT fraîchement prélevé (d0) par rapport aux cellules récoltées à SWAT. Cela peut être dû à l’augmentation du stress au tissu WAT en d0 lors de l’excision chirurgicale, transport vers le laboratoire et hacher. Toutefois, ces expériences ne démontrent aucune diminution en qualité lipolytique à SWAT à 1 ou 5 jours par rapport à WAT fraîchement prélevé.

SWAT a été démontrée pour être capable de la transplantation et de récupération dans un modèle murin (n = 4) comme une manifestation de la fonction complexe, tout le tissu. C’est aussi qu'une application possible de la plate-forme si un chercheur souhaite utiliser SWAT pour manipuler WAT in vitro avant la transplantation de tissus dans un modèle animal. SWAT a été cultivée pendant 10 jours et récolté utilisant le protocole standard ; adipocytes isolés de SWAT plaques étaient ensuite chargés dans une seringue de 1 mL (sans aiguille). Une incision est faite sous la peau sur la face dorsale d’une souris immunodéprimées d’exprimant eGFP (clin de œil. CG-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl Tg(CAG-EGFP)1Osb/SzJ). Cela a créé une petite poche sous-cutanée dorsale dans lequel les adipocytes cultivées SWAT ont été injectés avec la seringue, et la poche a été ensuite suturée fermé. Après une transplantation après 10 jours, les souris ont été euthanasiées. Greffes étaient clairement visibles et facilement récupéré (Figure 7 a). Tant la transplantation récupérée et un dépôt de graisse controlatérale de souris ont été résolus, paraffine incorporé et sectionnés. Immunohistochimie a été réalisée sur les lames sectionnés avec des anticorps primaires contre GFP (A10262, dilution 1 : 100) et PLIN humaine (sc-390169, dilution au 1/100). L’anticorps anti-PLIN sélectionnés ont été validées expérimentalement pour souiller PLIN humaine mais pas de souris. Les adipocytes de la greffe Récupérée étaient environ de 50 à 120 µm de longueur, qui est la gamme prévue pour les adipocytes humains, et complètement négatifs pour la GFP (Figure 7 b). Cependant, environ 31 % des adipocytes étaient positifs pour PLIN humaine, ce qui indique une greffe réussie dans l’hôte. Les adipocytes dans les dépôts de graisse de souris étaient de taille 20 à 40 µm, ce qui concorde avec les adipocytes de souris, tandis que la coloration totalement positive pour GFP et complètement négatif pour PLIN humaine (Figure 7 c). ADSC feuilles (avec aucun sandwich WAT) ont été récupérées sur les récipients de culture cellulaire et transplantées chez des souris en tant que contrôle. Toutefois, celles-ci n’ont pas donné n’importe quel tissu récupérable (données non présentées). Ceci indique que les adipocytes récupérés provenaient de la mature SWAT cultivée et non le résultat de la ADSCs humaines différenciées.

Figure 1 : méthode de SWAT le. (un) schématique de SWAT montrant le transfert d’une feuille des CRA eGFP marqué d’une culture de tissu enduit pNIPAAm plat sur une feuille de seconde, sans étiquette des CRA cultivés sur un plat de vitroplants standard. Hachées, primaire WAT humaine est pris en sandwich entre les 2 feuilles de cra. (b), Fluorescence microscopy démontrant le fond clair et GFP fusionnée de canaux d’un SWAT créé par la technique décrite à l’alinéa a. Echelle = 100 µm. (c) Digital photographie d’un mandataire, 5 jours SWAT, cultivées dans une plaque de 6 puits standard. L’important volume de WAT est fixé solidement au fond du puits. La figure est modifiée de Lau et al. ¹¹ S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : SWAT reste viable à 8 semaines de culture. Fond clair série d’imagerie d’une seule grappe SWAT sur 55 jours ne montre aucun changement morphologique cohérente avec la mort des cellules. Barreaux de l’échelle = 100 µm. la Figure a été modifiée de Lau et al. ¹¹ S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : SWAT reste viable à plus de 50 jours. (un) du Nil rouge marquage montre coloration restriction à SWAT cultivé pendant 15 jours, en indiquant les adipocytes direct viables. Qui entoure les cellules stromales tache pas. Figure sont à 40 X grossissement et barre d’échelle = 100 µm. (b) (PI) de l’iodure de propidium de SWAT cultivée pour 53 jours révèle complète exclusion PI, n’indiquant aucune mort d’adipocytes ; Echelle = 100 µm. (c) Oil-Red-O coloration d’un 51 jours SWAT montre restriction de lipides neutres d’adipocytes, indiquant la stabilité à long terme des membranes cellulaires des adipocytes. La figure est modifiée de Lau et al. ¹¹ S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : immunocytochimie montre que SWAT taches positivement pour les marqueurs de cellules adipocytes matures avec localisation attendue. (un) Confocal microscopy de 2 semaines SWAT a révélé PLIN + uniloculaires cellules humaines avec localisation de surface gouttelette lipidique. Echelle = 100 µm. (b) microscopie fluorescente de 3 jours SWAT a révélé FABP4 + cellules humaines avec localisation vers les cytoplasme et (c) PPARγ + cellules avec localisation au noyau de la cellule. Echelle = 100 µm. la Figure a été modifiée de Lau et al. ¹¹ S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : SWAT maintient l’expression des gènes clés adipocyte identité. Grappes SWAT ont été digéré après 1, 14 et 28 jours dans la culture et l’expression génétique déterminée par RT-qPCR de collagénase. RT-qPCR démontre que le SWAT âgés de 1 jour et âgés de 14 jours préserver des niveaux élevés de (un) PPARG, (b) FABP, (c), HSL, (d) CbEBPA, (e), LPL et (f) ADIPOQ. ACTB a été utilisé comme gène de référence. Barres d’erreur = écart-type. La figure est modifiée par rapport à Lau et al._. ¹¹. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : SWAT à la base secrète des adipokines et réagit physiologiquement à la stimulation de la catécholamine. (un) ELISA quantification de la sécrétion de leptine basale 24h ne montre aucune variation significative après 28 jours en culture. (b) une stimulation adrénergique avec l’épinéphrine et la forskoline génère une réponse glycolytique significative dans WAT primaire fraîchement récolté (1,7 x) et appariés selon l’objet SWAT à 1 et 5 jours de culture. Jour 1 SWAT répond aux stimulus de catécholamines avec une augmentation de 6.3-fold au cours de la glycolyse basale tandis que jour 5 SWAT ont démontré une augmentation de 3,3 au cours de la glycolyse basale. Stimulée par la glycolyse ne différait pas significativement dans le SWAT par rapport au WAT frais assorti (p = 0,53, n = 4). Barres d’erreur = écart-type. La figure est mis à jour le Lau et al. ¹¹. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 7 : SWAT peut être réimplanté en vivo, démontrant préservé fonction tissus entiers. (un) SWAT a été facilement visualisées 10 jours après la transplantation dans une souris immunodéprimée (astérisque). SWAT n’avait pas correctement implanté, en 10 jours le SWAT nécrotique serait ont été liquéfié. (b) Sections de SWAT récupéré ont montré grands, uniloculaires adipocytes (diamètres de 50 à 120 µm) qui étaient eGFP-. 31,3 % des adipocytes ont été PLIN humaine +. Les PLIN + les adipocytes humains ont tendance à être plus petits, qui cadrerait avec les observations cliniques de la greffe de graisse chez l’homme où les plus petits adipocytes sont plus susceptibles de survivre le transfert. Echelle = 100 µm, un grossissement de 200 X. (c), à la graisse controlatérale pads pris des souris mêmes démontré beaucoup plus petits adipocytes (20 à 40 µm) et étaient human PLIN-. Echelle = 100 µm, un grossissement de 200 X. La figure est modifiée de Lau et al. ¹¹. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Discussion

Ce protocole détaille l’utilisation de ADSCs pour "sandwich" humain le tissu adipeux blanc ; lignées de cellules humaines ADSC peuvent être isolées par l’intermédiaire des protocoles bien établis,¹⁵. Toutefois, le système peut être adapté pour les besoins de recherche individualisée (comme l’utilisation de cellules 3T3L-1 pour la souris "sandwich" WAT). Ce processus implique la manipulation des tissus humains primaires. Les précautions standard devraient être utilisées ; manipuler des tissus humains comme pathogènes BSL-2 (p. ex., VIH, VHC). Ne manipulez le tissu directement sous un BSC. Portez tous les EPI comme dictées par les normes de sécurité institutionnelle — gants doubles sont fortement recommandés. Désinfecter correctement toutes les fournitures et les déchets contenant 10 % d’eau de Javel solution ou à l’éthanol à 70 % avant réutilisation ou élimination.

La première étape critique dans la culture SWAT est recrutement et le maintien des plaques de culture de tissu enduit pNIPAAm. Ces plaques sont disponibles dans le commerce, ou ils peuvent être produits par le biais de méthodes établies^12,13,14. Ces plaques sont des surfaces de culture de cellules sensibles à la température. Au-dessus de la température critique (~ 32 ° C), la surface est hydrophobe et cellules adhérera, semblable aux autres plastiques traités pour la culture de tissus. Cependant, au-dessous de cette température critique, la surface devient hydrophile et les cellules seront désolidariser de la surface en plastique¹⁶. As a result, il faut établir : 1) la vitesse à laquelle un type de cellule donnée dissociera de la monocouche avant d’atteindre la pleine confluence (c'est-à-dire, lors des changements de médias normal) et 2) le temps nécessaire pour abaisser la température avec la gélatine plongeur appliquée sur la plaque de revêtement pNIPPAm, pour s’assurer que la feuille de la cellule entière se dissocie. Changements de médias doivent être effectuées avec les médias chauffé à 37 ° C ; Si les cellules sont sujettes à une dissociation rapide, effectuer des modifications de médias sur un bloc de chaleur défini à 37 ° C sous la BSC.

La deuxième étape critique est le traitement du tissu adipeux pour préparer l’ensemencement de SWAT. Nous avons effectué notre caractérisation par hachage WAT avec forceps stérilisé et rasoirs stérilisés. Cependant, fascia humaine ne peut pas être coupé facilement avec un rasoir. Il est important de conserver autant le tissu adipeux dans SWAT que possible sur une longue période de maximiser le ratio adipocyte-à-fascia. Gros morceaux de carénage intact n’empêchera contact cellule-cellule entre les ADSCs et les adipocytes, qui est essentiel pour maintenir ensemble les SWAT. Des quantités excessives de fascia peuvent également avoir un effet « tirant sur un fil ». Considérant qu’une seule grappe WAT peut se dissocier d’une plaque sans affecter les groupes voisins, plusieurs clusters connectés par fascia peuvent tirer assez grappes hors une monocouche pour restituer un SWAT bien inutilisable. Liposuccion, qui implique la mincing mécanisée de WAT, peut contourner ce problème comme le fascia est émincée pendant la chirurgie. Cependant, au cours de la liposuccion, les patients sont systématiquement traités avec de fortes doses d’adrénaline ; les conséquences possibles de ce traitement sur le tissu (et les expériences ultérieures) doivent être comptabilisés au cours d’une étude.

La dernière étape critique dans la culture SWAT consiste à sélectionner un milieux de culture expérimentale. Nous avons effectué nos expériences de caractérisation initiale utilisant une formulation de culture cellulaire standard (10 % des BF, 1 x pénicilline/streptomycine en DMEM). Cependant, basé sur la documentation disponible concernant maximisant la transcription de l’adipocyte, nous avons utilisé une formulation spécialisée (7 insuline µM, 30 dexaméthasone µM, 1 x pénicilline/streptomycine en milieu M199)¹⁷. Cette formulation améliorée des premiers niveaux de transcription, mais le taux a diminué au fil du temps. Nous pensons que c’est parce que dans le corps, les adipocytes sont exposés à une grande variété de signaux chimiques, souvent cyclisme entre États nourris et après le jeûne au cours d’une journée. Ainsi, il devrait être possible d’améliorer le profil transcriptionnel observé au fil du temps en plus optimisant les suppléments à nos milieux de culture cellulaire.

SWAT récolte (protocole, article 5) isole les adipocytes de la culture, réduit le volume de l’échantillon et supprime les interférences par rapport aux feuilles ADSC environnantes. Cela peut précéder homogénéisation adipocytaire (ce qui est nécessaire pour l’isolation de protéines ou d’acides nucléiques), ou des analyses fonctionnelles d’intact adipocytes (notamment des essais de captation glycolyse ou de glucose). Alternativement, la plaque SWAT intacte peut être récoltée pour immunocytochimique de coloration, qui permet les feuilles ADSC garantir les grappes WAT à la monocouche pendant tout le processus de coloration. Dans ce cas, aspirer les milieux de culture et le fixer la culture entière via des protocoles standard. Cependant, nous vous recommandons d’ajouter une lamelle de verre avant d’imagerie pour aplatir les clusters 3D adipocytaire et améliorer la qualité de l’image qui en résulte.

Nous croyons que SWAT a un potentiel important comme une drogue, dépistage de plate-forme. La technique est simple, reproductible et utilise des plaques de culture de tissus classiques. Par conséquent, les expériences de dépistage de drogue sont exécutables en ajoutant un composé pharmacologiquement actif dans le milieu de culture. Les adipocytes peuvent alors être récoltées pour examiner l’effet du composé sur l’expression des gènes, profil épigénétique, sensibilité à l’insuline, etc. que l’addition de toxines environnementales au milieu de culture peut de même être utilisée pour examiner leurs effets sur les adipocytes. Comme SWAT permet au chercheur de suivre les grappes d’adipocytes individuels au fil du temps, il est particulièrement bien adaptée pour évaluer un traitement qui apporte un changement phénotypique visible aux adipocytes. Un exemple flagrant serait adipocytes humains « brunissement », dans lequel un adipocyte blanc, lipides de stockage devient « brunis » ou similaire à un adipocyte brun thermogénique, multiloculaire¹⁸. Il s’agit d’un phénomène potentiellement importante pertinence clinique qui a été démontrée dans des modèles murins, mais jamais chez l’homme. Conjointement des variations sur SWAT détiennent également recherche énorme potentiel. SWAT est un système de co-culture naturel qui utilise des puits de culture cellulaire standard. Par conséquent, on peut conserver les adipocytes parmi les autres types de cellules cliniquement pertinente en changeant les cellules sandwiching ou en utilisant les inserts de culture de tissu de membrane. Par exemple, les hépatocytes pourraient fonctionner comme la feuille supérieure de la cellule sandwiching à l’écran un médicament qui est filtré par le foie avant d’atteindre le tissu adipeux. De même, cellules cancéreuses pourraient être cultivés sur un encart de membrane sur SWAT pour examiner comment les adipocytes contribuent à la pathologie du cancer.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x HBSS	Thermofisher	14185052
Gelatin	Sigma-aldrich	G9391
Collagenase	Sigma-aldrich	C5138
Adenosine	Sigma-aldrich	A9251
DMEM	Thermofisher	11995065
M199 Media	Thermofisher	11043023	Phenol red-free
250 µm Mesh Filter	Pierce	87791
0.2 µm Syringe Filter	Celltreat	229747
5 mL Luer-Lok syringes	BD	309646
Metal Washers			These are simple metal washers and can be bought at any hardware store. They simply add leight weight to the backs of the plugers to ensure even contact between cells and gelatin, while being easy to stock and sterilize. Approximate mass: 6.3 g
Name	Company	Catalog Number	Comments
Heated Equipment
Incubated Orbital Shaker	VWR	10020-988	Samples should be pitched at 45° angle to facilitate collagenase digestion
Heat Block			Set to 37-40 °C and placed under Biosafety Cabinet
Water Bath			Set to ~75 °C
Name	Company	Catalog Number	Comments
Specialized Plastics
Upcell Dishes 6cm of 6-multiwell	Nunc	174902  or 174901	These are commerically available pNIPAAm-coated dishes which can be used to grow the upper sheet of ADSCs. Alternatively, pNIPAAm-coated plates can be produced in-lab. diameter: <6 cm for 6 cm dish, <3.5 cm for 6-well plate; approximate mass: 6.7g for 6 cm dish, 5.1 g for 6-well plate
Plastic Plunger Apparatus			These can be fashioned to fit within desired pNIPAAm-coated plastics (multiwell plates, petri dishes). They are comprised of a simple stem attached to a circular disk. They can be produced in-lab or by any facility that can fashion acrylic plastics