Summary
白色脂肪組織 (WAT) には、薬理学的開発と代謝の研究を妨げる現在初代培養のモデルの重大な欠陥があります。ここで間質細胞のシートの間に挟むワット脂肪 microphysiological システムを生成するためのプロトコルを提案する.このコンス トラクターは、ワットの一次文化のため安定的かつ適応可能なプラットフォームを提供します。
Abstract
白色脂肪組織 (WAT) は、重量と毎日の健康の調節に重要な役割を果たしています。 まだ、忠実に脂肪の微小環境を要約またはワット 2 週間を超えて生存を拡張に失敗したすべての利用可能な初代培養モデルに大幅な制限があります。 信頼性の高い培養モデルの欠如は深刻なワット代謝および医薬品開発の研究を妨げます。このため「SWAT」(サンドイッチ白色脂肪組織) と呼ばれるワットの一次文化のための新規プラットフォームを開発する microphysiologic システムの NIH の基準を活用しています。我々 は、みじん切りのワット クラスター脂肪由来間質細胞のシートの間に挟むによって脂肪細胞の自然な浮力を克服します。 このコンス トラクターには、ワットのサンプルは、文化の実行可能な以上 8 週間です。 SWAT そのまま ECM、細胞-細胞間の接触、ワット条件体内の物理的な圧力を維持します。また、SWAT は、堅牢な転写プロファイル、外因性化学シグナリングと全体の組織の機能に対する感度を維持します。SWAT は、脂肪培養の再現性のある、シンプルで効果的なメソッドを表します。 潜在的に、ワット生理学、病態生理、代謝、及び医薬品開発の研究のための広く適用可能なプラットフォームです。
Introduction
脂肪は肥満は、米国1の $ 1470 億と $ 2100 億との間の直接の年間医療費を運ぶの主な臓器です。脂肪の蓄積は、心臓病、II 型糖尿病、特定の種類のがん2などの死の他の原因にもつながります。文化モデルの in vitro代謝の研究と医薬品開発に不可欠なが、現在の研究モデル脂肪組織の主要な不足があります。脂肪細胞は壊れやすく、軽快な, と終末分化した細胞細胞培養プラスチックを遵守しない、従って従来の細胞培養法を用いた培養することはできません。1970 年代、いくつかの方法がガラス coverslips、天井文化、懸濁培養細胞外マトリックス3,4,5,の使用を含む、これらの障壁を克服する試みで使用されています。6,7します。 ただし、これらのメソッドは、細胞死と脱分化、によってマークされていると、彼らは通常以上の 2 週間の研修期間に使用されます。さらに、これらのモデルがしないでそのまま ECM は保持していません、脂肪細胞と間質の相互作用サポート細胞も収縮力細胞を互いにで生体内で発揮ネイティブ脂肪微小環境を再現ワット。
ゴールド スタンダード脂肪培養法のない場合は、脂肪の研究は分化前脂肪細胞 (diffAds) の主に頼っています。DiffAds は多房性、付着性、および代謝活性です。対照的に、プライマリの白色脂肪細胞は単房性、非粘着性と比較的低代謝を示します。健康な成熟脂肪組織の生理を要約する現在脂肪培養モデルの失敗は、脂肪細胞を直接対象とする FDA 承認薬の不在で主要な要因では可能性が高い。実際には、生理学的体外臓器モデルの欠如は、ほとんどの臓器や疾患にわたって主要な問題です。
Microphysiological システム (MPS) プログラムの創設を発表したそのポジション ペーパー、国立衛生研究所 (NIH) 報告医薬品臨床試験のすべてにわたって 2013年成功率もすぎなかった 18 のフェーズ II の %、第 III 相 50%臨床試験8。MPS プログラムは、直接体外単作のモデル人間の生理にできないことに対処するためです。NIH は、人間のプライマリまたは器官の機能を要約するだろう多細胞の 3 D 構造で幹細胞から成る文化システムとして MPSs を定義します。同質で、不死化細胞培養の還元主義的モデルとは異なり MPSs をオルガン薬物相互作用9薬物、薬セル セル セル正確にモデルする必要があります。短期の初代培養方法とは異なり NIH の基準は文化8で 4 週間にわたって MPS 持続可能性を指示します。NIH の RFAs (#RFA-TR-18-001)10MPS プログラムの詳細を見つけることが。
適応可能な単純な小説を開発した、安価な脂肪の MPS は「白色脂肪組織に挟まれた」と呼ばれる (SWAT)11。私たちは「挟む」みじん切りにした主な脂肪脂肪由来間質細胞 (ADSCs) (図 1) のシートの間で脂肪細胞の自然な浮力を克服します。結果として 3 D 構築サポート セル人口は自然な脂肪細胞と成熟脂肪細胞を囲む細胞間接触とネイティブ脂肪微小環境を繰り返します。SWAT は、8 週間生存率、外因性シグナリング、アデポカイン分泌と動物モデルに生着する応答を実証によって検証されています。
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Protocol
IRB LSUHSC-NO. オフィスによって承認されたすべてのタスクが #8759 と #9189 プロトコルに準拠しました。すべての動物の仕事を行った #3285 激しい情緒号所 IACUC によって承認プロトコルへの準拠
1. 細胞シートを挟むの播種
注: は、図 1を参照してください。
- 組織培養プレート (6 cm または 6 ウェル プレート) で約 80% の confluency に種子 ADSCs。SWAT 希望のウェルのシードよく 1 従来の組織文化と組織文化の poly(N-isopropylacrylamide (pNIPAAm) コーティング プラスチック プレートに対応するサイズの 1 も。
注: したがって、SWAT の 6 ウェル プレートが必要になります 1 つ 6 ウェル標準組織培養プレート (ベースレイヤー) 上のセルと 1 つ 6 ウェル pNIPAAm 被覆組織培養プレート (上層) シードします。pNIPAAm コーティング プレート、市販で購入することができます。 またはラボの12,13,14。 - 維持 ADSCs 37 ° C および 5% の CO2のダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) 10 %fbs と 1 ペニシリン/ストレプトマイシン. x2 日ごとにメディアを変更します。
- 100% 合流になる紋パターン (約 6-8 日) を取るまでを合体します。
注: これらの細胞は、浮揚性の脂肪組織を安定させるために単一のまま細胞シートとして機能する必要があります。不十分な合流するセルをワットと播種時にフラグメント化します。
2. SWAT の準備用品します。
- いくつかの 10 mL の因数の 1 x ハンクのバランスの取れた塩ソリューション (HBSS); を準備します。余裕量板の所望の数の十分を準備します。
-
SWAT のシードのプランジャー装置を準備します。円形ディスクに接続されている幹から成る単純なのアクリル プラスチックを使用してプランジャーを構築します。組織培養の井戸の円周内に収まることを確認 (直径: < 料理は 6 cm、6 cm < 6 ウェル プレート用 3.5 cm; おおよその質量: 6 cm 皿、6 ウェル プレート用 5.1 g 6.7 g)。
- プロシージャを実行できるように円滑にケースで任意の個々 のプランジャーに問題があるに余分なプランジャーを準備します。
- ラボ テープ プランジャー ディスクの縁の周りをラップ、少なくとも 2 倍、ゼラチン液の漏れを防止します。
- スプレー安全キャビネット (BSC) 70 %etoh。空、上限なしの 15 mL の円錐管; と BSC 内 15 mL の円錐管ラック ダウン スプレーします。チューブは、ゼラチン プランジャーの配置をセキュリティで保護するのに役立ちます。
- ラックに 15 mL の円錐管に各テープ巻プランジャーを 70 %etoh と場所で徹底的にスプレーします。金属ワッシャー (おおよその質量 6.3 g) をスプレーし、フック鉗子; のペアと一緒にラックの上に置きますワッシャーは、SWAT がシード処理中にプランジャーに重量を追加します。
- BSC サッシを閉じる、UV 乾燥と殺菌を容易に光を入れます。
注: は理想的には、この手順の SWAT の播種前に 24 h を行います。また、組織コレクション/SWAT 播種; の日にプロセスを実施します。ただし、この場合、UV 乾燥・殺菌のための 15-45 分を許可します。
3. ゼラチン プランジャーの準備-シート上のセルへの適用
- 75 ° c の水浴を熱します。
-
ゼラチン溶液を準備するには、1 x HBSS の 10 mL のストックにゼラチン パウダーの 0.75 g を追加します。ヒューム フードの下で、溶液の pH のバランスをとる 1 M NaOH の 100 μ L を追加します。
- 風呂の水に 10 mL の株式を追加、ソリューションに粉末が溶解するまで精力的に 5 分ごとを振る。温水のお風呂に追加した後すぐに粉ゼラチンを溶解する目的。
- BSC 送風機をオンに、UV ライトをオフに、サッシュを上げ。BSC 表面をスプレーし、フィルターの供給 (5 mL ルアーロック注射器や 0.2 μ m シリンジ フィルター) を準備します。複数のフィルターをプランジャーに適用するゼラチンの十分なボリュームを効率的にひずみを準備します。
- ゼラチン溶液が均一な整合性に達したら、ソリューションをフィルター処理し、プランジャーに適用。ゼラチンで注射器をロードします。シリンジ フィルター (~2.5 mL 6 ウェル プレート、6 cm 皿 ~4.5 mL) を通じてプラスチック製プランジャーにゼラチンを適用し、(~ 20 分) を固化することができます。
- ゼラチンがしっかりと、プランジャーの端からテープの包みを開けます。フック鉗子でプランジャーの外側のエッジからゼラチンを削除 (すなわちメニスカスの縁の隆起)。プランジャーの中央に残りのゼラチンが完全にレベルを確認 ADSC シートとの接触を最大化します。
- 過剰なゼラチンを取り外したら、優しく pNIPAAm コーティング ADSC プレートにゼラチン プランジャーを適用します。金属の洗濯機を使用して、プランジャーを圧迫します。細胞シートはプランジャーを適用中のせん断しません。
-
室温で 1.5 h の細胞シートにプランジャーを残します。プレート/プランジャー pNIPAAm コーティング プレート表面から細胞シートの解離を完了する 1.5 h の氷水風呂で孵化させなさい。
- 氷浴; で抱卵中は注意します。氷浴孵卵中における携帯メディアを汚染することはできません。
- インキュベーションを完了すると、非滅菌水を取除く pNIPAAm 被覆板の下部をきれい。
4. 白色脂肪組織の処理
- ひと脂肪組織を手術室から収集する場合は、氷の上、SWAT がシード処理するまで滅菌コンテナーにすべてのサンプルをしてください。リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) などの無菌維持媒体を組織安定のため脂肪組織コンテナーに追加します。
- 冷たいセル培地ごとの井戸/料理する 1.5 mL 遠心チューブにシード (6 ウェル プレート用 100 μ L、200 μ L 6 cm 皿) を追加します。
-
脂肪組織をミンチします。
- 固体脂肪セグメントの次の手順に従います。
- 脂肪 3 の大規模なセグメントを洗って滅菌 PBS で x を外し、可能ように同様に多くの PBS。
- 粗く組織鉗子と滅菌のかみそりをミンチし、多くの血管と可能な限り筋膜を削除 (詳細については、の説明を参照)。
- 細かくみじん切りにした組織が厚く、液体の一貫性にまで剃刀で脂肪をミンチします。
注: 理想的には組織が表示されますワットのない目に見える個々 のセグメントで均質なこれは常に可能ではありませんが。
- Lipoaspirate のように処理します。
- BSC、下、ビーカーの上に滅菌ガーゼをテープ、余分な液体を収集する大きなビーカーにこのビーカーを配置します。
- 25 mL の血清ピペットを使用して、必要に応じて同様に多くの lipoaspirate を描画し、滅菌ガーゼの面に適用します。Lipoaspirated 脂肪を洗浄し、余分な血液と脂質の残基を削除するこの表面に直接 PBS を適用します。
- 排水組織を回復、滅菌肉挽き表面にそれを転送し、lipoaspirate をミンチ鉗子を使用します。
- 固体脂肪セグメントの次の手順に従います。
- みじん切りにした組織を転送する p1000 ピペット チップの遠位端を切断する滅菌かみそりを使用します。これは、脂肪細胞の換散につながることができるせん断応力を最小限になります。適切な組織の整合性に達する (6 ウェル プレートの 300-400 μ L、6 センチメートルの皿のための 500-600 μ L) 各 1.5 mL チューブにみじん切りにした組織の適切なボリュームを転送します。ひき肉のワットとチューブで簡単にメディアをミックスします。
-
ADSC のベース プレートを取るとメディアのデカント/吸引。メディアを各 1.5 mL チューブからワット/メディアの混合物に置き換えます。
- 優しく pNIPAAm コーティング プレートからゼラチン プランジャーを削除し、ADSC のベース プレートにワットの混合物に適用します。細胞の剥離を確認する顕微鏡下で pNIPAAm 被覆板の単分子膜を調べます。
- ヒート ブロックを BSC 約 37-40 ° C に設定します。まだ場所でプランジャー、ヒート ブロックの表面にプレートを移動します。温めた培細胞をインキュベートし、ゼラチンの溶解を容易にする 2-3 mL を追加します。
- ~ 30 分後に静かにプレート面からプランジャーを取り外します。基本組織培養皿の蓋を交換して、セル文化振興に移動します。ゼラチンは、37 ° C で完全に液化して、一度吸引し、細胞の培養基を置き換えます。
- 7 μ M インスリン、30 μ M デキサメタゾン、1 x フェノールレッド フリー M199 培地で 37 ° C、5% CO2で SWAT を維持ペニシリン/ストレプトマイシン。6 ウェル プレートと 6 cm 料理 3 mL 約 2 mL メディアで維持されます。2 日ごとにメディアを変更します。
5. 収穫を SWAT します。
- 準備コラゲナーゼ (0.5 mg/mL コラゲナーゼ、500 nM アデノシン、PBS) 15 mL コニカル チューブ (おおよそ量 10 mL) の因数。チューブを固定し、-20 ° C で保存
- 細胞から培地を吸引、PBS、1 x を洗浄し、PBS を吸引します。コラゲナーゼ因数を準備するには、それらを 37 ° C の水浴で解凍。
注: 理想的には、コラゲナーゼの解決が 37 ° C に達する;その後すぐに組織を追加します。 -
個々 の因数に SWAT 板からすべての組織を追加します。無菌細胞スクラッパーを使用して SWAT を収穫し、カットオフ p1000 ピペット チップとコラゲナーゼ因数に転送。コラゲナーゼ溶液 15 mL の円錐管に直接組織を追加します。
- また、50 mL のコニカル チューブ; 組織/コラゲナーゼ混合物をインキュベートします。面積の増大により、更に酵素消化を促進します。
- 45 ° の角度でインキュベートした軌道シェーカーにサンプル チューブを配置します。30-60 分の 37 ° c、200 rpm で孵化させなさい。
- コレクションの新しい 15 mL コニカル チューブにメッシュ フィルターを 250 μ m の場所です。フィルターを通して消化脂肪溶液を注ぐ。
注: これは線維組織をフィルタ リングを通過するすべてのセルになります。 - 相分離を許可する部屋の温度で 5 分間座って通過できます。
注: 脂肪細胞は、脂肪間質細胞 (Asc) 低い段階に解決する間ソリューションの上にフロートします.500 × gで 5 分間遠心分離は、細胞分離やペレットの ADSCs を囲む収穫を最大限ことができます。 -
カットオフ p1000 のピペット チップを使用して、1.5 mL 遠心管を脂肪細胞 (コラゲナーゼの解決の上にフローティング レイヤー) を転送します。脂肪細胞を収集するために管の端に沿ってゆっくりピペット一度に 〜 250 μ L を取るします。
- 内部に付着した細胞の回復を最大限に脂肪細胞を収集しながらチューブをゆっくりと回転します。1.5 mL 遠心チューブが完全になるまでより多くの細胞を描画してください。
- 注射器の針 (~ 21) に接続されているを使用して孤立した脂肪細胞から余分な液体を削除します。フローティングの脂肪層の下に針を沈めます。任意の細胞を針軸に付着を除去するために簡単に針を扇動し、上に浮かぶに外れ脂肪細胞の待ちます。
- 脂肪細胞の意図しない削除を避けるために注意しながら、余分な液体をゆっくりと描画します。一貫してサンプル ボリュームを分離する遠心チューブ卒業式を使用 (など。サンプルごとに 0.1 mL)。
- DNA ・ RNA の抽出、グルコース取り込みアッセイ、脂肪分解法等の隔離されたセルを使用します。
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Representative Results
SWAT の生存率が個々 のワット クラスターのシリアル明視野イメージングによる評価された当初 (n = 12) 約 7.6 週間。クラスターは、この時間を通して単分子膜上の場所にセキュリティで保護された残った。わずかな形態学的変化は、少し歪むか、またはシフト ポジションを個々 の脂肪細胞で観察されました。しかし、脂肪細胞も房になって、脱分化の欠如を示すも細胞死細胞ブレブ、換散、断片化 (図 2) などのいずれかの兆候を展示しています。クラスターの id を脂肪細胞は脂質染色ナイル赤 (NR) 2 週齢 SWAT に確認されました。明確な NR は、単房性脂肪細胞クラスターの染色には、これらがそのまま膜ではなくアーティファクト、嚢胞、または死んだ脂肪細胞と脂肪細胞にほんとうが示されます。NR 染色周辺の ADSC シートがない場合に、これらの細胞の脂質を蓄積されしたがっていない差別脂肪細胞系統の方 (図 3 a) されていないを示します。Propidium ヨウ化染色は、53 日齢 SWAT で実行されました。高度な縦長でクラスターを脂肪細胞内染色の除外は、細胞死 (図 3 b) の欠如を示しています。(オロ) オイル赤 O 染色は、SWAT の脂肪細胞が高度な縦長 (図 3 c) でもそのまま脂肪細胞の実行可能性を維持することを示す 51 日齢 SWAT 固定脂肪細胞クラスター内の脂質汚れローカライズで実行されました。
予想されるタンパク質の発現と SWAT 内成熟脂肪細胞マーカーの局在を示す免疫細胞化学 (ICC) を行った。そのまま SWAT プレートが PPARγ2 perilipin (ab3526、1: 200 希釈) に対する抗体で染色した (sc-166731、1: 100 希釈)、FABP4 (ab92501、縮尺希釈)。12 日古い SWAT の共焦点画像を示した perilipin 脂質液滴表面 (図 4 a) 周辺の予想されるローカリゼーション。脂質カウンター染色 BODIPY 3 日古い SWAT の蛍光顕微鏡観察 (図 4 b)、細胞質内 FABP4 ローカリゼーションと核 ( PPARG 局在を示した染色 PPARG および DAPI から信号を重複図 4 c)。
SWAT 転写プロファイルを複数科目からシード組織で評価した (n = 4 ドナー)。コレクションの時に脂肪組織の一部に使用されたベースライン RNA の抽出 (d0) の残りの部分が使用されていた種子 SWAT プレート。これらのプレートは、24 時間、14 日と 28 日 SWAT 文化で収穫しました。転写レベルを決定するワンステップ定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応 (RT qPCR) を行った。六つのキーの脂肪細胞の遺伝子を調べた: PPARG、FABP4、LPL CEBPA、HSL、ADIPOQ (図 5)。ACTB は内部統制として使用され、転写レベル主題一致基準 (d0) 式のパーセントとして表現しました。レベルは、時間の経過とともに下方傾向でしたが、すべての遺伝子は、SWAT の堅牢な転写を示した。観察転写プロファイルの説明で手の込んだ我々 としてさらに、メディアの最適化で改善できると考えています。
転写プロファイルに使用される同じ文化の基底の内分泌機能を行った。SWAT プレート上澄み採取し、酵素免疫測定法 (ELISA) (ab100581) を利用したレプチンのレベルを測定しました。SWAT は、1, 14, 28 (図 6 a) 日に基底レプチンの分泌を表示されます。ADSC シートは、SWAT のプレートと並行制御 (すなわち、挟まれたワットなし ADSC シート) として維持されました。これらのコントロール (データは示されていない) に分泌されるレプチンを検出できませんでした。
SWAT が時間をかけて誘導性応答の能力を維持できるかどうかを調べるには、脂肪分解を検討した (n = 4)。たて収集ワット (d0) の一部が刻まれた誘導性の脂肪分解能力を評価して、残りのシード SWAT に使われていた脂肪細胞が (プロトコル セクション 5で SWAT の収穫に似ています)、酵素によって分離されました。脂肪細胞の分離培養 300 μ L 2% 脂肪酸酸フリー ウシ血清アルブミン HBSS で 100 μ M フォルスコリン、1 μ M エピネフリンまたは制御バッファーの 37 ° C で 3 時間。収集したメディアでグリセロール濃度はグリセリン試薬で測定しました。SWAT は 1 と 5、脂肪分解能力が同じ方法で評価した日、収穫されました。化学刺激増加グリセロール リリースすべての大きく 3 つ縦長 (図 6 b): 治療脂肪細胞のグリセロール リリース d0 ワットで 82 ± 46% 増加した (p 0.01)、1 日 577 ± 387 %swat (p = 0.02) と 348 ± 343 %5 日 SWAT (p =0.03). 3 つ縦長の間で非常に類似していた刺激脂肪細胞におけるグリセロール濃度を意味する: プライマリ ワット 5.2 ± 0.8、1 日 SWAT 4.4 ± 1.9 と 5 日 SWAT 4.8 ± 1.8 μ g グリセロール/mg 総蛋白。SWAT 収穫細胞に比べて新鮮ワット (d0) の制御 (すなわち、基底脂肪分解) で平均グリセロール濃度が比較的高かった。これは外科的切除、ミンチと lab、輸送中に d0 のワット組織へのストレスの増加のためかもしれません。しかし、これらの実験にはたて収集ワットと比較して 1 または 5 日 SWAT の脂肪分解能力の衰えは示さない。
SWAT を移植とマウス モデルで回復できると示した (n = 4) 複雑で、全体の組織の機能のデモンストレーションとして。また、プラットフォームのアプリケーションする必要がありますワットの in vitro動物モデルに組織を移植する前に操作する SWAT を利用する研究者の願いです。SWAT は 10 日間培養と標準プロトコルを利用した収穫SWAT 板から隔離された脂肪細胞は、1 mL 注射器 (針) なしに読み込まれました。免疫不全 eGFP 発現マウス (NOD 背側皮膚の下切開。Cg Prkdcscid Il2rgtm1Wjl Tg(CAG-EGFP)1Osb/SzJ)。SWAT 培養脂肪細胞を注射器で注入したし、ポケットが縫合し、小さな背皮下ポケットを作成これは閉めた。10 日後の移植後マウスが犠牲になった。移植は、明確に見えるし、(図 7 a) を容易に回復します。回復した移植とマウス側の脂肪質のターミナルの両方を修正しました、パラフィン埋め込まれた、および断面します。断面のスライド (A10262、1: 100 希釈) GFP と人間 PLIN (sc 390169、1: 100 希釈) に対して一次抗体と免疫組織染色を行った。選択したアンチ PLIN 抗体は人間 PLIN ですがないマウスを染色する実験的検証されました。回復した移植脂肪細胞の脂肪が人間の脂肪細胞の予想される範囲のサイズで約 50-120 μ m、GFP (図 7 b) 完全に陰性でした。しかし、脂肪細胞の約 31% 人間 PLIN、ホストに成功した生着を示す陽性であった。マウスの脂肪質のターミナルで脂肪細胞は 20-40 μ m、GFP のそして完全に完全に肯定的な染色中にマウス脂肪細胞と一致している負の人間 PLIN (図 7 c) のサイズだった。ADSC シート (ないサンドイッチ ワット) の細胞培養皿から盗用、コントロールとマウスに移植しました。しかし、これらは、任意の回復可能な組織 (データは示されていない) はずはありません。これは培養の SWAT と差別化された人間の ADSCs の結果ではなく回復した脂肪細胞から成熟が示されます。
図 1:、SWAT メソッド。(、) スケマティックの SWAT eGFP ラベル Asc 標準培養皿上に成長した Asc の第二に、ラベルのないシートに pNIPAAm 被覆組織培養皿からのシートの移動を示します。みじん切りにした、プライマリ人間ワット 2 Asc シートに挟まれて。(b) 蛍光顕微鏡明視野、GFP、説明する手法によって作成された SWAT の結合チャンネルを示すにします。スケールバー = 100 μ m。 (c) デジタル標準 6 ウェル プレートで培養 5 日古い SWAT 代表の写真。ワットの大容量安定、井戸の底に固定されています。図は、ラウらから変更されます。11この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: SWAT の培養 8 週間で実行可能なままです。シリアル明視野イメージング単一 SWAT クラスターの 55 日間にわたって説明形態変化細胞死と一致します。スケール バー = 100 μ m. 図・ ラウらから変更されます。11この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: SWAT が 50 日以上で有効です。(、) Nile Red 染色 SWAT 15 日間の培養を示すライブ実行可能な脂肪細胞に染色の制限を示しています。周囲の間質細胞は染色されません。図は、拡大、およびスケール バー × 40 = 100 μ m (b) Propidium ヨウ化 (PI) の染色 SWAT 53 日明らかに完了する PI 除外は培養脂肪細胞死がないことを示す。スケールバー = 100 μ m。 (c) オイル赤 O 染色、51 日齢 SWAT 示しますの脂肪細胞は、中性脂質の制限脂肪細胞の細胞膜の長期安定性を示します。図は、ラウらから変更されます。11この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 各種 SWAT 汚れ積極的に予想されるローカリゼーション成熟脂肪細胞マーカーのことを示します。2 週齢 SWAT の (、) 共焦点顕微鏡 PLIN + 単房性細胞脂質液滴表面に局在を明らかにしました。スケールバー = 100 μ m。 (b) 3 日古い SWAT の蛍光顕微鏡は細胞核への局在と細胞質および (c) ppar γ + 細胞への局在と細胞 FABP4 + を明らかにしました。スケールバー = 100 μ m. 図・ ラウらから変更されて11この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: SWAT キー脂肪細胞アイデンティティ遺伝子発現を維持します。コラゲナーゼ消化 1 後、14、および文化と遺伝子発現の 28 日 Rt-qpcr によって決定されたクラスターをたたきます。RT qPCR 示します 1 日齢および 14 日齢の SWAT が (、) (b) (c) (d) (e) LPL CbEBPA HSL FABP PPARG の高レベルを維持すること、(f) ADIPOQ。ACTB は参照の遺伝子として使われました。誤差標準誤差を =。・ ラウら.からの図が変更されました。11.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6: SWAT 基肥アディポカイン分泌、カテコラミン刺激する生理学的応答します。24 h 基底レプチン分泌 (、) ELISA の定量化は、文化では 28 日後大きな変化を示さない。(b) エピネフリンおよびフォルスコリンとアドレナリン刺激新鮮な収穫の主なワットの重要な解糖系の応答を生成します (1.7 x) と 1 と 5 日間の培養で SWAT の件名一致します。基底解糖系を介して 3.3-fold 増加を示した日 5 をスワット中、超音波増加のカテコラミン刺激には基底解糖系に応答して日 1 ピシャリとたたきます。刺激解糖系がマッチした新鮮なワットと比較して SWAT に有意差はなかった (p = 0.53、n = 4)。誤差標準誤差を =。図は修正・ ラウらです。11.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 7: SWAT 使用されるインプラント体内全体の組織の機能を維持を示すします。免疫不全マウス (アスタリスク) への移植後 10 日間容易に可視化 (、) SWAT だった。SWAT が正常に注入、10 日間で壊死の SWAT だろうがされて液化。回復した SWAT の (b) セクションは実証された eGFP - 大規模、単房性の脂肪 (直径 120 に 50 μ m) です。脂肪細胞の 31.3% だった人間 PLIN +。人間の PLIN + 脂肪細胞を小さくすると、小さい脂肪細胞が移動を生き残るために可能性が高い人間の脂肪移植の臨床的観察と合うだろう傾向があった。スケールバー = 100 μ m、200 倍の倍率。同じマウスから撮影 (c) 反対側の脂肪パッドははるかに小さい脂肪細胞 (20-40 μ m) を示す、人間 PLIN。スケールバー = 100 μ m、200 倍の倍率。・ ラウらから図を変更します。11.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルの詳細 ADSCs を使用してサンドイッチひと白色脂肪組織;人間 ADSC 細胞は十分に確立されたプロトコル15を介して分離できます。ただし、システムは個別研究の要件 (サンドイッチ マウス ワット 3T3L 1 セルを使用して) などの適応することができます。主な人体組織にはこのプロセスが含まれます。標準的な安全上の注意を採用する必要があります。BSL 2 病原体 (例えばHIV、HepC) として人間の組織を処理します。BSC の直下組織の処理のみ。機関安全規格によって決定されるすべての適切な PPE を着用-二重の手袋をお勧めします。正しくすべての用品を消毒して 10% で廃棄物を再利用したり処分する前にソリューションまたは 70% エタノール溶液を漂白剤.
SWAT 文化の最初の重要なステップは、調達と pNIPAAm 被覆組織培養プレートを維持します。このような板は商業的に、利用または確立された方法12,13,14までの製造が可能します。これらのプレートは、温度応答性培養皿です。臨界温度 (~ 32 ° C)、上記表面は疎水性と細胞が付着、ティッシュ文化の他の扱われたプラスチックのよう。しかし、この臨界温度以下表面が親水性になるし、細胞がプラスチック表面16から分離してしまいます。その結果、注意が必要を確立する: 1) どのように迅速に指定したセルの種類が分離してしまう、単分子膜から完全 confluency (すなわち、通常のメディア変更時) と 2) ゼラチンの温度を下げるために必要な時間に達する前にプランジャーは全体の細胞シートが分離できるように pNIPPAm コーティング プレートに適用。37 ° C に温めてメディアでメディアの変更を行わなければなりません。細胞が迅速な解離しやすい、BSC 37 ° C に設定熱ブロックでメディアの変更を実行します。
2 番目の重要なステップは、SWAT の播種に備えて脂肪を処理します。カミソリの消毒と滅菌鉗子ワットをミンチにより私たちのキャラクタリゼーションを行った。しかし、人間の筋膜は、かみそりで簡単に切り取ることはできません。脂肪細胞の筋膜の比を最大化する長期の期間にわたってできるだけ SWAT 内でできるだけ多くの脂肪組織を保持することが重要です。そのまま筋膜の大部分は、SWAT を一緒に保つことに必須である ADSCs と脂肪細胞の間の細胞間接触をできなくなります。筋膜の過剰な量も「スレッドで引っ張る」効果を持つことができます。1 つワットのクラスターは、隣接のクラスターに影響を与えずにプレートから切り離すこともできます、一方筋膜で接続された複数のクラスターはできなくなる SWAT も単分子膜を十分なクラスターを引っ張ることができます。脂肪吸引は、ワットの機械化されたミンチが含まれている筋膜は手術中に細かくみじん切り、この問題を回避できます。しかし、脂肪吸引、中に患者が日常的に扱われる高用量エピネフリン;組織 (およびその後の実験) のこの治療の可能な結果を研究中に考慮する必要があります。
SWAT 文化の最後の重要なステップは、実験的文化メディアを選択します。標準細胞文化の定式化を利用した初期特性実験を行った (10 %fbs、1 ペニシリン/ストレプトマイシン DMEM で x)。ただし、利用可能な文献に基づくについて専門的な定式化を用いて脂肪細胞転写の最大化、(7 μ M インスリン、30 μ M, 1 x ペニシリン/ストレプトマイシン M199 メディア)17。この定式化は、転写の初期レベルですが時間をかけて減少したレベルに向上しました。よく一日のコース上の絶食の州間サイクリングこれは、体内の脂肪細胞のさまざまな化学信号にさらされていると考えます。したがって、それはさらに私たちの細胞培養媒体にサプリメントを最適化する時間をかけて観測転写プロファイルを改善することが可能する必要があります。
SWAT の収穫 (プロトコルセクション 5) 文化から脂肪細胞を分離、サンプル量が減少、周辺の ADSC シートからの干渉を削除します。そのままの機能試金 (これはタンパク質や核酸の分離に必要な) 脂肪の均質化が前後することができますこの脂肪細胞 (解糖やブドウ糖の取り込みアッセイ) など。また、そのまま SWAT プレート収穫できる免疫組織化学染色、ADSC シート染色のプロセス全体にわたって単一層にワット クラスターをセキュリティで保護することができます。この場合、培地を吸引し、標準プロトコルを介して全体の文化を修正します。ただし、3 D 脂肪細胞クラスターを平らにし、結果として得られる画像の品質を向上させるためにイメージングする前にガラス基板を追加することをお勧めします。
SWAT は、薬剤のスクリーニングのプラットフォームの大きな潜在力と考えています。技術は、簡単に再現可能な従来の組織培養プレートを利用して.したがって、薬物スクリーニング実験は薬理活性化合物を培養培地に追加することで実行可能です。脂肪細胞は、遺伝子発現、エピジェネティックなプロファイル、インスリン感受性、脂肪細胞への影響を調べるため、環境毒素培養培地に添加が同様に使えるなどの化合物の影響を調べるため、収穫できます。SWAT により時間をかけて個々 の脂肪細胞のクラスターを追跡する研究者になるため脂肪細胞に目に見える表現型の変化は、治療を評価するため一意に適しています。顕著な例は、人間の脂肪細胞が、前記白、脂質貯蔵脂肪なる「茶色」または発熱、多房性の褐色脂肪細胞18に似て「褐変」になります。これはマウス モデルでは、人間では実証されている可能性のある主要な臨床関連性の現象です。共培養による変奏曲 SWAT は、また潜在的な途方もない研究を保持します。SWAT は、スタンダードセル文化井戸を利用して自然の共培養システムです。したがって、1 つは挟むセルを変更するか、組織培養膜挿入を利用して他の臨床的に関連する細胞の種類の中で脂肪細胞を維持できます。たとえば、肝細胞が脂肪組織に達する前に肝臓で濾過は薬剤を選別する上挟む細胞シートとして機能します。同様に、SWAT 脂肪細胞が癌病理学に貢献する方法を検討する上膜挿入上癌細胞に成長させることができます。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
著者は、ルイジアナ州立大学健康科学センター、プロジェクトに資金を提供によって提供される制度上のサポートを確認したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x HBSS | Thermofisher | 14185052 | |
| Gelatin | Sigma-aldrich | G9391 | |
| Collagenase | Sigma-aldrich | C5138 | |
| Adenosine | Sigma-aldrich | A9251 | |
| DMEM | Thermofisher | 11995065 | |
| M199 Media | Thermofisher | 11043023 | Phenol red-free |
| 250 µm Mesh Filter | Pierce | 87791 | |
| 0.2 µm Syringe Filter | Celltreat | 229747 | |
| 5 mL Luer-Lok syringes | BD | 309646 | |
| Metal Washers | These are simple metal washers and can be bought at any hardware store. They simply add leight weight to the backs of the plugers to ensure even contact between cells and gelatin, while being easy to stock and sterilize. Approximate mass: 6.3 g | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heated Equipment | |||
| Incubated Orbital Shaker | VWR | 10020-988 | Samples should be pitched at 45° angle to facilitate collagenase digestion |
| Heat Block | Set to 37-40 °C and placed under Biosafety Cabinet | ||
| Water Bath | Set to ~75 °C | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Specialized Plastics | |||
| Upcell Dishes 6cm of 6-multiwell | Nunc | 174902 or 174901 | These are commerically available pNIPAAm-coated dishes which can be used to grow the upper sheet of ADSCs. Alternatively, pNIPAAm-coated plates can be produced in-lab. diameter: <6 cm for 6 cm dish, <3.5 cm for 6-well plate; approximate mass: 6.7g for 6 cm dish, 5.1 g for 6-well plate |
| Plastic Plunger Apparatus | These can be fashioned to fit within desired pNIPAAm-coated plastics (multiwell plates, petri dishes). They are comprised of a simple stem attached to a circular disk. They can be produced in-lab or by any facility that can fashion acrylic plastics |
References
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