Summary
Hvidt fedtvæv (WAT) er kritisk mangler i dens nuværende primære kultur modeller, hindrer farmakologiske udvikling og metaboliske undersøgelser. Vi præsenterer her, en protokol for at producere et fedt microphysiological system af sandwiching WAT mellem ark af stromale celler. Denne konstruktion giver en stabil og fleksibel platform for primære WAT kultur.
Abstract
Hvidt fedtvæv (WAT) spiller en afgørende rolle i reguleringen af vægt og everyday sundhed. Alligevel er der stadig betydelige begrænsninger til rådighed primære kultur modeller, som alle har undladt at trofast sammenfatte den adipøst mikromiljø eller udvide WAT levedygtighed ud over to uger. Manglen på en pålidelig primære kultur model hindrer alvorligt forskning i WAT metabolisme og udvikling af lægemidler. Til dette formål har vi udnyttet NIHS standarder for et microphysiologic system til at udvikle en ny platform for WAT primære kultur kaldet "SWAT" (klemt hvidt fedtvæv). Vi overvinde den naturlige opdrift af adipocytter af sandwiching hakket WAT klynger mellem ark af fedt-afledt stromale celler. I denne konstruktion er WAT prøver levedygtige over otte uger i kultur. SWAT fastholder intakt ECM, celle til celle kontakter og fysiske belastninger i vivo WAT betingelser; Derudover fastholder SWAT en robust transcriptional profil, følsomhed over for eksogene kemiske signaler, og hele væv funktion. SWAT repræsenterer en enkel, reproducerbare og effektiv metode til primær adipøst kultur. Potentielt, er det en generelt gældende platform for forskning i WAT fysiologi, Patofysiologi, stofskifte og farmaceutisk udvikling.
Introduction
Fedtvæv er den primære organ af fedme, som varetager direkte årlige medicinske omkostninger mellem 147 milliarder dollars og 210 milliarder dollar i den amerikanske1. Ophobningen af fedtvæv bidrager også til andre førende dødsårsager som hjertesygdom, type II sukkersyge og visse former for kræft2. In vitro kultur modeller er afgørende for metaboliske undersøgelser og udvikling af lægemidler, men aktuelle forskning modeller af fedtvæv har store mangler. Adipocytter er skrøbelige, livlig, og uhelbredeligt differentierede celler, der ikke vil overholde celle kultur plast, og derfor kan ikke være kulturperler konventionel celle kultur metoder. Siden 1970 ' erne, er flere metoder blevet brugt i forsøg på at overvinde disse hindringer, herunder brugen af glas coverslips loft, suspension kultur, og kultur ekstracellulære matricer3,4,5, 6 , 7. men disse metoder har været præget af celledød og dedifferentiation, og de bruges typisk til ikke mere end en to-ugers undersøgelse periode. Desuden, disse modeller forsøg ikke sammenfatte de indfødte adipøst mikromiljø som de ikke bevare intakt ECM, interaktioner mellem adipocytter og stromale støtte celler, og heller ikke de kontraktile styrker celler øve på hinanden i in vivo WAT.
I mangel af en guld-standard primære adipøst kultur metode, har fedt forskning påberåbt sig primært differentieret pre adipocytter (diffAds). DiffAds er multilocular, vedhængende og metabolisk aktive. Derimod primære hvid adipocytter er ensfarvet, nonadherent, og viser relativt lavt stofskifte. Den manglende nuværende adipøst kultur modeller til at sammenfatte fysiologi af sunde modne fedtvæv er sandsynligvis en vigtig faktor i mangel af FDA-godkendt medicin, der er direkte målrettet adipocytter. I virkeligheden, er manglen på fysiologisk in vitro- orgel modeller et stort problem på tværs af de fleste organer og sygdom.
I sit oplæg, annoncere oprettelsen af sin Microphysiological Systems (MPS) program, rapporterede National Institutes of Health (NIH), at 2013 succesrate på tværs af alle menneskelige farmaceutiske kliniske forsøg var kun 18% for fase II og 50% for fase III kliniske forsøg8. MPS-programmet er designet til at tage direkte fat i vitro monokultur manglende evne til at model menneskelige fysiologi. NIH definerer MPSs som kultur systemer består af menneskelig primær eller stamceller i flercellede 3D konstruktioner, at sammenfatte orgel funktion. I modsætning til reduktionistiske modeller af homogen, udødeliggjort cellekulturer, bør MPSs præcist model celle-celle, narkotika-celle, stof-stof og orgel-drug interaktioner9. I modsætning til kortsigtede primære kultur metoder dikterer NIH standarder MPS bæredygtighed over 4 uger i kulturen8. Yderligere oplysninger om MPS-programmet kan findes på NIH'S RFAs (#RFA-TR-18-001)10.
Vi har udviklet en simpel, roman, fleksibel, og billig adipøst MPS betegnes "klemt inde hvidt fedtvæv" (SWAT)11. Vi overvinde den naturlige opdrift af adipocytter af "sandwiching" hakket primære fedtvæv mellem ark af fedt-afledt stromale celler (ADSCs) (figur 1). Den resulterende 3D konstruktion sammenfatter celle-celle-kontakt og de indfødte adipøst mikromiljø af omkring modne adipocytter med en naturlig adipocyt støtte celle population. SWAT er blevet valideret ved at demonstrere 8-ugers levedygtighed, reaktion på eksogene signalering, adipokine sekretion og engraftment i en dyremodel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle opgaver blev udført i tilslutning til protokollerne #8759 og #9189, som er godkendt af den interne Ratingmetode Office LSUHSC-NO. Alle dyr arbejde blev udført i tilslutning til protokollen #3285 godkendt af Kontoret for IACUC på LSUHSC-nr.
1. såning af Sandwiching celle ark
Bemærk: Se figur 1.
- Seed ADSCs på ca 80% confluency i vævskultur plader (6 cm eller 6-godt plader). For hver brønd af SWAT ønskede frø 1 konventionelle vævskultur godt og 1 godt af tilsvarende størrelse på poly(N-isopropylacrylamide (pNIPAAm)-belagt væv kultur plastik plade.
Bemærk: Derfor, en 6-godt plade af SWAT vil kræve såning celler på en 6-godt standard vævskultur plade (base lag) og en 6-godt pNIPAAm-belagt væv kultur plade (øverste lag). pNIPAAm-belagte plader kan købes kommercielt eller produceret i lab12,13,14. - Opretholde ADSCs ved 37 ° C og 5% CO2 i Dulbeccos modificerede Eagle Medium (DMEM) suppleret med 10% FBS og 1 x Penicillin/Streptomycin. Ændre media hver 2 dage.
- Tillad celler går hånd i hånd indtil de bliver 100% sammenflydende og tage på et stribet mønster (ca 6-8 dage).
Bemærk: Disse celler bliver nødt til at fungere som et enkelt intakt celle ark for at stabilisere den blomstrende fedtvæv. Utilstrækkeligt sammenflydende celler vil splitte ved såning med WAT.
2. forberedelse af SWAT forsyninger
- Forbered flere 10 mL alikvoter af 1 x Hank's Balanced Salt løsning (HBSS); forberede nok til det ønskede antal plader med volumen til overs.
-
Forberede apparatet stemplet SWAT såning. Konstruere stemplet ved hjælp af simple akryl plast, består af en stilk, der er knyttet til en runde disk. Sikre, at det passer i omkredsen af vævskultur wells (diameter: < 6 cm til 6 cm parabol, < 3,5 cm til 6-godt plade; omtrentlige masse: 6,7 g for en 6 cm parabol, 5,1 g for en 6-godt plade).
- Forberede ekstra udstikkere til at sikre, at proceduren vil køre gnidningsløst i tilfælde der er et problem med nogen individuelle stemplet.
- Wrap lab bånd omkring kanten af stemplet disk, mindst 2 x, for at forhindre udsivning af gelatine løsning.
- Spray en biosikkerhed kabinet (BSC) med 70% EtOH. Sprøjte ned en 15 mL konisk tube rack inde BSC med Tom, ikke-reducerede 15 mL konisk rør; rør vil hjælpe med at sikre placeringen af gelatine udstikkere.
- Spray hver tape-indpakket stemplet grundigt med 70% EtOH og sted i en 15mL konisk slange på rack. Spray metal skiver (omtrentlige masse 6,3 g) og placere dem på rack sammen med et par af hooked pincet; skiver vil tilføje vægt til stemplerne under SWAT såning.
- Luk BSC skærf og tænde UV lys til fremme tørring og sterilisation.
Bemærk: Ideelt, udføre dette trin 24 timer forud for SWAT såning. Alternativt, udføre processen på dagen for væv samling/SWAT såning; men i dette tilfælde tillade, at 15-45 min til UV tørring/sterilisation.
3. forberedelse af gelatine udstikkere — ansøgning til øverste celle ark
- Varme vandbad til 75 ° C.
-
Forbered gelatine løsning ved at tilføje 0,75 g gelatine pulver til 10 mL bestand af 1 x HBSS. Tilsæt 100 µL 1 M NaOH at balancere pH af løsningen i et stinkskab.
- Tilføje 10 mL lagre til et vandbad og ryst kraftigt hvert 5 min, indtil pulveret er opløst i løsning. Formålet med at opløse den pulveriserede gelatine snart efter tilsætning til det opvarmede vandbad.
- Drej på BSC blæser, slukke for UV-lys, og hæve rammen. Spray BSC overflade og forberede filteret forsyninger (5 mL luer-lock sprøjter og 0,2 µm sprøjte filtre). Forbered flere filtre til effektivt stamme tilstrækkelige mængder af gelatine til anvendelse på stemplerne.
- Når gelatine løsning når en ensartet konsistens, opløsningen filtreres og anvende det på stemplerne. Indlæse sprøjte med gelatine. Gælde de plastik udstikkere gelatine gennem filteret sprøjte (~2.5 mL til en 6-godt plade, ~4.5 mL til en 6 cm parabol) og tillade for at størkne (~ 20 min).
- Når gelatine er solid, udpakke tape fra kanten af stemplerne. Med krogede pincet, fjerne gelatine fra yderkanten af stemplet (dvs. de hævede kanter af menisken). Sikre, at de resterende gelatine i midten af stemplet er helt plan at maksimere kontakt med ADSC ark.
- Når overskydende gelatine er fjernet, forsigtigt anvende gelatine udstikkere til de pNIPAAm-belagt ADSC plader. Bruge metal skiver til vejer ned stemplet. Shear ikke celle plader mens anvendelse stemplerne.
-
Forlade stemplerne på celle membraner til 1,5 timer ved stuetemperatur. Inkuber plader/udstikkere i en is vandbad til 1,5 time at fuldføre dissociation af arket celle fra pNIPAAm-belagt plade overflade.
- Udvis forsigtighed, mens inkubere i iskarret; Tillad ikke iskarret forurene celle medier under inkubation.
- Efter endt inkubation, rense bunden af de pNIPAAm-belagte plader til at fjerne ikke-sterilt vand.
4. hvidt fedtvæv behandling
- Når du indsamler menneskers fedtvæv fra operationsstuen, holde alle prøver i en steril beholder, der er på is, indtil SWAT er at blive seedet. Tilføje sterile vedligeholdelse medier, såsom fosfatbufferet saltopløsning (PBS), til fedtvæv beholder til væv stabilitet.
- Tilføje kolde cellekulturmedium til 1,5 mL microcentrifuge rør til hver brønd/parabol til at blive seedet (100 µL for en 6-godt plade, 200 µL til en 6 cm parabol).
-
Hakkekød fedtvæv.
- For solid fedtvæv segmenter, gøre som følger.
- Vaske store dele af fedtvæv 3 x i steril PBS og fjerne så meget PBS som muligt.
- Groft hakkekød væv med pincet og sterile razor og fjerne så meget vaskulatur og fascia som muligt (Se diskussion for flere detaljer).
- Fint hakke fedt med razor, indtil hakket væv tager på tykke, flydende konsistens.
Bemærk: Ideelt væv vises homogen med ingen synlige individuelle segmenter af WAT selv om dette ikke altid er muligt.
- Behandle lipoaspirate som følger.
- Under BSC, tape steril gaze over toppen af et bægerglas, og placere dette bæger i et større bægerglas at indsamle overskydende væske.
- Bruger en 25 mL serologisk pipette, trække så meget lipoaspirate efter behov og anvende det på overfladen af den steril gaze. Anvende PBS direkte til denne overflade at vaske lipoaspirated fedt og fjerne overskydende blod og lipid rester.
- Bruge pincet til at genoprette drænet væv, overføre det til en steril mincing overflade og hakke lipoaspirate.
- For solid fedtvæv segmenter, gøre som følger.
- Bruge en steril razor for at afskære den distale ende af p1000 pipette tips til at overføre hakket væv; Dette vil minimere shear stress, der kan føre til adipocyt lysering. Når en ordentlig væv konsistens er nået overføre den ønskede mængde af hakket væv til hver 1,5 mL tube (300-400 µL for 6-godt plade, 500 – 600 µL til 6 cm parabol). Bland hakket WAT og medier kort i rørene.
-
Tage de base ADSC plader og dekanteres/aspirat medierne. Erstatte medierne med WAT/media blandingen fra hver 1,5 mL tube.
- Forsigtigt fjerne gelatine stemplerne fra pNIPAAm-belagte plader og anvende dem til WAT blandingen på base ADSC pladerne. Undersøge éncellelag af de pNIPAAm-belagte plader under et mikroskop for at bekræfte cellulære detachement.
- Sat en varme blok til ca 37-40 ° C under BSC. Med udstikkere stadig på plads, skal du flytte pladerne varme blok overflade. Tilføje 2-3 mL af varmede dyrkningsmedier til Inkuber cellerne og lette smeltning af gelatine.
- Efter ~ 30 min, forsigtigt fjerne stemplerne fra plade overflade. Erstatte låg af base vævskultur plader og flytter til en celle kultur inkubator. Når gelatine har helt flydende ved 37 ° C, Aspirér og erstatte celle Kulturmedier.
- Vedligeholde SWAT ved 37 ° C og 5% CO2 i phenol rød-fri M199 medium med 7 µM insulin, 30 µM dexamethason, 1 x Penicillin/Streptomycin. Vedligehold i ca 2 mL medier for 6-godt plader og 3 mL til 6 cm retter. Ændre media hver 2 dage.
5. SWAT høst
- Forberede collagenase (0,5 mg/mL collagenase, 500 nM adenosin i PBS) delprøver i 15 mL konisk rør (omtrentlige mængde af 10 mL). Fryse rør og gemme dem på-20 ° C.
- Opsug enhver kulturmediet fra cellerne, vaske 1 x med PBS og derefter Aspirér PBS. Prep collagenase delprøver af optøning dem i et 37 ° C vandbad.
Bemærk: Ideelt, collagenase løsning vil nå 37 ° C; umiddelbart derefter tilføje væv. -
Tilføje alle væv fra SWAT plade til de enkelte delprøver. Høste SWAT ved hjælp af en steril celle scrapper og overføre det til collagenase delprøver med en cut-off p1000 pipette spids. Tilføje væv direkte til 15 mL konisk rør indeholdende collagenase løsning.
- Alternativt, inkuberes væv/collagenase blandingen i en 50 mL konisk slange; den øgede areal vil yderligere fremme Enzymatisk nedbrydning.
- Placer prøveglassene i en rugede orbitalryster i en 45° vinkel. Der inkuberes ved 200 rpm, ved 37 ° C i 30-60 min.
- Sted en 250 µm mesh-filter i en ny 15 mL konisk slange for samling. Hæld fordøjet adipocyt løsning gennem filteret.
Bemærk: Dette vil give alle celler til at passere gennem mens frafiltrere fibrøst væv. - Tillad gennemstrømnings at sidde i 5 min. ved stuetemperatur til faseadskillelse.
Bemærk: Adipocytter vil flyde til toppen af løsningen, mens de fedt stromale celler (ASCs) vil bosætte sig i de lavere faser. Centrifugering i 5 min på 500 x g kan også maksimere celleseparering eller høst omkring ADSCs i toerstoffet. -
Brug en cut-off p1000 pipette tip, overførsel adipocytter (flydende lag på toppen af collagenase løsning) til en 1,5 mL microcentrifuge collection tube. Tager ~ 250 µL ad gangen, afpipetteres langsomt langs kanten af røret til at indsamle adipocytter.
- Rotere røret langsomt mens indsamling adipocytter for at maksimere inddrivelsen af celler indersiden at overholde. Holde tegning flere celler, indtil 1,5 mL microcentrifuge tube er fuld.
- Fjern overskydende væske fra de isolerede adipocytter ved hjælp af en sprøjte, der er knyttet til en nål (~ 21 G). Dykke nål under det flydende adipocyt lag. Agitere nål kort for at løsne celler overholde nål akslen, og derefter vente på at forrykke adipocytter at flyde til toppen.
- Langsomt trække den overskydende væske, være omhyggelig med at undgå utilsigtet fjernelse af adipocytter. Bruge microcentrifuge tube gradueringer konsekvent isolere prøve diskenheder (fx. 0,1 mL for hver enkelt prøve).
- Bruge de isolerede celler til DNA/RNA udvinding, glukose optagelse assay, lipolyse assay, osv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Levedygtighed af SWAT var oprindeligt vurderet af serielle brightfield billeddannelse af enkelte WAT klynger (n = 12) over ca. 7,6 uger. Klynger forblev sikrede på plads på éncellelag i hele denne tid. Morfologiske ændringer blev observeret med individuelle adipocytter vridning lidt eller skiftende positioner. Imidlertid adipocytter heller ikke blive multilocular over tid, med angivelse af en mangel på dedifferentiation, eller gjorde de udviser synlige tegn på celledød som cellulære blebbing, lysis eller fragmentering (figur 2). Af klynger adipocyt identitet blev bekræftet på to-uge-forhenværende SWAT med lipid pletten Nilen Red (NR). Klar NR farvning af unilocular adipocyt klynger anført, at disse faktisk var adipocytter med udbrudte hinder, snarere end artefakt, cyster eller døde adipocytter. Fravær af NN farvning i de omkringliggende ADSC ark angiver, at disse celler ikke akkumulere lipid og derfor ikke skelne mod en adipogenic afstamning sig (figur 3a). Propidium Iodid farvning blev udført på 53 daggamle SWAT. Udelukkelse af pletten inden for adipocyt klynger på avancerede timepoints viser en manglende celledød (figur 3b). Olie-rød-O (ORO) plet blev udført på 51 dage gamle SWAT med lipid pletten lokalisering inden for faste adipocyt klynger, der angiver, at SWAT adipocytter bevare levedygtighed med intakt adipocytter selv ved avancerede timepoints (figur 3 c).
Immuncytokemi (ICC) blev udført for at demonstrere forventede protein udtryk og lokalisering af modne adipocyt markører i SWAT. Intakt SWAT plader var plettet med antistoffer mod perilipin (ab3526, 1:200 fortynding), PPARγ2 (sc-166731, 1: 100 fortynding), og FABP4 (ab92501, 1:1,000 fortynding). Konfokal billeder af 12 dage gamle SWAT demonstreret forventede lokalisering af perilipin omkring lipid droplet overflade (figur 4a). Fluorescens mikroskopi af 3 dage gamle SWAT med lipid counter pletten BODIPY viste FABP4 lokalisering i cytoplasma (figur 4b), og overlappende signal fra PPARG og DAPI farvning demonstreret PPARG lokalisering til kernen ( Figur 4 c).
SWAT transcriptional profil blev evalueret i væv seedede fra flere fag (n = 4 donorer). Efter indsamling, blev en del af fedtvæv brugt til en baseline RNA udvinding (d0), mens resten blev brugt til frø SWAT plader. Disse plader er derefter høstet på 24 timer, 14 dage, og 28 dage i SWAT kultur. Et-trins kvantitative reverse transkription polymerase kædereaktion (RT-qPCR) blev udført for at bestemme transskription niveauer. Seks vigtige adipocyt gener blev undersøgt: PPARG, FABP4, LPL, CEBPA, HSL, og ADIPOQ (figur 5). ACTB blev brugt som en intern kontrol og transcriptional niveauer blev udtrykt som en procent af emne-matchede baseline (d0) udtryk. Alle gener udvist robust transskription i SWAT, selvom niveauer trend nedad over tid. Vi mener, at observeret transcriptional profiler kunne forbedres med yderligere medier optimering, som vi uddybe i afsnittet diskussion.
Basal endokrine funktion blev evalueret på samme kulturer bruges til profilen transcriptional. Supernatanten blev indsamlet fra SWAT plader og leptin niveauer blev målt udnytte enzymmaerket assay (ELISA) (ab100581). SWAT vises basal leptin sekretion på dag 1, 14 og 28 (figur 6a). ADSC ark blev opretholdt i parallel med SWAT plader som en kontrol (dvs. ADSC ark uden klemt WAT). Udskilles leptin kunne ikke påvises i disse kontrolelementer (data ikke vist).
For at afgøre, om SWAT kunne bevare kapacitet for en inducerbar svar over tid, blev det undersøgt, lipolyse (n = 4). For at evaluere inducerbar lipolytic kapacitet, en del af frisk indsamlede WAT (d0) var hakket og adipocytter var enzymatisk isoleret (svarende til SWAT høst i protokollen afsnit 5), mens resten blev brugt til frø SWAT plader. Isolerede adipocytter blev udruget i 3 timer ved 37 ° C i 300 µL af 2% fedtsyrer-syre-fri bovint serumalbumin i HBSS med 100 µM forskolin, 1 µM adrenalin, eller kontrol buffer. Glycerol niveauer i indsamlede medier blev målt med gratis Glycerol reagens. SWAT var derefter høstet på dage 1 og 5 og lipolytic kapacitet blev evalueret på samme måde. Kemiske stimulation øget glycerol release betydeligt på alle tre timepoints (fig. 6b): glycerol frigivelse af behandlede adipocytter var steget i d0 WAT 82 ± 46% (p = 0,01), 1-dages SWAT 577 ± 387% (p = 0,02), og fem-dages SWAT 348 ± 343% (p = 0,03). mener glycerol niveauer i stimuleret adipocytter var meget ens på tværs af alle tre timepoints: primære WAT 5.2 ± 0,8, 1-dags SWAT 4.4 ± 1.9 og 5-dages SWAT 4,8 ± 1.8 µg glycerol/mg total protein. Gennemsnitlig glycerol niveauer i kontrol (dvs. basal lipolyse) var relativt høj i frisk indsamlede WAT (d0) i forhold til SWAT-høstet celler. Dette kan skyldes den øgede stress til WAT væv på d0 under kirurgisk excision, transport til laboratoriet, og hakkes. Men disse eksperimenter viser ingen diminishment i lipolytic kapacitet i SWAT på enten 1 eller 5 dage i forhold til frisk indsamlede WAT.
SWAT var vist sig for at være i stand til transplantation og opsving i en musemodel (n = 4) som en demonstration af komplekse, hele væv funktion. Det er også en eventuel anvendelse af platformen bør en forsker ønske om at udnytte SWAT for at manipulere WAT i vitro inden omplantning væv i en dyremodel. SWAT var kulturperler i 10 dage og høstet udnytter standard-protokol; isolerede adipocytter fra SWAT plader blev derefter indlæses i en 1 mL sprøjte (uden nål). Et snit er lavet under huden på den dorsale side af en immunkompromitterede eGFP-udtrykker mus (Nik. CG-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl Tg(CAG-EGFP)1Osb/SzJ). Dette skabte en lille rygfinne subkutane lomme som SWAT-kulturperler adipocytter blev sprøjtet med sprøjten og lommen var derefter sutureres lukket. Efter 10 dage efter transplantation, blev mus ofret. Transplantationer var klart synlige og let inddrevet (figur 7a). Både den gendannede transplantation og en mus kontralaterale fedt depot blev fastsat, paraffin indlejret, og snit. Immunhistokemi blev udført på sektioneret dias med primære antistoffer mod normal god landbrugspraksis (A10262, 1: 100 fortynding) og menneskelige PLIN (sc-390169, 1: 100 fortynding). Det valgte anti-PLIN antistof blev eksperimentelt valideret for at plette menneskelige PLIN men ikke mus. Adipocytter fra den gendannede transplantation var ca 50-120 µm i størrelse, som er det forventede interval for menneskelige adipocytter, og var helt negativ for normal god landbrugspraksis (figur 7b). Ca. 31% af adipocytter var imidlertid positiv for menneskelige PLIN, der angiver vellykket engraftment til værten. Adipocytter i mus fedt depoter var størrelse 20 – 40 µm, som er i overensstemmelse med musen adipocytter, mens farvning helt positiv for normal god landbrugspraksis og helt negativ for menneskelige PLIN (figur 7 c). ADSC ark (med ingen klemt WAT) var skrabet fra celle kultur retter og transplanteret ind i musene som kontrol. Disse imidlertid ikke give alle genoprettelige væv (data ikke vist). Dette antydede, at de gendannede adipocytter fra den modne kulturperler SWAT, og ikke resultatet af differentierede menneskelige ADSCs.
Figur 1: The SWAT metode. (en) skematisk af SWAT viser overførsel af et ark med eGFP-mærket ASCs fra en pNIPAAm-belagt væv kultur parabol på en anden, uden etiket ark af ASCs dyrkes på en standard vævskultur parabol. Hakket, primære menneskelige WAT er klemt inde mellem de 2 ASCs ark. (b) Fluorescens mikroskopi demonstrere Brightfield, normal god landbrugspraksis og flettede kanaler af en SWAT, lavet af den teknik, der er beskrevet i litra a. Skalalinjen = 100 µm. (c) Digital fotografi af en repræsentant, 5 dage gamle SWAT kulturperler i en standard 6-godt plade. Den store mængde af WAT er stabilt fastgjort til bunden af brønden. Figur ændres fra Lau mfl. 11 Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: SWAT forbliver levedygtige på 8 uger i kultur. Seriel brightfield imaging af en enkelt SWAT klynge over 55 dage viser ingen morfologiske ændringer i overensstemmelse med celledød. Skalere barer = 100 µm. figur ændres fra Lau mfl. 11 Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: SWAT forbliver levedygtige på større end 50 dage. (en) Nilen rød farvning viser farvning begrænsning til SWAT kulturperler for 15 dage, der viser live levedygtige adipocytter. Omkring stromale celler ikke pletten. Figur er på 40 X Forstørrelse og skalalinjen = 100 µm. (b) Propidium Iodid (PI) farvning af SWAT kulturperler 53 dage afslører udfylder PI udstødelse, der angiver ingen adipocyt død; Skalalinjen = 100 µm. (c) olie-rød-O farvning af en 51 daggamle SWAT viser begrænsning af neutrale lipider til adipocytter, der angiver langsigtet stabilitet af adipocyt cellemembraner. Figur ændres fra Lau mfl. 11 Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: immuncytokemi viser, at SWAT pletter positivt for modne adipocyt celle markører med forventede lokalisering. (en) Confocal mikroskopi af 2 uger gamle SWAT afslørede menneskelige PLIN + unilocular celler med lokalisering lipid droplet overflade. Skalalinjen = 100 µm. (b) fluorescerende mikroskopi af 3 dage gamle SWAT afslørede FABP4 + menneskeceller med lokalisering af cytoplasma og (c) PPARγ + celler med lokalisering til cellekernen. Skalalinjen = 100 µm. figur ændres fra Lau et al. 11 Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: SWAT fastholder centrale adipocyt identitet genekspression. SWAT klynger var collagenase fordøjet efter 1, 14 og 28 dage i kultur og gen udtryk bestemmes af RT-qPCR. RT-qPCR viser at 1 dag gamle og 14 dage gamle SWAT bevare høje niveauer af (en) PPARG, (b) FABP, (c) HSL, (d) CbEBPA, (e) LPL og (f) ADIPOQ. ACTB blev brugt som reference genet. Fejllinjer = standardafvigelse. Figur ændres fra Lau mfl. 11. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: SWAT basen udskiller adipokines og fysiologisk modsvarer catecholamin stimulation. (en) ELISA kvantificeringen 24t basal leptin sekretion viser ingen væsentlig ændring efter 28 dage i kultur. (b) adrenerg stimulation med adrenalin og forskolin genererer en betydelig glycolytic svar i friskhøstede primære WAT (1,7 x) og emne-matchede SWAT på 1 og 5 dage i kultur. Dag 1 SWAT reagerede på catecholamin stimulus med en 6.3-fold stigning over basal glykolyse mens dag 5 SWAT demonstreret en 3.3-fold stigning over basal glykolyse. Stimuleret glykolyse var ikke signifikant forskellig i SWAT sammenlignet med matchede frisk WAT (p = 0,53, n = 4). Fejllinjer = standardafvigelse. Figur er modificerede Lau et al. 11. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: SWAT kan være reimplanterede i vivo, demonstrerer bevaret hele væv funktion. (en) SWAT var let visualiseret 10 dage efter transplantation til en immunkompromitterede mus (stjerne). Havde SWAT ikke held implanteret, med ti dage ville de nekrotiske SWAT har været flydende. (b) dele af gendannede SWAT påvist store, unilocular adipocytter (diameter 50 til 120 µm), der var eGFP-. 31,3% af adipocytter var menneskelige PLIN +. De menneskelige PLIN + adipocytter tendens til at være mindre, som ville passe med kliniske observationer af fedt podning i mennesker hvor mindre adipocytter er mere tilbøjelige til at overleve overførsel. Skalalinjen = 100 µm, 200 X forstørrelse. (c) kontralaterale fedt puder taget fra de samme mus viste meget mindre adipocytter (20 – 40 µm) og var menneskelige PLIN-. Skalalinjen = 100 µm, 200 X forstørrelse. Figur ændres fra Lau et al. 11. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol beskriver brugen af ADSCs til sandwich menneskelige hvidt fedtvæv; menneskelige ADSC cellelinjer kan isoleres via veletablerede protokoller15. Dog kan systemet tilpasses til individualiseret forskning krav (f.eks. ved hjælp af 3T3L-1 celler til sandwich mus WAT). Denne proces indebærer håndtering primære humant væv. Standard sikkerhedsforanstaltninger bør være ansat; håndtere humane væv som BSL-2 patogener (fx HIV, HepC). Kun håndtere væv direkte under en BSC. Bære alle relevante PPE da dikteres af institutionelle sikkerhedsstandarder — dobbelt handsker er stærkt anbefales. Desinficere korrekt alle forsyninger og affald med 10% blegemiddel løsning eller 70% ethanol løsning før genbrug eller bortskaffelse.
Det første vigtige skridt i SWAT kultur rufferi og fastholde pNIPAAm-belagt væv kultur plader. Sådanne plader fås kommercielt, eller de kan fremstilles gennem etablerede metoder12,13,14. Disse plader er temperatur-responderende celle kultur overflader. Over den kritiske temperatur (~ 32 ° C), overfladen er hydrofobe og celler vil overholde, svarer til andre behandlede plast til vævskultur. Men under denne kritisk temperatur, overfladen bliver hydrofile og celler vil tage afstand fra de plastik overflade16. As a result, der bør udvises forsigtighed at etablere: 1) hvor hurtigt en given celletype vil tage afstand fra éncellelag, før de når fuld confluency (dvs. under normale medieændringer) og 2) den nødvendige tid til at sænke temperaturen med gelatine stemplet anvendes til pNIPPAm-belagt pladen, at sikre, at hele cellen ark dissocieres. Media ændringer bør udføres med media opvarmet til 37 ° C; Hvis celler er tilbøjelige til hurtig dissociation, udføre ændringer i medierne på en varme blok sat til 37 ° C under BSC.
Det andet vigtige skridt er forarbejdning fedtvæv at forberede SWAT såning. Vi udførte vores karakterisering af hakning WAT med steriliseret pincet og steriliseret barbermaskiner. Dog skæres ikke menneskelige fascia nemt med en barberkniv. Maksimere adipocyt til fascia forholdet er vigtigt at bevare så meget fedtvæv inden for SWAT som muligt over en langsigtet periode. Store stykker af intakt fascia vil forhindre celle-celle kontakt mellem ADSCs og adipocytter, hvilket er afgørende for at holde SWAT sammen. Store mængder af fascia kan også have en "trækker på en tråd" effekt. Der henviser til, at en enkelt WAT klynge kan tage afstand fra en plade uden at påvirke de tilstødende klynger, kan flere klynger forbundet af fascia trække nok klynger fra en éncellelag til at gengive en SWAT godt ubrugelig. Fedtsugning, som involverer de mekaniserede hakning af WAT, kan omgå dette problem som fascia er fint hakket under kirurgi. Dog under fedtsugning, er patienter rutinemæssigt behandles med høje doser af adrenalin; de mulige konsekvenser af denne behandling på væv (og efterfølgende eksperimenter) skal tages højde for under en undersøgelse.
Den sidste kritiske trin i SWAT kultur er at vælge en eksperimentel dyrkningsmedier. Vi udførte vores oprindelige karakterisering eksperimenter udnytter en standard celle kultur formulering (10% FBS, 1 x Penicillin/Streptomycin i DMEM). Men, baseret på tilgængelige litteratur med hensyn til maksimering adipocyt transskription, brugte vi en specialiseret formulering (7 µM insulin, 30 µM dexamethason, 1 x Penicillin/Streptomycin i M199 medier)17. Denne formulering forbedret de tidlige niveauer af transskription, men niveauet faldt over tid. Vi mener, dette er fordi kroppen, adipocytter er udsat for en lang række kemiske signaler, ofte cykling mellem fodret og udsultet stater i løbet af en dag. Således bør det være muligt at forbedre den observerede transcriptional profil over tid ved yderligere optimering af kosttilskud til vores celle kultur medier.
SWAT høst (protokol, afsnit 5) isolerer adipocytter fra kulturen, reducerer sample volumen og fjerner interferens fra de omkringliggende ADSC ark. Dette kan gå forud for adipocyt homogenisering, (som er nødvendigt for protein eller nukleinsyre isolation), eller funktionelle undersøgelser af intakt adipocytter (såsom glykolyse eller glukose optagelse assays). Intakt SWAT pladen kan alternativt høstes til andre farvning, som tillader ADSC ark til at sikre WAT klynger til éncellelag hele farvning processen. I dette tilfælde Opsug dyrkningsmedier og ordne det hele kultur via standardprotokoller. Vi anbefaler dog tilføjer et glas coverslip før imaging samkopiere 3D adipocyt klynger og forbedre den resulterende billedkvalitet.
Vi mener, at SWAT har stort potentiale som et lægemiddel screening platform. Teknikken er enkel, reproducerbar, og udnytter konventionelle vævskultur plader. Derfor er stof screening eksperimenter eksekverbare ved at tilføje et farmakologisk virksomt stof til næringssubstratet. Adipocytter kan derefter høstes for at undersøge effekten af sammensat på genekspression, epigenetiske profil, insulinfølsomhed, etc. tilsætning af miljømæssige toksiner at dyrkningsmediet kan ligeledes bruges til at undersøge deres virkninger på adipocytter. Fordi SWAT gør det muligt for forskeren at spore individuelle adipocyt klynger over tid, er det unikt tilpasset til at evaluere en behandling, der gør en synlig fænotypiske forandringer til adipocytter. Et fremtrædende eksempel ville være menneskelige adipocyt "bruning", hvori en hvid, lagring af lipid adipocyt bliver "brune" eller lignende til en termogeniske, multilocular brune adipocyt18. Dette er et fænomen af potentielt store klinisk relevans, der er påvist i musemodeller, men aldrig i et menneske. Co kulturperler variationer på SWAT hold også enorme forskning potentielle. SWAT er et naturligt fælles kultur system, der udnytter standard celle kultur brønde. Derfor kan man opretholde adipocytter blandt andre klinisk relevante celletyper ved at ændre de sandwiching celler eller ved at udnytte vævskultur membran skær. For eksempel, kunne hepatocytter fungere som den øverste sandwiching celle ark til at screene et stof, der er filtreret gennem leveren, før de når fedtvæv. Ligeledes, kræftceller kan dyrkes på en membran indsætte over SWAT at undersøge, hvordan adipocytter bidrage til kræft patologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne anerkende den institutionelle støtte fra LSU Health Sciences Center, som finansieres projektet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x HBSS | Thermofisher | 14185052 | |
| Gelatin | Sigma-aldrich | G9391 | |
| Collagenase | Sigma-aldrich | C5138 | |
| Adenosine | Sigma-aldrich | A9251 | |
| DMEM | Thermofisher | 11995065 | |
| M199 Media | Thermofisher | 11043023 | Phenol red-free |
| 250 µm Mesh Filter | Pierce | 87791 | |
| 0.2 µm Syringe Filter | Celltreat | 229747 | |
| 5 mL Luer-Lok syringes | BD | 309646 | |
| Metal Washers | These are simple metal washers and can be bought at any hardware store. They simply add leight weight to the backs of the plugers to ensure even contact between cells and gelatin, while being easy to stock and sterilize. Approximate mass: 6.3 g | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heated Equipment | |||
| Incubated Orbital Shaker | VWR | 10020-988 | Samples should be pitched at 45° angle to facilitate collagenase digestion |
| Heat Block | Set to 37-40 °C and placed under Biosafety Cabinet | ||
| Water Bath | Set to ~75 °C | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Specialized Plastics | |||
| Upcell Dishes 6cm of 6-multiwell | Nunc | 174902 or 174901 | These are commerically available pNIPAAm-coated dishes which can be used to grow the upper sheet of ADSCs. Alternatively, pNIPAAm-coated plates can be produced in-lab. diameter: <6 cm for 6 cm dish, <3.5 cm for 6-well plate; approximate mass: 6.7g for 6 cm dish, 5.1 g for 6-well plate |
| Plastic Plunger Apparatus | These can be fashioned to fit within desired pNIPAAm-coated plastics (multiwell plates, petri dishes). They are comprised of a simple stem attached to a circular disk. They can be produced in-lab or by any facility that can fashion acrylic plastics |
References
- Cawley, J., Meyerhoefer, C. The medical costs of obesity: An instrumental variables approach. Journal of Health Economics. 31 (1), 219-230 (2012).
- Pi-Sunyer, X.
- Smith, U. Morphologic studies of human subcutaneous adipose tissue in vitro. Anatomical Record. 169 (1), 97-104 (1971).
- Sugihara, H., Yonemitsu, N., Miyabara, S., Yun, K. Primary cultures of unilocular fat cells: characteristics of growth in vitro and changes in differentiation properties. Differentiation. 31 (1), 42-49 (1986).
- Sugihara, H., Yonemitsu, N., Toda, S., Miyabara, S., Funatsumaru, S., Matsumoto, T. Unilocular fat cells in three-dimensional collagen gel matrix culture. The Journal of Lipid Research. 29, 691-697 (1988).
- Hazen, S. A., Rowe, W. A., Lynch, C. J. Monolayer cell culture of freshly isolated adipocytes using extracellular basement membrane components. The Journal of Lipid Research. 36, 868-875 (1995).
- Fried, S. K., Kral, J. G. Sex differences in regional distribution of fat cell size and lipoprotein lipase activity in morbidly obese patients. International Journal of Obesity. 11 (2), 129-140 (1987).
- Sutherland, M. L., Fabre, K. M., Tagle, D. A. The National Institutes of Health. Microphysiological Systems Program focuses on a critical challenge in the drug discovery pipeline. Stem Cell Research and Therapy. 4, (2013).
- Wikswo, J. P. The relevance and potential roles of microphysiological systems in biology and medicine. Experimental Biology and Medicine. 239 (9), 1061-1072 (2014).
- National Institutes of Health. NIH-CASIS Coordinated Microphysiological Systems Program for Translational Research in Space (#RFA-TR-18-001). , Available from: https://grants.nih.gov/grants/guide/rfa-files/RFA-TR-18-001.html (2017).
- Lau, F. H., Vogel, K., Luckett, J. P., Hunt, M., Meyer, A., Rogers, C. L., Tessler, O., Dupin, C. L., St Hilaire, H., Islam, K. N., Frazier, T., Gimble, J. M., Scahill, S. Sandwiched White Adipose Tissue: A Microphysiological System of Primary Human Adipose Tissue. Tissue Engineering Part C: Methods. 24 (3), (2018).
- Ebara, M., Hoffman, J. M., Stayton, P. S., Hoffman, A. S. Surface modification of microfluidic channels by UV-mediated graft polymerization of non-fouling and 'smart' polymers. Radiation Physics and Chemistry. 76, 1409-1413 (2007).
- Lin, J. B., Isenberg, B. C., Shen, Y., Schorsch, K., Sazonova, O. V., Wong, J. Y. Thermo-responsive poly(N-isopropylacrylamide) grafted onto microtextured poly(dimethylsiloxane) for aligned cell sheet engineering. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 99, 108-115 (2012).
- Turner, W. S., Sandhu, N., McCloskey, K. E. Tissue Engineering: Construction of a Multicellular 3D Scaffold for the Delivery of Layered Cell Sheets. Journal of Visualized Experiments. (92), e51044 (2014).
- Bunnell, B., Flaat, M., Gagliardi, C., Patel, B., Ripoll, C. Adipose-derived stem cells: Isolation, expansion and differentiation. Methods. 45 (2), 115-120 (2008).
- Akiyama, Y., Kikuchi, A., Yamato, M., Okano, T. Ultrathin poly(N-isopropylacrylamide) grafted layer on polystyrene surfaces for cell adhesion/detachment control. Langmuir. 20 (13), 5506-5511 (2004).
- Fried, S. K., Russell, C. D., Grauso, N. L., Brolin, R. E. Lipoprotein lipase regulation by insulin and glucocorticoid in subcutaneous and omental adipose tissues of obese women and men. Journal of Clinical Investigation. 92 (5), 2191-2198 (1993).
- Keipert, S., Jastroch, M. Brite/beige fat and UCP1 - is it thermogenesis? Biochimica et Biophysica Acta. 1837 (7), 1075-1082 (2014).
