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Behavior

Una plataforma de Microphysiologic de grasa humana: intercala tejido adiposo blanco

Published: August 15, 2018 doi: 10.3791/57909
Automatic Translation
1, 2, 2, 2
1Department of Pharmacology, Louisiana State University Health Sciences Center, 2Department of Surgery, Louisiana State University Health Sciences Center

Summary

Tejido adiposo blanco (WAT) tiene deficiencias importantes en sus modelos actuales de cultivo primario, que obstaculizan el desarrollo farmacológico y estudios metabólicos. Aquí, presentamos un protocolo para producir un sistema microphysiological adiposo WAT bocadillo entre las hojas de las células estromales. Esta construcción proporciona una plataforma estable y adaptable para cultivo primario de WAT.

Abstract

Tejido adiposo blanco (WAT) desempeña un papel crucial en la regulación de la salud peso y todos los días. Sin embargo, existen importantes limitaciones a los modelos disponibles en cultivo primario, que no han podido recapitular el microambiente adiposo fielmente o extender la viabilidad WAT más de dos semanas. La falta de un modelo de cultura primaria confiable impide severamente investigación en WAT metabolismo y desarrollo de medicamentos. Para ello hemos utilizado estándares de NIH de un sistema de microphysiologic para desarrollar una nueva plataforma para cultivo primario WAT llamado 'SWAT' (tejido adiposo blanco intercalado). Vencemos la flotabilidad natural de los adipocitos intercalando picada WAT racimos entre las hojas de células estromales derivadas del adiposo. En esta construcción, WAT las muestras son viables después de ocho semanas en la cultura. SWAT mantiene el ECM intacta, contactos célula a célula y las presiones físicas de en vivo las condiciones WAT; Además, SWAT mantiene un perfil transcripcional robusto, sensibilidad a la señalización química exógena y función del tejido entero. SWAT representa un método simple, reproducible y eficaz de cultivo primario de adiposo. Potencialmente, es una plataforma ampliamente aplicable para la investigación en fisiología, Fisiopatología, metabolismo y desarrollo farmacéutico de WAT.

Introduction

Tejido adiposo es el órgano principal de la obesidad, que lleva los costos médicos anuales directos entre $ 147 billones y $ 210 billones en los Estados Unidos1. La acumulación de tejido adiposo contribuye también a otras causas de muerte tales como enfermedad cardíaca, tipo diabetes II y ciertos tipos de cáncer2. Modelos de cultivo in vitro son esenciales para los estudios metabólicos y de desarrollo de fármacos, pero modelos actuales de la investigación del tejido adiposo tienen deficiencias importantes. Adipocitos son frágiles, boyante y células que no se adherirán a los plásticos de la cultura de célula y por lo tanto no pueden ser cultivadas utilizando métodos de cultivo celular convencionales terminalmente diferenciadas. Desde la década de 1970, varios métodos se han utilizado en los intentos de superar estas barreras, incluyendo el uso de cubreobjetos de vidrio, techo cultura, cultura de suspensión y matrices extracelulares3,4,5, 6 , 7. sin embargo, estos métodos han sido marcados por la muerte de la célula y diferenciación, y se suelen usar para nada más que un periodo de dos semanas de estudio. Por otra parte, estos modelos no tratan de recapitular el microambiente adiposo nativo ya no sostienen el ECM intacto, las interacciones entre los adipocitos y stromal células de apoyo, ni las fuerzas contráctiles células ejercen sobre otros en en vivo WAT.

En la ausencia de un método estándar de oro en cultivo primario adiposo, investigación adiposo ha confiado principalmente en los adipocitos pre diferenciadas (diffAds). DiffAds son multiloculares, adherente y metabólicamente activo. Por el contrario, adipocitos blancos primarios son uniloculares, nonadherent y demuestran metabolismo relativamente baja. El fracaso de los modelos actuales de cultura adiposo para recapitular la fisiología del tejido adiposo maduro sano es probablemente un factor importante en la ausencia de medicamentos aprobados por la FDA que directamente adipocitos. De hecho, la falta de modelos de órganos fisiológicos en vitro es un problema importante en la mayoría de los órganos y la enfermedad.

En su documento de posición anunciando la creación de su programa de Microphysiological Systems (MPS), los institutos nacionales de salud (NIH) informó que la tasa de éxito de 2013 a través de todos los ensayos clínicos farmacéuticos humanos era sólo 18% para la fase II y 50% para la fase III ensayos clínicos8. El programa MPS está diseñado para abordar directamente la imposibilidad de fisiología humana modelo de monocultivo en vitro . El NIH define MPSs como sistemas de cultivo conformados por primaria humano o células madre en multicelulares construcciones 3D que recapitulan el funcionamiento del órgano. A diferencia de los modelos reduccionistas de cultivos de células homogéneas, inmortalizado, MPSs deben modelar con precisión la célula, célula de drogas, fármacos y fármacos órgano interacciones9. A diferencia de los métodos de cultivo primario a corto plazo, normas NIH exigen sostenibilidad MPS durante 4 semanas en cultura8. Pueden encontrar más detalles sobre el programa MPS en los NIH AFR (#RFA-TR-18-001)10.

Hemos desarrollado una novela simple, adaptable, y MPS adiposo barato llamado "tejido adiposo blanco intercalada" (SWAT)11. Vencemos la flotabilidad natural de los adipocitos por "bocadillo" picada el principal tejido adiposo entre las hojas de células del estroma adiposo derivados (ADSCs) (figura 1). La construcción resultante 3D recapitula el contacto célula-célula y el microambiente adiposo nativo rodeando adipocitos maduros con una población de célula de soporte natural del adipocito. SWAT ha sido validado por demostrar viabilidad de 8 semanas, respuesta a la señalización, la secreción de adipoquinas y engraftment en un modelo animal exógena.

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Protocol

Todas las tareas se realizaron en adhesión a protocolos 8759 # y #9189, aprobado por la oficina de LSUHSC-NO. de IRB Animal todo el trabajo se realizó en adhesión a protocolo #3285 aprobado por la oficina de IACUC LSUHSC-NO.

1. siembra de intercalando hojas de células

Nota: Vea la figura 1.

  1. Semilla ADSCs en aproximadamente 80% de confluencia en las placas de cultivo de tejidos (6 cm o placas de 6 pocillos). Para cada pocillo de SWAT deseado, semillas 1 cultivo convencional de tejidos bien y 1 pozo del tamaño correspondiente en la placa de plástico recubierto de poly(N-isopropylacrylamide (pNIPAAm) cultivo de tejidos.
    Nota: En consecuencia, una placa de 6 pozos de SWAT requieren de siembra de células en una placa de cultivo de tejidos estándar 6-pozo (capa base) y una placa de 6 pozos recubiertos de pNIPAAm cultivo de tejidos (capa superior). las placas revestidas de pNIPAAm pueden adquirirse comercialmente o producción en el laboratorio12,13,14.
  2. Mantener ADSCs en 37 ° C y 5% CO2 en de Dulbecco modificado Eagle Medium (DMEM) suplementado con 10% FBS y 1 x penicilina/estreptomicina. Cambiar el medio cada 2 días.
  3. Permitir que las células se aglutinan hasta que se convierten en 100% confluente y tomar en un patrón estriado (aproximadamente 6-8 días).
    Nota: Estas células se necesitan funcionar como una hoja sola célula intacta para estabilizar el tejido adiposo boyante. Las células insuficientemente confluentes se fragmentan en siembra con WAT.

2. preparación de suministros SWAT

  1. Preparar varias alícuotas de 10 mL de 1 x madeja equilibrado sal solución (HBSS); preparar suficiente para el número de las placas con volumen de sobra.
  2. Preparar el aparato de émbolo para la siembra de SWAT. Construir el émbolo utilizando plásticos de acrílico simple, conformados de un vástago conectado a un disco redondo. Asegurar que se ajuste a la circunferencia de los pocillos de cultivo de tejidos (diámetro: < 6 cm para plato de 6 cm, < 3,5 cm de placa de 6 pozos, masa aproximada: 6,7 g para un plato de 6 cm, 5,1 g de una placa de 6 pozos).
    1. Preparar elementos adicionales para asegurar que el procedimiento funcionará sin problemas en caso que hay un problema con cualquier émbolo individual.
    2. Coloque cinta de laboratorio alrededor del borde del disco de émbolo, por lo menos 2 x, para evitar la fuga de solución de gelatina.
    3. Rocíe un gabinete de seguridad biológica (BSC) con 70% EtOH. Aerosol hacia abajo de un estante de tubo cónico de 15 mL dentro del BSC con tubos cónicos de 15 mL de vacío, sin la tapa; tubos ayudará a garantizar la colocación de los émbolos de gelatina.
    4. Rocíe completamente cada émbolo envueltos en cinta con 70% EtOH y el lugar en un tubo cónico de 15mL en el estante. Rociar las arandelas de metal (masa aproximada de 6,3 g) y colocarlos en la bandeja junto con un par de pinzas de gancho; las arandelas de añadir peso a los émbolos durante la siembra de SWAT.
    5. Cierre la hoja BSC y encienda la UV luz para facilitar el secado y la esterilización.
      Nota: Lo ideal es realizar este paso 24 h antes de la siembra de SWAT. Por otra parte, dirigir el proceso en el día de siembra de colección/SWAT de tejido; sin embargo, que en este caso, 15 – 45 min de UV de secado o esterilización.

3. preparación de gelatina émbolos: aplicación a las hojas de la célula superior

  1. Calentar un baño de agua a 75 ° C.
  2. Preparar la solución de gelatina agregando 0,75 g de polvo de la gelatina a stock 10 mL de 1 x HBSS. Bajo una campana de humos, añada 100 μl de 1 M NaOH para equilibrar el pH de la solución.
    1. Agregar a las existencias de 10 mL para el baño de agua y agitar vigorosamente cada 5 min hasta que el polvo se disuelva en la solución. Objetivo es disolver la gelatina en polvo pronto después de agregar en la bañera de agua caliente.
    2. Encienda el ventilador BSC, apagar la luz UV y levante la hoja. La superficie de BSC y preparar el filtro de insumos (jeringas de luer-lock de 5 mL y filtros de jeringa de 0,2 μm). Preparar varios filtros para filtrar eficientemente volúmenes suficientes de gelatina para aplicar a los émbolos.
  3. Cuando la solución de gelatina alcanza una consistencia homogénea, filtrar la solución y aplicarla a los émbolos. Cargar la jeringa con gelatina. Aplicar la gelatina a los émbolos de plástico a través del filtro de la jeringuilla (~2.5 mL para una placa de 6 pozos, ~4.5 mL para un plato de 6 cm) y dejar para solidificar (~ 20 min).
  4. Una vez que la gelatina es sólida, desenrolle la cinta desde el borde de los émbolos. Con pinzas de gancho, quite la gelatina del borde exterior del émbolo (es decir, los bordes levantados del menisco). Asegurar que la gelatina restante en el centro del émbolo esté totalmente nivelada para maximizar el contacto con la hoja de la ADSC.
  5. Una vez que se quita exceso gelatina, aplique suavemente los émbolos de gelatina a las placas de la ADSC pNIPAAm-revestida. Utilice las arandelas de metal para pesar abajo el émbolo. No corte hojas de célula mientras aplica los émbolos.
  6. Deja los émbolos en las hojas de la célula durante 1,5 h a temperatura ambiente. Incubar las placas/émbolos en un baño de agua helada durante 1,5 h a la completa disociación de la capa celular de la superficie de la placa revestida de pNIPAAm.
    1. Tenga cuidado al mismo tiempo de incubación en el baño de hielo; No permita que el baño de hielo contaminar los medios de comunicación de la célula durante la incubación.
    2. Después de completar la incubación, limpiar la parte inferior de las placas pNIPAAm-revestida para eliminar el agua no estéril.

4. blanca procesamiento de tejido adiposo

  1. Al recoger el tejido adiposo humano de la sala de operaciones, mantener las muestras en un recipiente estéril que es sobre hielo hasta que SWAT es a ser sembradas. Agregar medios de mantenimiento estéril, como solución salina tamponada con fosfato (PBS), al contenedor de tejido adiposo para la estabilidad del tejido.
  2. Agregar celda fría medio de cultivo a tubos de microcentrífuga de 1,5 mL para cada pozo/plato ser sembradas (100 μL para una placa de 6 pozos, 200 μL para un plato de 6 cm).
  3. Pique el tejido adiposo.
    1. Para los segmentos sólidos del tejido adiposo, haga lo siguiente.
      1. Lavar grandes segmentos de tejido adiposo 3 x en PBS estéril y quitar tanta PBS como sea posible.
      2. Groseramente picada tejido con pinzas y maquinilla de afeitar estéril y eliminar tanto vasculatura y fascia como sea posible (véase la discusión para más detalles).
      3. Finamente picada grasa con navaja hasta picada tejido toma consistencia espesa, líquida.
        Nota: Idealmente tejido aparece homogéneo con no visibles segmentos individuales de WAT aunque esto no siempre es posible.
    2. Proceso de lipoaspiración como sigue.
      1. En el BSC, cinta de gasa estéril sobre la parte superior de un vaso de precipitados y colocar este vaso en un vaso más grande para recoger el exceso de líquido.
      2. Con una pipeta serológica de 25 mL, dibujar tanto lipoaspiración según sea necesario y aplicarlo a la superficie de la gasa estéril. Aplicar el PBS directamente sobre esta superficie a lavar lipoaspirated grasa y para eliminar el exceso de sangre y residuos de lípidos.
      3. Utilice pinzas para recuperar tejido drenado, transferir a una superficie estéril de picar y picar la lipoaspiración.
  4. Utilizar una maquinilla de afeitar estéril para cortar el extremo distal de pipetas p1000 para transferir tejido picadito; Esto minimizará el esfuerzo cortante que puede llevar a la lisis del adipocito. Una vez que se alcanza una consistencia adecuada del tejido transferir el volumen de tejido picadito a cada tubo 1,5 mL (300-400 μL para placa de 6 pozos, 500 – 600 μL para plato de 6 cm). Mezcla había picada de WAT y los medios brevemente en los tubos.
  5. Toma de las placas base de la ADSC y aspirado decantar los medios de comunicación. Sustituir los medios de comunicación con la mezcla WAT/medios de cada tubo de 1,5 mL.
    1. Suavemente Retire los émbolos de la gelatina de las placas recubiertas de pNIPAAm y aplicarlos a la mezcla WAT en las placas base de la ADSC. Examinar la monocapa de las placas recubiertas de pNIPAAm bajo un microscopio para confirmar la separación celular.
  6. Establecer un bloque de calor a aproximadamente 37 – 40 ° C en el BSC. Con los émbolos en su lugar, hacia las placas de las superficie del bloque de calor. Añadir 2 – 3 mL de medios de cultivo calentados para incubar las células y facilitar la fusión de la gelatina.
  7. Después de 30 min, retire suavemente los émbolos de la superficie de la placa. Vuelva a colocar las tapas de las placas base de cultivo de tejidos y pasar a una incubadora de cultivo celular. Una vez la gelatina ha licuado completamente a 37 ° C, Aspire y reemplazar medios de cultivo celular.
  8. Mantener SWAT a 37 ° C y 5% CO2 en medio M199 sin rojo de fenol 7 insulina μm, dexametasona μm 30, 1 x penicilina/estreptomicina. Mantener en medios de aproximadamente 2 mL para placas de 6 pocillos y 3 mL en los platos de 6 cm. Cambiar el medio cada 2 días.

5. cosecha de SWAT

  1. Preparar la colagenasa (colagenasa de 0.5 mg/mL, la adenosina 500 nM, en PBS) alícuotas en tubos cónicos de 15 mL (volumen aproximado de 10 mL). Congelar los tubos y almacenar a-20 ° C.
  2. Aspirar cualquier medio de cultivo de células, lavar 1 x con PBS y luego aspirar PBS. Preparación de las alícuotas de colagenasa por descongelación en un baño de agua de 37 ° C.
    Nota: Idealmente, la solución de colagenasa llegará a 37 ° C; inmediatamente después, añadir el tejido.
  3. Añadir todo el tejido de la placa SWAT a las alícuotas individuales. Cosecha SWAT con un scrapper de célula estéril y transferirlo a las alícuotas de colagenasa con una punta de pipeta corte p1000. Agregue el tejido directamente en los tubos cónicos de 15 mL que contiene solución de colagenasa.
    1. Por otra parte, incubar la mezcla de tejido/colagenasa en un tubo cónico de 50 mL; la mayor área de superficie más facilitará la digestión enzimática.
  4. Colocar tubos de muestra en un agitador orbital incubado en un ángulo de 45°. Incubar a 200 rpm, a 37 ° C durante 30 – 60 min.
  5. Filtro de malla de 250 μm de lugar en un nuevo tubo cónico de 15 mL para recolección. Vierta la solución digerida adipocito a través del filtro.
    Nota: Esto permitirá que todas las células pasar a través de filtrado de tejido fibroso.
  6. Permiten paso a reposar 5 min a temperatura ambiente para permitir la separación de fases.
    Nota: Los adipocitos flotará en la parte superior de la solución mientras que las células del estroma adiposas (ASCs) resolverá en las fases inferiores. Centrifugación durante 5 min a 500 x g también puede maximizar la separación de células o cosecha alrededor de ADSCs en el sedimento.
  7. Usando una punta de pipeta corte p1000, transferir los adipocitos (la capa flotante en la parte superior de la solución de colagenasa) a un tubo de colección de microcentrífuga de 1,5 mL. Tomando 250 μl a la vez, pipeta lentamente a lo largo del borde del tubo para recoger los adipocitos.
    1. Girar el tubo lentamente mientras recogía los adipocitos para maximizar la recuperación de las células adheridas en el interior. Guardar dibujo más células hasta el tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
  8. Retire el exceso de líquido de los adipocitos aislados mediante una jeringa conectada a una aguja (~ 21). Sumergir la aguja debajo de la capa flotante del adipocito. Talle la aguja para desalojar las células adheridas al eje de la aguja y esperar que los adipocitos desalojados flotar en la parte superior.
  9. Sacar lentamente el exceso de líquido, teniendo cuidado de evitar la eliminación accidental de los adipocitos. Use graduaciones del tubo de microcentrífuga para aislar sistemáticamente volúmenes de muestra (por ejemplo,. 0,1 mL para cada muestra).
  10. Uso de las células aisladas para extracción de ADN/ARN, ensayo de absorción de glucosa, prueba de lipolisis, etc.

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Representative Results

Inicialmente se evaluó la viabilidad de SWAT por brightfield serial proyección de imagen de los racimos individuales de WAT (n = 12) durante aproximadamente 7,6 semanas. Grupos seguía siendo seguros en lugar de la monocapa en todo este tiempo. Se observaron ligeros cambios morfológicos con adipocitos individuales combarse ligeramente o cambiar posiciones. Sin embargo, adipocitos ni ser multiloculares con el tiempo, lo que indica una falta de diferenciación, ni presentan signos visibles de la muerte celular como blebbing celular, lisis o fragmentación (figura 2). Identidad del adipocito de clusters fue confirmada en dos semanas de edad SWAT con la mancha del lípido del Nilo rojo (NR). NR clara tinción de cúmulos de adipocitos uniloculares indicó que en efecto se trataba de adipocitos con membranas intactas, en lugar de artefacto, quistes o adipocitos muertos. La ausencia de NR la coloración en las hojas circundantes de la ADSC indica que estas células no están acumulando lípidos y por lo tanto, no diferenciando hacia un linaje adipogenic ellos mismos (figura 3a). Yoduro de propidio coloración fue realizada en 53 días de edad SWAT. Exclusión de la mancha en cúmulos de adipocitos en horarios avanzados demuestra una falta de la muerte celular (figura 3b). Mancha de petróleo-rojo-O (ORO) se realizó en 51 días de edad SWAT con el lípido mancha localizar dentro de los clusters de adipocito fijo, indicando que SWAT adipocitos mantengan viabilidad con adipocitos intactas incluso en los puntos de tiempo avanzados (Figura 3C).

Inmunocitoquímica (ICC) fue realizado para demostrar la expresión de la proteína esperada y localización de marcadores del adipocito maduro en SWAT. Placas SWAT intactas fueron teñidas con anticuerpos contra perilipin (ab3526, dilución 1: 200), PPARγ2 (dilución 1: 100 sc-166731) y FABP4 (ab92501, 1:1,000 dilución). Imágenes confocales de 12 días de edad SWAT demostraron localización prevista de perilipin alrededor de superficie de la gota de lípidos (figura 4a). Microscopia de la fluorescencia de 3 días de edad SWAT con la mancha de contador de lípidos BODIPY demostró FABP4 localización dentro del citoplasma (Figura 4b), y superposición de la señal de PPARG y DAPI coloración demostró localización de PPARG en el núcleo ( Figura 4 c).

Perfil transcripcional SWAT se evaluó en tejido sembrado de múltiples sujetos (n = 4 donantes). Sobre la colección, una porción de tejido adiposo fue utilizada para una base de extracción de RNA (d0), mientras que el resto fue utilizado para placas SWAT de semilla. Estas placas se cosecharon luego a las 24 h, 14 días y 28 días en cultura SWAT. Un paso cuantitativo transcripción reversa reacción en cadena polimerasa (RT-qPCR) fue realizada para determinar los niveles de transcripción. Se analizaron seis genes clave adipocito: PPARG FABP4, LPL, CEBPA, HSL y ADIPOQ (figura 5). ACTB fue utilizado como un control interno y los niveles transcripcionales se expresaron como un porcentaje de expresión del mismo tema base (d0). Todos los genes demostraron sólida transcripción en SWAT, aunque niveles tendencia hacia abajo con el tiempo. Creemos que observó perfiles transcripcionales podrían mejorarse con mayor optimización de los medios de comunicación que elaboramos en la sección de discusión.

Función endocrina basal se evaluó en una misma cultura utilizada para el perfil transcripcional. Sobrenadante se recogió de las placas de SWAT y los niveles de leptina se midieron utilizando análisis enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA) (ab100581). SWAT aparece la secreción de leptina basal en los días 1, 14 y 28 (Figura 6a). Hojas ADSC mantuvieron en paralelo con las placas de SWAT como control (es decir, hojas ADSC sin WAT hojaldrada). No se pudo detectar la leptina secretada en estos controles (datos no mostrados).

Para determinar si SWAT podría mantener la capacidad de una respuesta inducible con el tiempo, se examinó la lipolisis (n = 4). Para evaluar la capacidad lipolítica inducible, una porción de WAT recién recogida (d0) fue picada y adipocitos aislaron enzimáticamente (similar a la cosecha SWAT en Protocolo sección 5), mientras que el resto fue utilizado para placas SWAT de la semilla. Adipocitos aislados fueron incubadas durante 3 h a 37 ° C en 300 μL de 2% libre de ácidos grasos de seroalbúmina bovina en HBSS con 100 μm forskoline, epinefrina de 1 μm o almacenador intermediario de control. Niveles de glicerol en los medios de comunicación recogidos se midió con el reactivo de glicerol libre. SWAT se cosechó entonces a los días 1 y 5 y lipolítica capacidad fueron evaluados de la misma manera. Estimulación química aumenta liberación de manera significativa en los tres puntos de tiempo glicerol (figura 6b): liberación de glicerol de los adipositos tratados se incrementó en d0 WAT por 82 ± 46% (p = 0,01), 1 día SWAT en 577 ± 387% (p = 0,02) y SWAT de cinco días por 348 ± 343% (p = 0.03). significa niveles de glicerol en los adipocitos estimuladas fueron muy similares en los tres puntos de tiempo: primaria WAT 5.2 ± 0.8, 1 día SWAT 4.4 ± 1.9 y 5 días SWAT 4,8 ± 1,8 μg glicerol/mg proteína total. Niveles de glicerol media en control (es decir, la lipolisis basal) fueron relativamente altos en WAT recién recogida (d0) en comparación con las células cosechadas a SWAT. Esto puede ser debido a la creciente tensión al tejido WAT en d0 durante la supresión quirúrgica, transporte al laboratorio y picar. Sin embargo, estos experimentos demuestran ninguna disminución en capacidad lipolítica de SWAT a 1 o 5 días en comparación con el WAT recién recogido.

SWAT fue demostrada para ser capaz de trasplante y recuperación en un modelo murino (n = 4) como una manifestación de la función del complejo, todo el tejido. Es también que una posible aplicación de la plataforma debe investigador deseo utilizar SWAT para manipular WAT en vitro antes de transplantar tejido en un modelo animal. SWAT fue cultivado durante 10 días y cosechados utilizando el protocolo estándar; adipocitos aislados de SWAT las placas entonces fueron cargados en una jeringa de 1 mL (sin aguja). Se hace una incisión debajo de la piel en el lado dorsal de un immunocompromised ratones expresaban eGFP (cabeceo. CG-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl Tg(CAG-EGFP)1Osb/SzJ). Esto crea un bolsillo subcutáneo dorsal pequeña en el cual los adipocitos cultivados SWAT fueron inyectados con la jeringa y el bolsillo entonces fue suturado cerrado. Después del trasplante después de 10 días, los ratones fueron sacrificados. Los trasplantes eran claramente visibles y fácilmente recuperaron (Figura 7a). El trasplante recuperado y un depósito de grasa contralateral de ratón fueron fijados, parafina incrustado y seccionadas. Immunohistochemistry fue realizado en las diapositivas seccionadas con anticuerpos primarios contra GFP (A10262, dilución 1: 100) y el humano PLIN (sc-390169, dilución 1: 100). El anticuerpo anti-PLIN seleccionado fue validado experimentalmente para la mancha humana PLIN pero no mouse. Adipocitos de trasplante recuperado fueron aproximadamente 50-120 μm de tamaño, que es el rango esperado por adipocitos humanos, y eran totalmente negativos para la GFP (figura 7b). Sin embargo, aproximadamente el 31% de los adipocitos eran positivo para humano PLIN, indicando engraftment acertado en el host. Los adipocitos en los depósitos de grasa de ratón fueron tamaño 20-40 μm, que es consistente con los adipocitos de ratón, mientras que la coloración totalmente positivo para GFP y totalmente negativo para PLIN humana (figura 7 c). ADSC hojas (no WAT hojaldrada) raspadas de los platos de cultivo celular y trasplantadas en ratones como control. Sin embargo, estos no dió ningún tejido recuperable (datos no mostrados). Esto indica que los adipocitos recuperados eran de la SWAT cultivada y no el resultado de ADSCs humanos diferenciados.

Figure 1
Figura 1: método de la SWAT. (a) esquema de SWAT mostrando a la transferencia de una hoja de ASCs eGFP marcado de un plato de cultivo de tejidos recubiertos de pNIPAAm en una hoja de segunda, sin etiqueta de ASCs cultivado en una placa de cultivo de tejido estándar. Picada, primaria WAT humana se encuentra entre las 2 hojas de ASC. (b) fluorescencia microscopía demostrando Brightfield, GFP y canales combinados de un SWAT creado por la técnica descrita en (a). Barra de escala = 100 μm. (c) Fotografía Digital de un representante, 5 SWAT día cultivado en una placa de 6 pozos estándar. El gran volumen de WAT estable está asegurado en el fondo del pozo. Se modifica la figura de Lau et al. 11 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: SWAT sigue siendo viable en 8 semanas en cultura. Brightfield serial proyección de imagen de un único clúster SWAT durante 55 días muestra sin cambios morfológicos compatibles con muerte celular. Barras de escala = 100 μm. figura es modificado de Lau et al. 11 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: SWAT sigue siendo viable en más de 50 días. (a) del Nilo rojo coloración muestra tinción restricción a SWAT cultivada durante 15 días, indicando energizados adipocitos viables. No mancha que rodea las células del estroma. Figura son a 40 aumentos, Y barra de escala = 100 μm. (b) propidio yoduro (PI) tinción de SWAT cultivada para 53 días revela exclusión de PI, indicando que no hay muerte del adipocito; Barra de escala = 100 μm. (c) aceite-rojo-O de un 51 día SWAT muestra restricción de lípidos neutros a los adipocitos, que indica estabilidad a largo plazo de las membranas celulares de adipocitos. Se modifica la figura de Lau et al. 11 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: inmunocitoquímica demuestra que SWAT tiñe positivamente para marcadores de la célula del adipocito maduro con la localización esperada. (un) Confocal microscopio de 2 semanas de edad SWAT reveló PLIN + uniloculares células humanas con localización de la superficie de la gotita del lípido. Barra de escala = 100 μm. (b) la microscopia fluorescente de 3 días de edad SWAT reveló FABP4 + las células humanas con localización en el citoplasma (c) PPARy + células y con localización de a núcleo de la célula. Barra de escala = 100 μm. figura es modificado de Lau et al. 11 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: SWAT mantiene la expresión de genes de identidad de adipocito clave. Grupos SWAT fueron colagenasa que digiere después de 1, 14 y 28 días de cultura y expresión genética determinaron por RT-qPCR. RT-qPCR demuestra que 1 día de edad y 14 días de edad SWAT preservar altos niveles de (un) PPARG, (b) FABP, (c) HSL, (d) CbEBPA, (e) LPL yfADIPOQ. ACTB fue utilizado como gen de referencia. Barras de error = error estándar. Se modifica la figura de Lau et al.. 11. por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: SWAT basally segrega adipokines y responde fisiológicamente a la estimulación de catecolaminas. (a) ELISA cuantificación de la secreción de leptina basal 24 h no muestra ningún cambio significativo después de 28 días en la cultura. (b) estimulación adrenérgica con epinefrina y forskoline genera una respuesta significativa de la glucolisis en WAT primaria recién cosechado (1.7 x) y tema-SWAT a 1 y 5 días en cultivo. Día 1 SWAT respondió al estímulo de la catecolaminas con el 6.3-fold aumento sobre glucólisis basal mientras que el día 5 SWAT demostró un aumento de 3.3-fold sobre glucólisis basal. Estimula la glicolisis no fue significativamente diferente en SWAT frente a WAT fresco combinado (p = 0,53, n = 4). Barras de error = error estándar. Figura es modificado de Lau et al. 11. por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: SWAT puede ser reimplantados en vivo, demostrando que conserva la función del tejido entero. (un) SWAT fue fácilmente visualizados 10 días después del trasplante en un ratón immunocompromised (asterisco). SWAT no había implantado, por 10 días el SWAT necrótico habría sido licuado. (b) secciones de SWAT recuperado demostraron adipocitos grandes, uniloculares (diámetros 50 y 120 μm) que eran eGFP-. 31.3% de los adipocitos eran humanos PLIN +. Los humanos PLIN + adipocitos tienden a ser más pequeño, que encajaría con las observaciones clínicas de injertos de grasa en los seres humanos donde adipocitos más pequeños tienen más probabilidades de sobrevivir a la transferencia. Barra de escala = 100 μm, 200 aumentos. (c) grasa Contralateral de los ratones de la misma demostró adipocitos mucho menores (20-40 μm) y eran humanos PLIN-. Barra de escala = 100 μm, 200 aumentos. Se modifica la figura de Lau et al. 11. por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Este protocolo detalla el uso de ADSCs humano tejido adiposo blanco sandwich; líneas de celulares ADSC humanas pueden ser aisladas mediante protocolos bien establecidos15. Sin embargo, el sistema puede ser adaptado para los requisitos de la investigación individualizada (como el uso de las células 3T3L-1 ratón emparedado WAT). Este proceso implica el manejo primario del tejido humano. Deben emplearse precauciones de seguridad estándar; manejar los tejidos humanos como BSL-2 patógenos (p. ej., VIH, VHC). Sólo mango tejido directamente debajo de un BSC. Use PPE todas las dictadas por las normas de seguridad institucional, guantes dobles son muy recomendables. Desinfectar correctamente todos los suministros y residuos 10% lejía solución o solución de etanol al 70% antes de reutilización o eliminación.

El primer paso crítico en la cultura SWAT es procurar y mantener las placas de cultivo de tejidos recubiertos de pNIPAAm. Estas placas están disponibles comercialmente o pueden ser producidos a través de métodos establecidos12,13,14. Estas placas son las superficies de cultivo sensibles a la temperatura de la célula. Por encima de la temperatura crítica (~ 32 ° C), la superficie es hidrofóbica y las células se adhieran, similar a otros tratados plásticos para cultivo de tejidos. Sin embargo, por debajo de esta temperatura crítica, la superficie se vuelve hidrófila y serán disociar las células de la superficie plástica16. As a result, se debe establecer: 1) cómo rápidamente un tipo celular determinado se disocia de la monocapa antes de llegar a confluencia completo (es decir, durante los cambios de la media normal) y 2) el tiempo necesario para bajar la temperatura con la gelatina émbolo aplicada a la placa revestida de pNIPPAm, para asegurar que la hoja de toda la célula se disocia. Cambios de los medios de comunicación se deben realizar con medios calentados a 37 ° C; Si las células son propensas a la rápida disociación, realizar cambios de los medios de comunicación en un bloque térmico a 37 ° C en el BSC.

El segundo paso crítico es procesar el tejido adiposo para preparar para la siembra de SWAT. Se realizó la caracterización por picar WAT con pinzas esterilizadas y maquinillas de afeitar esterilizadas. Sin embargo, faja humana no se puede cortar fácilmente con una navaja de afeitar. Es importante conservar tanto tejido adiposo dentro de SWAT como sea posible durante un período a largo plazo maximizando el ratio del adipocito a la fascia. Pedazos grandes de fascia intacta evitará contacto célula-célula entre ADSCs y adipocitos, que es esencial para mantener Unidas SWAT. Una cantidad excesiva de la fascia también puede tener un efecto "tirando de un hilo". Mientras que un único clúster WAT puede disociar de una placa sin afectar a los grupos vecinos, varios clústeres conectados por fascia pueden tirar bastante los racimos de una monocapa a inutilizar bien un SWAT. La liposucción, que consiste en el picado mecanizada de WAT, puede eludir esta cuestión como fascia quede picada finamente durante la cirugía. Sin embargo, durante la liposucción, rutinariamente tratan a pacientes con altas dosis de epinefrina; las posibles consecuencias de este tratamiento sobre el tejido (y experimentos posteriores) deben ser representaron durante un estudio.

El último paso crítico en la cultura SWAT es la selección de un medio de cultivo experimental. Realizamos nuestros experimentos de caracterización inicial utilizando una formulación de la cultura de célula estándar (10% FBS, 1 x penicilina/estreptomicina en DMEM). Sin embargo, basado en la literatura disponible en cuanto a maximizar la transcripción del adipocito, se utilizó una formulación especializada (7 insulina μm, dexametasona μm 30, 1 x penicilina/estreptomicina en medio M199)17. Esta formulación mejora los primeros niveles de la transcripción, pero los niveles disminuidos con el tiempo. Creemos que esto es porque en el cuerpo, los adipocitos están expuestos a una amplia variedad de señales químicas, a menudo ciclismo entre alimentados y hambrienta en el transcurso de un día. Por lo tanto, debería ser posible mejorar el perfil transcripcional observado en el tiempo más optimizando los suplementos a nuestros medios de cultivo celular.

Cosecha SWAT (Protocolo, artículo 5) aísla los adipocitos de la cultura, reduce el volumen de muestra y elimina la interferencia de las hojas alrededor de la ADSC. Esto puede preceder la homogeneización del adipocito (que es necesario para el aislamiento de la proteína o ácido nucleico), o ensayos funcionales de intacto adipocitos (como ensayos de absorción de glicolisis o glucosa). Por otra parte, la placa intacta de SWAT se puede cosechar para la coloración immunocytochemical, que permite que las hojas de la ADSC garantizar a los grupos WAT a la monocapa en todo el proceso de tinción. En este caso, los medios de cultivo de aspirar y fijar toda la cultura a través de protocolos estándar. Sin embargo, es aconsejable colocar un cubreobjetos de vidrio antes de la proyección de imagen para aplanar los racimos de adipocito 3D y mejorar la calidad de la imagen resultante.

Creemos que SWAT tiene gran potencial como una plataforma de detección de drogas. La técnica es simple, reproducible y utiliza las placas de cultivo de tejido convencional. Por lo tanto, los experimentos de detección de drogas son ejecutables mediante la adición de un compuesto farmacológicamente activo al medio de cultivo. Adipocitos se pueden cosechar después para examinar el efecto del compuesto sobre la expresión génica, perfil epigenético, sensibilidad a la insulina, etc. que además de las toxinas medioambientales a medio de cultivo se pueden utilizar semejantemente para examinar sus efectos en los adipocitos. Porque SWAT permite al investigador seguir cúmulos de adipocitos individuales con el tiempo, está especialmente preparado para evaluar un tratamiento que hace un cambio visible fenotípico a adipocitos. Un ejemplo prominente es adipocito humano "dorado", en donde un adipocito blanco, almacenamiento de lípidos se convierte en "dorada" o similar a un termogénico, multilocular adipocito marrón18. Se trata de un fenómeno potencialmente mayor relevancia clínica que se ha demostrado en modelos de ratón, pero nunca en un ser humano. Variaciones Co cultivadas en SWAT tienen tremenda investigación potencial. SWAT es un sistema de cocultivo natural que utiliza pozos de cultura de célula estándar. Por lo tanto, uno puede mantener los adipocitos entre otros tipos de células clínicamente relevantes cambiando las células colocando o utilizando inserciones de membrana de cultivo de tejidos. Por ejemplo, los hepatocitos podrían funcionar como la hoja superior de la celda colocando a un fármaco que se filtra a través del hígado antes de alcanzar el tejido adiposo de la pantalla. Además, las células cancerosas podrían cultivarse en una inserción de membrana sobre SWAT para examinar cómo adipocitos contribuyen a la patología del cáncer.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Los autores desean reconocer el apoyo institucional de LSU Health Sciences Center, que financió el proyecto.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x HBSS Thermofisher 14185052
Gelatin Sigma-aldrich G9391
Collagenase Sigma-aldrich C5138
Adenosine Sigma-aldrich A9251
DMEM Thermofisher 11995065
M199 Media Thermofisher 11043023 Phenol red-free 
250 µm Mesh Filter Pierce 87791
0.2 µm Syringe Filter Celltreat 229747
5 mL Luer-Lok syringes  BD 309646
Metal Washers These are simple metal washers and can be bought at any hardware store. They simply add leight weight to the backs of the plugers to ensure even contact between cells and gelatin, while being easy to stock and sterilize. Approximate mass: 6.3 g 
Name Company Catalog Number Comments
Heated Equipment
Incubated Orbital Shaker VWR 10020-988 Samples should be pitched at 45° angle to facilitate collagenase digestion
Heat Block Set to 37-40 °C and placed under Biosafety Cabinet
Water Bath Set to ~75 °C
Name Company Catalog Number Comments
Specialized Plastics
Upcell Dishes 6cm of 6-multiwell Nunc 174902  or 174901 These are commerically available pNIPAAm-coated dishes which can be used to grow the upper sheet of ADSCs. Alternatively, pNIPAAm-coated plates can be produced in-lab. diameter: <6 cm for 6 cm dish, <3.5 cm for 6-well plate; approximate mass: 6.7g for 6 cm dish, 5.1 g for 6-well plate
Plastic Plunger Apparatus These can be fashioned to fit within desired pNIPAAm-coated plastics (multiwell plates, petri dishes). They are comprised of a simple stem attached to a circular disk. They can be produced in-lab or by any facility that can fashion acrylic plastics

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References

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Comportamiento número 138 tejido adiposo adipocitos obesidad microphysiological sistemas órganos en chips de detección de drogas desarrollo de medicamentos toxicidad ambiental cultivo primario diabetes metabolismo
Una plataforma de Microphysiologic de grasa humana: intercala tejido adiposo blanco
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Scahill, S. D., Hunt, M., Rogers, C. … More

Scahill, S. D., Hunt, M., Rogers, C. L., Lau, F. H. A Microphysiologic Platform for Human Fat: Sandwiched White Adipose Tissue. J. Vis. Exp. (138), e57909, doi:10.3791/57909 (2018).

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