Summary
Vi rapporterar metoder för karakterisering av MLKL-medierad plasmamembranet bristning i necroptosis inklusive konventionella och confocal live-cell mikroskopi imaging, scanning electron microscopy, och NMR-baserade lipid bindande.
Abstract
Necroptosis är en programmerad cell death väg utlöses av aktivering av receptorn interagerar proteinkinas 3 (RIPK3), som phosphorylates och aktiverar blandade härstamning kreatinkinas-liknande domän pseudokinase, MLKL, att brista eller permeabilize plasmamembranet . Necroptosis är en inflammatorisk väg som är associerad med flera patologier inklusive autoimmunitet, infektions- och kardiovaskulära sjukdomar, stroke, neurodegeneration och cancer. Här beskriver vi protokoll som kan användas för att karaktärisera MLKL som bödeln av plasmamembranet bristning i necroptosis. Vi visualiserar processen för necroptosis i cellerna med hjälp av live-cell imaging med konventionella och confocal fluorescensmikroskopi, och i fasta celler med hjälp av elektronmikroskopi, som tillsammans avslöjat en omfördelning av MLKL från cytosolen till plasma membran före induktion av stora hål i plasmamembranet. Vi presenterar i vitro kärnmagnetisk resonans (NMR) analys med lipider för att identifiera förmodad modulatorer av MLKL-medierad necroptosis. Baserat på denna metod, identifierat vi kvantitativa lipid-bindande preferenser och fosfatidyl-inositol fosfater (kärnor) som kritiska bindemedel av MLKL som krävs för plasmamembranet inriktning och permeabilisering i necroptosis.
Introduction
Identifiera genetiska komponenter av necroptosis har underlättat användningen av djurmodeller att testa implikationen av necroptosis i fysiologi och sjukdom1,2,3,4,5. Knockout av RIPK3 eller MLKL i möss hade minimal implikation i utveckling och vuxen homeostas vilket tyder på att necroptosis inte är nödvändiga för liv3,6. Dessutom innehåller vissa arter inte antingen RIPK3 eller MLKL gener, stödja necroptosis icke väsentliga roll i djur7,8. Däremot, har utmanande knockout djurmodeller med olika sjukdomar studeras i laboratorium visat en viktig roll för necroptosis i inflammation, medfödd immunitet och virusinfektion9,10, 11 , 12.
Necroptosis kan aktiveras på flera sätt genom signalering genom olika medfödd immunitet sensorer, alla som leder till aktivering av RIPK31,13,14. Aktiva RIPK3 i sin tur phosphorylates och aktiverar MLKL3,4,5,6,7,8,9,10 ,11,12,13,14,15,16,17,18. Det studerade, och kanske det mest komplexa sätt, vilket leder till aktivering av RIPK3 innebär döden receptor ligering, som bifurcates baserat på nedströms sammansättningen av signalering komplexen antingen inducera apoptos eller necroptosis1. Necroptosis inträder när signalering via RIPK1 gynnas och resulterar i engagemang RIPK319,20. Detta resultat är enkelt gynnade vid farmakologisk hämning eller genetiska radering av kaspas 8, en förmodad endogen hämmare av necroptosis som håller necroptosis borta. RIPK1 binder till och aktiverar RIPK3. Ett annat sätt att aktivera necroptosis är genom Toll-liknande receptorer TLR3/TLR4 signalering, som engagerar och aktiverar RIPK3 genom TIR-domän-innehållande adapter-inducerande interferon-β (TRIF)21. Ännu är ett sätt att dö av necroptosis av aktivering av DNA sensorn DAI, som direkt engagerar och aktiverar RIPK322.
MLKL är ett cytosoliskt protein som består av en N-terminal helix bundle (NB)-domän och en C-terminal pseudokinase domän (psKD) Förenade genom ett föreskrivande stag region3. I normala celler finns MLKL i cytosolen där det är tänkt att vara i ett inaktivt komplex med RIPK314. Aktivering av necroptosis utlöser RIPK3 fosforylering av MLKL i den aktiveringen öglan av psKD och eventuellt ytterligare platser i NB och stag3,15,23. Fosforylering inducerar en conformationaländring i MLKL som resulterar i dissociation från RIPK314. Dåligt förstådd konfirmerande förändringar släpp stag från psKD24. Stag, som innehåller 2 spiraler, förmedlar oligomerisering av MLKL till en förmodad trimer genom C-terminal helix25. Den N-terminala spiralen av stag hämmar domänen NB, vilket är viktigt för membran permeabilisering24,26. Isolerat är NB domän tillräcklig för att framkalla plasmamembranet vilket och necroptosis16,24,27. Pro-necroptotic aktiviteten av NB ombildades i mus embryonala fibroblaster bristfällig i MLKL (mlkl- / - MEFs). NB är en lipid bindande domän som företrädesvis engagerar de fosfolipid fosfatidylinositol 4,5 diphosphate (PIP2). Vi föreslår en stegvis mekanism för aktivering av MLKL, vari stag oligomerisering underlättar rekrytering av MLKL till plasmamembranet via svaga interaktioner för NB på PIP2 polar huvud grupp24. På membranet genomgår NB reglerade exponering av en extra hög affinitet bindningsstället för PIP2som maskeras av stag i inaktiva MLKL. Sammantaget destabilisera de flera interaktionerna för NB med PIP2 plasmamembranet leder till dess bristning, även om den molekylära mekanismen av dessa händelser inte har klargjorts.
Här illustrera vi specifika metoder som används för att karakterisera MLKL funktion som bödel i necroptosis24. I synnerhet fokusera vi på den mest minimala domänen MLKL, NB och stag (NBB), som regleras av stag hämning och kan aktiveras genom påtvingade dimerization att framkalla plasmamembranet bristning och necroptosis. Vi beskriver våra inducerbara uttryck systemet kombinerat med påtvingade läkemedelsinducerad FKBP-medierad dimerization för live-cell imaging och elektronmikroskopi av celler som genomgår necroptosis. Dessutom kan illustrera vi vår in vitro- NMR-analys av samspelet mellan NBB med phosphatidylinositols (kärnor).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. kloning och Cell linje Generation
- PCR förstärka regionen NBB, motsvarande aminosyra rester 1-140 (NBB140), från mänskliga MLKL cDNA för i ram standard restriktionsenzym-baserade kloning med oligomerisering domän 2 x FK506 bindande protein (2xFKBP eller 2xFV) och Venus lysrör protein i doxycyklin (Dox) - inducerbara retrovirala vektor pRetroX-TRE3G att skaffa NBB140- 2xFV-Venus (tabell 1, figurerna 1A-B).
- Föreviga primära mlkl- /- eller ripk3- / - mlkl- / - mus embryonala fibroblaster (MEFs) erhålls från respektive möss tillgängliga i gröna laboratoriet genom övergående transfection med SV40-stora antigen att uttrycka plasmid. Markera förevigade celler i ~ 1 – 2 veckor, och underhålla i DMEM kompletteras med 10% fetalt bovint serum (FBS), 2 mM L-glutamin, 100 U/mL penicillin och streptomycin, 1 mM natrium pyruvat och onödiga aminosyror vid 37 ° C och 5% CO2 i standard vävnad kultur inkubatorer.
- Transduce SV40-förevigade mlkl- / - MEFs med den omvända tetracyklin kontrollerad transactivator (rtTA)-innehållande retrovirus uttryckt från en plasmid innehållande blasticidin motstånd-genen (vår modifierade plasmid) och behandla för 1 vecka med 5 μg/mL blasticidin välja för celler som stabilt uttrycker rtTA28.
- Transduce de rtTA-uttryckande MEFs med Dox-inducerbara retrovirala vektorn som innehåller den chimära MLKL (pRetroX-NBB140-2xFV-Venus-puro) och välj med 4 μg/mL puromycin för en vecka, 2 dagar efter transduktion.
2. live-Cell mikroskopi avbildning av MLKL-medierad Necroptosis
- Tallrik mlkl- / - MEFs uttrycker NBB140-2xFV-Venus vid en densitet av 50 000 celler per väl (1 mL per brunn) i 24 bra plattor, och inkubera över natten (figur 2A). Använda live-cell färgning för automatiserad cell inventering (se Tabell för material).
- Behandla celler för 12 h med Dox (0,5 μg/mL) att inducera uttrycket av NBB140-2xFV-Venus.
- Framkalla necroptosis med 25 nM FKBP dimerizer (Dim) förutom 25 nM membran-impermeable grön fluorescerande färgämne (se Tabell för material) i standard DMEM (se 1.2). Celler som genomgår necroptosis ackumuleras färgämnet som deras plasmamembranet integritet äventyras av NBB140-medierad bristning. Utföra analyser i tre exemplar eller fyra exemplar.
- För att övervaka necroptosis med enkel - eller tvåfärgad bildgivande system (se Tabell för material), placera kärlen i respektive bildenheten inrymt i ett däggdjur vävnadsodling inkubator.
- Öppna programvaran (se Tabell av material) och välj fliken schema kommande File under listan uppgifter.
Not: detta protokoll är för bildåtergivning med enfärgad system, men en liknande programvara är tillgänglig för tvåfärgad system. - Välj ”facket, fartyg, Scan typer”, och ”Scan mönstret” i fliken ”fysisk Layout” och ”snabbt fluorescens” på fliken Egenskaper.
- Lägga till ”Skanna tid” genom att klicka på fönstret ”tidslinje” och det totala antalet tidpunkter och frekvens för förvärvet (typiskt 1 förvärv varje 0,5 h 1 h för 6 h till 12 h eller varje 5 min för snabb-kinetik necroptosis) och börja bild förvärv genom att välja ”App ly ”(röd knapp).
- Kvantifiera necroptosis med hjälp av bild analys programvara (se Tabell för material) genom att välja från ”fönstret uppgifter”, ”Object Counting ny analys med fasta segmentering tröskel över bakgrundsnivån”, vilket kan bestämmas genom att hovra den muspekaren över bakgrunden regioner i flera bilder som används i analysen.
- Undersöka fluorescerande objekt genom att välja förhandsvisning använder aktuell bild och förfina tröskelvärdena som behövs.
- Integrera grön fluorescens räknas genom att öppna fliken ”starta ny analys”, välja ”tidsintervall”, Välj brunnarna att analyseras, ange namnet ”analys-jobb” och tryck på ”OK”.
- Tillgång analyserade data från fliken ”analys jobb” genom att dubbelklicka på jobbnamnet på respektive och exportera från fönstret diagram/Export för ytterligare analys i extern grafritande programvara (se Tabell för material).
- Kvantifiera data som grön fluorescens positiv (+ ve) räknas mm2 eller normalisera räkningarna av sammanflödet och uttrycka data som grön fluorescens + ve räknas/confluence.
- Alternativt på experimentell slutpunkten, färga celler med 100 nM av den membran-diffusionskoefficient grön fluorescerande färgämne (se Tabell för material). Normalisera data till % necroptotic celler som förhållandet mellan grön fluorescens/grön fluorescens vid endpoint.
3. live-cell konfokalmikroskopi avbildning av plasmamembranet rekrytering och permeabilisering av MLKL
- Tallrik mlkl- / - MEFs uttrycker NBB140-2xFV-Venus vid en densitet av 20 000 celler per brunn (0,5 mL per brunn) i ett glas botten 4-väl mikroskopi kammare förbehandlats med 50 µg/mL Fibronektin i PBS vid 37 ° C i 30 min och inkubera i ~ 12 h ( Figur 2B).
- Behandla cellerna med Dox (0,5 μg/mL) att inducera uttrycket av NBB140h på ~ 12-2xFV-Venus.
- Framkalla necroptosis genom inkubation med färska medium (1 mL per brunn) innehållande 25 nM Dim inducera NBB140-2xFV-Venus aktivering och flyttning till plasmamembranet.
- Placera kammaren på en snurrande skiva laser skanning confocal Mikroskop byggd på en inverterad stativ utrustat med miljökontroll och en 63 1,4 NA mål och börja imaging förvärv med programvara av val (se Tabell för material).
- Initiera programvaran, Välj ”fokus” ikonen och YFP filterkonfiguration (excitation våglängd 515 nm).
- Leta upp synfält och fokalplanet och engagera fokus underhållssystemet med hjälp av fliken ”bestämd fokus”.
- För att påbörja förvärv, Välj fliken ”fånga” följt av tilldelning av filtret konfiguration, lämplig elektrisk kamera exponering tid och intensifiering vinst och time-lapse förvärv parametrar inklusive intervall och längd av förvärvet.
- Övervaka cellulära omfördelning av de fluorescerande NBB140-2xFV-Venus protein under necroptosis genom att förvärva bilder varje 10 s av en elektrisk kameran med en 515 nm laser (film 1).
Obs: Fotoblekning är ett bekymmer med fluorescerande protein imaging. Venus är en av de mer resistenta fluorescerande proteinerna fotoblekning29. Om du använder fluorescerande proteiner som är mer mottagliga för fotoblekning bild varje 30 s eller längre för att möjliggöra återhämtning av signalen mellan imaging tidpunkter. - Att övervaka plasmamembranet sammanslutning av NBB140-2xFV-Venus under necroptosis, bild varje 10 s provet utarbetats i 3.3 av totalreflexion fluorescens (Frida) mikroskopi med Mikroskop utrustat med en automatiserad Frida reglaget och en 100 x 1.4 NA mål och en elektrisk kamera (Movie 2). Följ steg 3.5 – 3,7, men justera Frida vinkel inom fliken Frida fokus enligt prov och botten glastjocklek mikroskopi avdelning.
Obs: plasmamembranet markörer såsom LCK-C-RFP kan användas som kontroller för plasmamembranet lokalisering i Frida analys. - Utföra bildbehandling för att förbättra kvaliteten genom faltning med negativa normaliserade andraderivatan av en Gaussisk funktion (Marr algoritm).
4. elektronmikroskopi
- Tallrik mlkl- / - MEFs uttrycker NBB140-2xFV-Venus vid en densitet av 5 miljoner celler i en plasma-belagd 150 mm cell kultur maträtt och inkubera i 12 h (figur 3).
- Behandla cellerna med doxycyklin (0,5 μg/mL) att inducera uttrycket av NB1-140-2xFV-Venus för 12 h.
- Inducera NBB140-2xFV-Venus aktivering och flyttning till plasmamembranet med 25 nM homodimerizer för 5 min. Denna gång är etablerad från kineticsen av necroptosis som observerats i live-cell imaging.
- Ta bort materialet och fixa celler med 10 mL 2,5% glutaraldehyd, 2% PARAFORMALDEHYD i 0,1 M natrium cacodylate buffert pH 7,4 (cacodylate buffert) före värmas vid 37 ° C.
- Samla in provet genom att skrapa och snurra proverna för 10 min vid 500 x g. Kassera supernatanten.
- Postfix provet för 1,5 h i reducerad 2% osmium vanligtvis med 1,5% kaliumferrocyanid i 0,1 M natrium cacodylate buffert. Osmium vanligtvis är en färgning agent som ofta används i TEM för att ge kontrast. Vi använde TEM som preliminär analys före SEM av cell som genomgår necroptosis.
- Skölj provet 5 gånger i ultrarent vatten för 5 min varje vid 500 x g, följt av sköljningar i buffert (se 4.6), vatten och etanol på en automatisk processor. Kassera supernatanten.
- För SEM, färga av tidigare fasta prov med 1% uranyl acetat och bly aspartat heavy metal fläcken31.
- Torka proverna genom en graderad serie av alkohol och propylen oxid lösningar.
- Bädda in provet i hård harts32 att erhålla ett harts block.
- Skär tjocka sektioner 0,5 μm till bestämma rätt analys.
- Päls av prov med en ultra-tunn film av elektriskt ledande metall (Iridium).
- Bild och analysera proverna (figur 3). För kvantifiering, en låg-förstoring bild av harts block ytan med exponerade cellerna skannas på 5 keV med ett elektronmikroskop.
- Visualisera celler över enskilda bilder tagna av SEM eller imaging programvara kan användas för att ansluta sig till flera fält-of-view till en sammanhängande bild30. Ungefär 100 celler kan användas för att utvärdera fraktionen av celler som genomgår necroptosis på detta sätt genom att generera ett högupplöst montage i programvara val (se Tabell för material).
Obs: Scoring nekrotisk morfologi av SEM jämför normal cell funktioner med utvecklingen av pre nekrotisk eller nekrotiska fenotyper. Dessa funktioner inkluderar plasmamembranet förändringar inklusive Mikrovilli försvinnande, tillplattning, spricker i celler som sträcker sig från 10 nm till 1 µm i storlek, eller förlust av organell struktur över minst 30 – 40% av området cytosoliska cell.
5. lipid bindningen av MLKL av kärnmagnetisk resonans (NMR) spektroskopi
- Förbereda 15N-märkt NBB1-156 av standard proteinuttryck och rening som tidigare beskrivits24.
- Lös 500 µg 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoinositol ammoniumsalt (18:0 PI) och 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-myo-inositol) ammoniumsalt (18:1 PI) i 500 µL av iskall CHCl3 varje för slutliga koncentrationer på 1 mg/mL.
- Sonikera 1 mg/mL 18:0 och 18:1 PI i ultraljudsbehandling vattenbad för 1 min i rumstemperatur eller upp till 5 min i ett is-vatten-blandning.
-
Alikvotens 1 mg/mL 18:0 och 18:1 PI i rena glasflaskor för enskilda NMR titrering serien (figur 4). Överföring lipider i organiska lösningsmedel med glas lufttät sprutor.
- Alikvotens 132 µL av 1 mg/mL 18:1 PI (Molmassa = 880.137 g/mol) CHCl3 för en sista resuspension volym av 1 200 µL vid 125 µM koncentration.
Obs: För 5 mm NMR rör, förbereda seriell utspädning volymer > 1000 µL och slutliga NMR prov volymer > 500 µL. För 3 mm NMR rör, förbereda seriell utspädning volymer > 300 µL och slutliga NMR prov volymer > 150 µL.
- Alikvotens 132 µL av 1 mg/mL 18:1 PI (Molmassa = 880.137 g/mol) CHCl3 för en sista resuspension volym av 1 200 µL vid 125 µM koncentration.
- Alikvotens 1 mg/mL svin hjärnan L-α-fosfatidylinositol-4,5-bisphosphate ammoniumsalt i 20:9:1 CHCl3/MeOH/H2O (hjärnan PI (4,5) P2) till rena glasflaskor.
- Ställ flaskor under en gasformiga ström av argon (Ar) eller kvävgas (N2) med lagom flöde att avdunsta organiskt lösningsmedel utan stänk mot glas injektionsflaska väggarna. Fem till trettio min är vanligtvis tillräckligt för volymer på 10 – 200 µL organiskt lösningsmedel.
- Ordna glas vaccinkoncentratet längst ned i en Büchner eller vacuum flask med stor pincett, försegla med en gummipropp och bifoga plaströr som är anslutna till ett vakuum linje. Evakuera kolven under milda vakuum över natten att ta bort kvarvarande organics.
- Overlay lipid film alikvoter med inert gas, försegla med lufttätt lock och förvaras vid-20 ° C för användning inom en månad eller -80 ° C för långsiktig lagring.
- Förbereda NMR prov buffertar utan rengöringsmedel (-Det) som innehåller 20 mM NaxHyPO4 pH 6.8, 10% D2O och med tvättmedel (+ Det) som innehåller 20 mM NaxHyPO4 pH 6.8, 10% D2O, 0,34 mM n-dodecyl-β-D-maltopyranoside (DDM).
- Lägg till + Det buffert injektionsflaska av glas med lipid film för att uppnå önskad koncentration och Sonikera i vattenbad för upp till 30 min, omväxlande ultraljudsbehandling för 10 min följt av okulärbesiktning.
Obs: Ultraljudsbehandling kan värma provet. Låt svalna till rumstemperatur i 15 min innan sista protein prov beredning. - Utföra seriell utspädning av lipid-tvättmedel miceller i + Det buffert med ultraljudsbehandling av 1:1 blandningar för önskad koncentration serien. Börjar på 125 µM lipid koncentration, kommer att tre repetitioner ge 62,5 µM, 31,3 µM och 15,6 µM lipid i 0,34 mM DDM.
- Förbereda kontroll och referera NMR prover av protein och tillsatser i - Det och + Det buffertar, respektive. Lägga till protein och tillsatser till varje utspädning av lipid i + Det buffert.
Obs: För 15N NBB156, protein läggs till en slutlig koncentration på 40 µM och kompletteras med 2 mM deutererat Ditiotreitol att hålla Cys rester minskas. - Över en lämplig volym av prover till 5 mm eller 3 mm NMR rör (se anmärkning i steg 5,4).
- Manuellt ladda prover i NMR instrument eller ordna i en automation plattform såsom SampleCase lastaren.
- Förvärva sammansatta NMR spectra med standard puls program för 1H proton spectra som kvalitetskontroll följt av 2D 1H -15N korrelation spectra antingen som tvärgående avkoppling optimerad spektroskopi (TROSY) eller heteronuclear flera quantum samstämmighet (SOFAST-HMQC)33.
Obs: Användning av 3 mm NMR rör kräver 64 skanningar för 1 H -15N TROSY (~ 3 h) eller 1H -15N SOFAST-HMQC (~ 90 min). Skanna nummer halveras för 5 mm NMR rör. - Bearbetade 2D NMR spectra kan läggas till en CARA repository34 för analys eller annan programvara val för användaren.
-
Analysera programvara genom att kommentera 2D NMR resonanser för tre väl spridda och löst toppar för varje protein stat. Spela in peak amplituderna för varje av de sex topparna för varje buffert villkor som innehåller NBB156 (figur 5A).
- Använda CARA för att förbereda en batch-integration lista (klicka på huvudmenyn rubrik ”spektrum | Inställning av Batchlista ”...) av alla spektra samlas in och analysera med hjälp av en enkel topp uppdragsfilen (klicka på huvudmenyn rubrik ”toppar | Importera Peaklist ”.. .och välja en användardefinierad .peaks fil med 6 totala toppar, 3 för varje protein land, definieras inom).
- Finjustera inställningarna (”Integrator | Tune topp modell ”...) X-bredd 0,06 ppm och Y-bredd 0.30 ppm (klicka på huvudmenyn rubrik ”Integrator | Tune topp modell ”...) innan inspelningen slutresultatet i två menyval (1. Klicka på huvudmenyn rubrik ”Integrator | Integrera Batchlista ”) (2. Klicka på huvudmenyn rubrik ”toppar | Dataexportregistret Integration ”) (figur 5B).
Obs: Ryggrad amide resonanser för resthalter M21, V53 och L105 har tilldelats för NBB156 stängd-brace staten. Öppna-brace staten tilldelades ryggraden amide resonanser av rester G130 och A141 och epsilon proton sidokedjan resonansen av W133 använder 3D NMR experiment24.
- Normalisera prover för direkt jämförelse från olika magneter eller prov villkor genom genomsnitt tre öppna-brace amplituderna av referens proverna och beräkna en normalisering faktor avseende två referenser. Beräkna de skala amplituderna för NBB156 resonanser med hjälp av normalisering faktor och inställningen negativ amplituder till noll (tabell 2).
Exempel: (1) jämföra prover från olika magneter: Magnet A, NBB156DDM och Magnet B, NBB156+ DDM. (2) tvättmedel jämförelse: 0,34 mM DDM och 1,7 mM DDM. - Beräkna för varje resonans den skala fraktionen av stängd - eller öppna-brace genom att dividera med utbud av minsta till maximal amplitud av alla spektra som samlas in innehåller lämpliga referenser gratis NBB156 samt fullt öppen-brace NBB156 i rengöringsmedel.
- Rita de normaliserade NMR-amplituderna som en funktion av lipid koncentration och jämför fraktionen av öppen-brace NBB156 under olika förhållanden (figur. 5 C).
Obs: Alternativt, analys av fraktionen av stängd-brace konformation mot lipid koncentration kan utföras för att jämföra lipid bindning till NBB156. Vi föredrar den tidigare analysen eftersom det är snabbare och bättre rapporter om bråket-engagerade av lipider.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Visualisera reglerade necroptosis avrättning i levande celler har varit möjligt genom inducerbara uttryck för en minimal trunkerade MLKL konstruktion, NBB140-2xFV-Venus. Denna konstruktion bibehåller förmågan att inducera plasmamembranet vilket och aktiveras via Dim-inducerad oligomerisering av FKBP kassetten (2xFV). Vi observerar och kvantifiera necroptosis av live-cell mikroskopi imaging, övervakning kinetiskt (var 5: e minut) upptaget av en cell ogenomtränglig grön fluorescens DNA bindande färgämne(figur 6). Detta inducerbara system är mycket robust och komplett necroptosis av mlkl- / - MEFs kan observeras inom ~ 1 h vid Dim-medierad oligomerisering av Dox-teststamman celler som uttrycker NBB140-2xFV-Venus (figur 1A ). Vi hänvisar till dessa villkor som snabb-kinetik necroptosis. Uttryck för Venus ensam ± Dim eller NBB140-2xFV-Venus i avsaknad av Dim inducerade inte necroptosis(figur 6). Vi utför vanligen minst 3 replikera imaging experiment i tre exemplar eller fyra exemplar i 24 - 96- eller 384 brunnar.
Den snabb-kinetik necroptosis induceras av påtvingade dimerization NBB140-2xFV-Venus (figur 6A) stöder MLKL roll som förmodad bödeln av plasmamembranet bristning. Att visualisera omfördelning av NBB140-2xFV-Venus till plasmamembranet under necroptosis, live-cell konfokalmikroskopi används för att övervaka Venus fluorescens. Under snabb-kinetik necroptosis, inom 2 – 3 min inkubering med Dim, följt Venus beläggning av cell periferin observeras, av gradvis cell avrundning (film 1). NBB140-2xFV-Venus ackumulering vid plasmamembranet visualiseras av Frida konfokalmikroskopi, som fokuserar på cell volymen på gränssnittet cytosol-plasma membran-glas. Plasmamembran-associerade Venus puncta är synliga inom 1 – 2 min inkubering med Dim (Movie 2). Således, verkställas oligomerisering av NBB140-2xFV-Venus inducerar sin snabba omfördelning till plasmamembranet.
Svepelektronmikroskopi (SEM) är ett kraftfullt verktyg för att avslöja de morfologiska förändringarna i celler som genomgår necroptosis. Under snabb necroptosis induceras av oligomerisering av NBB140-2xFV-Venus, celler förändring morfologi från normala avlånga former (tid 0 min) till rundade och svällde (5 min) till delvis brusten (10 min) och omfattande demonteras där cytosolen har försvann (20 min) (figur 6B). SEM kompletterar de tidigare iakttagelser från live-cell mikroskopi korrelera MLKL lokalisering till plasmamembranet med membran bristning. Övergripande mikroskopi tekniker presenteras häri erbjuda kompletterande medel att övervaka, utvärdera och kvantifiera necroptosis på cellnivå och implicerade NBB140-2xFV-Venus i utförandet av plasmamembranet bristning.
För att avgöra om MLKL direkt kan kontakta plasmamembranet utför vi in vitro- lipid bindande experiment övervakas av NMR spektroskopi med rekombinant NBB156. Seriespädningar av lipid-tvättmedel miceller, använda en konstant koncentration av tvättmedel (fordon för lipid presentation) och variabel lipid koncentrationer, testas för bindning till 15N-märkt NBB156 av 2D NMR spektroskopi, som monitorer bindande-inducerade förändringar i proteinet. NBB156 genomgår stora strukturella förändringar på bindande att tränga undan den hämmande stag regionen (aminosyror 132-156) från den slutna och spiralformade lipid (stängd stag) till öppen och egensäkra oordnade konformation (öppna stag) (figur 7 A). Tvådimensionella NMR spektroskopin ger per rester information om blandningar av både konformationer (Siffror 7B-7 C). Vi har tidigare tilldelade de ryggraden amider av båda konformationer24. Vi kan enkelt övervaka procentsatserna för slutna och öppna konformationer i ett givet prov som beskrivs i diagram 5A-C. Använder denna bindande analys, utforska vi NBB156 bindande till kärnor i DDM tvättmedel, som är inert till NBB156 bindande (figur 5B). I denna analys är PIP2 den bästa NBB156 liganden, som inducerar fullständiga öppnandet av den hämmande stag på 125 µM (bild 5C). Däremot är mättade (18:0) PI och omättade (18:1) PI fattiga NBB156 ligander inducerande partiell stag öppning på samma villkor (bild 5C). Våra NMR-baserade lipid bindande assay ger stödjande bevis för växelverkan av MLKL NBB156 fosfolipider och antyder ett direkt samband mellan MLKL och plasmamembranet.
Figur 1: Stabil cellinje härbärgerat en modifierad Tet-On 3 G inducerbara system. (A) stabil cellinjer genererades av retrovirala transduktion av/mlkl- / - MEFs med pTREX-rtTA-explosionen följt av de pRetroX-TRE3G-NBB140-2xFV-Venus-puro. Varje transduktion följdes av antibiotika urval för upp till 1 vecka innan du går till efterföljande analyser. (B) Schematisk bild av inducerbara MLKL uttryck systemet. Detta system är baserat på 2 drog-inducerbara reglerande steg: i) MLKL genuttryck och proteinproduktion (+ Dox) och ii) aktivering av oligomerisering (+ Dim). När proteinproduktion induceras i förväg, + Dox, snabb-kinetik necroptosis kan utlösas, + Dim. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Live-cell avbildning av snabb-kinetik necroptosis avslöjar snabba membran relocalization av MLKL. (A) Fast-kinetik necroptosis inducerad som i figur 1B kan övervakas i ett bildsystem. Necroptosis är gjorda av upptag av den cell-impermeable grön fluorescerande färgen. (B) Schematisk bild av live-cell avbildning av snabb-kinetik necroptosis med epifluorescence och total inre reflektion fluorescens (Frida) mikroskopi analys. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Schematisk representation av scanning electron microscopy (SEM) provberedning och analys. Celler från snabb-kinetik necroptosis inducerad som beskrivs i figur 1 är fasta på plattan vid olika tidpunkter efter tillsats av Dim. Cellerna är då förberedda för SEM analys av skrapning och poolning, tungmetall färgning, harts inbäddning och iridium coating som beskrivs i avsnitt 4. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Prov förberedelse och datainsamling för NMR titreringar av 15N NBB156 och lipid-tvättmedel miceller. Denna analys och analys utförs normalt i 3 – 4 dagar: under dag 1, lipid alikvoter expedieras och torkat över natten. Under dag 2, är lipid filmerna rehydrerad i assay buffert ± tvättmedel, sonicated, och seriellt utspädda (två gånger) genom att blanda lika stora volymer av återfuktad lipid lösningen med lipid-fri buffertlösning. Varje utspädning är sonicated för att säkerställa homogen blandning och fördelning av lipider i tvättmedel miceller före efterföljande spädningarna. Protein proverna blandas i de seriella lipid-tvättmedel micelle utspädningarna, lastas i lämpliga NMR rören, placeras i en SampleCase lastare (eller laddas manuellt) och automatisk NMR datainsamlingen inleds. Under efterföljande dagar, är NMR datainsamlingen klar och följt av 2D NMR analys. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 : Lipid-bindande preferenser NBB156 mätt med 2D NMR. (A) ovanpå 1H -15N TROSY spectra för 15N-NBB156 i närvaro (röd) eller saknas (blå) 125 µM PI (4,5) P2 i 0,34 mM DDM visualiseras i CARA. (B) endimensionell skivor av resonanser används för amplitud mätningar och normalisering. Rå (grön) spektrumet överdras med gränsen för amplitud och integration av CARA-programmet. (C) Normalized amplituder av NBB156 i närvaro av fosfoinositid-DDM miceller plottas mot lipid koncentration. PIP2 inducerar fullständiga öppnandet av ortosen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6 : Fast-kinetik necroptosis induceras av oligomerisering av NBB140-2xFV-Venus i/mlkl- / - MEFs. (A) Necroptosis kvantifiering av hög genomströmning fluorescens imaging av upptag av cell-impermeable, DNA-bindande grön fluorescerande färg. Robust necroptosis induktion har endast observerats vid Dim-inducerad oligomerisering av NBB140-2xFV-Venus, men inte i avsaknad av Dim. Venus-bara kontroll experiment utförs också. Alla villkor görs i tre exemplar och ritas som genomsnitt och SD från en representant replikera. (B) Fast-kinetik necroptosis inducerad i närvaro av Dim visualiseras med svepelektronmikroskopi. Kurs avslöjar morfologiska ändras underliggande necroptosis inklusive cell avrundning och svullnad (5 min), bristning i plasmamembranet (10 min) och slutför extravasation av cytosolen (20 min). Varje prov hade liknande antal celler vid tiden 0 min. Från vänster till höger innehåller inzoomade området 26, 32, 23 och 36 celler med kärnor. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7 : Bindande av NBB156 till phosphoinositides övervakas av NMR spektroskopi. (A) 1H -15N TROSY spektrum av 15N-NBB156. De kemiska förskjutningarna av resonanser används för normalisering av slutna stag spektrum eller kvantifiering av öppna staten markeras med rutor eller cirklar, respektive. Rätt, schematisk av NMR signaturer upptäcks i frånvaron eller närvaron av lipid-tvättmedel miceller. NBB156 binder inte DDM tvättmedel miceller i avsaknad av phosphoinositides. (B) ovanpå 1H -15N TROSY spectra 15N-NBB156 i närvaro av de respektive lipid-tvättmedel micellerna. (C) enda 1H -15N TROSY spectra 15N-NBB156 i närvaro av respektive lipid-tvättmedel micellerna från panelen B. Vi kan kvantifiera procentsatserna för de två konformationer i ett givet prov genom att identifiera de öppna och slutna konformationer otvetydigt i blandningar av de två konformationer. PIP2 är rekommenderad lipid liganden av NBB156 som ger en direkt koppling mellan MLKL och plasmamembranet fosfolipider. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| PCR-buffert (10 x) | 5.0 ΜL |
| DNA-mall (100 ng/µL) | 1,0 ΜL |
| cDNAs för MLKL, 2 x FKBP, Venus) | |
| dNTP (25 mM varje NTP) | 0,5 ΜL |
| PCR primers framåt (F) (100 ng/µL) | 1.3 ΜL |
| PCR primers framåt (FR (100 ng/µL) | 1.3 ΜL |
| NBB140 F | ATAATCGATACCATGGAAAATTTGAAGCATATT |
| NBB140 R | TATGCGGCCGCATCCTGCTGATCTTCCTGTGC |
| 2xFKBP F | ATAGCGGCCGCAGGCGTCCAAGTCGAAACCATT |
| 2xFKBP R | TATGCGGCCGCTTCCAGTTTTAGAAGCTCCAC |
| Venus F | ATAGGGCCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAG |
| Venus R | TATGAATTCTTACTTGTACAGCTCGTC |
| DNA-polymeras (2,5 U/µL) | 1,0 ΜL |
| Destillerat avjoniserat vatten (ddH2O) | 39,9 ΜL |
| Totala reaktionsvolym | 50,0 ΜL |
| PCR-cykling parametrar | |
| 1 cykel | 94-98 ° C; 45 s |
| 25 – 30 cykler | 94-98 ° C; 45 s |
| 58 ° C; 45 s | |
| 72 ° C; 1-2 min | |
| 1 cykel | 72 ° C; 10 min |
Tabell 1: PCR-reaktionen för NB 140 -2xFV-Venus för restriktionsenzym-baserade kloning i pRetroX-TRE3G.
Tabell 2: rådata för NMR spectra presenteras i diagram 5 illustrerar den normaliserade omvandlingen av data som samlats in från en andra NMR-magnet till den beräkna genomsnittliga öppna stag staten. Klicka här för att se en större version av denna tabell.
Film 1: snabb-kinetik necroptosis induceras av oligomerisering av NBB 140 -2xFV-Venus i mlkl- / - MEFs. Live konfokalmikroskopi visar på snabb flyttning av NBB140-2xFV-Venus från cytosolen till plasmamembranet efter påtvingad oligomerisering av FKBP domänen. Cellerna behandlades som beskrivs i figur 1. Gul: NBB140-2xFV-Venus. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)
Movie 2: Frida mikroskopi av snabb-kinetik necroptosis. Frida mikroskopi visar snabbt (~ 2 min) relocalization och aggregering av MLKL på plasmamembranet vid tillägg av Dim mlkl- / - MEFs uttrycker NBB140-2xFV-Venus. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi tillhandahåller protokoll för tekniker som vi kombinerat till inblandad MLKL som förmodad bödeln av plasmamembranet bristning24. Förutom att dechiffrera det regulatoriska nätverk som reglerar MLKL-medierad necroptosis, kan dessa tekniker användas självständigt att karakterisera andra lämpliga biologiska system. Praktiskt sett är dessa tekniker medium till låg-genomströmning upptäckt verktyg.
Vi har rutinmässigt används live-cell avbildning av NBB140-2xFV-Venus-medla necroptosis, och som framkallas av andra MLKL konstruktioner, att slentrianmässigt dissekera regleringen av MLKL i necroptosis genom mutagenes och med hjälp av små molekyler kemiska sonder. I synnerhet vi och andra grupper har visat att mänskliga och mus konstruktioner av MLKL som innehåller minimal regionen av NBB kan medla necroptosis i mänskliga och mus cellinjer. Ett rapporterat förbehållet reglerar MLKL-medierad necroptosis är arter specificitet av RIPK3 och MLKL interaktion, vilket förhindrar korsreaktion hos arter som observerats vid uppströms stimulering av kombination av TNF, smac mimetika och kaspas hämning 25,35,36. Därför människa och mus RIPK3 och MLKL proteiner inte korsreagerar enligt dessa villkor25,35,36. För att kringgå begränsningarna som mellan arter, vi införa mutationer som aktiverar mänskliga MLKL eller använder oligomerisering kassetter som visas här för NBB140-2xFV-Venus24. Mänskliga NBB140 är en konstruktion som upprätthåller regionen hämmande och därför förblir inaktiva i samband med NBB140-2xFV-Venus. Dimerization på 2xFV tros aktivera NBB140 genom att släppa stag. Däremot inducerar mänskliga NBB182 necroptosis även i avsaknad av oligomerisering, eftersom denna konstruktion kan spontant oligomerize24. Dessutom pekar mutanter (R30A, R30E, E136A och E136R) Aktivera NB regionen i samband med fullängds mänskliga MLKL övervinna behovet för aktivering av RIPK3 fosforylering24. Dessutom vi beredas dimerizable mänskliga RIPK3 (Cerulean-2xFV-RIPK3) och Dox-inducerbara fullängds mänskliga MLKL-Venus, som är kompatibla och kraftfullt inducera necroptosis i/ripk3- / - mlkl- / - MEFs24 . Andra har nyligen avslöjat ytterligare mutationer eller mänskliga-mus domän bytte MLKL konstruktioner som kan övervinna arter specificitet barriärer25.
Vi optimerar vanligtvis necroptosis assay villkoren genom att utföra flera dosval experiment i 96 brunnar. Vi följer sedan med optimerad experiment i 24 brunnar, som ger tillräckligt med celler för multiplexering med kompletterande fluorescerande aktiverad cell sortering (FACS) och western blotting analyser utförs därefter på samma prover omedelbart efter imaging den slutliga tidpunkten. För närvarande, bygger live-cell imaging på detektion av grön och röd fluorescens, begränsa märkning möjligheter för många tillämpningar. Ett vanligt alternativ till grön fluorescerande färgämnen är den cell-impermeable DNA-bindande fluorescerande färgämne propidium jodid (PI). Tvåfärgad imaging instrument erbjuder möjlighet att använda dessa färgämnen med kompletterande grön eller röd fluorescerande proteiner för att förbättra verktyget och information innehållet i necroptosis imaging.
Möjligheten för MLKL att translocate till plasmamembranet efter dess aktivering, gör levande mikroskopi tekniken med val att studera biologi på detta protein och för att följa i realtid den morfologiska förändringar underliggande necroptosis. Frida mikroskopi löser otvetydigt MLKL protein aggregat på plasmamembranet, särskilt när avrättades i närvaro av markörer som samtidig lokaliserar till plasmamembranet. Vi använde LCK-C-RFP som markör för plasmamembranet samtidig lokalisering24. Förmågan att taggen proteiner av intresse med olika fluorophores, tillåter också att samtidigt studera aktiviteten av flera proteiner inblandade i samma process. Nästa generation av super-resolution mikroskopi delvis övervinner diffraktion begränsa problemet i standard konfokalmikroskopi och har potential att avslöja ytterligare funktioner av MLKL-medierad necroptosis.
Ett av kännetecknen för necroptosis är plasmamembranet vilket. Även om flera tekniker kan indirekt kvantifiera eller ange membranet spricker, kan endast EM visualisera diskontinuiteter i plasmamembranet integriteten inducerad av MLKL. Medan TEM har högsta upplösning, har SEM förmågan att mappa större exemplar områden. Den här funktionen, i kombination med utveckling av nya och kraftfulla programvara kunna hantera större volym av data, har förbättrats nyttan av SEM i cell morfologi karakterisering. SEM är dessutom också kunna skanna efterföljande insamlingar sektioner möjliggör 3D rekonstruktion då den kopplas till andra system, som fokuserade Ion Beam. Några av nackdelarna med EM analys inkluderar kostnaden för instrumenteringen och underhåll, nödvändigheten av högt specialiserad personal och betydande tid investeringen i provet bearbetning och analys.
Dot blot analyser har använts ursprungligen att göra direkta anslutningar mellan MLKL och plasmamembranet fosfolipider16,27. Våra NMR-baserade lipid bindande assay ifrågasätter slutgiltigt MLKL i specifika fosfolipid bindande, belysa PIP2 som MLKL liganden av val. Våra resultat visar en skadlig effekt av acyl kedja mättnad på NBB156 bindning till fosfatidylinositol. Ändå, hur MLKL bindning till PIP2och eventuellt andra fosfolipider, resulterar i plasmamembranet bristning förblir okänd. Använder det här protokollet kan alla andra fosfolipid testas för bindning till MLKL. Vår analys fungerar som ett bra verktyg för att testa nya modeller av MLKL-medla necroptosis, eftersom den kan användas med mutanter av MLKL och olika ligander att peka ut de särskilda bidragen till lipid bindande. Dessutom kan det användas för några andra associerade membransystem för att förhöra deras lipidprofiler bindande.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen.
Acknowledgments
Ingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cloning and cell line generation | |||
| pRetroX-TRE3G | Clontech | 631188 | |
| Tet-On transactivator plasmid | Llambi et al., 2016 | ||
| Mouse Embryonic Fibroblasts (MEFs) mlkl-/- | Dillon et al., 2014 | ||
| Blasticidin S Hydrochloride | Thermo Fisher Scientific | BP2647100 CAS#3513-03-9 | |
| Cell death quantification and live-cell microscopy | |||
| Doxycycline | Clontech | 631311 CAS# 24390-14-5 | |
| B/B Homodimerizer AP20187 | Takara | 635059 CAS# 195514-80-8 | |
| SYTOX Green | Thermo Fisher Scientific | S7020 | |
| Syto16 | Thermo Fisher Scientific | S7578 | |
| NMR | |||
| 15 N Ammonium Chloride | Cambridge Isotope Laboratories | NLM-467-10 CAS# 12125-02-9 | |
| Deuterated DTT | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-2622-1 | |
| Deuterium Oxide | Sigma Aldrich | 617385-1 CAS# 7789-20-0 | |
| n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside | Anatrace | D310 CAS# 69227-93-6 | |
| L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (Brain, Porcine) (ammonium salt) | Avanti Polar Lipids | 840046X CAS# 383907-42-4 | |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoinositol (ammonium salt) (18:0 PI) | Avanti Polar Lipids | 850143 CAS# 849412-67-5 | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-myo-inositol) (ammonium salt) (18:1) | Avanti Polar Lipids | 850149 CAS# 799268-53-4 | |
| Specialized Equipment | |||
| IncuCyte FLR or ZOOM | Essen BioScience, Inc. | Live-cell microscopy imaging | |
| Helios NanoLab 660 DualBeam | Thermo Fisher Scientific | Electron microscope | |
| Software | |||
| IncuCyte 2011A Rev2 v20111.3.4288 (FLR) | Essen BioScience, Inc. | http://www.essenbioscience.com | Imaging analysis |
| FEI MAPS | Thermo Fisher Scientific | https://www.fei.com/software/maps/ | EM analysis |
| TopSpin v3.2 | Bruker BioSpin | http://www.bruker.com | NMR data collection |
| CARA v1.9.1.7 | http://cara.nmr.ch/ | NMR data analysis | |
| Slidebook | 3i (Intelligent Imaging Innovations) | https://www.intelligent-imaging.com/slidebook | Confocal microscopy |
References
- Weinlich, R., Oberst, A., Beere, H. M., Green, D. R. Necroptosis in development, inflammation and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (2), 127-136 (2017).
- Kaiser, W. J., et al. RIP3 mediates the embryonic lethality of caspase-8-deficient mice. Nature. 471 (7338), 368-372 (2011).
- Murphy, J. M., et al. The pseudokinase MLKL mediates necroptosis via a molecular switch mechanism. Immunity. 39 (3), 443-453 (2013).
- Oberst, A., et al. Catalytic activity of the caspase-8-FLIP(L) complex inhibits RIPK3-dependent necrosis. Nature. 471 (7338), 363-367 (2011).
- Zhang, H., et al. Functional complementation between FADD and RIP1 in embryos and lymphocytes. Nature. 471 (7338), 373-376 (2011).
- He, S., et al. Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-alpha. Cell. 137 (6), 1100-1111 (2009).
- Dondelinger, Y., Hulpiau, P., Saeys, Y., Bertrand, M. J. M., Vandenabeele, P. An evolutionary perspective on the necroptotic pathway. Trends in Cell Biology. 26 (10), 721-732 (2016).
- Newton, K., Manning, G. Necroptosis and Inflammation. Annual Review of Biochemistry. 85, 743-763 (2016).
- Kaiser, W. J., Upton, J. W., Mocarski, E. S. Viral modulation of programmed necrosis. Current Opinion in Virology. 3 (3), 296-306 (2013).
- Newton, K., et al. RIPK3 deficiency or catalytically inactive RIPK1 provides greater benefit than MLKL deficiency in mouse models of inflammation and tissue injury. Cell Death & Differentiation. 23 (9), 1565-1576 (2016).
- Kearney, C. J., Martin, S. J. An Inflammatory Perspective on Necroptosis. Molecular Cell. 65 (6), 965-973 (2017).
- Pasparakis, M., Vandenabeele, P. Necroptosis and its role in inflammation. Nature. 517 (7534), 311-320 (2015).
- Sun, L., Wang, X. A new kind of cell suicide: mechanisms and functions of programmed necrosis. Trends in Biochemical Sciences. 39 (12), 587-593 (2014).
- Grootjans, S., Vanden Berghe, T., Vandenabeele, P. Initiation and execution mechanisms of necroptosis: an overview. Cell Death & Differentiation. 24 (7), 1184-1195 (2017).
- Sun, L., et al. Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase. Cell. 148 (1-2), 213-227 (2012).
- Wang, H., et al. Mixed lineage kinase domain-like protein MLKL causes necrotic membrane disruption upon phosphorylation by RIP3. Molecular Cell. 54 (1), 133-146 (2014).
- Cai, Z., et al. Plasma membrane translocation of trimerized MLKL protein is required for TNF-induced necroptosis. Nature Cell Biology. 16 (1), 55-65 (2014).
- Chen, X., et al. Translocation of mixed lineage kinase domain-like protein to plasma membrane leads to necrotic cell death. Cell Research. 24 (1), 105-121 (2014).
- Dillon, C. P., et al. RIPK1 blocks early postnatal lethality mediated by caspase-8 and RIPK3. Cell. 157 (5), 1189-1202 (2014).
- Rickard, J. A., et al. RIPK1 regulates RIPK3-MLKL-driven systemic inflammation and emergency hematopoiesis. Cell. 157 (5), 1175-1188 (2014).
- Kaiser, W. J., et al. Toll-like receptor 3-mediated necrosis via TRIF, RIP3, and MLKL. Journal of Biological Chemistry. 288 (43), 31268-31279 (2013).
- Upton, J. W., Kaiser, W. J. DAI Another Way: Necroptotic Control of Viral Infection. Cell Host & Microbe. 21 (3), 290-293 (2017).
- Tanzer, M. C., et al. Necroptosis signalling is tuned by phosphorylation of MLKL residues outside the pseudokinase domain activation loop. Biochemical Journal. 471 (2), 255-265 (2015).
- Quarato, G., et al. Sequential Engagement of Distinct MLKL Phosphatidylinositol-Binding Sites Executes Necroptosis. Molecular Cell. 61 (4), 589-601 (2016).
- Davies, K. A., et al. The brace helices of MLKL mediate interdomain communication and oligomerisation to regulate cell death by necroptosis. Cell Death & Differentiation. , (2018).
- Su, L., et al. A plug release mechanism for membrane permeation by MLKL. Structure. 22 (10), 1489-1500 (2014).
- Dondelinger, Y., et al. MLKL compromises plasma membrane integrity by binding to phosphatidylinositol phosphates. Cell Reports. 7 (4), 971-981 (2014).
- Llambi, F., et al. BOK Is a Non-canonical BCL-2 Family Effector of Apoptosis Regulated by ER-Associated Degradation. Cell. 165 (2), 421-433 (2016).
- Malkani, N., Schmid, J. A. Some secrets of fluorescent proteins: distinct bleaching in various mounting fluids and photoactivation of cyan fluorescent proteins at YFP-excitation. PLoS One. 6 (4), 18586 (2011).
- Perez, A. J., et al. A workflow for the automatic segmentation of organelles in electron microscopy image stacks. Frontiers in Neuroanatomy. 8, 126 (2014).
- Walton, J. Lead aspartate, an en bloc contrast stain particularly useful for ultrastructural enzymology. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 27 (10), 1337-1342 (1979).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biology. 2 (11), 329 (2004).
- Rossi, P., Xia, Y., Khanra, N., Veglia, G., Kalodimos, C. G. 15N and 13C- SOFAST-HMQC editing enhances 3D-NOESY sensitivity in highly deuterated, selectively [1H,13C]-labeled proteins. Journal of Biomolecular NMR. 66 (4), 259-271 (2016).
- Keller, R. The computer aided resonance assignment tutorial. Cantina Verlag. , (2004).
- Chen, W., et al. Diverse sequence determinants control human and mouse receptor interacting protein 3 (RIP3) and mixed lineage kinase domain-like (MLKL) interaction in necroptotic signaling. Journal of Biological Chemistry. 288 (23), 16247-16261 (2013).
- Tanzer, M. C., et al. Evolutionary divergence of the necroptosis effector MLKL. Cell Death & Differentiation. 23 (7), 1185-1197 (2016).
