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Medicine

Ensayo de eflujo de colesterol marcado con Nitrobenzoxadiazole de alto rendimiento

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58891
Automatic Translation
1, 1, 1
1Group of Genomics and Pharmacogenomics in HIV, Laboratory of Retrovirology and Viral Immunopathogenesis, IDIBAPS, Hospital Clínic de Barcelona

Summary

Medición de la capacidad de eflujo de colesterol in vitro en suero o plasma en modelos celulares de macrófagos es una herramienta prometedora como un biomarcador para la ateroesclerosis. En el presente estudio, optimizar y estandarizar un método fluorescente de eflujo de NBD-colesterol y desarrollar un análisis de alto rendimiento con placas de 96 pocillos.

Abstract

Atherosclerosis conduce a enfermedades cardiovasculares (ECV). No está todavía claro si la concentración de colesterol-HDL (cHDL) desempeña un papel causal en el desarrollo de aterosclerosis. Sin embargo, un factor importante en las primeras etapas de formación de la placa de ateroma es capacidad de eflujo de colesterol de HDL (la capacidad de las partículas de HDL colesterol de los macrófagos de aceptar) para evitar formación de espuma de la célula. Este es un paso clave para evitar la acumulación de colesterol en el endotelio y una parte del transporte de colesterol inverso (ECA) para eliminar el colesterol por el hígado. Capacidad de eflujo de colesterol en suero o plasma en modelos celulares de macrófagos es una herramienta prometedora que puede utilizarse como marcador de aterosclerosis. Tradicionalmente, [3H]-colesterol se ha utilizado en ensayos de eflujo de colesterol. En este estudio, nuestro objetivo es desarrollar una estrategia más segura y más rápida con fluorescente etiquetado-colesterol (colesterol de NBD) en un ensayo celular rastrear el proceso de absorción y eflujo de colesterol en macrófagos THP-1-derivados. Por último, optimizar y estandarizar el método de eflujo de NBD-colesterol y desarrollar un análisis de alto rendimiento con placas de 96 pocillos.

Introduction

Según la Organización Mundial de la salud, las principales causas actuales de muerte en todo el mundo son la cardiopatía isquémica y accidente cerebrovascular (que representa un total de 15,2 millones de defunciones)1. Ambos son las enfermedades cardiovasculares (ECV) que pueden estar precedidas por la aterosclerosis y la ruptura de placas de ateroma en los vasos sanguíneos2,3.

Aterosclerosis es una enfermedad inflamatoria del pared vaso en el que los macrófagos, células T, mastocitos y células dendríticas infiltran en el endotelio y acumulan de la sangre, eventualmente formando placas ateroscleróticas. Placas ateroscleróticas presentan un lípido cristales base y colesterol, por medidas de ecografía de alta resolución B-modo de la carótida íntima media grueso4,5. En macrófagos, eflujo de colesterol hacia las partículas de aceptador de lípidos se realiza por medio de los ATP-binding cassette (ABC) los receptores ABCA1, miembro de ATP enlace cassette subfamilia G 1 (ABCG1) y el receptor scavenger SR-BI. El desequilibrio del flujo de colesterol y de la emanación en los macrófagos se considera un proceso clave en la aterosclerosis iniciación6. Eflujo de colesterol se considera un paso clave en la eliminación de colesterol del tejido periférico para el plasma y el hígado en un proceso llamado transporte de colesterol inverso (ECA). Se transfiere colesterol de los macrófagos principalmente a apolipoproteína A1 (ApoA1) encontrados en la superficie de las partículas de lipoproteína de alta densidad (HDL). Esferoides entonces transportan colesterol al hígado para la excreción y reutilización7,8,9.

Colesterol marcado con radio de tritio (3H) se ha utilizado tradicionalmente, en el eflujo de colesterol10. La señal de emisión de radioisótopos es altamente sensible10; sin embargo, colesterol marcado con radio presenta desventajas obvias como protocolos largos, el riesgo de exposición a la radiación ionizante y la necesidad de radiactividad especial instalaciones y equipos para manejo de emisiones radiactivas. Por el contrario, la fluorescencia se ha incorporado con éxito en las técnicas de diagnóstico debido a su simplicidad en la detección de la señal fluorescente, la gran variedad de fluoróforos disponibles y su seguridad11. Varios esteroles fluorescentes etiquetados han sido utilizados para estudiar el metabolismo del colesterol como dehydroergosterol (con fluorescencia intrínseca), colesterol de Dansilo, 4,4-difluoro-3a, 4adiaza-s-indacene (BODIPY) - colesterol y 22-(N-(7- Nitrobenz-2-OXA-1,3-diazol-4-yl)amino)-23,24-Bisnor-5-cholen-3β-ol (NBD-colesterol). Particularmente, NBD-colesterol presenta una absorción eficaz en células humanas12. Están disponibles dos diferentes NBD etiquetados-colesterol: 22-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-23,24-bisnor-5-cholen-3b-ol (22-NBD) y 25-(N-[(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)-methyl]amino)-27-norcholesterol (25-NBD; Figura 1). Colesterol con parte de la 22-NBD puede satisfacer mejor estudios de eflujo de colesterol, mientras que 25 NBD de colesterol se utiliza principalmente en la membrana celular dinámica investigación13,14.

Líneas celulares típicamente utilizadas en los análisis de eflujo de colesterol in vitro son monocitos-como las células como las células THP-1 humanas derivada de la leucemia murino de células Raw 264.715y J774.1. Todas estas células pueden diferenciarse en macrófagos en vitro con forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) y macrófagos THP-1 derivados (dmTHP-1) mejor reflejan y mímico los macrófagos humanos16.

En el presente estudio, optimizar y estandarizar un método fluorescente de alto rendimiento para determinar la capacidad de eflujo de colesterol de las muestras de suero de dmTHP-1, con 22-NBD-colesterol como alternativa a [3H]-colesterol. Además, comparamos la técnica fluorescente optimizada con el estándar análogo radioactivo.

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Protocol

Para este estudio, se obtuvieron aprobación del Comité de ética (Comitè Ètic de Investigación Clínica, Hospital Clinic, Barcelona; número de homologación de HCB/2014/0756) y consentimiento escrito informado de todos los temas.

1. al siguiente día laborable-colesterol preparación

  1. Disolver la NBD-el colesterol (MW 494.63; véase Tabla de materiales) de etanol puro para obtener el caldo (2 mM). Para un vial de 10 mg, disolver el contenido del frasco entero en un volumen de 10,1 mL de etanol para obtener un stock de 2 mM.
  2. Diluir el colesterol durante toda la semana de la acción en RPMI 1640 suplementado con 10% fetal bovina sérica y 5% penicilina/estreptomicina (R10 medio) para alcanzar una concentración final de 5 μM (e.g., obtener 10 mL de colesterol durante toda la semana en concentración final de 5 μM) por diluir 25 μL del stock de NBD-colesterol (2 mM) en medio de R10. Este volumen es suficiente para una placa de 96 pocillos.

2. célula de cultivo y siembra (día 2)

  1. Células THP-1 en cultivo en medio de R10 a 37 ° C, 5% CO2. Ajuste a 0,3 x 106 células/mL cada 3 días.
  2. Semilla de las células en un plato blanco de 96 pocillos con fondo plano, claro en 0.2 x 106 células/pozo en medio de la R10 (100 μL por pozo).
  3. Tratar las células con 100 nM forbol 12-miristato 13-acetato (PMA, de un stock de 10 μM) por 48-72 h, incubando a 37 ° C, 5% CO2 para diferenciar THP-1 células en dmTHP-1.
    Nota: Se recomienda utilizar 5 μL del stock PMA (10 μM) en 500 μL de medio de R10. Antes de esto, preparar un μM 10 valores PMA al disolver un vial de liofilizado 1 g en 10 mL de dimetilsulfóxido (DMSO), alícuota y stock a-20 ° C.
  4. Alternativamente (sugerencia) combinan pasos 2.2 y 2.3 para la mejor homogeneización. Preparar 10 mL de células THP-1 en un tubo de 15 mL, añadir 200 μL de caldo PMA (10 μM), mezcle suavemente e inmediatamente sembrar 100 μL por pocillo en la placa. Incube las células como se describe en el paso 2.3.

3. Apolipoproteína B agotado suero (masturbo) PREPARACION (el dia 2 o 3)

  1. Para preparar una solución de polietilenglicol (PEG), diluir glicina en PBS 10% (con estéril H2O) a una concentración de 200 mM a pH 7.4. Añadir 40 mL de glicina de 200 mM a 10 g de PEG 8000 para obtener PEG 20% (p/v). La solución vigorosamente para homogeneizar la mezcla.
  2. Aplicar 4 piezas 20% de PEG por 10 partes de suero o plasma en cada muestra de suero o plasma en un tubo de 1,5 mL y deja la mezcla en hielo para 25 min17 (por ejemplo, para 100 μL del plasma o suero, agregar 40 μL de 20% PEG solución).
  3. Centrifugue el precipitado PEG-Apolipoproteína B a 13.000 x g durante 15 min a 4 ° C.
  4. Descartar el precipitado. Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo.
    Nota: Sugerimos preparar la masturbo el día 3 (fresco). Si no es posible, prepare la masturbo el día 2 y guardar a 4 ° C durante la noche.

4. al siguiente día laborable-colesterol celular carga (día 2)

  1. Descartar el medio de cultivo de la dmTHP-1 y lavan las células dos veces con 1 x solución salina tamponada con fosfato (PBS).
  2. Carga las células con 5 μM NBD-colesterol (100 μL por pozo) en medio de R10 e incubar durante una noche a 37 ° C, 5% CO2.

5. incubación con aceptores de colesterol (día 3)

  1. Descartar el medio y lavan las células dos veces con PBS.
  2. Incubar las células con 2 – 5% masturbo o la concentración deseada de aceptador purificada de lípidos (HDL, ApoA, ApoE, etc.) diluido en Medio RPMI 1640 incoloro (100 μL por pozo) para 4 – 6 h a 37 ° C.
    Nota: Incluir un control negativo (C-) de incoloro Medio RPMI 1640 sin aceptadores y un control positivo (C +) (por ejemplo, masturbo desde un pool de donantes sanos) o esferoides purificadas. Nota que el control positivo aplica especialmente cuando las muestras del paciente (condiciones de enfermedad) son analizadas (figura 1 complementaria).
  3. Preparar un stock de 200 mL de la solución de lisis celular 1 (tampón de Tris 50 mM, 150 mM NaCl, H2O). La mezcla la proporción de solución 1 a 1:1 (v: v) de lisis celular con etanol puro para obtener la solución de lisis 2.

6. captura de señal fluorescente (día 3)

  1. Detección de colesterol durante toda la semana de los medios de comunicación
    1. Retire el medio celular de las placas y recoger en una nueva placa de 96 pocillos blanca con un fondo plano opaco.
    2. Para una detección de señal óptima de la fluorescencia en las muestras de los medios de comunicación, añada 100 μL de etanol puro en 100 μL de cada muestra media para obtener una proporción de 1:1 en la placa de 96 pocillos blanca.
    3. Mantenga la placa con los medios de comunicación tratada a otra medida de la intensidad de fluorescencia (FI) en una longitud de onda de 463⁄536 nm (excitación/emisión) en el luminómetro.
  2. Detección de NBD-colesterol intracelular
    1. Lavan las células dos veces con PBS.
    2. Para obtener el colesterol intracelular, lyse las células por incubación con 100 μL de solución de lisis 2 por pozo y agitar la placa a temperatura ambiente (RT) durante 25 minutos.
    3. Para la captura de una detección de señal óptima de la fluorescencia en las muestras de lisado de células, la intensidad de fluorescencia de los lysates de la célula en el mismo blanco placa de 96 pocillos con fondo claro plano (el mismo plato en el que las células fueron sembradas en el paso 2.2).
  3. 6.3 medir la intensidad de fluorescencia (FI) en el luminómetro y ajuste el parámetro de sensibilidad a 50 en el software (véase Tabla de materiales).

7. Análisis de resultados

  1. Expresar la tasa de colesterol de la emanación de una muestra como porcentaje calculado por la fórmula:
    Equation
  2. Obtener la medida final del eflujo de colesterol (CE) restando el CE del control negativo (ejemplo cargado con NBD-colesterol pero incubados con Medio RPMI 1640 descolorido sin aceptores de colesterol) de la CE de un dado muestras:
    Equation 2

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Representative Results

El objetivo del ensayo de eflujo de colesterol es determinar en vitro la capacidad de eflujo de colesterol de un determinado suero, plasma o sobrenadante que contiene las partículas de HDL. El método consiste en cargar colesterol etiquetados en una cultura de una línea celular de macrófagos estándar e induciendo el contacto con la muestra de prueba diluida en los medios de comunicación libres de FBS con las células. Por último, los niveles fluorescentes de la NBD se miden en los medios y lisado de célula. Para optimizar las mediciones, el colesterol del effluxed de las células a los medios de comunicación se mezcla con un volumen de solvente que contiene etanol. El NBD-colesterol en las células se resuspendió en un disolvente que contenga etanol o detergente antes de las mediciones. Por último, se determina la proporción de colesterol marcado con effluxed total. Para establecer la técnica, se utilizó el apolipoprotein B-agotado suero (masturbo) de un pool de donantes sanos.

Se investigaron las mejores condiciones de dilución para el NBD-colesterol en medio y etanol. Hemos probado el comportamiento fluorescente de NBD-colesterol libre en varios ambientes solventes, incluyendo diferentes proporciones de etanol y descolorido RPMI 1640. La intensidad de fluorescencia (FI) de NBD-colesterol diluido en la solución acuosa mostraron los menores valores FI, mientras NBD-colesterol en etanol puro emite la máxima FI. Esto sugiere que la emisión de fluorescencia de la molécula de colesterol-NBD-22 es altamente dependiente en el medio que lo contiene. Por consiguiente, la señal de fluorescencia del 22-NBD-colesterol es significativamente mayor cuando se coloca en un etanol que contiene los medios de comunicación. Observamos que en una proporción de 1:1 los medios de comunicación: etanol, la señal de intensidad de la fluorescencia aumenta proporcionalmente con la concentración del colesterol analógica en el rango de 0.5-50 μM, lo que sugiere un comportamiento adecuado de la sonda en este caso (figura 2 ). El comportamiento lineal en la condición 1:1 (media: etanol) se representa por la siguiente ecuación: y = 20.88 x + 146.7 con R2 = 0.9341.

Un paso clave en este método es el tiempo de incubación las células cargadas con aceptores de colesterol el colesterol es capaz de emanación. Para determinar el tiempo de incubación necesario, los medios de comunicación celular se cosechan en diferentes puntos de tiempo (1 a 24 h; Figura 3). El eflujo de colesterol en el rango de 0 a 6 h evolucionado linealmente (p < 0.0001; y = 18.2 x + 127.3) de una manera dependiente del tiempo. La máxima señal captada fue a las 6 h después de masturbo fue agregado a las células. Después de 6 h, el colesterol perdido regularidad en la emanación, variabilidad aumentó después de 6 h de incubación con la masturbo (figura 3).

Además probamos el umbral de saturación y gama dinámica aplicada a masturbo humana mediante la medición de CE en diferentes porcentajes de HDL que contiene los medios de comunicación (masturbo). El eflujo de NBD-colesterol en el ensayo de alto rendimiento (placa de 96 pocillos) evolucionado linealmente dentro de masturbo de 1 a 7%, donde FI aumentó de una manera dependiente de la concentración con la masturbo, alcanzando el pico de la capacidad de eflujo de colesterol a masturbo 7% (figura 4). A concentraciones superiores al 7%, FI disminuyó en una relación inversa con el porcentaje de masturbo. Esto puede haber ocurrido porque el colesterol fue regresar a cargado de las células de la NBD-colesterol HDL presente en los medios de comunicación.

El método estándar para medir eflujo de colesterol utiliza de colesterol marcado con radio (de3H)16. Para evaluar el funcionamiento de nuestro método basado en la fluorescencia, se realizó y en comparación con técnicas fluorescentes y radio marca. Encontramos que la técnica tradicional de la radiactividad y nuestro método de NBD-colesterol fueron altamente correlacionados (r de Pearson = 0.97; p < 0.001) con diferentes concentraciones de masturbo (1 – 8%; Figura 5). En general, esto sugiere que nuestro método fluorescente puede ser un sustituto más seguro que la técnica radioactiva.

Finalmente, hemos comparado nuestro método sonda fluorescente diferente de NBD. Comparamos nuestro método a un kit de ensayo basado en células de alto rendimiento comercial tuvo como objetivo determinar el eflujo de colesterol en las células (kit de ensayo de eflujo de colesterol, celular). El método desarrollado en nuestro grupo fue sensible a un aumento de concentración del aceptador (% masturbo) dentro de valores de CE entre 5 y 15%. Sin embargo, el kit comercial, realizado siguiendo las instrucciones del fabricante, dio lugar a medidas de CE por debajo de 5% a lo largo de la gama de masturbo analizadas; así, la CE resultante era esencialmente inafectada cuando masturbo fue aumentado (figura 6).

Figure 1
Figura 1: estructuras moleculares de colesterol natural (A) 22-NBD-colesterol (B) y 25-NBD-colesterol (C). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: intensidad de la fluorescencia de la NBD-colesterol (FI) con diferentes proporciones de etanol y descolorido Medio RPMI 1640. NBD-colesterol se diluyó 1:0, 3:1, 1:1, 1:3 y 0:1 etanol: proporciones medio acuosas a concentraciones de NBD-colesterol entre 0,5 y 50 μm. FI la señal fue detectada por el luminómetro con el parámetro de sensibilidad establecido a 70 en el software de Fluorímetro. La señal FI de los medios y el lisado celular se midió con blanco placas de 96 pocillos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: emanación de tiempo progresión NBD-colesterol en macrófagos THP-1 derivados. DmTHP-1 fueron cargados con 5 μm NBD-colesterol y se incubaron con masturbo de 5%. Los medios de comunicación celular se midieron en una placa de 96 pocillos blanca en diferentes puntos de tiempo (1 – 24 h). Los valores se presentan como la media ± desviación estándar de los pozos cuatriplicados. FI de la señal fue detectada por el luminómetro con el parámetro de sensibilidad establecido a 70 en el software de Fluorímetro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: eflujo de NBD-colesterol en macrófagos THP-1 derivadas en placa de 96 pocillos con diferentes concentraciones de masturbo. Las células de dmTHP-1 fueron tratadas con 5 μm NBD-colesterol, se incubaron con diferentes porcentajes de masturbo y lisis con etanol. La señal FI de los medios y el lisado celular se midió utilizando una placa de 96 pocillos blanca en el Fluorímetro 1:1 (solución de etanol: lisis 1). Las medidas de controles negativos (masturbo sin tratar los medios de comunicación) se restan en los planos proporcionados. Los valores se presentan como la media ± desviación estándar de los pozos por triplicado. FI de la señal fue detectada por el luminómetro con el parámetro de sensibilidad establecido en 50 en el software de Fluorímetro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Correlación de NBD-colesterol y [3H]-eflujo de colesterol en macrófagos THP-1 derivados. DmTHP-1 siguientes con el correspondiente etiquetado colesterol durante 6 h. El eflujo de colesterol se midió usando masturbo de 1 a 8%. Para las muestras de colesterol durante toda la semana, la señal fluorescente fue detectada usando blanco placas de 96 pocillos en el Fluorímetro en solución de etanol: lisis de 1:1 1. FI de la señal fue detectada por el luminómetro con el parámetro de sensibilidad establecido en 50 en el software de Fluorímetro. Para [3H]-muestras de colesterol, la señal radiactiva fue detectada usando 100 μl de medio y celular lisada mezclado con el centelleo cóctel y rojo en el contador de centelleo, siguiendo el protocolo descrito por baja et al.17. Eficiencia de correlación se determinó mediante el coeficiente de correlación r de Pearson. Las medidas de controles negativos (masturbo sin tratar los medios de comunicación) se restan de niveles radiactivos siempre y fluorescencia. Los valores se presentan como la media ± desviación estándar de los pozos por triplicado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: comparación entre el ensayo de eflujo de NBD-colesterol alto rendimiento y un kit comercializado ensayo fluorescente celular. Eflujo de colesterol desde masturbo se evaluó siguiendo el protocolo descrito, utilizando como lisis solvente etanol (50%) o Tween 80 (1%). El kit de ensayo fluorescente basadas en celdas se evaluó según protocolo del fabricante del kit. Los valores se presentan como la media ± desviación estándar de los pozos por triplicado. FI de la señal fue detectada por el luminómetro con el parámetro de sensibilidad establecido en 50 en el software de Fluorímetro haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: Diagrama de flujo de trabajo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Supplementary Figure 1
Figura 1 complementaria: eflujo de NBD-colesterol de muestras de suero de pacientes infectados por el VIH y un estándar de control positivo (C +). Se muestra la variación interindividual del método de eflujo de NBD-colesterol aplicado a un conjunto de pacientes VIH-infectados. Un control interno positivo (C +) representa el eflujo de NBD-colesterol de un pool de muestras de sueros de pacientes sanos 8. Barras de error indican la desviación estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Etiqueta fluorescente el colesterol es una estrategia prometedora para analizar e investigar las propiedades y el metabolismo del colesterol natural in vitro. Sus principales ventajas son que puede ser tomada por las células, permite la intracelular y los estudios de distribución de la membrana y puede ser aplicado a ensayos de eflujo de colesterol como este protocolo (figura 7). Algunos esteroles etiquetados fluorescentes permiten seguimiento de colesterol in vitro incluyendo BODIPY-colesterol, colesterol de Dansilo, dehydroegrosterol y 22 - 25-NBD-colesterol y12. Particularmente, 22-NBD-colesterol es apropiado para el estudio de dinámica de colesterol con diferentes tipos de células y es un sustituto del colesterol marcado con radio18. No existe ningún método de consenso para evaluar la señal fluorescente en un ensayo de eflujo de colesterol. Canción et al.14 cosecha lysates de la célula y el medio para medir FI por separado; Liu et al.14 transferir el medio a otras placas, y la señal fluorescente intracelular se midió directamente en la placa de cultivo; y Zhang et al.15 utiliza un tampón de lisis para lyse las células, seguidas de purificación del colesterol fluorescente para diluir en etanol puro y detectar la fluorescencia intensidad señal19. En nuestro ensayo de eflujo de colesterol, el uso de la misma composición solvente final en medios de comunicación y de las células permitidas la homogeneización de los medios de comunicación de la célula y las mediciones de lisado eficientemente.

El presente estudio perfila el eflujo de NBD-colesterol con el tiempo y encontrar una progresión de tiempo hasta las 6 h de incubación con el aceptador de la masturbo, similar a Song et al.14 y Liu et al.14 y a diferencia de Zhang et al. que utiliza un período de incubación de 1 h con los lípidos aceptadores19. Encontramos que después de 6 h de incubación, el colesterol effluxed perdido linealidad; por lo tanto, es de suma importancia no debe exceder 6 horas. Nuestra gama óptima de eflujo de colesterol fue entre 3 a 6 h después de agregar los usuarios. Sugerimos incubando células durante 4 h con los aceptores de colesterol. Pasos críticos adicionales son el uso de los medios incoloros aplicar los aceptadores para evitar fondo, siembra una capa de cultura celular parcialmente confluentes y garantizar una correcta adherencia de los a la placa. Cabe señalar que el fondo claro de la placa blanca es útil seguir las células bajo un microscopio de luz inversa.

Más ensayos de eflujo de colesterol se llevan a cabo utilizando aceptadores de lípidos purificados en el ensayo de eflujo de colesterol. La presente técnica se desarrolló para obtener la capacidad de eflujo del colesterol de suero humano o plasma. Usamos el aceptores de colesterol intrínsecos presentes en el suero, pero es fundamental para eliminar las partículas que contienen Apolipoproteína B, que se recirculan las moléculas de colesterol dentro de las células20,21. Como modificaciones, purificada ApoAI y HDL también pueden ser utilizado como aceptadores. También, las líneas celulares que no sea humana THP-1 han utilizado con éxito en ensayos de eflujo de colesterol fluorescente, como macrófagos Raw 264.7 o J774A1 y así sería posible trabajo en nuestro método15,22.

Las principales limitaciones de este método es que de resultados depende de la línea celular específica, una línea celular estándar pero sin células sería ventajoso para utilizarlo como un biomarcador. Además, los sueros utilizados para estandarizar este método estaba congelado; la molécula de NBD en colesterol es menos fisiológica que el marcado con radio y su absorción difiere el colesterol endógeno; y probamos el resultado final de un conjunto de procesos (es decir, que partículas de suero, , una línea celular, posible esterificación del colesterol, difusión posible de colesterol o de procesos simultáneos de emanación y afluencia). Sin embargo, como ventaja, las técnicas basadas en fluorescencia han demostrado tener alto potencial como sustitutos de los tradicionales técnicas de marcado con radio y en la sustitución de [3H]-colesterol, por una molécula fluorescente-labelled para monitorear eflujo de colesterol ensayos de14.

Eflujo de colesterol puede actuar como marcador de aterosclerosis23, porque correlaciona con eventos cardiovasculares futuros24,25. La posibilidad de estudiar el papel de los macrófagos en la aterosclerosis es a través de esferoides purificadas y su composición; sin embargo, esferoides purificación es un proceso arduo y lento. Además, durante la purificación, otros componentes de suero con efecto aterogénico pueden ser subestimados o perdidos. Por esa razón, masturbo fue elegido como el aceptador del lípido. La escala de alto rendimiento y la reducción del tiempo hicieron posible sustituir el contador de centelleo para un lector de placas, medición de la señal fluorescente en la misma placa de cultivo (en el caso de la célula lisada) y reduciendo el protocolo de dos días. Además, esta técnica muestra mayor sensibilidad cuando las células se exponen a diferentes concentraciones de suero que las medidas obtenidas de un kit comercializado para evaluar el eflujo de colesterol.

En conclusión, se ha descrito un ensayo de eflujo de NBD-colesterol que se correlaciona con el tradicional método radiactivo. Determinamos el momento óptimo para incubar aceptadores del lípido de muestras humanas (suero o plasma) en la forma de masturbo. Hemos optimizado la siembra celular, diferenciación, rango dinámico y punto de saturación de la técnica. En cuanto a su principal novedad, hemos optimizado una combinación de solventes utilizada en las mediciones para la obtención de altas intensidades y una mejorada gama lineal.

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Disclosures

Los autores desean declarar que ellos son inventores de la patente (18382337.6-1118, EPO; 17 de mayo de 2018) titulado "Método para determinar el eflujo de colesterol" basado en este método.

Acknowledgments

Este trabajo ha sido parcialmente financiado por FIS (PS12/00866) las becas de la investigación del Instituto de Salud Carlos III, Madrid, España; El de Fondo Europeo para Desarrollo Regional (FEDER); Red de Investigación en SIDA (RIS), ISCIII-RETIC (RD16/0025/0002) y el programa de CERCA / Generalitat de Catalunya. Los autores agradecen la Retrovirología y Viral laboratorio de Inmunopatología del Institut d ' Investigacions Biomèdiques de agosto Pi I Sunyer (IDIBAPS). Agradecemos a T. Escribà, C. Rovira y C. Hurtado por su asistencia y Cufí S. desde el conocimiento y la oficina de transferencia de tecnología para su orientación en la protección de la invención.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well collecting plate Corning Inc Costar 3912 white 96-well plate with opaque clear bottom
96-well culture plate Corning Inc Costar 3610 white 96-well plate with flat clear bottom
Cholesterol Efflux Assay Kit (Cell-based) Abcam ab196985 commercial high-throughput cell-based assay kit aimed to determine the cholesterol efflux
colorless RPMI 1640 Sigma-Aldrich R7509 RPMI 1640 with no pehnol-red
Gen5 Data Analysis Software BioTek Version 2.0
Glycine Sigma-Aldrich G8790-100G Glycine, non-animal use
Luminometer Biotek SYNERGY HT Multi-Detection Microplate Reader
Lysis Solution 1 in-house 50 mM Tris Buffer, 150 mM NaCl and H2O
Lysis Solution 2 in-house Pure ethanol and Cell Lysis Solution 1:1 (v:v)
NBD-cholesterol Thermo-Fisher N1148 22-(N-(7-Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)Amino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3β-Ol
PBS Sigma-Aldrich P3813 Phosphate-buffered saline
PEG 8000 Sigma-Aldrich 202452-250G polyethylene glycol
PMA Sigma-Aldrich 79346 Phorbol 12-merystate B-acetate.
R10 in-house RPMI 1640 supplemented with 10% fetal bovine serum and 5% Penicillin/Streptomycin.
RPMI 1640 Sigma-Aldrich R8758 RPMI 1640 with 2 mM L-glutamine containing 1.5 g/L sodium bicarbonate and 4.5 g/L glucose
THP-1 cells Sigma-Aldrich ATCC, #TIB-202 monocyte-like line derived from leukemia from a one year old baby
Tween 80 Sigma-Aldrich P1754

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. The top 10 causes of death. , Available from: http://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/the-top-10-causes-of-death (2018).
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Medicina número 143 NBD-colesterol macrófagos HDL eflujo de colesterol fluorescencia apolipoprotein B-agotado suero ateroesclerosis transporte reverso de colesterol
Ensayo de eflujo de colesterol marcado con Nitrobenzoxadiazole de alto rendimiento
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Pastor-Ibáñez, R., Arnedo, … More

Pastor-Ibáñez, R., Arnedo, M., Tort, O. High-throughput Nitrobenzoxadiazole-labeled Cholesterol Efflux Assay. J. Vis. Exp. (143), e58891, doi:10.3791/58891 (2019).

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