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Medicine

Ensaio de efluxo de colesterol Nitrobenzoxadiazole-etiquetadas do elevado-throughput

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58891
Automatic Translation
1, 1, 1
1Group of Genomics and Pharmacogenomics in HIV, Laboratory of Retrovirology and Viral Immunopathogenesis, IDIBAPS, Hospital Clínic de Barcelona

Summary

Medição da capacidade de efluxo de colesterol in vitro de soro ou plasma em modelos de celular de macrófagos é uma ferramenta promissora como um biomarcador para a aterosclerose. No presente estudo, podemos otimizar e padronizar um método de efluxo de colesterol NBD fluorescente e desenvolver uma análise do elevado-throughput usando placas de 96 poços.

Abstract

Aterosclerose leva a doenças cardiovasculares (DCV). Ainda não está claro se a concentração de colesterol-HDL (cHDL) desempenha um papel causal no desenvolvimento de aterosclerose. No entanto, um fator importante nas fases iniciais da formação da placa de ateroma é a capacidade de efluxo de colesterol HDL (a capacidade de partículas de HDL de colesterol de macrófagos de aceitar) para evitar a formação de células de espuma. Este é um passo chave para evitar o acúmulo de colesterol no endotélio e uma parte do transporte reverso de colesterol (RCT) para eliminar o colesterol através do fígado. Capacidade de efluxo de colesterol de soro ou plasma em modelos de celular macrófago é uma ferramenta promissora que pode ser usada como um biomarcador para a aterosclerose. Tradicionalmente, [3H]-colesterol tem sido usado em ensaios de efluxo de colesterol. Neste estudo, pretendemos desenvolver uma estratégia mais segura e mais rápida usando fluorescente rotulados-colesterol (colesterol-NBD) em um ensaio de celular para rastrear o processo de absorção e efluxo de colesterol em macrófagos THP-1-derivado. Finalmente, podemos otimizar e padronizar o método de efluxo de colesterol NBD e desenvolver uma análise do elevado-throughput usando placas de 96 poços.

Introduction

De acordo com a Organização Mundial de saúde, principais causas de morte no mundo atuais são doenças isquêmicas do coração e acidente vascular cerebral (contabilizando um total de 15,2 milhões de mortes)1. Ambas são doenças cardiovasculares (DCV) que podem ser precedidas por aterosclerose e a ruptura de placas de ateroma nos vasos sanguíneos2,3.

A aterosclerose é uma doença inflamatória vaso parede em que as células T, macrófagos, mastócitos e células dendríticas infiltrar o endotélio em acumulam de sangue, eventualmente formando placas ateroscleróticas. Ateroma apresenta um lipido cristais de colesterol e núcleo, evidenciados por medições de ultra-sonografia de alta resolução B-modo da carótida íntima mídia espessura4,5. Em macrófagos, efluxo de colesterol para partículas de lipídios aceitador é realizado por meio de receptores ATP-binding cassette (ABC) ABCA1, membro do ATP subfamília G 1 (ABCG1) e o receptor ao tesouro SR-BI. O desequilíbrio do colesterol influxo e efluxo em macrófagos é considerado um processo chave na aterosclerose iniciação6. Efluxo de colesterol é considerado um passo fundamental na eliminação de colesterol dos tecidos periféricos para o plasma e fígado em um processo chamado transporte reverso de colesterol (RCT). Colesterol é transferida de macrófagos principalmente para Apolipoproteína A1 (ApoA1) encontrados na superfície das partículas de lipoproteína de alta densidade (HDL). HDLs então transportam de colesterol para o fígado para excreção e reutilização de8,7,9.

Tradicionalmente, o colesterol de rádio-rotulados de trítio (3H) tem sido usado no efluxo de colesterol10. O sinal de emissão de radioisótopos é altamente sensível,10; no entanto, colesterol marcado apresenta limitações óbvias, tais como protocolos longos, risco de exposição a radiações ionizantes e a necessidade especial de radioactividade instalações e equipamentos garantir a manipulação segura de emissão radioactiva. Pelo contrário, fluorescência tenha sido incorporada com sucesso em técnicas de diagnóstico, devido à sua simplicidade na detecção do sinal fluorescente, a grande variedade de fluorophores disponível e sua segurança11. Vários esteróis com rótulo fluorescentes têm sido usados para estudar o metabolismo do colesterol incluindo dehydroergosterol (com fluorescência intrínseca), dansyl colesterol, 4,4-diflúor-3a, 4adiaza-s-indacene (BODIPY) - colesterol e 22-(N-(7- Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-YL)amino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3β-ol (NBD-colesterol). Particularmente, NBD-colesterol apresenta uma absorção eficiente em células humanas12. Dois diferentes NBD rotulados-colesterol estão atualmente disponíveis: 22-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-23,24-bisnor-5-cholen-3b-ol (22-NBD) e 25-(N-[(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)-methyl]amino)-27-norcholesterol (25-NBD; A Figura 1). Colesterol rotulado com moiety 22-NBD pode melhor se adequar estudos de efluxo de colesterol, enquanto 25-NBD-colesterol é usado principalmente na membrana celular dinâmica pesquisa13,14.

Linhas de células normalmente utilizadas em ensaios de efluxo de colesterol in vitro são monócitos células como as células THP-1 derivado de leucemia humanas, murino Raw 264.7 células15ou J774.1. Todas essas células podem ser diferenciadas em macrófagos em vitro usando phorbol myristate 12 13-acetato (PMA), mas THP 1-derivado de macrófagos (dmTHP-1) melhores refletem e imitam os macrófagos humanos16.

No presente estudo, podemos otimizar e padronizar um método de alta produtividade fluorescente para determinar a capacidade de efluxo do colesterol das amostras de soro na dmTHP-1, usando 22-NBD-colesterol como uma alternativa para [3H]-colesterol. Além disso, comparamos a técnica fluorescente otimizada com o padrão analógico radioativo.

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Protocol

Para este estudo, obtiveram aprovação do Comité de ética (Comitè Ètic d'Investigació Clínica, Hospital Clinic, Barcelona; número de aprovação HCB/2014/0756) e o consentimento informado por escrito, de todas as disciplinas.

1. preparação NBD-colesterol

  1. Dissolva o NBD-colesterol (494.63 MW; ver Tabela de materiais) em etanol puro para obter o estoque (2 mM). Para um frasco de 10 mg, dissolva o conteúdo do frasco inteiro em um volume de 10,1 mL de etanol para obter um estoque de 2 mM.
  2. Diluir o NBD-colesterol do estoque em RPMI 1640 suplementado com 10% fetal bovino soro e 5% penicilina/estreptomicina (R10 médio) para atingir uma concentração final de 5 μM (por exemplo,, obter 10 mL de NBD-colesterol na concentração final de 5 μM) por diluir 25 μL de estoque NBD-colesterol (2 mM) no meio de R10. Este volume é suficiente para uma placa de 96 poços.

2. celular cultura e semeadura (dia-2)

  1. Células de cultura THP-1 no meio de R10 a 37 ° C, 5% de CO2. Ajuste a 0.3 x 106 células/mL em 3 dias.
  2. Sementes das células em uma placa de 96 poços branca com um fundo liso, claro a 0,2 x 106 células/bem no meio de R10 (100 μL por poço).
  3. Tratar as células com 100 nM phorbol myristate 12 13-acetato (PMA; de um estoque de 10 μM) para 48-72 h, incubar a 37 ° C, 5% de CO2 para diferenciar THP-1 pilhas para dmTHP-1.
    Nota: Recomenda-se usar 5 μL de estoque PMA (10 μM) em 500 µ l de meio de R10. Antes disso, preparar um 10 μM estoque PMA dissolvendo-se um frasco de liofilizado 1G em 10 mL de Dimetilsulfóxido (DMSO), alíquota e estoque a-20 ° C.
  4. Como alternativa (sugestão) combinar etapas 2.2 e 2.3 para melhor homogeneização. Prepare-se 10 mL de células THP-1 em um tubo de 15 mL, adicionar 200 μL de estoque PMA (10 μM), misture delicadamente e imediatamente semente 100 μL por poço na chapa. Incube as células conforme descrito na etapa 2.3.

3. Apolipoprotein B empobrecido preparação de soro (sorte) (dia 2 ou 3)

  1. Para preparar uma solução de polietilenoglicol (PEG), diluir glicina em PBS 10% (com estéril H2O) a uma concentração de 200 mM em pH 7,4. Adicionar 40 mL de glicina de 200 mM a 10 g de 8000 PEG PEG de obter 20% (p/v). Misture a solução vigorosamente para homogeneizar.
  2. Aplicar 4 peças de 20% PEG por 10 partes de cada amostra de soro/plasma em um tubo de 1,5 mL de soro/plasma e deixe a mistura no gelo para 25 min17 (por exemplo, para 100 μL de plasma ou soro, adicionar 40 μL de 20% PEG solução).
  3. Centrifugar o precipitado de PEG-apolipoproteína B a 13.000 x g durante 15 min a 4 ° C.
  4. Descarte o precipitado. Transferi o sobrenadante para um tubo novo.
    Nota: Sugerimos preparar a sorte no dia 3 (fresco). Se não for possível, preparar a sorte no dia 2 e mantê-lo em 4 ° C durante a noite.

4. NBD-colesterol celular carregamento (dia 2)

  1. Descartar o meio de cultura da dmTHP-1 e lavar as células duas vezes com 1x tampão fosfato salino (PBS).
  2. Carregar as pilhas com 5 μM NBD-colesterol (100 μL por poço) no meio de R10 e incubar durante uma noite a 37 ° C, 5% de CO2.

5. incubação com colesterol aceitadores (dia 3)

  1. Descartar o meio e lavar as células duas vezes com PBS.
  2. Incube as celulas com sorte de 2 – 5% ou a concentração desejada de aceitador de lipídios purificado (HDL ApoA, ApoE, etc.) diluído em incolor meio RPMI 1640 (100 μL por poço) para 4-6 h a 37 ° C.
    Nota: Inclua um controle negativo (C-) consistindo de incolor meio RPMI 1640 sem aceitadores e um controlo positivo (C +) (por exemplo, a sorte de um pool de doadores saudáveis) ou HDLs purificadas. Nota que o controlo positivo aplica-se especialmente quando as amostras dos pacientes (condições de doença) são analisados (complementar a Figura 1).
  3. Prepare um estoque de 200 mL da solução de lise de célula 1 (tampão de Tris 50 mM, 150 mM de NaCl, H2O). Misture a proporção de 1 uma solução a 1:1 (v: v) lise celular com etanol puro para obter a solução de Lise 2.

6. captura de sinal fluorescente (dia 3)

  1. Deteção de mídia NBD-colesterol
    1. Retire o meio celular as chapas e recolhê-la em uma nova placa de 96 poços branca com um fundo plano opaco.
    2. Para uma detecção do sinal de fluorescência ideal nas amostras de mídia, adicione 100 μL de etanol puro a 100 μL de cada amostra média para obter uma proporção de 1:1 em placa de 96 poços branca.
    3. Manter a placa com os meios de comunicação tratados à medida adicional a intensidade de fluorescência (FI) em um comprimento de onda de 463⁄536 nm (excitação/emissão) no luminómetro.
  2. Deteção de NBD-colesterol intracelular
    1. Lave as células duas vezes com PBS.
    2. Para obter o colesterol intracelular, lisar as células incubando-os com 100 μL de solução de Lise 2 por bem e agitar a placa na temperatura de quarto (RT) para 25 min.
    3. Para uma detecção do sinal de fluorescência ideal nas amostras lisado celular, capturar a intensidade de fluorescência dos lisados celulares na mesma branco placa de 96 poços, com clara plana inferior (o mesmo prato em que as células foram semeadas no passo 2.2).
  3. 6.3 medir a intensidade de fluorescência (FI) no luminómetro enquanto ajusta o parâmetro de sensibilidade para 50 no software (consulte a Tabela de materiais).

7. resultados análise

  1. Expressa a taxa de efluxo de colesterol de uma amostra em percentagem calculada pela fórmula:
    Equation
  2. Obter a medida final do efluxo de colesterol (CE) subtraindo o CE do controlo negativo (amostra NBD-colesterol mas incubadas com incolor meio RPMI 1640, sem aceitadores de colesterol) do CE de um dado amostras:
    Equation 2

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Representative Results

O objectivo do ensaio de efluxo do colesterol é determinar em vitro, a capacidade de efluxo de colesterol de um determinado soro, plasma ou sobrenadante contendo partículas de HDL. O método consiste em carregar rotulados de colesterol em uma cultura de uma linhagem de células de macrófagos padrão e induzindo o contato com a amostra de ensaio diluída em media FBS-free com as células. Finalmente, os níveis fluorescentes do NBD são medidos na mídia e lisado celular. Para otimizar as medições, o effluxed de colesterol das células para mídia é misturado com um volume de solvente que contém etanol. O NBD-colesterol restante nas células é resuspended em um solvente contendo etanol ou detergente antes de medições. Finalmente, a relação de effluxed/total rotulados-colesterol é determinada. Para definir a técnica, utilizou-se a apolipoproteína B empobrecido soro (sorte) de um pool de doadores saudáveis.

As melhores condições de diluição para o NBD-colesterol em médio e etanol foram investigadas. Testamos o comportamento fluorescente de NBD-colesterol livre em diversos ambientes de solventes, incluindo diferentes rácios de etanol e incolor RPMI 1640. A intensidade de fluorescência (FI) de NBD-colesterol diluído em solução aquosa mostrou os menores valores FI, enquanto NBD-colesterol dentro de etanol puro emitida a FI mais alto. Isto sugere que a emissão de fluorescência da molécula de colesterol-NBD-22 é altamente dependente do meio no qual está contido. Por conseguinte, o sinal de fluorescência do 22-NBD-colesterol é significativamente maior quando colocado em um etanol contendo a mídia. Observamos que na proporção de 1:1 mídia: etanol, o sinal de intensidade de fluorescência aumenta proporcionalmente com a concentração do colesterol analógica na faixa de 0,5 a 50 μM, sugerindo um comportamento adequado da sonda neste caso (Figura 2 ). O comportamento linear na condição 1:1 (mídia: etanol) é representado pela equação a seguir: y = 20.88 x + 146.7 com R2 = 0.9341.

Um passo fundamental neste método é o tempo gasto incubando as células carregadas com aceitadores de colesterol, o colesterol é capaz de efluxo. A fim de determinar o tempo de incubação necessário, meios de comunicação celular foi colhido em momentos diferentes (1 a 24 h; A Figura 3). O efluxo de colesterol na faixa de 0 a 6 h evoluiu linearmente (p < 0,0001; y = 18,2 x + 127.3) em uma maneira dependente do tempo. O máximo sinal capturado foi a 6 h após sorte foi adicionado às células. Após 6 h, o colesterol perdi regularidade no efluxo, variabilidade aumentou após 6 h de incubação com a sorte (Figura 3).

Além disso testamos o limiar de saturação e gama dinâmica aplicada a sorte humana medindo CE em diferentes percentagens de mídia contendo HDL (sorte). O efluxo de colesterol NBD no ensaio de alto throughput (placa de 96 poços) evoluiu linearmente dentro de 1 a 7% de sorte, onde FI aumentou de forma concentração-dependente com a sorte, atingindo o pico da capacidade de efluxo de colesterol em 7% sorte (Figura 4). Em concentrações superiores a 7%, FI diminuiu em uma relação inversa com a percentagem de sorte. Isto pode ter ocorrido porque o colesterol estava reentrando carregado de células do NBD-colesterol HDL presente na mídia.

O método padrão para medir o efluxo de colesterol usa rádio-rotulado (3H) colesterol16. Para avaliar o desempenho do nosso método baseado em fluorescência, realizamos e comparado a técnicas fluorescentes e rádio-rotulados. Nós achamos que a técnica tradicional de radioactividade e nosso método de NBD-colesterol foram altamente correlacionados (r de Pearson = 0,97; p < 0,001) utilizando diferentes concentrações de sorte (1 – 8%; A Figura 5). Em geral, isto sugere que o nosso método fluorescente pode ser um substituto mais seguro do que a técnica radioativa.

Finalmente, comparamos o nosso método de sonda fluorescente diferente de NBD. Comparamos nosso método para um kit de ensaio comercial baseada em célula de alta produtividade, teve como objetivo determinar o efluxo de colesterol em células (kit de ensaio de efluxo de colesterol; baseados em células). O método desenvolvido no nosso grupo foi sensível a um aumento da concentração do aceptor (% sorte) dentro dos valores de CE entre 5 e 15%. No entanto, o kit comercial, realizado seguindo as instruções do fabricante, resultou em CE medidas inferiores a 5% ao longo do intervalo de sorte analisada; assim, o CE resultante foi essencialmente afetada quando sorte foi aumentada (Figura 6).

Figure 1
Figura 1: estruturas moleculares de colesterol natural (A) 22-NBD-colesterol (B) e (C) 25-NBD-colesterol. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: intensidade de fluorescência NBD-colesterol (FI) com diferentes proporções de etanol e incolor meio RPMI 1640. NBD-colesterol foi diluído em 0, 3:1, 1:1, 1:3 e 1:0:1 etanol: rácios médios aquosos em concentrações NBD-colesterol entre 0,5 e 50 µM. FI sinal foi detectado pelo luminómetro com o parâmetro de sensibilidade fixado em 70 no software fluorímetro. O sinal FI de mídia e o lisado celular foi medido usando brancas placas de 96 poços. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: efluxo de colesterol-NBD-aumentou em macrófagos THP-1-derivada. O dmTHP-1 foram carregados com 5 µM NBD-colesterol e incubadas com 5% de sorte. Célula de mídia foram medidas em uma placa de 96 poços branca em momentos diferentes (1 – 24 h). Os valores são apresentados como o média ± desvio-padrão de poços de quadruplicate. Sinal FI foi detectada pelo luminómetro com o parâmetro de sensibilidade fixado em 70 no software fluorímetro. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: efluxo NBD-colesterol em macrófagos THP-1-derivado em placa de 96 poços, com diferentes concentrações de sorte. As células de dmTHP-1 foram tratadas com 5 µM NBD-colesterol, incubadas com diferentes percentagens de sorte e lysed com etanol. O sinal FI de mídia e o lisado celular foi medido usando uma placa de 96 poços branca no fluorímetro em 1:1 (solução de etanol: lise 1). As medidas de controles negativos (sorte de mídia não tratada) foram subtraídas aos níveis fornecidos. Os valores são apresentados como o média ± desvio-padrão de três vias poços. Sinal FI foi detectada pelo luminómetro com o parâmetro de sensibilidade definido em 50 no software fluorímetro. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Correlação de NBD-colesterol e [3H]-efluxo de colesterol em macrófagos THP-1-derivada. DmTHP-1, com o correspondente rotulados-colesterol para 6 h a seguir. O efluxo de colesterol foi medido usando 1-8% de sorte. Para amostras de NBD-colesterol, o sinal fluorescente foi detectado usando placas de 96 poços brancas no fluorímetro em solução de 1:1 etanol: lise 1. Sinal FI foi detectada pelo luminómetro com o parâmetro de sensibilidade definido em 50 no software fluorímetro. Para [3H]-amostras de colesterol, o sinal radioativo foi detectado usando 100 µ l do meio e da pilha lisado misturado com a cintilação cocktail e vermelha no contador de cintilação, seguindo o protocolo descrito por baixo et al.17. Eficiência de correlação foi determinada utilizando o coeficiente de correlação de Pearson r. As medidas de controles negativos (sorte de mídia não tratada) foram subtraídas da fluorescência e níveis radioativos fornecidos. Os valores são apresentados como o média ± desvio-padrão de três vias poços. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: comparação entre o ensaio de efluxo de NBD-colesterol elevado-throughput e um kit comercializado fluorescente ensaio baseada em célula. Efluxo de colesterol de sorte foi avaliado seguindo o protocolo descrito, usando como lise solvente etanol (50%) ou Tween 80 (1%). O kit de ensaio baseada em célula fluorescente foi avaliado de acordo com o protocolo do fabricante do kit. Os valores são apresentados como o média ± desvio-padrão de três vias poços. Sinal FI foi detectada pelo luminómetro com o parâmetro de sensibilidade definido em 50 no fluorímetro software clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7: diagrama de fluxo de trabalho. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Supplementary Figure 1
Complementar Figura 1: efluxo de colesterol NBD de amostras de soro de pacientes infectados pelo HIV e um padrão de controle positivo (C +). É mostrada a variação inter-individual do método efluxo NBD-colesterol aplicado a um conjunto de pacientes infectados pelo HIV. Um controle interno positivo (C +) representa o efluxo de colesterol NBD de um pool de amostras de soros de 8 pacientes saudáveis. Barras de erro mostram o desvio-padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Colesterol com rótulo fluorescente é uma estratégia promissora para analisar e investigar as propriedades e o metabolismo do colesterol natural in vitro. Suas principais vantagens são que ele pode ser absorvido por células, permite para intracelular e estudos de distribuição de membrana e pode ser aplicado a ensaios de efluxo colesterol como no presente protocolo (Figura 7). Alguns esteróis fluorescente-rotulados permitam colesterol rastreamento in-vitro incluindo BODIPY-colesterol, colesterol-dansyl, dehydroegrosterol e 22 - 25-NBD-colesterol e12. Particularmente, 22-NBD-colesterol é adequado para estudar a dinâmica de colesterol com diferentes tipos de células e como um substituto da rádio-rotulado colesterol18. Não há nenhum método de consenso para avaliar o sinal fluorescente em um ensaio de efluxo de colesterol. Música et al.14 colhidas lysates médio e célula para medir FI separadamente; Liu et al.14 transferido o meio para outras placas, e o sinal fluorescente intracelular foi medido diretamente na placa de cultura; e Zhang et al15 usado um tampão de Lise para lisar as células, seguidas de depuração do colesterol fluorescente para diluí-la em etanol puro e detectar a intensidade de fluorescência sinal19. No nosso ensaio de efluxo de colesterol, use da mesma composição solvente final na mídia e células permitidas a homogeneização dos meios de comunicação celular e medições de lisado eficientemente.

O presente estudo perfilado o efluxo de colesterol NBD ao longo do tempo e encontrei uma progressão dependente do tempo até 6 h de incubação com sorte o aceitador, semelhantes à canção et al14 e Liu et al.14 e ao contrário de Zhang et al. que utilizou um período de incubação de 1 h com os lipídios aceitadores19. Nós achamos que após 6 h de incubação, o colesterol effluxed perdeu a linearidade; Portanto, é fundamental para não exceder 6 h. Nossa gama óptima de efluxo de colesterol foi entre 3 a 6 h após a adição do aceitadores. Sugerimos que a incubação de células para 4h com as aceitadores de colesterol. Etapas críticas adicionais são uso da mídia incolor para aplicar as aceitadores para evitar fundo, semeando uma camada de cultura celular semi confluente e garantindo uma correta aderência desses para a placa. Note que o fundo transparente da placa branca é útil para acompanhar as células sob um microscópio de luz inversa.

A maioria dos ensaios de efluxo de colesterol são realizados usando aceitadores de lipídios purificado no teste de efluxo de colesterol. A presente técnica foi desenvolvida para obter a capacidade de efluxo de colesterol do soro humano ou plasma das amostras. Nós usamos as aceitadores de colesterol intrínseca presentes no soro, mas é fundamental para remover as partículas contendo apolipoproteína B, que seria recircular as moléculas de colesterol dentro de20,de células21. Como modificações, purificada ApoAI e HDL também podem ser utilizado como aceitadores. Também, linhas de célula diferente de THP-1 humana tem sido utilizadas com sucesso em ensaios de efluxo de colesterol fluorescentes, tais como macrófagos 264.7 crus ou J774A1 e funcionaria, portanto, provável em nosso método15,22.

As principais limitações desse método é que os resultados dependem a linha da célula específica, uma linha celular padrão mas sem célula método seria vantajoso usar como um biomarcador. Além disso, o sera usado para padronizar este método foi congelado; a fracção NBD no colesterol é menos fisiológica do que é rotulado de rádio, e sua absorção difere do colesterol endógeno; e nós testamos o resultado final de um conjunto de processos (ou seja, partículas de soro envolvendo, , uma linha celular, possível esterificação do colesterol, possível difusão de colesterol ou processos simultâneos de efluxo e influxo). No entanto, como uma vantagem, técnicas baseadas em fluorescência mostraram ter elevado potencial como substitutos para marcado as técnicas tradicionais e na substituição de [3H]-colesterol, por uma molécula fluorescente etiquetado para monitorar 14ensaios de efluxo de colesterol.

Efluxo de colesterol pode atuar como biomarcador de aterosclerose23, como correlaciona com eventos cardiovasculares futuros24,25. Uma possibilidade de estudar o papel dos macrófagos na aterosclerose é através de HDLs purificadas e sua composição; no entanto, purificação de HDLs é um processo árduo e demorado. Além disso, durante a purificação, outros componentes do soro com efeito aterogênico podem ser subestimados ou perdidos. Por esse motivo, a sorte foi escolhido como o aceitador de lipídios. A escala de alta produtividade e redução de tempo foram feitas possíveis substituindo o contador de cintilação para um leitor de placa, medindo o sinal fluorescente a mesma placa de cultura (no caso o lisado celular), e reduzindo o protocolo em dois dias. Além disso, esta técnica mostra maior sensibilidade quando as células são expostas a diferentes concentrações de soro do que as medidas obtidas a partir de um kit comercializado para avaliar o efluxo de colesterol.

Em conclusão, um ensaio de efluxo de NBD-colesterol que correlaciona-se com o tradicional método radioativo tem sido descrito. Determinamos o tempo ideal para incubar aceitadores de lipídios de amostras humanas (soro ou plasma) sob a forma de sorte. Nós aperfeiçoamos a semeadura de celular, diferenciação, gama dinâmica e ponto de saturação da técnica. Quanto a sua principal novidade, nós aperfeiçoamos uma combinação solvente usada em medições para a obtenção de alta intensidade e uma escala linear melhorada.

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Disclosures

Os autores desejam declarar que eles são os inventores do pedido de patente (EPO; 18382337.6-1118; 17 de maio de 2018) intitulado "Método para a determinação de efluxo de colesterol" baseia-se este método.

Acknowledgments

Este trabalho foi parcialmente apoiado pela pesquisa concede FIS (PS12/00866) do Instituto de Salud Carlos III, Madrid, Espanha; Fondo Europeo el de pará Desarrollo Regional (FEDER); Red de Investigación en SIDA (RIS), ISCIII-relíquia (RD16/0025/0002) e programa de CERCA / Generalitat de Catalunya. Os autores graças a Retrovirology e o laboratório de Imunopatologia Viral do d'Investigacions Institut Biomèdiques agosto Pi I Sunyer (IDIBAPS). Agradecemos T. Escribà, c. Rovira e Hurtado C. por sua assistência e S. Cufí do escritório de transferência de tecnologia e conhecimento para sua orientação em proteger a invenção.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well collecting plate Corning Inc Costar 3912 white 96-well plate with opaque clear bottom
96-well culture plate Corning Inc Costar 3610 white 96-well plate with flat clear bottom
Cholesterol Efflux Assay Kit (Cell-based) Abcam ab196985 commercial high-throughput cell-based assay kit aimed to determine the cholesterol efflux
colorless RPMI 1640 Sigma-Aldrich R7509 RPMI 1640 with no pehnol-red
Gen5 Data Analysis Software BioTek Version 2.0
Glycine Sigma-Aldrich G8790-100G Glycine, non-animal use
Luminometer Biotek SYNERGY HT Multi-Detection Microplate Reader
Lysis Solution 1 in-house 50 mM Tris Buffer, 150 mM NaCl and H2O
Lysis Solution 2 in-house Pure ethanol and Cell Lysis Solution 1:1 (v:v)
NBD-cholesterol Thermo-Fisher N1148 22-(N-(7-Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)Amino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3β-Ol
PBS Sigma-Aldrich P3813 Phosphate-buffered saline
PEG 8000 Sigma-Aldrich 202452-250G polyethylene glycol
PMA Sigma-Aldrich 79346 Phorbol 12-merystate B-acetate.
R10 in-house RPMI 1640 supplemented with 10% fetal bovine serum and 5% Penicillin/Streptomycin.
RPMI 1640 Sigma-Aldrich R8758 RPMI 1640 with 2 mM L-glutamine containing 1.5 g/L sodium bicarbonate and 4.5 g/L glucose
THP-1 cells Sigma-Aldrich ATCC, #TIB-202 monocyte-like line derived from leukemia from a one year old baby
Tween 80 Sigma-Aldrich P1754

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. The top 10 causes of death. , Available from: http://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/the-top-10-causes-of-death (2018).
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Medicina edição 143 NBD-colesterol macrófago HDL efluxo de colesterol fluorescência apolipoproteína B-esgotada soro aterosclerose transporte reverso do colesterol
Ensaio de efluxo de colesterol Nitrobenzoxadiazole-etiquetadas do elevado-throughput
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Pastor-Ibáñez, R., Arnedo, … More

Pastor-Ibáñez, R., Arnedo, M., Tort, O. High-throughput Nitrobenzoxadiazole-labeled Cholesterol Efflux Assay. J. Vis. Exp. (143), e58891, doi:10.3791/58891 (2019).

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