Summary
Mesure de la capacité de l’efflux de cholestérol in vitro de sérum ou de plasma dans les modèles de cellules macrophages est un outil prometteur comme biomarqueur d’athérosclérose. Dans la présente étude, nous optimiser et uniformiser une méthode d’efflux de cholestérol NBD fluorescente et développer une analyse de haut-débit à l’aide de plaques de 96 puits.
Abstract
L’athérosclérose entraîne des maladies cardiovasculaires (MCV). On ignore encore si la concentration de cholestérol-HDL (cHDL) joue un rôle causal dans le développement de l’athérosclérose. Cependant, un facteur important dans les premiers stades de la formation de plaques d’athérome est capacité de l’efflux de cholestérol HDL (la capacité des particules HDL à accepter le cholestérol des macrophages) afin d’éviter la formation de cellules de mousse. Il s’agit d’une étape clé en évitant l’accumulation de cholestérol dans l’endothélium et une partie du transport du cholestérol inverse (RCT) à éliminer le cholestérol par le foie. Capacité de l’efflux de cholestérol de sérum ou de plasma dans les modèles de cellules macrophages est un outil prometteur qui peut être utilisé comme biomarqueur d’athérosclérose. Traditionnellement, [3H]-cholestérol a été utilisé lors d’essais de l’efflux de cholestérol. Dans cette étude, notre objectif est d’élaborer une stratégie plus sûre et plus rapide à l’aide de fluorescent étiquetés-cholestérol (NBD) lors d’un test cellulaire de retracer le processus de captation et l’efflux de cholestérol dans les macrophages dérivés du THP-1. Enfin, optimiser et uniformiser la méthode de l’efflux de cholestérol NBD et développer une analyse de haut-débit à l’aide de plaques de 96 puits.
Introduction
Selon l’organisation mondiale de la santé, les cours principales causes de décès dans le monde sont les cardiopathies ischémiques et les accidents vasculaires cérébraux (représentant un total de 15,2 millions de décès)1. Les deux sont des maladies cardiovasculaires (MCV) qui peuvent être précédées de l’athérosclérose et la rupture des plaques d’athérome dans les vaisseaux sanguins2,3.
L’athérosclérose est une maladie inflammatoire de mur du navire dans laquelle macrophages, lymphocytes T, cellules de mât et les cellules dendritiques infiltrent l’endothélium et s’accumulent dans le sang, formant éventuellement les plaques d’athérome. Les plaques d’athérosclérose présentent un lipide cristaux cœur et cholestérol, attestées par des mesures de l’échographie mode B haute résolution de la carotide intima média épaisseur4,5. Dans les macrophages, efflux de cholestérol vers des particules lipidiques accepteur est effectué par des moyens des récepteurs ATP binding cassette (ABC) ABCA1, ATP binding cassette membre du subfamily G 1 (ABCG1) et le récepteur éboueur SR-BI. Le déséquilibre des influx de cholestérol et l’efflux dans les macrophages est considéré comme un processus clé de l’athérosclérose initiation6. Efflux de cholestérol est considéré comme une étape clé dans l’élimination du cholestérol des tissus périphériques au plasma et le foie dans un processus appelé transport du cholestérol inverse (RCT). Cholestérol est transférée de macrophages principalement d’apolipoprotéine A1 (ApoA1) dans la surface des particules de lipoprotéines de haute densité (HDL). Puis le transport HDL cholestérol vers le foie pour l’excrétion et réutilisation7,8,9.
Traditionnellement, cholestérol radiomarqué de tritium (3H) a été utilisé dans l’efflux de cholestérol10. Le signal d’émission de radioisotopes est hautement sensible10; Cependant, cholestérol radiomarqué présente des handicaps évidents tels que les protocoles longs, risque d’exposition aux rayonnements ionisants et la nécessité de radioactivité spécial installations et le matériel assurer une manipulation sûre des émissions radioactives. Au contraire, la fluorescence a été avec succès incorporé dans des techniques de diagnostic en raison de sa simplicité dans la détection de signal fluorescent, la grande variété des fluorophores disponibles et sa sécurité11. Plusieurs des stérols fluorescentes marquées ont été utilisés pour étudier le métabolisme du cholestérol notamment dehydroergosterol (avec fluorescence intrinsèque), cholestérol dansyl, 4,4-difluoro-3 a, 4adiaza-s-indacene (BODIPY) - cholestérol et 22-(N-(7- Nitrobenz-2-oxa-1,3-Diazol-4-YL)Amino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3β-OL (NBD-cholestérol). En particulier, NBD-cholestérol présente une absorption efficace dans les cellules humaines12. Deux différentes NBD étiquetés-cholestérol n’est actuellement disponible : 22-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-23,24-bisnor-5-cholen-3b-ol (22-NBD) et 25-(N-[(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)-methyl]amino)-27-norcholesterol (25-jour ouvrable suivant ; La figure 1). Cholestérol marqué avec portion de 22-NBD peut mieux à des études de l’efflux de cholestérol, tandis que 25-NBD-cholestérol est principalement utilisé dans la membrane cellulaire dynamique recherche13,14.
Lignées cellulaires généralement utilisées dans les essais de l’efflux de cholestérol in vitro sont des cellules de type monocyte comme des cellules THP-1 leucémie-dérivé humaines, murines Raw 264.7 cellules15ou J774.1. Toutes ces cellules se différencient en macrophages in vitro à l’aide de phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA), mais les macrophages dérivés du THP-1 (dmTHP-1) mieux reflètent et imitent les macrophages humains16.
Dans la présente étude, nous avons optimiser et uniformiser une méthode fluorescente de haut débit afin de déterminer la capacité de l’efflux de cholestérol du sérum sur dmTHP-1, à l’aide de 22-NBD-cholestérol comme une alternative à la [3H]-cholestérol. En outre, nous comparons la technique fluorescente optimisée avec l’analogue radioactif standard.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Pour cette étude, l’approbation du comité de l’éthique (Comitè Ètic d' recherche clinique, clinique de l’hôpital, Barcelone ; numéro d’homologation HCB/2014/0756) et le consentement écrit et informé de tous les sujets ont été obtenus.
1. NBD-cholestérol préparation
- Dissoudre le NBD-cholestérol (MW 494.63 ; voir Table des matières) dans l’éthanol pur pour obtenir le stock (2 mM). Pour un flacon de 10 mg, dissoudre le contenu de la fiole entière dans un volume de 10,1 mL d’éthanol pour obtenir un stock de 2 mM.
- Diluer le NBD-cholestérol du stock en RPMI 1640 additionné de 10 % fœtale bovine sérique et 5 % la pénicilline/streptomycine (R10 moyen) pour atteindre une concentration finale de 5 μM (p. ex., obtenir 10 mL de NBD-cholestérol à concentration finale de 5 μM) par diluer 25 μL de stock NBD-cholestérol (2 mM) dans un milieu R10. Ce volume est suffisant pour une plaque à 96 puits.
2. cell Culture and Seeding (jour 2)
- Cellules THP-1 de culture dans un milieu R10 à 37 ° C, 5 % de CO2. Ajuster à 0,3 x 106 cellules/mL tous les 3 jours.
- Graine de cellules dans une plaque à 96 puits blanche avec un fond plat, verni à 0,2 x 106 cellules/puits dans le milieu R10 (100 μL / puits).
- Traiter les cellules avec 100 nM phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA, d’un stock de 10 μM) pour 48 à 72 h, en incubation à 37 ° C, 5 % de CO2 pour différencier les THP-1 cellules en dmTHP-1.
Remarque : Il est recommandé d’utiliser 5 μL de stock PMA (10 μM) dans 500 μl de milieu de R10. Avant cela, préparer un 10 μM stock PMA en dissolvant un flacon lyophilisé 1 g dans 10 mL de diméthylsulfoxyde (DMSO), aliquot et stock à-20 ° C. - Sinon (suggestion) combine les étapes 2.2 et 2.3 pour meilleure homogénéisation. Préparer 10 mL de cellules THP-1 dans un tube de 15 mL, ajouter 200 μl de stock PMA (10 μM), mélanger doucement et amorcer immédiatement 100 μL / puits, sur la plaque. Incuber les cellules comme indiqué au point 2.3.
3. apolipoprotéine B appauvri sérum (constructeurs-distributeurs autorisés) préparation (jour 2 ou 3)
- Pour préparer une solution de polyéthylène glycol (PEG), diluer la glycine dans du PBS de 10 % (avec stérile H2O) à une concentration de 200 mM à pH 7,4. Ajouter 40 mL de glycine de 200 mM pour 10 g de PEG 8000 pour obtenir PEG 20 % (p/v). Mélanger la solution vigoureusement pour homogénéiser.
- Appliquer 4 pièces 20 % PEG par 10 parties de sérum/plasma sur chaque échantillon dans un tube de 1,5 mL de sérum/plasma et laisser le mélange sur la glace pour 25 min17 (p. ex., 40 μL de 20 %, ajouter 100 μL de sérum, le plasma ou le PEG solution).
- Centrifuger le précipité PEG-apolipoprotéine B à 13 000 x g pendant 15 min à 4 ° C.
- Éliminer le précipité. Transférer le surnageant dans un nouveau tube.
Remarque : Nous vous suggérons de préparer les constructeurs-distributeurs autorisés le jour 3 (frais). S’il n’est pas possible, préparer les constructeurs-distributeurs autorisés au jour 2 et gardez-le toute la nuit à 4 ° C.
4. NBD-cholestérol cellulaire chargement (jour 2)
- Jeter le milieu de culture du dmTHP-1 et laver les cellules deux fois avec 1 x solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
- Charger les cellules avec 5 μM NBD-cholestérol (100 μL / puits) dans un milieu R10 et incuber une nuit à 37 ° C, 5 % de CO2.
5. l’incubation avec cholestérol accepteurs (jour 3)
- Jeter le milieu et laver les cellules deux fois avec du PBS.
- Incuber les cellules avec des constructeurs-distributeurs autorisés de 2 à 5 % ou la concentration désirée d’accepteur de lipides purifiés (HDL, ApoA, ApoE, etc) en dilution dans un milieu RPMI 1640 incolore (100 μL / puits) 4 – 6 h à 37 ° C.
NOTE : Inclure un contrôle négatif (C-) consistant en incolore milieu RPMI 1640 sans accepteurs et un témoin positif (C +) (p. ex., constructeurs-distributeurs autorisés d’un bassin de donneurs sains) ou HDL purifiée. Note que le contrôle positif s’applique en particulier lorsque les échantillons de patients (pathologiques) sont analysés (supplémentaire Figure 1). - Préparation d’un stock de 200 mL de la solution de lyse cellulaire 1 (tampon Tris de 50 mM, 150 mM NaCl, H2O). Le ratio de solution 1 à 1:1 (v : v) de lyse cellulaire se mêlent l’éthanol pur pour obtenir la solution de lyse 2.
6. Capture de Signal fluorescent (jour 3)
-
Détection de média NBD-cholestérol
- Retirer le milieu cellulaire des plaques et il récupérer dans une nouvelle plaque 96 puits blanche avec un fond plat opaque.
- Pour une détection de signal de fluorescence optimale dans les échantillons de médias, ajouter 100 μL d’éthanol pur à 100 μL de chaque échantillon moyen pour obtenir un ratio de 1:1 dans la plaque 96 puits blanc.
- Maintenir la plaque avec les médias traités d’autre mesure l’intensité de fluorescence (FI), à une longueur d’onde de 463⁄536 nm (excitation/émission) sur le luminomètre.
-
Détection de NBD-cholestérol intracellulaire
- Laver les cellules deux fois avec du PBS.
- Pour obtenir le taux de cholestérol intracellulaire, lyser les cellules en incubant eux avec 100 μL de solution de lyse 2 / puits et secouer la plaque à température ambiante (RT) pendant 25 min.
- Pour une détection de signal de fluorescence optimale dans les échantillons de lysat cellulaire, capturer l’intensité de la fluorescence des lysats cellulaires dans le même blanc plaque à 96 puits avec fond clair plat (la même plaque dans laquelle les cellules ont été ensemencés à l’étape 2.2).
- 6.3 mesurer l’intensité de fluorescence (FI) dans le luminomètre tout en ajustant le paramètre de sensibilité à 50 dans le logiciel (voir Table des matières).
7. analyse des résultats
- Exprimer le taux d’efflux de cholestérol d’un échantillon en pourcentage calculé par la formule suivante :
- Obtenir la dernière mesure d’efflux de cholestérol (EC) en soustrayant de la CE du contrôle négatif (échantillon chargé avec NBD-cholestérol mais incubés avec incolore milieu RPMI 1640, sans accepteurs de cholestérol) de la CE du a donné des échantillons :
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Le but de l’essai de l’efflux de cholestérol est de déterminer in vitro la capacité de l’efflux de cholestérol d’une donnée de sérum, le plasma ou surnageant contenant des particules HDL. La méthode consiste à charger cholestérol marqué dans une culture d’une lignée de cellules macrophages standard et induisant des contact avec l’échantillon dilué dans des milieux sans FBS avec les cellules. Enfin, les niveaux fluorescents de la NBD sont mesurés dans les médias et le lysat cellulaire. Pour optimiser les mesures, le cholestérol est des cellules aux médias est mélangé avec un volume d’un solvant contenant de l’éthanol. La NBD-cholestérol restant dans les cellules est resuspendu dans un solvant contenant de l’éthanol ou détergent avant de mesures. Enfin, le rapport est/total marqués-cholestérol est déterminé. Pour mettre en place la technique, l’apolipoprotéine B-appauvri sérum (constructeurs-distributeurs autorisés) d’un bassin de donneurs sains a été utilisé.
Les auteurs ont étudié les meilleures conditions de dilution pour le NBD-cholestérol en milieu et en éthanol. Nous avons testé le comportement fluorescent de NBD-cholestérol libre dans plusieurs milieux solvants, y compris les différentes proportions d’éthanol et incolore RPMI 1640. L’intensité de la fluorescence (FI) de NBD-cholestérol dilué dans la solution aqueuse a montré les plus faibles valeurs FI, NBD-cholestérol au sein de l’éthanol pur émis le FI plus élevée. Ceci suggère que l’émission de fluorescence de la molécule de cholestérol-NBD-22 est fortement dépendante du milieu dans lequel il est contenu. Par conséquent, le signal de fluorescence du 22-NBD-cholestérol est significativement plus élevé lorsqu’il est placé dans un éthanol contenant des médias. Nous avons observé qu’à un ratio de 1:1 de médias : l’éthanol, le signal d’intensité de fluorescence augmente proportionnellement avec la concentration du cholestérol analogique de l’ordre de 0,5 à 50 μM, ce qui suggère un comportement approprié de la sonde dans ce cas (Figure 2 ). Le comportement linéaire dans la condition 1:1 (médias : éthanol) est représenté par l’équation de suivre : y = 20.88 x + 146,7 avec R2 = 0.9341.
Une étape clé dans cette méthode est le temps passé en incubant les cellules chargées d’accepteurs de cholestérol, le cholestérol est donc capable de l’efflux. Afin de déterminer le temps d’incubation nécessaire, milieux cellulaires a été récoltée à différents intervalles (1 à 24 h ; La figure 3). L’efflux de cholestérol dans la gamme de 0 à 6 h a évolué de manière linéaire (p < 0,0001 ; y = 18,2 x + 127,3) d’une manière dépendante du temps. Le signal maximal capturé était à 6 h après les constructeurs-distributeurs autorisés a été ajouté aux cellules. Après 6 h, le taux de cholestérol a perdu régularité dans l’efflux, donc variabilité accrue après 6 h d’incubation avec les constructeurs-distributeurs autorisés (Figure 3).
Nous avons testé en outre le seuil de saturation et de la plage dynamique appliquée à l’humains constructeurs-distributeurs autorisés en mesurant CE à différents pourcentages de milieux contenant du HDL (constructeurs-distributeurs autorisés). L’efflux de cholestérol NBD dans l’essai de débit élevé (plaque à 96 puits) évolué linéairement dans 1 – 7 % constructeurs-distributeurs autorisés, où FI a augmenté de manière dose-dépendante avec les constructeurs-distributeurs autorisés, pour atteindre le sommet de la capacité de l’efflux de cholestérol à 7 % constructeurs-distributeurs autorisés (Figure 4). Aux concentrations supérieures à 7 %, FI a diminué dans une relation inverse avec le pourcentage de constructeurs-distributeurs autorisés. Cela peut se produire parce que le cholestérol était rentrant chargement de cellules chez le NBD-cholestérol HDL présente dans les médias.
La méthode standard pour mesurer l’efflux de cholestérol utilise radio-marquées (3H) cholestérol16. Pour évaluer la performance de notre méthode de fluorescence, nous avons effectué et comparé les techniques fluorescents et radio-marquées. Nous avons trouvé que la technique traditionnelle de la radioactivité et notre méthode de NBD-cholestérol étaient fortement corrélés (r de Pearson = 0,97 ; p < 0,001) à l’aide de différentes concentrations de constructeurs-distributeurs autorisés (1 à 8 % ; La figure 5). Dans l’ensemble, cela donne à penser que notre méthode fluorescent peut être un substitut plus sûr que la technique radioactif.
Enfin, nous avons comparé notre méthode à sonde fluorescente différent de jour ouvrable suivant. Nous avons comparé notre méthode pour un kit commercial haut débit basés sur les cellules test visant à déterminer l’efflux de cholestérol dans les cellules (kit de dosage de l’efflux de cholestérol ; base de cellules). La méthode développée dans notre groupe était sensible à une augmentation de la concentration d’accepteur (% constructeurs-distributeurs autorisés) au sein de CE valeurs comprises entre 5 et 15 %. Toutefois, la trousse commerciale, effectuée en suivant les instructions du fabricant, a provoqué CE mesures inférieures à 5 % le long de la gamme des constructeurs-distributeurs autorisés, dosés ; ainsi, CE qui en résulte n’est essentiellement pas affectée quand constructeurs-distributeurs autorisés a été augmenté (Figure 6).
Figure 1 : structure moléculaire de cholestérol naturel (A), 22-NBD-cholestérol (B) et 25-NBD-cholestérol (C). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : intensité de la fluorescence NBD-cholestérol (FI) avec différentes proportions d’éthanol et incolore milieu RPMI 1640. NBD-cholestérol a été dilué dans 1:0, 3:1, 1:1, 1:3 et 0:1 éthanol : ratios de moyenne aqueuses à des concentrations de cholestérol-NBD entre 0,5 et 50 µM. FI signalent a été détecté par le luminomètre avec le paramètre de sensibilité fixé à 70 dans le logiciel fluorimètre. Le signal FI des médias et de lysat cellulaire a été mesuré à l’aide de plaques de 96 puits blanches. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : efflux de temps-progression NBD-cholestérol dans les macrophages dérivés du THP-1. Le dmTHP-1 ont été chargés avec 5 µM NBD-cholestérol et incubées avec 5 % constructeurs-distributeurs autorisés. Milieux cellulaires ont été mesurées dans une plaque à 96 puits blanche à différents intervalles (1 à 24 h). Les valeurs sont présentées comme la moyenne ± écart-type des quatre puits. FI signal a été capté par le luminomètre avec le paramètre de sensibilité fixé à 70 dans le logiciel fluorimètre. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : efflux de NBD-cholestérol dans les macrophages dérivés du THP-1 dans la plaque à 96 puits avec différentes concentrations de constructeurs-distributeurs autorisés. Les cellules dmTHP-1 ont été traitées avec 5 µM NBD-cholestérol, incubé avec différents pourcentages de constructeurs-distributeurs autorisés et lysées avec de l’éthanol. Le signal FI des médias et de lysat cellulaire a été mesuré à l’aide d’une plaque à 96 puits blanche dans le fluorimètre à 1:1 (solution d’éthanol : lyse 1). Les mesures de contrôles négatifs (constructeurs-distributeurs autorisés de médias non traitée) ont été soustraites aux niveaux indiqués. Les valeurs sont présentées comme la moyenne ± écart-type de puits en triple. FI signal a été capté par le luminomètre avec le paramètre de sensibilité fixés à 50 dans le logiciel fluorimètre. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Corrélation de NBD-cholestérol et la [3H]-efflux de cholestérol dans les macrophages dérivés du THP-1. DmTHP-1 suivants avec le cholestérol portant la mention correspondant pendant 6 h. L’efflux de cholestérol a été mesurée à l’aide de constructeurs-distributeurs autorisés de 1 à 8 %. Pour les échantillons de NBD-cholestérol, le signal fluorescent a été détecté à l’aide des plaques de 96 puits blanches dans le fluorimètre à solution 1:1 éthanol : lyse 1. FI signal a été capté par le luminomètre avec le paramètre de sensibilité fixés à 50 dans le logiciel fluorimètre. Pour la [3H]-échantillons de cholestérol, le signal radioactif a été détecté à l’aide de 100 µL de milieu et lysat de cellules mélangé à la scintillation cocktail et rouge dans le compteur à scintillation, suivant le protocole décrit par basse et coll.17. Efficacité de corrélation a été déterminée à l’aide du coefficient de corrélation r de Pearson. Les mesures de contrôles négatifs (constructeurs-distributeurs autorisés de médias non traitée) ont été soustraites de fluorescence et de niveaux radioactifs fournies. Les valeurs sont présentées comme la moyenne ± écart-type de puits en triple. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : comparaison entre le test de l’efflux de NBD-cholestérol haut débit et un kit de commercialisé sur les cellules immunofluorescence. Efflux de cholestérol des constructeurs-distributeurs autorisés a été évaluée selon le protocole décrit, en utilisant comme lyse solvant éthanol (50 %) ou le Tween 80 (1 %). Le kit de base de cellules immunofluorescence a été évalué selon le protocole du fabricant dans le kit. Les valeurs sont présentées comme la moyenne ± écart-type de puits en triple. FI signal a été capté par le luminomètre avec le paramètre de sensibilité fixés à 50 dans le logiciel fluorimètre s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 7 : diagramme de flux de travail. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Supplémentaire Figure 1 : efflux de cholestérol NBD de sérums de patients infectés par le VIH et un témoin positif standard (C +). La variation entre individus de la méthode de l’efflux de NBD-cholestérol appliquée à un ensemble de patients infectés par le VIH est montrée. Un contrôle interne positif (C +) représente l’efflux de cholestérol-NBD parmi un groupe d’échantillons de sérums de 8 patients en bonne santé. Barres d’erreur voir la déviation standard. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Cholestérol marqué fluorescent est une stratégie prometteuse pour analyser et étudier les propriétés et le métabolisme du cholestérol naturel in vitro. Ses principaux avantages sont qu’il peut être absorbé par les cellules, permettant l’intracellulaire et étude de membrane de diffusion et peut être appliqué à des épreuves de l’efflux de cholestérol comme dans ce protocole (Figure 7). Certains stérols fluorescentes marqués permettent de cholestérol suivi in vitro y compris BODIPY-cholestérol, cholestérol dansyl, dehydroegrosterol et 22 - 25-NBD-cholestérol et12. En particulier, 22-NBD-cholestérol est approprié pour l’étude dynamique de cholestérol avec différents types de cellules et comme un substitut de cholestérol radio-marqués18. Il n’y a aucune méthode de consensus pour évaluer le signal fluorescent dans un essai de l’efflux de cholestérol. Chanson Al14 récoltés lysats moyen et cellule pour mesurer FI séparément ; Liu Al.14 transféré au moyen d’autres plaques, et le signal fluorescent intracellulaire a été mesuré directement dans la plaque de culture ; et Zhang et al.15 a utilisé un tampon de lyse à lyser les cellules, suivies de la purification du cholestérol fluorescent à diluer dans de l’éthanol pur et détecter la fluorescence intensité signal19. Dans notre test de l’efflux de cholestérol, l’utilisation de la composition du solvant finale même dans les médias et a permis l’homogénéisation des médias cellulaire et mesures de lysat efficacement les cellules.
La présente étude l’efflux de cholestérol NBD de profilage dans le temps et trouvé une progression dépendant du temps jusqu'à 6 h d’incubation avec l’accepteur constructeurs-distributeurs autorisés, similaires à la chanson et coll.14 et Liu et al.14 et contrairement à Zhang et Al qui ont utilisé une période d’incubation de 1 h avec les lipides accepteurs19. Nous avons constaté qu’après 6 h d’incubation, le cholestérol est perdu linéarité ; Il est donc primordiale ne devant ne pas dépasser 6 heures. Notre gamme optimale d’efflux de cholestérol était entre 3 à 6 h après avoir ajouté les accepteurs. Nous vous suggérons d’incubation des cellules pendant 4 h avec les accepteurs de cholestérol. Étapes critiques supplémentaires sont l’emploi des médias incolores à appliquer les accepteurs pour éviter le fond, ensemencement d’une couche de culture de cellules semi confluentes et assurant une adhérence correcte de ceux de la plaque. Il est à noter que le fond transparent de la plaque blanche est utile pour suivre les cellules sous un microscope optique inverse.
La plupart dosages de l’efflux de cholestérol sont réalisées à l’aide de lipides purifiés accepteurs dans le test de l’efflux de cholestérol. La technique actuelle a été développée afin d’obtenir la capacité de l’efflux de cholestérol du sérum humain ou des échantillons de plasma. Nous utilisons les accepteurs intrinsèque cholestérol présents dans le sérum, mais il est essentiel d’enlever les particules contenant l’apolipoprotéine B, qui serait recirculer les molécules de cholestérol à l’intérieur de cellules20,21. Sous réserve de modifications, purifiée n’et HDL peuvent également servir comme accepteurs. Aussi, des lignées de cellules autres que les humains THP-1 ont été utilisées avec succès dans des tests de l’efflux de cholestérol fluorescentes, comme macrophages Raw 264.7 ou J774A1 et seraient donc susceptible de travail dans notre méthode15,22.
Les principales limites de cette méthode est que les résultats dépendent de la lignée de cellules spécifiques, une lignée de cellules standard mais sans cellule méthode serait avantageux d’utiliser comme biomarqueur. En outre, les sérums utilisées pour normaliser cette méthode ont été gelées ; la portion NBD sur le cholestérol est moins physiologique que le radio-marquées, et son absorption diffère du cholestérol endogène ; et nous avons testé le résultat final d’une série de processus (, des particules de sérum, une lignée cellulaire, possible estérification du cholestérol, diffusion possible du cholestérol ou de processus simultanés d’efflux et afflux). Cependant, comme un avantage, basés sur la fluorescence des techniques ont démontré que le potentiel élevé comme substituts des techniques traditionnelles radiomarqué et à la substitution de la [3H]-cholestérol, par une molécule fluorescente marquée à surveiller efflux de cholestérol dosages14.
Efflux de cholestérol peut-être servir de biomarqueurs de l’athérosclérose23, tel qu’il est en corrélation avec les événements cardiovasculaires futurs24,25. Une possibilité d’étudier le rôle des macrophages dans l’athérosclérose est par le biais de HDLs purifiées et sa composition ; Cependant, HDLs purification est un processus long et ardu. En outre, au cours de la purification, autres composants du sérum avec effet athérogène peuvent être sous-estimée ou perdus. Pour cette raison que les constructeurs-distributeurs autorisés a été choisi comme l’accepteur de lipides. L’échelle de haut débit et de la réduction du temps ont été rendues possibles par son remplacement par le compteur à scintillation pour un lecteur de plaque, mesurer le signal fluorescent dans la même plaque de culture (dans le cas du lysat cellulaire) et en réduisant le protocole en deux jours. En outre, cette technique montre une sensibilité plus élevée quand les cellules sont exposées à différentes concentrations de sérum que les mesures obtenues à partir d’un kit commercialisé pour évaluer l’efflux de cholestérol.
En conclusion, un essai d’efflux NBD-cholestérol qui est en corrélation avec la méthode traditionnelle de radioactive a été décrite. Nous avons déterminé le moment optimal pour l’incubation des accepteurs de lipides provenant d’échantillons humains (sérum ou plasma) sous forme de constructeurs-distributeurs autorisés. Nous avons optimisé l’ensemencement de la cellule, différenciation, dynamique et point de saturation de la technique. En ce qui concerne sa principale nouveauté, nous avons optimisé une combinaison de solvant utilisée dans les mesures pour obtenir des intensités élevées et une meilleure gamme linéaire.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs souhaitent déclarer qu’ils sont les inventeurs de la demande de brevet (EPO, 18382337.6-1118 ; 17 mai 2018) intitulé « Méthode pour déterminer l’efflux de cholestérol » basée sur cette méthode.
Acknowledgments
Ce travail a été partiellement soutenu par la subventions de recherche FIS (PS12/00866) d’Instituto de Salud Carlos III, Madrid, Espagne ; El de Fondo Europeo para Desarrollo régional (FEDER) ; Red de Investigación en SIDA (RIS), ISCIII-RETIC (RD16/0025/0002) et Programme de CERCA / Generalitat de Catalunya. Les auteurs remercient la rétrovirologie et laboratoire d’immunopathologie virale de l’Institut d'Investigacions Biomèdiques août Pi I Sunyer (IDIBAPS). Nous remercions Escribà T., c. Rovira et C. Hurtado pour leur aide et S. Cufí de la connaissance et le bureau de transfert de technologie pour son orientation dans la protection de l’invention.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well collecting plate | Corning Inc | Costar 3912 | white 96-well plate with opaque clear bottom |
| 96-well culture plate | Corning Inc | Costar 3610 | white 96-well plate with flat clear bottom |
| Cholesterol Efflux Assay Kit (Cell-based) | Abcam | ab196985 | commercial high-throughput cell-based assay kit aimed to determine the cholesterol efflux |
| colorless RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R7509 | RPMI 1640 with no pehnol-red |
| Gen5 Data Analysis Software | BioTek | Version 2.0 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8790-100G | Glycine, non-animal use |
| Luminometer | Biotek | SYNERGY HT | Multi-Detection Microplate Reader |
| Lysis Solution 1 | in-house | 50 mM Tris Buffer, 150 mM NaCl and H2O | |
| Lysis Solution 2 | in-house | Pure ethanol and Cell Lysis Solution 1:1 (v:v) | |
| NBD-cholesterol | Thermo-Fisher | N1148 | 22-(N-(7-Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)Amino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3β-Ol |
| PBS | Sigma-Aldrich | P3813 | Phosphate-buffered saline |
| PEG 8000 | Sigma-Aldrich | 202452-250G | polyethylene glycol |
| PMA | Sigma-Aldrich | 79346 | Phorbol 12-merystate B-acetate. |
| R10 | in-house | RPMI 1640 supplemented with 10% fetal bovine serum and 5% Penicillin/Streptomycin. | |
| RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R8758 | RPMI 1640 with 2 mM L-glutamine containing 1.5 g/L sodium bicarbonate and 4.5 g/L glucose |
| THP-1 cells | Sigma-Aldrich | ATCC, #TIB-202 | monocyte-like line derived from leukemia from a one year old baby |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1754 |
References
- The top 10 causes of death. , Available from: http://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/the-top-10-causes-of-death (2018).
- Hansson, G. K., Hermansson, A.
- Libby, P., Ridker, P. M., Hansson, G. K. Progress and challenges in translating the biology of atherosclerosis. Nature. 473 (7347), 317-325 (2011).
- Ilhan, F. Atherosclerosis and the role of immune cells. World Journal of Clinical Cases. 3 (4), 345 (2015).
- Greaves, D. R., Gordon, S. Immunity, atherosclerosis and cardiovascular disease. Trends Immunol. 22, (2001).
- Yamamoto, S., Narita, I., Kotani, K. The macrophage and its related cholesterol efflux as a HDL function index in atherosclerosis. Clinica Chimica Acta. 457, 117-122 (2016).
- Escolà-Gil, J. C., Rotllan, N., Julve, J., Blanco-Vaca, F. In vivo macrophage-specific RCT and antioxidant and antiinflammatory HDL activity measurements: New tools for predicting HDL atheroprotection. Atherosclerosis. 206 (2), 321-327 (2009).
- Santos-Gallego, C. G., Ibanez, B., Badimon, J. J. HDL-cholesterol: Is it really good? Differences between apoA-I and HDL. Biochemical Pharmacology. 76 (4), 443-452 (2008).
- Rothblat, G. H., Phillips, M. C. High-density lipoprotein heterogeneity and function in reverse cholesterol transport. Current Opinion in Lipidology. 21 (3), 229-238 (2010).
- Hafiane, A., Genest, J. HDL-mediated cellular cholesterol efflux assay method. Annals of Clinical and Laboratory Science. 45 (6), 659-668 (2015).
- Szalaia, R., Hadzsiev, K., Melegh, B. Cytochrome P450 Drug Metabolizing Enzymes in Roma Population Samples: Systematic Review of the Literature. Current Medicinal Chemistry. 23, 1-26 (2016).
- Mcintosh, A. L., et al. Fluorescent Sterols for the Study of Cholesterol Trafficking in Living Cells. Probes and Tags to Study Biomolecular Function: for Proteins, RNA, and Membranes. , 1-33 (2008).
- Ostašov, P., et al. FLIM studies of 22- and 25-NBD-cholesterol in living HEK293 cells: Plasma membrane change induced by cholesterol depletion. Chemistry and Physics of Lipids. 167, 62-69 (2013).
- Song, W., et al. Characterization of fluorescent NBD-cholesterol efflux in THP-1-derived macrophages. Molecular Medicine Reports. 12 (4), 5989-5996 (2015).
- Liu, N., Wu, C., Sun, L., Zheng, J., Guo, P. Sesamin enhances cholesterol efflux in RAW264.7 macrophages. Molecules. 19 (6), 7516-7527 (2014).
- Qin, Z. The use of THP-1 cells as a model for mimicking the function and regulation of monocytes and macrophages in the vasculature. Atherosclerosis. 221 (1), 2-11 (2012).
- Low, H., Hoang, A., Sviridov, D.
- Gimpl, G., Gehrig-Burger, K.
- Zhang, J., Cai, S., Peterson, B. R., Kris-Etherton, P. M., Heuvel, J. P. Vanden Development of a Cell-Based, High-Throughput Screening Assay for Cholesterol Efflux Using a Fluorescent Mimic of Cholesterol. ASSAY and Drug Development Technologies. 9 (2), 136-146 (2011).
- Rader, D. D. J. Molecular regulation of HDL metabolism and function: implications for novel therapies. Journal of Clinical Investigation. 116 (12), 3090-3100 (2006).
- Davidson, W. S., et al. The effects of apolipoprotein B depletion on HDL subspecies composition and function. Journal of Lipid Research. 57 (4), 674-686 (2016).
- Park, S. H., et al. Sage weed (Salvia plebeia) extract antagonizes foam cell formation and promotes cholesterol efflux in murine macrophages. International Journal of Molecular Medicine. 30 (5), 1105-1112 (2012).
- Litvinov, Y., Savushkin, E. V., Garaeva, E. A. D. A. Cholesterol Efflux and Reverse Cholesterol Transport: Experimental Approaches. Current Medicinal Chemistry. 371 (25), 2383-2393 (2016).
- Phillips, A., Mucksavage, M. L., Wilensky, R. L., Mohler, E. R. Cholesterol efflux capacity, high-density lipoprotein function, and atherosclerosis. N Engl J Med. 364 (2), 127-135 (2011).
- Rohatgi, A., et al. HDL Cholesterol Efflux Capacity and Incident Cardiovascular Events. New England Journal of Medicine. 371 (25), 2383-2393 (2014).
