Summary
Este protocolo descreve um procedimento detalhado para ressusciar e cultivar os neurônios derivados humanos da pilha de haste que foram diferenciados previamente dos progenitores neural in vitro por semanas múltiplas. O procedimento facilita os ensaios com base em imagens de neuritos, sinapses e marcadores neuronais de expressão tardia em um formato compatível com microscopia de luz e triagem de alto conteúdo.
Abstract
Os neurônios diferenciados na cultura bidimensional das células progenitoras neurais pluripotentes humanas (NPCs) representam um poderoso sistema modelo para explorar os mecanismos de doença e realizar a triagem de alto conteúdo (HCS) para interrogar o composto bibliotecas ou identificar fenótipos de mutação genética. Entretanto, com as pilhas humanas a transição do NPC ao neurônio funcional, maduro exige diversas semanas. As sinapses normalmente começam a se formar após 3 semanas de diferenciação na cultura monocamada, e várias proteínas neuronais específicas, por exemplo, o marcador Pan-neuronal mais tarde expressando Neun, ou a camada 5/6 neurônio cortical cerebral marcador CTIP2, começam a expressar cerca de 4-5 semanas após a diferenciação. Este tempo longo da diferenciação pode ser incompatível com as condições ideais da cultura usadas para o volume pequeno, plataformas multi-well do HCS. Entre os muitos desafios estão a necessidade de células bem aderidas e uniformemente distribuídas com o mínimo de aglomeração celular e procedimentos de cultura que promovem a viabilidade a longo prazo e a maturação funcional da sinapse. Uma abordagem é diferenciar os neurônios em um formato de grande volume, em seguida, mas-los em um ponto de tempo posterior em HCS-compatível com vários poços. Alguns dos principais desafios ao usar essa abordagem de resposta referem-se à reprodutibilidade e viabilidade celular, devido ao rompimento estressante da rede dendrítica e axonal. Aqui nós demonstramos um procedimento detalhado e de confiança para a célula de haste pluripotente induzida enzimaticamente ressuscitem os neurônios (hipsc)-derivado humanos após sua diferenciação por 4-8 semanas em um formato Large-volume, transferindo os ao de microtitulação 384-well placas, e cultivando-os para umas 1-3 semanas mais adicionais com sobrevivência excelente da pilha. Esta resposta de neurônios humanos não só permite o estudo do conjunto de sinapse e maturação dentro de duas semanas de repique, mas também permite estudos de regeneração neurite e características do cone de crescimento. Nós fornecemos exemplos de ensaios escalonáveis para neuritogênese e sinaptogênese usando uma plataforma 384-well.
Introduction
Células-tronco pluripotentes humanas (hiPSC)-os neurônios derivados são cada vez mais relevantes nas áreas de pesquisa básica, desenvolvimento de fármacos e medicina regenerativa. Fluxos de trabalho e procedimentos para otimizar sua cultura e manutenção, e melhorar a eficiência da diferenciação em subtipos neuronais específicos, estão evoluindo rapidamente1,2. Para melhorar a utilidade e a relação custo-eficácia dos neurônios derivados de células-tronco humanas como sistemas modelo que permitem análises de alto conteúdo na descoberta de fármacos e na validação de alvos, é útil diminuir o tempo de cultivo necessário para gerar neurônios, mantendo a máxima robustez, reprodutibilidade e relevância do fenótipo. Embora as culturas organoid 3-dimensionais estejam conduzindo avanços na pesquisa do neurodesenvolvimento3, as culturas do monocamada 2-dimensional são especial compatíveis com as aplicações Imaging-based automatizadas devido a sua espessura mínima do tecido.
No entanto, a adaptação de métodos de triagem baseados em imagem para modelos de doença neurológica e neurodesenvolvimental humana enfrenta um grande desafio. O período prolongado sobre o qual o sistema nervoso humano amadurece in vivo necessita de tempo estendido na cultura para acomodar programas naturais de expressão gênica e alcançar a maturação neuronal.
Uma conseqüência prática do programa longo da diferenciação neuronal é que a manutenção de culturas monocamada hipsc-derivadas deve ser sustentada por muitas semanas para conseguir a maturidade adequada do sinapse. Durante esse tempo, os progenitores neurais que permanecem indiferenciados continuam a se dividir. Estes podem rapidamente overgrow a cultura e usurpar o índice nutriente exigido para manter neurônios células viáveis. A divisão vigorosamente de células progenitoras neurais (NPCs) também pode competir com neurônios para o substrato de crescimento. Isso pode tornar essas culturas sujeitas a problemas de má adesão, uma condição inadequada para ensaios baseados em imagem. Além disso, muitos investigadores acham que quanto menor o volume de cultura, maior a dificuldade em manter populações saudáveis de neurônios diferenciados tempo suficiente para observar os estágios tardios da diferenciação neuronal. Em outras palavras, os ensaios de maturação de sinapse usando abordagens de rastreamento de alto conteúdo (HCS) podem ser muito desafiadores para os neurônios derivados do ser humano.
Para contornar alguns desses problemas, foi utilizado um procedimento de ressuscito e replante de neurônios derivados de hiPSC previamente diferenciados. Em primeiro lugar, permite o estudo do crescimento do neurite (ou, mais precisamente, regeneração de neurite) em uma população de neurônios totalmente comprometidos. Em segundo lugar, a resposta de neurônios previamente diferenciados de um formato de grande volume (como placas de 10 cm ou maior), até formatos de volume pequeno (como placas de de microtitulação 96-ou 384-well compatíveis com HCS) permite uma redução significativa no tempo total de cultivo em a condição de pequeno volume. Isto facilita o estudo do conjunto e da maturação da sinapse sobre semanas subseqüentes in vitro.
No entanto, a resposta de neurônios maduros que já estabeleceram neuritos longos e uma complexa rede de conectividade apresenta vários desafios, um dos quais é a taxa às vezes alta e variável de morte celular. Aqui, nós descrevemos um procedimento de repique que resulte na sobrevivência e na reprodutibilidade excelentes da pilha. Comumente, os neurônios são expostos a enzimas proteolíticas para períodos curtos de incubação (tipicamente ~ 3-10 min), a fim de separar as células do substrato antes da trituração. Este breve tempo de proteólise é habitualmente utilizado para ressuscitar e de muitos tipos de células divisórias, incluindo células não-neuronais e progenitores indiferenciados4,5,6. No entanto, para neurônios diferenciados que carregam neuritos longos e interligados, é essencial não apenas separar as células do substrato, mas também interromper a rede dendrítica e axonal, a fim de isolar as células individuais, minimizando os danos. Na verdade, uma malha grossa de neurônios geralmente tende a se separar do substrato como uma única folha, em vez de células individuais. Se o cuidado não é tomado para afrouxar a rede grossa de neurites, os neurônios não somente tornam-se irreversivelmente danificados durante o trituration, mas muitos deles não conseguem passar através do filtro usado para remover os grupos, tendo por resultado o rendimento pobre da pilha. Abaixo descrevemos uma simples modificação em um procedimento de incubação de protease amplamente utilizado para contrariar essas dificuldades.
No protocolo descrito abaixo, os neurônios são incubados por 40-45 min com uma protease leve, como a enzima proteolítica (por exemplo, Accutase). Durante o primeiro 5-10 min após a adição da enzima, a rede neuronal levanta-se do substrato como uma folha. A incubação com a protease prossegue por um adicional de 30-40 min antes de prosseguir com trituração e filtração suaves. Este tempo extra da incubação ajuda a assegurar-se de que a digestão do material Relaxe a rede intercelular, assegurando desse modo que o trituration subseqüente produza uma suspensão de pilhas individuais. Este procedimento maximiza a uniformidade da distribuição da pilha em cima de repique ao minimizar a morte da pilha. Nós aplicamos com sucesso este método de repique às culturas neuronal hipsc-derivadas geradas por vários protocolos7,8 da diferenciação e das várias linhas de hipscs. O procedimento é nominalmente adequado para uso com a maioria ou todas as linhas de neurônios derivados de células-tronco. Observou-se que um tempo prolongado de incubação da protease não é absolutamente essencial para a resposta de culturas de placas de pequeno formato (por exemplo, 35 mm de diâmetro); Entretanto, como nós mostramos aqui, fornece um benefício significativo ao repique das placas do grande diâmetro (por exemplo, diâmetro de 10 cm ou maior), provavelmente porque os neuritos em tais placas podem estender processos muito longos e formar uma disposição densa interconectada.
Aqui nós demonstramos este método e ilustram momentaneamente sua aplicação nos ensaios para o neuritogênese adiantado e para a maturação do sinapse, que envolve o agrupamento de proteínas pre-e pós-sináptica ao longo dos dendritos e dos axônios, seguidos por seu mais atrasado colocalização em sítios sinápticos. Os exemplos destacam as vantagens que este protocolo oferece na preservação da viabilidade celular e reprodutibilidade. Primeiramente, permite que os investigadores estudem etapas adiantadas no neuritogenesis humano. O cenário experimental é semelhante às culturas primárias comumente usadas de neurônios corticais ou hipocampais de roedores, onde as células são extraídas do cérebro pós-natal fetal ou precoce, dissociada pela trituração após tratamento suave da protease, e permitiu Iniciar neuritos ou regenerar neuritos que foram cortados no procedimento9,10. Semelhante a tais neurônios primários de roedores, neurónios derivados de hiPSC começam a formar ou regenerar seus neuritos dentro de horas após a resposta, permitindo a imagem de cones de crescimento e morfologia neurite em um ambiente ideal para imagens de alta espaciotemporal com menos células não diferenciadas circundantes. Nós observamos que o conseqüência do neurite é mais sincronizado comparado aos atrasos variáveis e às taxas diferentes do conseqüência consideradas quando os neurônios começam primeiramente a diferenciar-se de uma população do progenitor. Além disso, a resposta permite ensaios de neurônios expressando marcadores de subtipo neuronal que tipicamente aparecem mais tarde no desenvolvimento neural, como a camada cortical 5/6 fator de transcrição CTIP2 (frango ovalbumina transcrição promotor upstream fator-interagindo proteína 2), ou o marcador Pan-neuronal NeuN11. Uma característica especialmente útil da abordagem de resposta é que o sinaptogênese prossegue dentro de um período de tempo compatível com HCS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. período de diferenciação antes de responder
- Diferencie os neurônios em pratos de 10 cm, usando um protocolo de escolha7,8até que os neurônios formaram uma rede espessa com seus processos e expressam não apenas marcadores neuronais precoces, como map2 ou TuJ1, mas também marcadores tardios, como Neun.
-
Mude metade do meio de escolha a cada 4 dias durante o processo de diferenciação neuronal.
Nota: mudanças médias mais extensas ou freqüentes diluem fatores tróficos essenciais e podem desfavorecer a maturação.- Para os neurônios WT126 derivados do iPSC, use os seguintes meios de cultivo pós-diferenciação: 5 mL de suplemento de N2 100x, 10 ng/mL de BDNF, 10 ng/mL de GDNF, 1 μg/mL de laminina, 200 μM de ácido ascórbico, 1 μM de dibutyryl-cAMP e 10 mL SM1 para 500 mL de meio/ mistura nutritiva F-12 (DMEM/F12). Gradualmente, usando meia-mídia muda, substituir com o meio neural basal (tabela de materiais) e os mesmos suplementos.
- Para os neurônios CVB WT derivados do iPSC, use o seguinte meio de cultivo pós-diferenciação: 500 mL de meio neural basal A (tabela de materiais) e 500 ml de meio DMEM/F12 com laminina a 2 μg/ml, suplemento de glutamina a 10 ml (tabela de materiais), 0,75 mg/ml de bicarbonato de sódio, 5 ml mínimo essencial médio (MEM) não essenciais aminoácidos, 0,2 mm ácido ascórbico, 10 ng/ml BDNF, 20 ml 50x B27, e 10 ml 100x N2 suplemento.
2. revestimento Multipoços
- O dia antes de replating, revestimento com poli-L-ornithine (PLO). Dissolver PLO em água estéril para fazer uma solução de estoque (10 mg/mL). Armazene este estoque em-20 ° c. Diluir PLO 1:100 em água para produzir uma concentração de 50 μg/mL quando o revestimento de vidro e 1:1000 relação (10 μg/mL) quando o revestimento de plástico.
- Aplique o revestimento diretamente nas placas alvo. Use o volume do revestimento apropriado ao tamanho da placa (isto é, para uma placa de 24 poços aplique 500 μL da solução de PLO por o poço).
- Permita que as placas se sentem no escuro durante a noite na temperatura ambiente.
- Recupere placas revestidas no dia de repique e de transferência a um armário estéril da Biossegurança.
- Aspirar a solução PLO e enxaguar duas vezes com água estéril.
- Diluir a laminina (1,15 mg/mL) em soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS) a 1:400 diluição.
Nota: Descongelar laminina a 4 ° c e adicionar rapidamente a PBS para evitar a agregação de laminina e revestimento irregular. - Aspirar água estéril e aplicar 500 μL de revestimento de laminina a poços previamente revestidos com PLO.
- Coloque as placas em uma incubadora de 37 ° c por um mínimo de 4-6 h. Use incubações mais longas, até 16 h, para superfícies de vidro. Use tempos de incubação consistentes.
3. replando neurônios diferenciados
- Enxágüe a placa de neurônios diferenciados com PBS uma vez delicadamente. Disperse PBS suavemente para baixo da parede da placa, e não diretamente sobre as células, para evitar interrompê-los.
- Gentilmente aspirar PBS, sendo cuidadoso para evitar tocar as células diretamente, mas para aspirar a partir da borda do prato, enquanto derrubá-lo para o pesquisador.
- Aplique no mínimo 1 mL da enzima proteolítica (tabela de materiais) por placa de 10 cm e células de retorno à incubadora. Adicione volumes ligeiramente mais elevados se a sala da cultura do tecido exibe uma taxa de evaporação elevada devido à baixa umidade.
- Incubar células com enzima proteolítica para 40-45 min, a fim de destacá-los da placa e desanexá-los de outros neurônios dentro da rede neuronal.
Nota: O tempo nesta etapa é crítico. Extinguir a protease muito cedo pode levar ao aumento da morte celular após a resposta. O fabricante da enzima proteolítica recomenda que as temperaturas muito inferiores a 37 ° c sejam utilizadas com períodos de incubação mais longos para as linhas celulares de de (por exemplo, durante a noite a 4 ° c). No entanto, os neurônios de manuseio a 4 ° c devem ser evitados, pois muitas vezes mostram a baixa sobrevida após a exposição ao frio. O fabricante igualmente indica que uma incubação de 60 minutos com a enzima em 37 ° c conduz a sua inactivação enzimática. Entretanto, na experiência dos autores, uma incubação de 40-45 minutos de culturas neuronal hiPSC-derivadas em 37 ° c é suficiente para a dissociação eficiente e a sobrevivência neuronal excelente em cima de responder. - Verifique os neurônios em um microscópio de contraste de fase durante o tempo de incubação e permitir que o tratamento de protease para continuar até que a rede neural se desconecta completamente da placa e começa a se separar em folhas menores ao agitar brevemente a placa o Microscópio.
- Saciar a atividade da protease usando 5 mL de mídia DMEM fresca por 1 mL de protease na placa de 10 cm para parar a digestão. Triturar suavemente as células contra a placa 5-8 vezes para interromper a rede, utilizando pipetas serológicas. Tenha cuidado para não aplicar demasiada pressão ao triturar, pois os neurônios diferenciados são frágeis. Não use uma ponta P1000, como o fim é muito afiada e estreita, e, portanto, pode pura ou danificar os neurônios.
- Aplique a solução com as pilhas através de um filtro da pilha com engranzamento do diâmetro de 100 μm em uma gota cónica fresca do tubo 50 mL pela gota.
- Enxague o filtro com um adicional de 5 mL de mídia DMEM fresca, após as células terem sido filtradas.
- Gire pilhas no centrifugador do de bancada em 1.000 x g por 5 minutos.
- Retorne o tubo cônico ao gabinete de biossegurança e aspirar a maioria dos meios de comunicação, deixando em torno de 250 μL para garantir que as células retenham a humidade.
- Reressuscite as células suavemente em 2 mL de mídia DMEM fresca. Não pipeta o pellet contra o lado do tubo. Em vez disso, inverta suavemente cónicos 2-3 vezes e passar as células através do final de um 5 mL de Pipet serológico para desalojar-los.
- Aplique 10 μL de neurônios ressuscipended na borda de um Hemocytometer.
- Adicionar 8-10 μL de azul de Tripan a gotículo de células para avaliar a viabilidade celular durante esta etapa de ressuscipensão. Aplique 10 μL desta mistura ao hemocitômetro ou aos outros contadores automáticos da pilha. Avaliar como viável as células que são fase brilhante e excluir o corante azul Tripan.
- Determine a quantidade de células/mL viáveis, e prepare-se para diluir o conteúdo do tubo cônico de acordo com a densidade da célula desejada.
- Placa ~ 10.000 células por poço para uma placa de 384 poços; placa ~ 150000-200000 células por poço para uma placa de 24 poços.
- Adicione o DMEM fresco ao tubo cônico das células reressuscitadas para obter a diluição apropriada e adicione suplementos apropriados adicionais, como B27 e/ou BDNF, dependendo dos requisitos da linha celular específica.
- Incline suavemente o tubo cônico para misturar 2-3 vezes.
- Aspire o revestimento do laminina da placa 24-well, ou da placa do de do 384-well usando um Pipet de 16 canais e enxague uma vez com PBS.
- Aspirar PBS usando um P1000 para a placa de 24 poços, ou a pipeta de 16 canais para placas 384-well.
- Aplique a solução da pilha a cada poço em um movimento da figura oito para evitar aglomerar. A uniformidade do chapeamento também pode ser otimizada usando dispositivos de manuseio de líquidos automatizados.
Nota: A adição de laminina para a mídia a partir de 2-4 dias pós-replating também ajuda a manter uma distribuição homogênea das células. - Repita as etapas 3,19 e 3,20 para cada poço.
- Retorne a placa à incubadora ajustada em 37 ° c e em 5% CO2.
- Depois de 2 dias, comece a mudar metade do meio a cada 4 dias usando a mídia de cultivo pós-diferenciação descrita na seção 1,2. Após o tempo de maturação desejado, fixar culturas usando 3,7% formaldeído a 37 ° c e células de mancha de acordo com as exigências experimentais.
4. ensaios de viabilidade celular post-replating
- Adicione o repórter de morte celular precoce (VivaFix: 0,5 μL da solução de estoque de 50 μL por 500 μL de mídia de cultura por poço) depois de rapidamente vortexing a solução de estoque.
- Imagem as células ao vivo e mortas cultivadas em multipoços de vidro-fundo, após 20 min, sem qualquer etapa de lavagem, uma vez que o corante fluoresce a apenas um dentro das células, ou correção e co-mancha com 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) e/ou outros anticorpos antes de imagem usando um microscópio confocal.
5. imunocoloração
- Corrija culturas com 3,7% de formaldeído em PBS mais 120 mM de sacarose por 20 min a 37 ° c.
- Enxague e Permeabilize com 0,2% Triton X-100 por 5 min à temperatura ambiente e, em seguida, bloqueie por 30 min com 2% de albumina sérica bovina (BSA).
- Aspire a BSA sem enxaguar e incubar por 1 h em temperatura ambiente com coelho MAP2 anticorpo 1:1000, mouse anti-β3 tubulina (TuJ1) Anticorpo 1:2000, frango anti-NeuN anticorpo (1:100) e Rat anti-CTIP2 anticorpo (1:500), ou com mouse anti-PSD95 ( 1:200), coelho anti-synapsin 1 (1:200) e frango anti-MAP2 anticorpo para coloração sináptica.
- Enxague com PBS, e incubar com os anticorpos secundários conjugados de Alexa fluor mais DAPI para 45 min em 37 ° c.
- Finalmente, lave duas vezes com PBS antes da imagem latente.
6. imagem latente do cálcio
- Infectar células cultivadas com AAV8-SYN-jGCAMP7f-WPRE (o Instituto Salk de estudos biológicos, GT3 Core Facility) em 10 dias após a reresposta e imagem para avaliar transientes de cálcio espontâneo em 3-4 semanas após a resposta.
7. aquisição e análise de imagens
Nota: Para mais informações sobre o sistema de aquisição, consultar Calabrese et al.12.
- Use um módulo de imagem para aquisição manual ou automatizada de imagens e um módulo de software de análise de imagem, como o CellProfiler13, para medições morfométricas.
- Calcule o comprimento médio de TuJ1 positivos e MAP2 dendritos positivos medindo o comprimento total por campo de visão dividido pelo número de neurônios (DAPI + MAP2 ou TuJ1 células positivas) dentro do mesmo campo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
A resposta de neurônios derivados de hiPSCs que foram diferenciadas por várias semanas oferece várias vantagens. No entanto, a desanexação e A resposta de neurônios diferenciados que têm dendritos e axônios longos e interligados (Figura 1a) podem resultar em uma fração alta de neurônios irreversivelmente danificados.
Como descrito na seção do protocolo, nós usamos a incubação com uma enzima proteolíticas para separar os neurônios do substrato. Tipicamente, devido à sua espessa malha de neuritos (Figura 1a),as células tendem a separar tudo de uma vez como uma única camada sincicial-like, que muitas vezes começa a flutuar no poço (Figura 1C). Isto acontece razoavelmente rapidamente, e é talvez porque a maioria de laboratórios tendem a recolher as pilhas após somente 5 minutos da incubação com sua enzima proteolíticas da escolha, e para quebrar imediatamente distante a folha das pilhas pela trituração (pipetting a acima e para baixo). No entanto, esta manipulação mecânica parece resultar em alta tensão para os neurônios. Acreditamos que o grau de estresse pode ser proporcional à área coberta pela rede neuronal, pois achamos que o dano aparente da incubação inadequada da protease é maior para placas de 10 cm ou maiores do que para placas de 35 mm ou menores. Assim, de forma contrária, verificou-se que prolongar a incubação enzimática para 40-45 min reduz a morte celular no momento da dissociação celular (Figura 1C) e permite uma recuperação mais eficiente de células ao vivo e saudáveis que emitem processos ao longo de horas a dias após a reresposta (Figura 1B). Presumivelmente, o tempo prolongado de incubação com uma enzima proteolítica leve permite a digestão parcial de proteínas que aderem fortemente as células e seus processos uns aos outros e à matriz extracelular. Isto permite que o processo do ressuspensão trabalhe eficientemente para separar pilhas individuais sem a necessidade para o trituration excessivamente vigoroso.
Para quantificar a efetividade do procedimento prolongado de incubação enzimática, avaliamos a viabilidade de células suspensas imediatamente após a trituração utilizando o azul de Tripan (Figura 1C) e, posteriormente, aos 1, 3 e 7 dias após a reresposta usando uma célula precoce marcador de óbito (Figura 2). Imediatamente após a trituração, a mancha azul do Tripan indicou que havia uma morte de pilha substancialmente maior após uma incubação de 5 minutos comparada a uma incubação de 45 minutos com a enzima proteolíticas (Figura 1C). As duas linhas de IPSC que nós usamos para ilustrar esta observação foram diferenciadas em neurônios do estágio neural do progenitor usando protocolos diferentes, e mostraram a sensibilidade extensamente diferente ao procedimento de repique. Culturas da linha WT126 diferenciadas em NPCs usando o "método de seleção de Roseta"7 foram mais sensíveis ao dano do que as culturas diferenciadas da linha CVB WT24 usando um método de diferenciação rápida8. Não obstante, para ambas as linhas o grau de morte imediata da pilha era aproximadamente Halved usando o procedimento prolongado da incubação da enzima.
Após a resposta, as culturas exibiram uma duplicação aproximada da viabilidade celular nos dias subsequentes, utilizando o procedimento prolongado de incubação enzimática, conforme determinado pela densidade de células DAPI-positivas (Figura 2B, gráfico à esquerda). Além disso, a incubação da enzima estendida resultou em uma menor densidade de células mortas ou morrendo detectadas usando um kit de viabilidade corante-exclusão (Figura 2B, gráfico à direita). A fração de células mortas detectada com o uso do ensaio de viabilidade após 24 h pós-resposta foi maior do que a observada com o azul de Tripan imediatamente após a trituração. Isto reflete provavelmente a acumulação de pilhas inoperantes e morrendo sobre estes primeiros 24 h, embora seja igualmente possível que o ensaio da viabilidade detecta mais sensivelmente a morte da pilha do que o ensaio azul do Tripan. As células mortas continuaram a ser detectadas durante 1-7 dias após a reresposta (Figura 2B). A densidade inicial do chapeamento para ambos os grupos experimentais (5 minutos e 45 minutos) era idêntica e baseada em contagens de pilha viva do hemocitômetro da suspensão da pilha do borne-trituration. Importante, em todos os pontos do tempo post-replating, o número de vivo, as pilhas saudáveis eram aproximadamente dobradas depois da incubação da enzima de 45 min comparada à incubação de 5 minutos. Estas observações foram confirmadas qualitativamente usando microscopia de contraste de fase para monitorar a morfologia celular em cada etapa: antes de responder, durante a resposta, e após a resposta (Figura 1 e Figura 2).
Uma das vantagens de reformular os neurônios derivados do hiPSC depois que eles têm sido diferenciadores por várias semanas é que a maioria das células terá saído do estágio progenitor e tornar-se comprometida com um fenótipo neuronal no momento da resposta. A fase de transição da diferenciação neuronal dos progenitores neurais ocorre ao longo de vários dias, com maior número de células que expressam gradualmente marcadores neuronais de estágio inicial, como a tubulina Beta-III (detectada pelo anticorpo TuJ1) ou MAP2. A expressão gênica evolui durante várias semanas, resultando, eventualmente, em expressão de marcadores Pan-neuronais de estágio tardio, como NeuN, ou marcadores específicos do tipo célula para neurônios corticais, como CTIP2. Conseqüentemente, o repique de neurônios hipsc-derivados previamente diferenciados permite que um estude eventos neuronal adiantados e transientes, tais como a iniciação do neurite, em subtipos identificados dos neurônios. A Figura 3 ilustra a presença imediata de marcadores neuronais precoces em culturas que foram rebanhadas após 4 semanas de pré-diferenciação em um prato de cultura maior. Note-se que os neurônios NeuN-e CTIP2-expressando são prontamente identificados dentro de alguns dias após a resposta (Figura 3). As características e o sincronismo da diferenciação neuronal podem variar entre linhas do hiPSC. Para a linha WT 126 e as linhas CVB WT24 descrevemos aqui, 85 ± 12% (n = 2) e 52 ± 11% (n = 5) das células, respectivamente, expressaram imunorreatividade para o marcador βIII-tubulin TuJ1 aos 4 dias após a resposta utilizando o procedimento prolongado de incubação da protease. Para ambas as linhas, 30-40% das células, e 80-90% dos neurônios também expressam a camada 5/6 marcador neokortikalny CTIP2. Além do que a viabilidade melhorada, o protocolo prolongado do protease igualmente aumentou moderadamente o conseqüência do neurite (comprimento médio do neurite por o Neuron), como mostrado na Figura 4. Tanto o comprimento do neurite total (quantificada usando o anticorpo Tuj1, que mancha ambos os axônios e dendrites; Figura 4 B, gráfico esquerdo) e crescimento de dendrito (quantificados usando map2, que mancha apenas dendritos; Figura 4 B, gráfico central) foram favorecidos quando se utiliza o procedimento prolongado de incubação da protease. Observe que o gráfico para contagens de células DAPI-positivas (DAPI (+)) na Figura 2 são baseados nas mesmas amostras de imagem que o gráfico de contagem de células na Figura 4, mas na Figura 2 eles foram quantificados usando um método não automatizado assistido pelo software Fiji, enquanto na Figura 4 eles foram quantificados usando a plataforma de software de análise de imagem automatizada cellprofiler. Estas duas abordagens de análise de imagem produziram resultados semelhantes.
A resposta é útil não só para estudar o crescimento do neurite, mas também para estudar sinapses ou outras características biológicas mais tarde aparecendo dos neurônios. Na verdade, após apenas uma semana após a resposta, observamos marcadores para muitas proteínas pré-sinápticas e postsynapticas decorando os dendritos neuronais em um padrão punctado (Figura 5a). Após 4 semanas, também começamos a detectar sua colocalização, que é um indicador da formação de sinapses funcionais (Figura 5a). Além disso, a atividade elétrica da despolarização espontânea e das correntes synaptically conduzidas é detectável usando a imagem latente do cálcio (Figura 5B) ou matrizes do multieletrodo (MEAs).
Figura 1 : Preservação superior da viabilidade neuronal após uma incubação mais longa com a enzima proteolíticas para a dissociação da pilha. (A) imagem de contraste de fase de neurônios derivados de NPC diferenciados por 3 semanas. A região em caixa na imagem à esquerda é ampliada à direita. Neste estágio os neurônios têm processos longos, que formam uma malha grossa. Barras de escala = 80 μm (esquerda); 35 μm (direita). (B) imagens selecionadas de neurônios derivados do hipsc aos 1 e 5 dias após a reresposta. Barra de escala = 100 μm. (C) esquerda: as células se desprendem como uma única folha em poucos minutos após o início do tratamento com protease. Barra de escala = 200 μm. Direita: depois que as pilhas da trituração são contadas no hemocitômetro antes de replating. Os gráficos mostram a quantificação de células positivas não viáveis, Tripan-azuis após 5 min ou 45 min de incubação com a enzima proteolítica para duas linhas diferentes CVB WT24 (* * * p < 0, 3, teste t não pareado) e WT 126 (* * * p < 0, 1, teste t não pareado). Os valores representam a média ± S. E. M de 4 repetições individuais. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Viabilidade neuronal após diversos dias pós-replating. (A) imagens de neurônios WT126 NPC-derivados em 1 e 3 dias após a reresposta usando 5 min e 45 min de incubação de protease. Células moribundas são rotuladas com o repórter sensível da morte celular precoce. As imagens correspondentes do brightfield são mostradas à esquerda. Alguns detritos celulares (seta azul) são tipicamente detectados após a resposta, especialmente no grupo de 5 min. Barras de escala = 150 μm. (B) imagens de culturas CVB WT24 NPC-derivadas em 1, 3 e 7 dias após a rereplação utilizando 5 min e 45 min de incubação de protease. As células moribundas são rotuladas com o repórter de morte de célula precoce sensível (vermelho). Todos os núcleos de células vivas e moribundas são rotulados com DAPI (ciano). O sinal branco mesclado representa as células DAPI e VivaFix positivo (+). Algumas células exibem VivaFix coloração, mas falta DAPI coloração (células vermelhas na imagem combinada à direita); Estas são células prováveis que morreram por muitas horas. Barras de escala: 25 μm. O gráfico direito mostra a quantificação da fração de células mortas (VivaFix/DAPI) após o tempo de incubação diferente com a enzima proteolítica (5 min vs 45 min: * p < 0, 5 1 d e * * * p < 0, 1, 3 d; ANOVA bidirecional, seguida de multicomparação teste post hoc de Bonferroni). Gráfico esquerdo mostra alterações na densidade da célula geral (# DAPI (+) células para 5 min vs 45 min: * * * p < 0, 1 para todos os pontos de tempo; ANOVA bidirecional, seguida de multicomparação teste post hoc de Bonferroni). Todos os valores são mostrados como a média ± S. E. M de 3 repetições, com um mínimo de 1.500 células pontuadas por condição. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Expressão detectável de marcadores neuronais de estágio tardio imediatamente após a resposta. Culturas de CVB WT24 células derivadas de hiPSC imaged 4 dias após a resposta, usando 45 min de incubação de protease, de um prato de 10 cm que tinha sido diferenciado do estágio NPC por 4 semanas. Os exemplos mostrados foram manchados para os marcadores Pan-neuronal TuJ1, MAP2, ou NeuN; ou o marcador de neurônio cortical de camada profunda CTIP2. Observe a presença de neuritos extensos e a expressão robusta de TuJ1 e MAP2. Note especialmente que uma fração substancial dos neurônios também expressa os marcadores de estágio tardio NeuN e CTIP2. Barra de escala = 16 μm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Crescimento do neurite e do dendrito sobre o tempo que segue a incubação mais curta e mais longa da enzima durante a resposta. (A) os neurônios derivados de CVB WT24 hipsc rapidamente estendem neurites, como detectado usando o anticorpo Tuj1. Observe que o tempo prolongado de incubação da protease promove a neuritogênese. Barra de escala = 25 μm. (B) quantificação do comprimento do neurite e dendrito, mais de 1, 3 e 7 dias após a reresposta usando 5 min ou 45 min de protease. O comprimento total do neurite foi quantificado da coloração de TuJ1 (βIII-tubulin); a coloração dendrite-específica foi quantificada do SNF de coloração MAP2 corrigido para a densidade de pilha total (gráfico direito). Todos os valores são mostrados como a média ± S. E. M de 3 repetições. Neurite comprimento 5 min vs 45 min: * p < 0, 5 em 1 dia e 7 dias, * * p < 0, 1 em 3 dia; dendrito comprimento 5 min vs 45 min: * * p < 0, 1 em 1 dia e 3 dias, não significativo (ns) em 7 dia; # DAPI (+) 5 min vs 45 min: * * * p < 0, 1 para todos os pontos de tempo; ANOVA bidirecional, seguida de multicomparação teste post hoc de Bonferroni. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 : Synaptogenesis e transientes espontâneos do cálcio em neurônios hiPSC-derivados diferenciados após a resposta. (A) esquerda: às 4 semanas após a reresposta usando o protocolo de incubação de protease estendido, o marcador pré-sináptico sinapsina 1 é detectável em aglomerados punctate ao longo dos dendrites map2 positivos. Barras de escala = 5 μm. Direita: região dendrítica selecionada mostrando colocalização entre clusters pré-sinápticos e pós-synapticos (seta amarela), uma indicação de sinapses potencialmente ativas. Barras de escala = 1,5 μm. (B) esquerda: neurônios derivados de hipsc infectados com AAV8-SYN-jGCaMP7f-wpre foram utilizados para monitorar transientes de cálcio espontâneos conduzidos por atividade de rede. A imagem do brightfield é mostrada adjacente à rendição do pseudocolor da fluorescência de GCaMP7 em um único ponto da hora na série do Time-Lapse. Barra de escala = 25 μm. os números coloridos indicam as 4 células selecionadas em que a fluorescência GCaMP7 foi medida ao longo do tempo, como mostrado nos traços à direita. Cada traço colorido corresponde a uma célula. O asterisco aponta para o tempo durante a gravação ao vivo para o qual a imagem à esquerda corresponde. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6 : Fluxo de trabalho de repique procedimentos para cultura hipscs para triagem de alto conteúdo e/ou estudos detalhados de diferenciação e conseqüência neurite ou gravações mea. Partindo de uma cultura diferenciada de neurônios cultivados por 4 ou mais semanas em um formato maior (por exemplo, um prato de cultura de 10 cm), os neurônios são incubados com uma protease por 40-45 min, triturados suavemente para dissociar e ressuscitados. As pilhas são distribuídas então em multi-poços compatíveis com o HCS, plaqueadas em carcaças compatíveis com os cones do crescimento da imagem latente (seta amarela) ou outras estruturas, ou em multi-poços apropriados para gravações da disposição do multieletrodo. Barras de escala = 27 μm, 5 μm, 2,5 μm, 130 μm (da esquerda para a direita). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nós demonstramos um procedimento reto para a ressuscita e a resposta de culturas neuronal humanas que aperfeiçoa a viabilidade, o sucesso da diferenciação, e a imagem latente subcellular em uma maneira que seja compatível com as plataformas elevadas da seleção satisfeita, e outros ensaios relevantes para a descoberta de fármacos. A Figura 6 ilustra o fluxo de trabalho geral e exemplos de tais aplicativos.
Embora aqui nós nos concentramos em neurônios derivados de hiPSC que são direcionados para um destino de neurônio cortical, esperamos que este método deve ser igualmente aplicável aos neurônios derivados de células-tronco embrionárias humanas, e aos neurônios derivados de células-tronco direcionados para outros fenótipos neuronais14,15,16,17,18. Além disso, nós Postulamos que este procedimento prolongado da protease pôde ser benéfico a outras situações que exigem o ressuspensão das pilhas que têm um meshwork estabelecido do neurite, por exemplo para a classificação de FACS ou análises da único-pilha de neurônios preliminares19 , vinteanos.
A resposta de neurônios derivados do hiPSC fornece um sistema de modelo viável para investigar mecanismos celulares e moleculares de muitos eventos biológicos importantes. Por exemplo, este procedimento pode facilitar estudos detalhados sobre as características do crescimento do neurite humano e do cone de expansão, e a comparação dos achados com a extensa base de conhecimento construída a partir de décadas de estudo de outras espécies, tanto de vertebrados como de invertebrados. Achamos que o procedimento de repique fez com que seja mais fácil otimizar as condições para gerar cones de crescimento maiores que são bem adequados para a avaliação óptica da estrutura e função subcelular (Figura 6). Em comparação, os cones de crescimento mais tipicamente observados durante a diferenciação inicial de neurônios de hiPSCs tendem a ser pequenos e compactos, e a densa variedade de células não-neuronais em tais culturas torna difícil tanto para ajustar as condições de substrato para promover o crescimento cone espalhando e para a imagem de crescimento individual cones dentro do ambiente de tecido complexo. Assim, repique neurônios em um prato fresco fornece uma ardósia mais limpa em que para ver cones de crescimento boas condições de imagem.
A resposta é particularmente vantajosa ao usar plataformas de cultura de células apropriadas para HCS porque reduz consideravelmente o tempo total em que as culturas são cultivadas em pequenos volumes. Os pequenos volumes de trabalho dos poços individuais de 96, 384 ou 1536-poços múltiplos (aproximadamente 100, 50 e 5 microlitros volume de trabalho, respectivamente) geralmente requer freqüentes (ou seja, diariamente) mudanças de mídia para neutralizar a evaporação e depleção de nutrientes. Mudanças freqüentes na mídia são dispendiosas, não só em termos de reagentes e de mão-de-obra, mas podem comprometer a viabilidade das culturas diluindo a mídia condicionada e aumentando as chances de as células se destacarem do substrato devido à turbulência mecânica. A resposta dos hipscs também pode facilitar o registro da atividade fisiológica usando matrizes multieletrodos21,22ou imagens ao vivo de culturas em ensaios de fenótipos neuronais dinâmicos23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho é um componente dos grupos nacionais cooperativos reprogramados da pesquisa da pilha (NCRCRG) para estudar a doença mental e foi apoiado pela concessão de NIH U19MH1 2015-0644. O trabalho inicial também foi apoiado pelo NIH Grant NS070297. Agradecemos aos Drs. Carol Marchetto e Fred Gage, o Instituto Salk, por fornecer a linha WT 126 de células progenitoras neurais, e DRS. Eugene Yeo e Lawrence Goldstein, UC San Diego para fornecer a linha CVB WT24 de células progenitoras neurais. Agradecemos a Deborah pre no laboratório do Dr. Anne Bang, Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute, para discussões úteis.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Post Replating Media | |||
| L-Ascorbic Acid | Sigma | A4403 | Add 1 mL of 200 mM stock to 1 L of N2B27 media |
| Dibutyryl-cAMP | Sigma | D0627 | Add 1 µM |
| Human BDNF | Peprotech | 450-02 | 10 ng/ml final concentration |
| B27 (50x) | Thermofisher Scientific | 17504044 | Add 20 mL to 1 L N2B27 media |
| DMEM/F12 with Glutamax | Thermofisher Scientific | 31331093 | Add N2 and distribute in 50 mL conicals; parafilm wrap lids |
| Human GDNF | Peprotech | 450-10 | 10 ng/mL final concentration |
| Glutamax | Thermofisher Scientific | 35050038 | Add 10 ml to 1 L N2B27 media; glutamine supplement |
| Mouse Laminin | Sigma | P3655-10mg | Add 100 µL to 50 mL N2B27 |
| MEM Nonessential Amino Acids | Thermofisher Scientific | 11140035 | Add 5 mL to 1 L N2B27 media |
| N2 (100x) Supplement | Life Technologies | 17502048 | Add 5 mL to 500 mL media |
| Neurobasal A Media | Thermofisher Scientific | 10888022 | Combine with DMEM/F12 to generate N2B27 media for CVB wt cells; neural basal A media |
| Neurobasal Media | Thermofisher Scientific | 21103049 | for WT126 cells; neural basal media |
| SM1 Supplement | StemCell Technologies | 5711 | Add 1:50 to media |
| Sodium bicarbonate | Thermofisher Scientific | 25080-094 | Add 10 mL to 1 L N2B27 media |
| Plate Preparation | |||
| 10 cm Tissue Culture Dishes | Fisher Scientific | 08772-E | Plastic TC-treated dishes |
| 6-well Tissue Culture Dishes | Thomas Scientific | 1194Y80 | NEST plates |
| Mouse Laminin | Life Technologies | 23017-015 | Add 1:400 on plastic |
| Poly-Ornithine | Sigma | P3655-10mg | Add 1:1,000 on plastic |
| UltraPure Distilled Water | Life Technologies | 10977-015 | To dilute Poly-L-Ornithine |
| Replating Reagents | |||
| 100 mM Cell Strainer | Corning | 431752 | Sterile, individually wrapped |
| 384-well plate, uncoated | PerkinElmer | 6007550 | Coat with PLO and Laminin |
| DPBS | Life Technologies | 14190144 | Dulbecco's phosphate-buffered saline |
| Poly-D-Lysine-Precoated 384-well Plates | PerkinElmer | 6057500 | Rinse before coating with laminin |
| StemPro Accutase | Life Technologies | A1110501 | Apply 1 mL/10 cm plate for 30-45 min; proteolytic enzyme |
| Fixation Materials | |||
| 37% Formaldehyde | Fisher Scientific | F79-1 | Dissolved in PBS |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-12 | 0.8 g per 10 mL of fixative |
| Immunostaining Materials | |||
| Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse | Invitrogen | A-11001 | secondary antibody |
| Alexa Fluor 568 Goat anti-chicken | Invitrogen | A-11041 | secondary antibody |
| Alexa Fluor 647 Goat anti-chicken | Invitrogen | A-21449 | secondary antibody |
| Alexa Fluor 561 Goat anti-rat | Invitrogen | A-11077 | secondary antibody |
| DAPI | Biotium | 40043 | visualizes DNA |
| Mouse antibody against b3-tubulin (TuJ-1) | Neuromics | MO15013 | early stage neuronal marker |
| Rat antibody against CTIP2 | Abcam | ab18465 | layer 5/6 cortical neurons |
| Chicken antibody against MAP2 | LifeSpan Biosciences | LS-B290 | early stage neuronal marker |
| Chicken antibody against NeuN | Millipore | ABN91 | late stage neuronal marker |
| Rabbit antibody against MAP2 | Shelley Halpain | N/A | early stage neuronal marker |
| Mouse antibody against PSD-95 | Sigma | P-246 | post-synaptic marker |
| Rabbit antibody against Synapsin 1 | Millipore | AB1543 | pre-synaptic marker |
| Bovine serum albumin (BSA) | GE Healthcare Life Sciences | SH30574.02 | 10% in PBS for blocking |
| Titon X-100 | Sigma | 9002931 | Dilute to 0.2% on PBS for permeabilization |
| Viability Markers | |||
| Vivafix 649/660 | Biorad | 135-1118 | cell death marker |
| Calcium Imaging | |||
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| AAV8-syn-jGCAMP7f-WPRE | THE SALK INSTITUTE, GT3 Core Facility | N/A | calcium reporter in a viral delivery system |
| hiPSC-derived NPCs | |||
| WT 126 (Y2610) | Gage lab | N/A | Marchetto et al., 2010 |
| CVB WT24 | Yeo and Goldstein labs | N/A | unpublished |
References
- Engel, M., Do-Ha, D., Munoz, S. S., Ooi, L. Common pitfalls of stem cell differentiation: a guide to improving protocols for neurodegenerative disease models and research. Cell and Molecular Life Sciences. 73 (19), 3693-3709 (2016).
- Kim, D. S., Ross, P. J., Zaslavsky, K., Ellis, J. Optimizing neuronal differentiation from induced pluripotent stem cells to model ASD. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 109 (2014).
- Amin, N. D., Paşca, S. P. Building Models of Brain Disorders with Three-Dimensional Organoids. Neuron. 100 (2), 389-405 (2018).
- Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Passaging Cells. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2019).
- Langdon, S. P. Cancer Cell Culture. , Humana Press. New York, NY. (2010).
- Picot, J. Human Cell Culture Protocols. 107, Springer Science & Business Media. Berlin, Germany. (2005).
- Marchetto, M. C., et al. A model for neural development and treatment of Rett syndrome using human induced pluripotent stem cells. Cell. 143 (4), 527-539 (2010).
- Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks. Nature Protocols. 7 (10), 1836-1846 (2012).
- Banker, G., Goslin, K.
- Calabrese, B., Halpain, S. Essential role for the PKC target MARCKS in maintaining dendritic spine morphology. Neuron. 48 (1), 77-90 (2005).
- Mullen, R. J., Buck, C. R., Smith, A. M. NeuN, a neuronal specific nuclear protein in vertebrates. Development. 116 (1), 201-211 (1992).
- Calabrese, B., Saffin, J. M., Halpain, S. Activity-dependent dendritic spine shrinkage and growth involve downregulation of cofilin via distinct mechanisms. PLOS One. 9 (4), 94787 (2014).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. 7 (10), 100 (2006).
- Gupta, S., et al. Deriving Dorsal Spinal Sensory Interneurons from Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Reports. 10 (2), 390-405 (2018).
- Ogura, T., Sakaguchi, H., Miyamoto, S., Takahashi, J. Three-dimensional induction of dorsal, intermediate and ventral spinal cord tissues from human pluripotent stem cells. Development. 145, (2018).
- Playne, R., Jones, K., Connor, B. Generation of dopamine neuronal-like cells from induced neural precursors derived from adult human cells by non-viral expression of lineage factors. Journal of Stem Cells and Regenerative Medicine. 14 (1), 34-44 (2018).
- Rao, M. S., et al. Illustrating the potency of current Good Manufacturing Practice-compliant induced pluripotent stem cell lines as a source of multiple cell lineages using standardized protocols. Cytotherapy. 20 (6), 861-872 (2018).
- Suga, H. Differentiation of pluripotent stem cells into hypothalamic and pituitary cells. Neuroendocrinology. 101 (1), 18-24 (2015).
- Endaya, B., et al. Isolating dividing neural and brain tumour cells for gene expression profiling. Journal of Neuroscience Methods. 257, 121-133 (2016).
- Sergent-Tanguy, S., Chagneau, C., Neveu, I., Naveilhan, P. Fluorescent activated cell sorting (FACS): a rapid and reliable method to estimate the number of neurons in a mixed population. Journal of Neuroscience Methods. 129 (1), 73-79 (2003).
- Frega, M., et al. Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays. Journal of Visualized Experiments. (119), e54900 (2017).
- Grainger, A. I., et al. In vitro Models for Seizure-Liability Testing Using Induced Pluripotent Stem Cells. Frontiers in Neuroscience. 12, 590 (2018).
- Daub, A., Sharma, P., Finkbeiner, S. High-content screening of primary neurons: ready for prime time. Current Opinion in Neurobiology. 19 (5), 537-543 (2009).
