Summary
يصف هذا البروتوكول إجراء مفصل لإعادة تعليق وزراعة الخلايا الجذعية البشرية المشتقة من الخلايا العصبية التي كانت تختلف سابقا عن الذرية العصبية في المختبر لعدة أسابيع. يسهل هذا الإجراء الاختبارات المستندة إلى التصوير للنيوريت، ونقاط الاشتباك العصبي، وعلامات الخلايا العصبية التي يتم التعبير عنها في وقت متأخر في شكل متوافق مع الفحص المجهري الخفيف وفحص المحتوى العالي.
Abstract
تمثل الخلايا العصبية المتمايزة في الثقافة ثنائية الأبعاد من الخلايا الجذعية البشرية المتعددة القوى خلايا السلف العصبية المشتقة من الخلايا الجذعية (NPCs) نظام نموذج قوي لاستكشاف آليات المرض وإجراء فحص المحتوى العالي (HCS) لاستجواب المركب المكتبات أو تحديد الأنماط الظاهرية للطفرة الجينية. ومع ذلك، مع الخلايا البشرية الانتقال من المجلس الوطني لنواب الشعب الصيني إلى وظيفية، الخلايا العصبية الناضجة يتطلب عدة أسابيع. عادة ما تبدأ نقاط الاشتباك العصبي في تشكيل بعد 3 أسابيع من التمايز في ثقافة الطبقة الأحادية، والعديد من البروتينات الخاصة بالخلايا العصبية، على سبيل المثال في وقت لاحق التعبير عن علامة عموم الخلايا العصبية NeuN، أو طبقة 5/6 الدماغ علامة الخلايا العصبية القشرية CTIP2، تبدأ في التعبير عن حوالي 4-5 أسابيع بعد التمايز. يمكن أن يكون هذا الوقت التمايز طويلة غير متوافقة مع ظروف الثقافة المثلى المستخدمة لأحجام صغيرة، منصات HCS متعددة الآبار. ومن بين التحديات العديدة الحاجة إلى خلايا مُتقيدة بشكل جيد وموزعة بشكل موحد مع الحد الأدنى من تجميع الخلايا، والإجراءات الثقافية التي تعزز القدرة على البقاء على المدى الطويل والنضج الوظيفي للمشبك. نهج واحد هو التمييز بين الخلايا العصبية في شكل حجم كبير، ثم لوحة لهم في وقت لاحق نقطة في سداسي كلورو البنزين متوافقة مع الآبار المتعددة. بعض التحديات الرئيسية عند استخدام هذا النهج replating تتعلق استنساخ وجدوى الخلية، وذلك بسبب تعطيل المجهدة للشبكة التقشرية وaxonal. هنا نقوم بتوضيح إجراء مفصل وموثوق به لإعادة تعليق الخلايا العصبية المتعددة القوى التي يسببها الإنسان (hiPSC) بعد تمايزها لمدة 4-8 أسابيع في شكل كبير الحجم، ونقلها إلى ميكروتيدر 384-well لوحات ، وزراعة لهم لمدة 1-3 أسابيع أخرى مع بقاء الخلية ممتازة. هذا replating من الخلايا العصبية البشرية لا يسمح فقط دراسة التجميع متشابك والنضج في غضون أسبوعين من replating، ولكن أيضا تمكن دراسات تجديد النيورايت وخصائص مخروط النمو. نحن نقدم أمثلة على الاختبارات القابلة للتحجيم لنشأة النُشَع ومتشابك باستخدام منصة 384-well.
Introduction
الخلايا الجذعية البشرية متعددة القوى (hiPSC) الخلايا العصبية المشتقة من أهمية متزايدة في مجالات البحوث الأساسية، وتطوير المخدرات، والطب التجديدي. سير العمل والإجراءات لتحسين ثقافتهم وصيانتها، وتحسين كفاءة التمايز في أنواع فرعية عصبية محددة، تتطور بسرعة1،2. لتحسين فائدة وفعالية التكلفة للخلايا العصبية المستمدة من الخلايا الجذعية البشرية كأنظمة نموذجية قابلة للتحليلات عالية المحتوى في اكتشاف المخدرات والتحقق من الهدف، فمن المفيد تقليل الوقت التركيب اللازم لتوليد ناضجة، وظيفية الخلايا العصبية، مع الحفاظ على أقصى قدر من المتانة، واستنساخ، وأهمية النمط الظاهري. على الرغم من أن الثقافات العضوية ثلاثية الأبعاد تقود اختراقات في أبحاث تطوير الأعصاب3،إلا أن الثقافات أحادية الطبقة ثنائية الأبعاد متوافقة بشكل خاص مع التطبيقات الآلية القائمة على التصوير بسبب الحد الأدنى من سمك الأنسجة.
ومع ذلك، فإن تكييف أساليب الفحص القائم على التصوير مع نماذج الأمراض العصبية والعصبية والتنموية البشرية يواجه تحدياً كبيراً. الإطار الزمني المطول الذي ينضج الجهاز العصبي البشري في الجسم الحي يتطلب وقتا طويلا في الثقافة لاستيعاب البرامج الطبيعية للتعبير الجيني وتحقيق النضج العصبي.
إحدى النتائج العملية لبرنامج التمايز العصبي الطويل هو أن الحفاظ على الثقافات أحادية الطبقة المشتقة من hiPSC يجب أن تستمر لعدة أسابيع لتحقيق النضج متشابك كافية. خلال هذا الوقت، لا تزال الذرية العصبية التي لا تزال غير متمايزة الانقسام. هذه يمكن أن تزيد بسرعة من الثقافة واغتصاب المحتوى الغذائي المطلوب للحفاظ على الخلايا العصبية ما بعد الولادة قابلة للحياة. تقسيم بقوة الخلايا السلف العصبية (NPCs) يمكن أيضا أن تتنافس مع الخلايا العصبية لالركيزة النمو. وهذا يمكن أن يجعل هذه الثقافات عرضة لمشاكل التصاق ضعيف، وهو شرط غير مناسب للفحص القائم على التصوير. وعلاوة على ذلك، يجد العديد من المحققين أنه كلما كان حجم الثقافة أصغر، كلما زادت صعوبة الحفاظ على السكان الأصحاء من الخلايا العصبية المتمايزة لفترة كافية لمراقبة المراحل المتأخرة من التمايز العصبي. وبعبارة أخرى، يمكن أن تكون الاختبارات من نضج متشابك باستخدام نهج فحص المحتوى العالي (HCS) تحديا كبيرا للخلايا العصبية المستمدة من الإنسان.
للتحايل على بعض هذه المشاكل، تم استخدام إجراء لإعادة تعليق وإعادة طلاء الخلايا العصبية المستمدة من hiPSC المتمايزة سابقا. أولا، فإنه يسمح بدراسة نمو نيورايت (أو، على نحو أكثر دقة، تجديد النيورايت) في مجموعة من الخلايا العصبية ملتزمة تماما. ثانيا، إعادة طلاء الخلايا العصبية المتمايزة سابقا من شكل حجم كبير (مثل لوحات 10 سم أو أكبر)، وصولا إلى تنسيقات حجم صغيرة (مثل لوحات متوافقة مع HCS 96- أو 384 جيدا microtiter) تمكن من انخفاض كبير في مجموع وقت الزراعة في حالة حجم صغير. وهذا يسهل دراسة تجميع المشبك والنضج على مدى الأسابيع اللاحقة في المختبر.
ومع ذلك، فإن إعادة طلاء الخلايا العصبية الناضجة التي أنشأت بالفعل النيوريتات الطويلة وشبكة اتصال معقدة يطرح العديد من التحديات، واحدة منها هو معدل عالية ومتغيرة في بعض الأحيان من موت الخلايا. هنا، ونحن نصف إجراء replating التي تؤدي إلى البقاء على قيد الحياة الخلية ممتازة واستنساخ. عادة، تتعرض الخلايا العصبية للإنزيمات البروتيوليتيك لفترات حضانة قصيرة (عادة ~ 3-10 دقيقة) من أجل فصل الخلايا عن الركيزة قبل الثلاثية. يتم استخدام هذا الوقت البروتيوليسي وجيزة عادة لإعادة تعليق وتمرير العديد من أنواع الخلايا القسمة، بما في ذلك الخلايا غير العصبية والprogenitors غير متمايزة4،5،6. ومع ذلك، بالنسبة للخلايا العصبية المتمايزة التي تحمل النيوريتيات طويلة ومترابطة، فمن الضروري ليس فقط لفصل الخلايا عن الركيزة ولكن أيضا لتعطيل الشبكة الجذعية والإبطية من أجل عزل الخلايا الفردية مع تقليل الضرر. في الواقع، شبكة سميكة من الخلايا العصبية عادة ما يميل إلى فصل من الركيزة كورقة واحدة، بدلا من الخلايا الفردية. إذا لم يتم اتخاذ العناية لتخفيف شبكة سميكة من النيورايتات، الخلايا العصبية لا تصبح فقط تضررت لا رجعة فيه أثناء trituration، ولكن العديد منهم تفشل في تمرير من خلال مرشح المستخدمة لإزالة كتل، مما أدى إلى ضعف العائد الخلوي. فيما يلي وصف تعديل بسيط لإجراء حضانة البروتياز المستخدمة على نطاق واسع لمواجهة هذه الصعوبات.
في البروتوكول الموضح أدناه، يتم احتضان الخلايا العصبية لمدة 40-45 دقيقة مع البروتياز خفيفة، مثل الإنزيم البروتيوليتيك (على سبيل المثال، Accutase). خلال أول 5-10 دقيقة بعد إضافة الإنزيم، والشبكة العصبية يرفع قبالة من الركيزة كورقة. الحضانة مع البروتياز يستمر لمدة 30-40 دقيقة إضافية قبل المضي قدما مع trituration لطيف وتصفية. يساعد هذا الوقت الإضافي للحضانة على ضمان أن هضم المادة يرتاح الشبكة بين الخلايا، مما يضمن أن التتثّة اللاحقة تنتج تعليق الخلايا الفردية. هذا الإجراء يزيد من توحيد توزيع الخلايا عند إعادة الطلاء مع تقليل موت الخلايا. لقد طبقنا بنجاح هذه الطريقة replating إلى الثقافات العصبية المستمدة hiPSC التي تم إنشاؤها بواسطة بروتوكولات التمايز المختلفة7و8 ومن خطوط مختلفة من hiPSCs. الإجراء هو مناسبة اسميا للاستخدام مع معظم أو كل خطوط الخلايا العصبية المشتقة من الخلايا الجذعية. وقد لاحظنا أن تمديد فترة حضانة البروتياز ليس ضروريا ً تماماً لإعادة طلاء الثقافات من لوحات صغيرة الشكل (على سبيل المثال، قطر 35 مم)؛ ومع ذلك، كما نعرض هنا، فإنه يوفر فائدة كبيرة عند replating من لوحات قطرها كبير (على سبيل المثال، 10 سم قطرها أو أكبر)، ربما لأن neurites في مثل هذه اللوحات يمكن أن تمتد عمليات طويلة جدا وتشكل مجموعة مترابطة بشكل كثيف.
هنا نقوم بتوضيح هذه الطريقة ونوضح بإيجاز تطبيقها في الاختبارات لتكوين النيوريتوجينيس المبكر ونضج المشبك، والذي ينطوي على تجميع البروتينات قبل وpostsynaptic على طول dendrites وaxons، تليها في وقت لاحق التعريب المشترك في مواقع متشابك. وتبرز الأمثلة المزايا التي يوفرها هذا البروتوكول في الحفاظ على صلاحية الخلايا وإمكانية استنساخها. أولا، فإنه يسمح للمحققين لدراسة الخطوات المبكرة في تكوين النييوريات البشرية. يشبه الإعداد التجريبي الثقافات الأولية الشائعة الاستخدام للخلايا العصبية القشرية أو فرس النهر، حيث يتم استخراج الخلايا من الدماغ الجنيني المتأخر أو في وقت مبكر بعد الولادة، وينفصل عن طريق التريتوريشن بعد العلاج البروتياز لطيف، ويسمح ل بدء النيوريت أو لتجديد النيوريت اتى في الإجراء9،10. على غرار هذه الخلايا العصبية الأولية القوارض، الخلايا العصبية المستمدة من hiPSC تبدأ في تشكيل أو تجديد النيورايتات في غضون ساعات بعد إعادة الطلاء، مما يسمح بتصوير المخاريط النمو ومورفولوجيا النيورايت في بيئة الأمثل للتصوير الفناءي عالية مع أقل المحيطة الخلايا غير المتمايزة. وقد لاحظنا أن نمو نيورايت هو أكثر تزامنا بالمقارنة مع التأخيرات المتغيرة ومعدلات النمو المختلفة التي ينظر إليها عندما تبدأ الخلايا العصبية لأول مرة في التمييز بين السكان السلف. وبالإضافة إلى ذلك، يتيح replating اختبار الخلايا العصبية التي تعبر عن علامات النوع الفرعي العصبي التي تظهر عادة في وقت لاحق في التطور العصبي، مثل طبقة القشرية 5/6 عامل النسخ CTIP2 (الدجاج ovalbumin النسخ المروج المنبع عامل التفاعل البروتين 2)، أو علامة عموم الخلايا العصبية NeuN11. ومن السمات المفيدة بشكل خاص لنهج إعادة الطلاء أن عملية تكوين المشبك تمضي ضمن إطار زمني متوافق مع HCS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. فترة التمايز قبل إعادة الطلاء
- تمييز الخلايا العصبية على أطباق 10 سم، وذلك باستخدام بروتوكول من اختيار7،8 حتى شكلت الخلايا العصبية شبكة سميكة مع عملياتها والتعبير ليس فقط علامات الخلايا العصبية في وقت مبكر مثل MAP2 أو TuJ1، ولكن أيضا علامات في وقت متأخر مثل NeuN.
-
تغيير نصف وسيلة الاختيار كل 4 أيام خلال عملية التمايز العصبية.
ملاحظة: تغييرات متوسطة أكثر اتساعاأو تواترا تضعف العوامل الغذائية الأساسية، ويمكن أن لا تفضل النضج.- بالنسبة للخلايا العصبية WT126 المشتقة من iPSC، استخدم وسائط الزراعة التالية بعد التمايز: 5 مل 100x N2 الملحق، 10 نانوغرام/مل BDNF، 10 نانوغرام/مل GDNF، 1 ميكروغرام/مل لامينين، 200 ميكرو متر حمض الاسكوربيك، 1 ميكرو متر ديبوتيريل-cAMP و 10 مل SM1 ل500 مل دولبكو تعديل النسر المتوسط/ خليط المغذيات F-12 (DMEM /F12). تدريجيا، وذلك باستخدام التغيرات نصف وسائلالإعلام، واستبدال مع المتوسطة القاعدية العصبية (جدول المواد) ونفس المكملات الغذائية.
- للخلايا العصبية CVB WT المشتقة من iPSC، استخدم المتوسط التالي بعد التمايز: 500 مل الأساسية العصبية A المتوسطة (جدولالمواد)و 500 مل DMEM /F12 المتوسطة مع 2 ميكروغرام / مل لامينين، 10 مل الجلوتامين الملحق (جدولالمواد)، 0.75 ملغم/مل بيكربونات الصوديوم، 5 مل الحد الأدنى من الأحماض الأمينية الأساسية (MEM)، 0.2 م حمض الاسكوربيك، 10 نانوغرام /مل BDNF، 20 مل 50X B27، و 10 مل 100X N2 الملحق.
2. طلاء الآبار المتعددة
- في اليوم السابق لإعادة الطلاء، معطف مع بولي-L-ornithine (منظمة التحرير الفلسطينية). إذابة منظمة التحرير الفلسطينية في الماء المعقم لجعل محلول الأوراق المالية (10 ملغ / مل). تخزين هذا المخزون في -20 درجة مئوية. تخفيف PLO 1:100 في الماء لإنتاج تركيز 50 درجة مئوية / مل عند طلاء الزجاج ونسبة 1:1000 (10 ميكروغرام / مل) عند طلاء البلاستيك.
- تطبيق الطلاء مباشرة على لوحات الهدف. استخدام حجم الطلاء المناسب لحجم لوحة (أي، للوحة 24 جيدا تطبيق 500 درجة مئوية من حل منظمة التحرير الفلسطينية في بئر).
- السماح لوحات للجلوس في الظلام بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
- استرداد لوحات المغلفة في يوم إعادة الطلاء ونقلها إلى مجلس الوزراء السلامة البيولوجية العقيمة.
- يستنشق حل منظمة التحرير الفلسطينية ويشطف مرتين بالماء المعقم.
- تمييع اللامينين (1.15 ملغم/مل) في محلول ملحي مُسَنَّق بالفوسفات (PBS) في 1:400 تخفيف.
ملاحظة: ذوبان اللامينين في 4 درجة مئوية وإضافة بسرعة إلى PBS لتجنب تجميع اللامينين وطلاء متفاوتة. - يستنشق الماء المعقم ويطبق 500 لتر من طلاء اللامينين على الآبار المغلفة سابقا مع منظمة التحرير الفلسطينية.
- ضع لوحات في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 4-6 ح. استخدام الحضانة أطول، تصل إلى 16 ساعة، للأسطح الزجاجية. استخدام أوقات الحضانة متسقة.
3. إعادة طلاء الخلايا العصبية المتمايزة
- شطف لوحة من الخلايا العصبية المتمايزة مع PBS مرة واحدة بلطف. تفريق PBS بلطف أسفل جدار اللوحة، وليس مباشرة على الخلايا، لتجنب تعطيلها.
- يستنشق بلطف PBS، والحرص على تجنب لمس الخلايا مباشرة ولكن لاستنشاق من حافة الطبق في حين يميل نحو الباحث.
- تطبيق على الأقل 1 مل من الإنزيمبروتيوليتيك (جدول المواد) لكل لوحة 10 سم وإعادة الخلايا إلى الحاضنة. إضافة أحجام أعلى قليلا إذا كانت غرفة زراعة الأنسجة يعرض معدل تبخر عالية بسبب انخفاض الرطوبة.
- حضانة الخلايا مع إنزيم بروتيوليتيك لمدة 40-45 دقيقة من أجل فصلها عن لوحة وفصلها عن الخلايا العصبية الأخرى داخل شبكة الخلايا العصبية.
ملاحظة: التوقيت في هذه الخطوة أمر بالغ الأهمية. يمكن أن يؤدي تبريد البروتياز في وقت مبكر جداً إلى زيادة موت الخلايا بعد إعادة الطلاء. توصي الشركة المصنعة للإنزيم البروتيوليتيك باستخدام درجات حرارة أقل بكثير من 37 درجة مئوية مع فترات حضانة أطول لخطوط الخلايا التمرير (على سبيل المثال، بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية). ومع ذلك, التعامل مع الخلايا العصبية في 4 °C ينبغي تجنب, كما أنها غالباً ما تظهر ضعف البقاء على قيد الحياة بعد التعرض البارد. وتقول الشركة المصنعة أيضا أن حضانة 60 دقيقة مع الإنزيم في 37 درجة مئوية يؤدي إلى تعطيل الأنزيمية. ومع ذلك، في تجربة المؤلفين، و40-45 دقيقة حضانة من الثقافات العصبية المستمدة hiPSC في 37 درجة مئوية يكفي للانفصال فعالة والبقاء على قيد الحياة الخلايا العصبية ممتازة عند إعادة الطلاء. - تحقق من الخلايا العصبية على مجهر على النقيض من المرحلة خلال وقت الحضانة والسماح لعلاج البروتياز لمواصلة حتى الشبكة العصبية ينفصل تماما عن لوحة ويبدأ في كسر في أوراق أصغر عند هز لفترة وجيزة لوحة تحت المجهر.
- تبريد نشاط البروتياز باستخدام 5 مل من وسائل الإعلام DMEM الطازجة لكل 1 مل من البروتياز في لوحة 10 سم لوقف الهضم. تُطوّر الخلايا بلطف ضد ّ اللوحة 5-8 مرات لتعطيل الشبكة، وذلك باستخدام الماصات المصلية. يجب الحرص على عدم تطبيق الكثير من الضغط عند triturating، كما الخلايا العصبية المتمايزة هشة. لا تستخدم طرف P1000، كما نهاية حادة جدا وضيقة، وبالتالي يمكن أن محض أو تلف الخلايا العصبية.
- تطبيق الحل مع الخلايا من خلال مصفاة الخلية مع شبكة قطرها 100 ميكرومتر في انخفاض أنبوب مخروطي جديد 50 مل قطرة قطرة.
- شطف مصفاة مع 5 مل إضافية من وسائل الإعلام DMEM الطازجة، بعد الخلايا قد تمت تصفيتها من خلال.
- تدور الخلايا في جهاز الطرد المركزي benchtop في 1000 × ز لمدة 5 دقائق.
- العودة أنبوب مخروطي إلى مجلس الوزراء السلامة البيولوجية واستنشاق معظم وسائل الإعلام، وترك حوالي 250 درجة مئوية لضمان الخلايا الاحتفاظ بالرطوبة.
- إعادة تعليق الخلايا بلطف في 2 مل من وسائل الإعلام DMEM الطازجة. لا ماصة بيليه ضد جانب الأنبوب. بدلا من ذلك، عكس بلطف مخروطي 2-3 مرات وتمرير الخلايا من خلال نهاية الأنابيب المصلية 5 مل لخلعها.
- تطبيق 10 ميكرولتر من الخلايا العصبية التي تم تعليقها على حافة مقياس الهيموكيتوماتومتر.
- إضافة 8-10 درجة مئوية من التريبان الأزرق لإسقاط الخلايا لتقييم صلاحية الخلية خلال هذه الخطوة إعادة تعليق. تطبيق 10 ميكرولتر من هذا الخليط على مقياس الهيموكيتومات أو غيرها من عدادات الخلايا التلقائية. تقييم قابلة للحياة تلك الخلايا التي هي مرحلة مشرقو واستبعاد صبغة الأزرق trypan.
- تحديد كمية الخلايا القابلة للحياة / مل، والاستعداد لتخفيف محتويات الأنبوب المخروطي وفقا لكثافة الخلية المطلوبة.
- لوحة ~ 10،000 خلية في بئر للوحة 384 جيدا؛ لوحة ~ 150،000-200،000 خلية في بئر للوحة 24 جيدا.
- إضافة DMEM جديدة إلى أنبوب مخروطي من الخلايا المعاد تعليقها لتحقيق التخفيف المناسب وإضافة ملاحق مناسبة إضافية مثل B27 و / أو BDNF, اعتمادا على متطلبات خط الخلية محددة.
- إمالة بلطف أنبوب مخروطي لخلط 2-3 مرات.
- قم بتسطي طلاء اللامينين من لوحة 24 بئر، أو من لوحة multiwell 384-well باستخدام أنبوب 16 قناة وشطف مرة واحدة مع PBS.
- قم بإستعصاق PBS باستخدام P1000 للوحة 24 بئر، أو ماصة 16 قناة للوحات 384 جيدا.
- تطبيق حل الخلية على كل بئر في حركة الشكل 8 لتجنب تكتل. ويمكن أيضا تحسين التوحيد الطلاء باستخدام أجهزة المناولة السائلة الآلي.
ملاحظة: إضافة اللامينين إلى وسائل الإعلام بدءا من 2-4 أيام بعد replating يساعد أيضا على الحفاظ على توزيع متجانسة من الخلايا. - كرر الخطوتين 3.19 و 3.20 لكل بئر.
- العودة لوحة إلى حاضنة تعيين في 37درجة مئوية و 5٪ CO 2.
- بعد يومين، ابدأ في تغيير نصف المتوسط كل 4 أيام باستخدام وسائط ما بعد التمايز الموصوفة في القسم 1.2. بعد وقت النضج المطلوب، إصلاح الثقافات باستخدام 3.7٪ الفورمالديهايد في 37 درجة مئوية وخلايا وصمة عار وفقا لمتطلبات التجريبية.
4. خلية الصلاحية اختبار ما بعد replating
- إضافة مراسل الموت الخلية في وقت مبكر (VivaFix: 0.5 € L من محلول الأسهم 50 درجة مئوية لكل 500 μL وسائل الإعلام الثقافة في بئر) بعد دوامة لفترة وجيزة حل الأسهم.
- صورة الخلايا الحية والميتة المستزرعة على multiwells الزجاج القاع، بعد 20 دقيقة، دون أي خطوة الغسيل، منذ الفلوروسيس صبغ مرة واحدة فقط داخل الخلايا، أو إصلاح ووصمة عار مشتركة مع 4 '، 6-دياميدينو-2-فينيليندول (DAPI) و / أو الأجسام المضادة الأخرى قبل التصوير باستخدام مجهر بؤري.
5. تلطيخ المناعة
- إصلاح الثقافات مع 3.7٪ الفورمالديهايد في PBS بالإضافة إلى 120 مليون متر السكروز لمدة 20 دقيقة في 37 درجة مئوية.
- شطف وpermeabilize مع 0.2٪ تريتون X-100 لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، ومن ثم كتلة لمدة 30 دقيقة مع 2٪ الزلال المصل البقري (BSA).
- استعبد BSA دون الرينينغ وحضانة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة مع الأرنب المضادة MAP2 الأجسام المضادة 1:1,000، الماوس المضادة لβ3 tubulin (TuJ1) الأجسام المضادة 1:2000، الدجاج المضادة للنيوين الأجسام المضادة (1:100) والفئران المضادة CTIP2 الأجسام المضادة (1:500)، أو مع الماوس المضادة PSD95 ( 1:200)، أرنب المضادة للسينسابسين 1 (1:200) والدجاج المضادة MAP2 الأجسام المضادة لتلطيخ متشابك.
- شطف مع PBS، وحضانة مع اليكسا فلور المترافق الأجسام المضادة الثانوية بالإضافة إلى DAPI لمدة 45 دقيقة في 37 درجة مئوية.
- وأخيرا، يغسل مرتين مع PBS قبل التصوير.
6. تصوير الكالسيوم
- إصابة الخلايا المستزرعة مع AAV8-syn-jGCAMP7f-WPRE (معهد سالك للدراسات البيولوجية، GT3 مرفق الأساسية) في 10 أيام بعد replating وصورة لتقييم العابرين الكالسيوم عفوية في 3-4 أسابيع بعد replating.
7. الحصول على الصور وتحليلها
ملاحظة: وللاطلاع على تفاصيل عن نظام الاقتناء، يرجى الرجوع إلى كلبريس وآخرون12.
- استخدم وحدة تصوير للحصول على صورة يدوية أو تلقائية، ووحدة برمجية لتحليل الصور، مثل CellProfiler13،للقياسات المورفولومترية.
- حساب متوسط طول النيوريتيات الإيجابية TuJ1 وdendrites MAP2 إيجابية عن طريق قياس الطول الإجمالي لكل مجال من مجالات العرض مقسوما على عدد الخلايا العصبية (DAPI + MAP2 أو TuJ1 الخلايا الإيجابية) داخل نفس المجال.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
إعادة طلاء الخلايا العصبية المستمدة من hiPSCs التي تم تمييزها لعدة أسابيع يقدم العديد من المزايا. ومع ذلك، فصل وإعادة طلاء الخلايا العصبية المتمايزة التي لديها طويلة، مترابطة dendrites والمحاور (الشكل1A)يمكن أن يؤدي إلى جزء كبير من الخلايا العصبية التالفة لا رجعة فيه.
كما هو موضح في قسم البروتوكول، استخدمنا الحضانة مع إنزيم بروتيوليتيك لفصل الخلايا العصبية من الركيزة. عادة، بسبب شبكة سميكة من النيورايتات (الشكل 1A)، والخلايا تميل إلى فصل في كل مرة كطبقة واحدة مثل syncytial، والتي غالبا ما تبدأ في تعويم في البئر (الشكل1C). هذا يحدث بسرعة إلى حد ما، وربما هو السبب في أن معظم المختبرات تميل إلى جمع الخلايا بعد 5 دقائق فقط من الحضانة مع إنزيم بروتيوليتيك من اختيارهم، وكسر على الفور ورقة من الخلايا عن طريق trituration (pipetting صعودا وهبوطا). ومع ذلك, هذا التلاعب الميكانيكية يبدو أن يؤدي إلى ارتفاع الضغط على الخلايا العصبية. ونحن نعتقد أن درجة الإجهاد قد تكون متناسبة مع المنطقة التي تغطيها الشبكة العصبية، لأننا نجد أن الضرر الواضح من حضانة البروتياز غير كافية أكبر ل10 سم أو لوحات أكبر من للوحات 35 ملم أو أصغر. وهكذا، على عكس الحدس، وجدنا أن إطالة أمد الحضانة الأنزيمية إلى 40-45 دقيقة يقلل من موت الخلايا في وقت تفكك الخلايا (الشكل1C)ويسمح باستعادة أكثر كفاءة من الخلايا الحية والصحية التي تنبعث منها العمليات على مدى ساعات إلى أيام ما بعد إعادة الطلاء (الشكل1باء). من المفترض أن فترة الحضانة الموسعة مع إنزيم بروتيوليتيك معتدل يسمح بالهضم الجزئي للبروتينات التي تلتزم بقوة الخلايا وعملياتها لبعضها البعض وإلى المصفوفة خارج الخلية. وهذا يسمح لعملية إعادة التعليق للعمل بكفاءة لفصل الخلايا الفردية دون الحاجة إلى تقوية مفرطة.
لتحديد فعالية إجراء حضانة الإنزيم الموسع، قمنا بتقييم صلاحية الخلايا المعلقة مباشرة بعد التطر باستخدام التريبان الأزرق (الشكل1C)، وفي وقت لاحق في 1 و 3 و 7 أيام بعد إعادة الطلاء باستخدام خلية في وقت مبكر علامةالموت (الشكل 2). مباشرة بعد trituration، trypan البقعة الزرقاء أشار إلى أن هناك أكبر بكثير من موت الخلية بعد حضانة 5 دقائق بالمقارنة مع 45 دقيقة حضانة مع إنزيم بروتيوليتيك (الشكل1C). تم تمييز خطين iPSC كنا لتوضيح هذه الملاحظة في الخلايا العصبية من مرحلة السلف العصبي باستخدام بروتوكولات مختلفة، وأظهرت حساسية مختلفة بشكل عام لإجراء replating. الثقافات من خط WT126 المتمايزة إلى NPCs باستخدام "طريقة اختيار روزيت"7 كانت أكثر حساسية للضرر من الثقافات المتمايزة عن خط WT24 CVB باستخدام طريقة التمايز السريع8. ومع ذلك، لكلا الخطين تم تخفيض درجة الوفاة الفورية للخلية إلى النصف تقريبا باستخدام إجراء حضانة الإنزيم الموسع.
بعد إعادة الطلاء، أظهرت الثقافات مضاعفة تقريبية لقدرة الخلية على البقاء على مدى الأيام اللاحقة باستخدام إجراء حضانة الإنزيم الموسع، كما تحدده كثافة الخلايا الإيجابية DAPI (الشكل2B،الرسم البياني على اليسار). وبالإضافة إلى ذلك، أدى حضانة الإنزيم الموسع إلى انخفاض كثافة الخلايا الميتة أو المحتضرة التي تم اكتشافها باستخدام مجموعة صلاحية استبعاد الصبغ (الشكل2B،الرسم البياني على اليمين). وكان جزء من الخلايا الميتة التي تم الكشف عنها باستخدام اختبار الصلاحية بعد 24 ساعة بعد إعادة الطلاء أعلى من تلك التي شوهدت باستخدام الأزرق تريبان مباشرة بعد الثلاثية. هذا ربما يعكس تراكم الخلايا الميتة والموتى على هذه أول 24 ح، على الرغم من أنه من الممكن أيضا أن اختبار الجدوى يكشف عن موت الخلايا أكثر حساسية من اختبار الأزرق trypan. واستمر الكشف عن الخلايا الميتة على مدى 1-7 أيام بعد إعادة الطلاء (الشكل2باء). كانت كثافة الطلاء الأولية لكل من المجموعتين التجريبيتين (5 دقائق و45 دقيقة) متطابقة وتستند إلى عدد الخلايا الحية من تعليق الخلايا بعد الثلاثية. الأهم من ذلك، في جميع النقاط وقت ما بعد replating، تم مضاعفة عدد الخلايا الحية والصحية تقريبا بعد 45 دقيقة حضانة الإنزيم مقارنة مع حضانة 5 دقائق. وقد تم تأكيد هذه الملاحظات نوعيا باستخدام مجهرية التباين المرحلة لرصد مورفولوجيا الخلية في كل خطوة: قبل replating، أثناء replating، وبعد replating (الشكل1 والشكل 2).
واحدة من مزايا replating الخلايا العصبية المشتقة hiPSC بعد أن تم التمييز لعدة أسابيع هو أن معظم الخلايا قد خرجت من مرحلة السلف وتصبح ملتزمة النمط الظاهري العصبي في وقت replating. المرحلة الانتقالية من التمايز العصبي من الذرية العصبية تجري على مدى عدة أيام، مع أعداد أكبر من الخلايا تعبر تدريجيا عن علامات الخلايا العصبية في مرحلة مبكرة، مثل بيتا-III توبولين (الكشف عنها من قبل الأجسام المضادة TuJ1) أو MAP2. التعبير الجيني يتطور على مدى عدة أسابيع، مما أدى في نهاية المطاف إلى التعبير عن علامات عموم الخلايا العصبية في مرحلة متأخرة، مثل NeuN، أو علامات محددة من نوع الخلية للخلايا العصبية القشرية مثل CTIP2. ولذلك، فإن إعادة طلاء الخلايا العصبية المستمدة من hiPSC المتمايزة سابقا يسمح للمرء بدراسة الأحداث العصبية المبكرة والعابرة، مثل بدء النيورايت، في أنواع فرعية محددة من الخلايا العصبية. يوضح الشكل 3 الوجود الفوري لعلامات الخلايا العصبية المبكرة في الثقافات التي تم إعادة تصفيحها بعد 4 أسابيع من ما قبل التمايز في طبق ثقافة أكبر. لاحظ أن الخلايا العصبية NeuN- و CTIP2 التعبير عن يتم التعرف عليها بسهولة في غضون أيام قليلة بعد إعادة الطلاء (الشكل3). خصائص وتوقيت التمايز العصبي يمكن أن تختلف بين خطوط hiPSC. بالنسبة لخط WT 126 وخطوط WT24 CVB التي نصفها هنا، 85 ± 12٪ (n = 2) و 52 ± 11٪ (ن = 5) من الخلايا، على التوالي، أعرب عن النشاط المناعي لعلامة βIII-tubulin TuJ1 في 4 أيام بعد إعادة الطلاء باستخدام إجراء الحضانة بروتياز الموسعة. لكلا الخطين، 30-40٪ من الخلايا، و 80-90٪ من الخلايا العصبية أيضا التعبير عن طبقة 5/6 علامة neocortical CTIP2. بالإضافة إلى تحسين القدرة على البقاء، فإن بروتوكول البروتياز الموسع أيضا تعزيز معتدل نمو النيورايت (متوسط طول النيورايت لكل خلية عصبية)، كما هو مبين في الشكل 4. كل من طول النيورايت الكلي (كميا باستخدام الأجسام المضادة Tuj1، الذي يلطّخ كل من المحاور وdendrites. الشكل 4 B، الرسم البياني الأيسر) ونمو dendrite (كميا باستخدام MAP2 ، والتي البقع dendrites فقط؛ الشكل 4 B، الرسم البياني المركز) كانت مفضلة عند استخدام إجراء الحضانة البروتياز الموسعة. لاحظ أن الرسم البياني لتعداد الخلايا الإيجابية DAPI (DAPI (+)) في الشكل 2 يستند إلى نفس عينات الصورة مثل الرسم البياني لعدد الخلايا في الشكل4، ولكن في الشكل 2 تم قياسها كمياً باستخدام طريقة غير آلية بمساعدة برنامج فيجي، بينما في الشكل 4 تم قياسها كميا باستخدام منصة البرمجيات تحليل الصور الآلي CellProfiler. وقد أسفر هذان النهجان لتحليل الصور عن نتائج مماثلة.
إعادة الطلاء مفيد ليس فقط لدراسة نمو النيورايت، ولكن أيضا لدراسة نقاط الاشتباك العصبي أو غيرها من السمات البيولوجية التي تظهر في وقت لاحق من الخلايا العصبية. في الواقع، بعد أسبوع واحد فقط بعد إعادة الطلاء نلاحظ علامات لكثير من البروتينات presynaptic وpostynaptic تزيين dendrites الخلايا العصبية في نمط الملتحمة (الشكل5A). بعد 4 أسابيع نبدأ أيضا للكشف عن التوطين المشترك، وهو مؤشر على تشكيل نقاط الاشتباك العصبي الوظيفية (الشكل5A). وعلاوة على ذلك، فإن النشاط الكهربائي من إزالة الاستقطاب التلقائي والتيارات التي تحركها المتلازمة يمكن الكشف عنها باستخدام تصوير الكالسيوم (الشكل5باء)أو صفائف متعددة الأقطاب (التقنيات البحرية المحدودة).
الشكل 1 الحفاظ على متفوقة من البقاء العصبية بعد حضانة أطول مع إنزيم بروتيوليتيك لتفكك الخلايا. (أ) صورة تباين المرحلة من الخلايا العصبية المستمدة من المجلس الوطني لنواب الشعب الصيني متباينة لمدة 3 أسابيع. يتم تكبير المنطقة المربعة في الصورة اليسرى في اليمين. في هذه المرحلة الخلايا العصبية لديها عمليات طويلة، والتي تشكل شبكة سميكة. قضبان مقياس = 80 ميكرومتر (يسار)؛ 35 ميكرومتر (يمين). (ب) صور مختارة من الخلايا العصبية المستمدة من hiPSC في 1 و 5 أيام بعد replating. شريط مقياس = 100 درجة مئوية (C) اليسار: فصل الخلايا كورقة واحدة في غضون بضع دقائق بعد بدء العلاج البروتياز. شريط مقياس = 200 ميكرومتر. الحق: بعد أن يتم حساب خلايا ثلاثية الطور على مقياس الهيموكيتومتر قبل إعادة الطلاء. تُظهر الرسوم البيانية تكميم الخلايا الإيجابية غير القابلة للحياة، والتريبان-بلو بعد 5 دقائق أو 45 دقيقة من الحضانة مع الإنزيم البروتيوليتيك لخطين مختلفين CVB WT24 (*** p < 0.0003، اختبار t غير المقترن) وWT 126 (*** p < 0.0001، اختبار t غير المقترن). القيم تمثل متوسط ± S.E.M من 4 النسخ المتماثل الفردية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2 البقاء العصبية بعد عدة أيام بعد replating. (أ) صور الخلايا العصبية المستمدة من المجلس الوطني للخلايا WT126 في 1 و 3 أيام بعد replating باستخدام 5 دقائق و 45 دقيقة حضانة البروتياز. الخلايا المحتضرة تحمل اسم مراسل الموت المبكر الحساس تظهر صور brightfield المقابلة على اليسار. يتم الكشف عن بعض الحطام الخلوي (السهم الأزرق) عادة بعد replating، وخاصة في مجموعة 5 دقائق. قضبان مقياس = 150درجة مئوية (B) صور CVB WT24 الثقافات المستمدة من المجلس الوطني لنواب الشعب الصيني في 1 و 3 و 7 أيام بعد replating باستخدام 5 دقائق و 45 دقيقة حضانة البروتياز. يتم تسمية الخلايا المحتضرة مع مراسل الموت في وقت مبكر حساسة (الأحمر). وصفت جميع النوى من الخلايا الحية والمحتضرة مع DAPI (سماوي). تمثل الإشارة البيضاء المدمجة خلايا DAPI وVivaFix الإيجابية (+). وهناك عدد قليل من الخلايا عرض VivaFix تلطيخ ولكن تفتقر DAPI تلطيخ (الخلايا الحمراء في الصورة مجتمعة على اليمين); هذه هي الخلايا المحتملة التي كانت ميتة لعدة ساعات. قضبان المقياس: 25 درجة مئوية. الرسم البياني الأيمن يظهر القياس الكمي لجزء من الخلايا الميتة (VivaFix / DAPI) بعد وقت حضانة مختلفة مع إنزيم بروتيوليتيك (5 دقيقة مقابل 45 دقيقة: * ع < 0.05 1 د و *** ع < 0.001, 3 د; في اتجاهين ANOVA, تليها متعددة المقارنات بونفيرونى اختبار ما بعد مخصص). يُظهر الرسم البياني الأيسر التغيرات في الكثافة الإجمالية للخلايا (# خلايا DAPI(+) لمدة 5 دقائق مقابل 45 دقيقة: *** p < 0.0001 لجميع نقاط الوقت؛ ANOVA ثنائيالاتجاه، متبوعاً باختبار بونفيروني بعد المقارنة المتعددة). يتم عرض جميع القيم على أنها متوسط ± S.E.M من 3 نسخ متماثل، مع ما لا يقل عن 1500 خلية سجلت لكل شرط. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3 التعبير القابل للكشف عن علامات الخلايا العصبيةفي مرحلة متأخرة مباشرة بعد replating. ثقافات الخلايا المشتقة من CVB WT24 hiPSC التي تم تصويرها بعد 4 أيام من إعادة الطلاء، وذلك باستخدام 45 دقيقة حضانة البروتياز، من طبق 10 سم التي تم تمييزها عن مرحلة المجلس الوطني لنواب الشعب الصيني لمدة 4 أسابيع. وكانت الأمثلة المعروضة ملطخة لعلامات عموم الخلايا العصبية TuJ1، MAP2، أو NeuN. أو طبقة عميقة القشرية الهرمية العصبية علامة CTIP2. لاحظ وجود النيوريتات واسعة النطاق، والتعبير القوي من TuJ1 وMAP2. لاحظ بشكل خاص أن جزءا كبيرا من الخلايا العصبية يعبر أيضا علامات في مرحلة متأخرة NeuN و CTIP2. شريط مقياس = 16 درجة.
الشكل 4 نمو النيورايت وديندريت مع مرور الوقت بعد حضانة إنزيم أقصر وأطول أثناء إعادة الطلاء. (A) الخلايا العصبية المستمدة من CVB WT24 hiPSC مطلي بسرعة توسيع النيورايتات، كما تم الكشف عنها باستخدام الأجسام المضادة Tuj1. لاحظ أن وقت حضانة البروتياز الموسع يعزز تكوين النيونيتوجيني. شريط مقياس = 25 ميكرومتر (ب) قياس الكم من النيورايت وطول dendrite، أكثر من 1، 3 و 7 أيام بعد replating باستخدام إما 5 دقيقة أو 45 دقيقة البروتياز. تم تحديد طول النيورايت الكلي من TuJ1 (βIII-tubulin) تلطيخ. تم تحديد التلطيخ الخاص بالدندرية من MAP2 تلطيخ snf تصحيح لكثافة الخلية عموما (الرسم البياني الصحيح). يتم عرض جميع القيم كما يعني ± S.E.M من 3 نسخ متماثل. طول النيورايت 5 دقائق مقابل 45 دقيقة: * p < 0.05 في 1 يوم و 7 أيام, ** p < 0.01 في 3 أيام; طول الدندرية 5 دقائق مقابل 45 دقيقة: ** p < 0.01 في يوم واحد و 3 أيام, ليست كبيرة (ns) في 7 يوم; # DAPI (+) 5 دقيقة مقابل 45 دقيقة: *** p < 0.0001 لجميع نقاط الوقت؛ في اتجاهين ANOVA، تليها متعددة المقارنة بونفيرونى آخر اختبار مخصص. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5 متشابك وعابرات الكالسيوم العفوية في الخلايا العصبية المستمدة من hiPSC المتمايزة بعد إعادة الطلاء. (أ) اليسار: في 4 أسابيع بعد إعادة الطلاء باستخدام بروتوكول حضانة البروتياز الموسعة، وعلامة presynaptic synapsin 1 يمكن الكشف عنها في مجموعات الملتحمة على طول dendrites MAP2 إيجابية. قضبان مقياس = 5 ميكرومتر. إلى اليمين: منطقة تُختار تُظهر التعريب المشترك بين المجموعات التبشّر والرصائغ (السهم الأصفر)، مما يشير إلى نقاط الاشتباك العصبي التي يحتمل أن تكون نشطة. قضبان مقياس = 1.5 ميكرومتر (ب) اليسار: تم استخدام الخلايا العصبية المستمدة من hiPSC المصابة AAV8-syn-jGCaMP7f-WPRE لرصد العابرين الكالسيوم التلقائية مدفوعة بنشاط الشبكة. تظهر صورة brightfield بجوار تقديم الألوان الزائفة من الفلورة GCaMP7 في نقطة زمنية واحدة في سلسلة الفاصل الزمني. شريط المقياس = 25 ميكرومتر تشير الأرقام الملونة إلى الخلايا الأربعة المختارة التي تم فيها قياس الفلورة GCaMP7 مع مرور الوقت، كما هو موضح في الآثار الموجودة على اليمين. يتوافق كل أثر ملون مع خلية واحدة. تشير العلامة النجمية إلى الوقت أثناء التسجيل المباشر الذي تتوافق معه الصورة على اليسار. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6 سير العمل من [ربلت] إجراءات إلى ثقافة [هبسك] لعال محتوى فحص [و/ور] دراسات مفصّلة من تمايز و [نيوريت] [أو] [م] تسجيلات. بدءا من ثقافة مختلفة من الخلايا العصبية نمت لمدة 4 أسابيع أو أكثر في شكل أكبر (على سبيل المثال، طبق ثقافة 10 سم)، يتم احتضان الخلايا العصبية مع البروتياز لمدة 40-45 دقيقة، triturated بلطف إلى التفكك وإعادة تعليق. ثم يتم توزيع الخلايا في آبار متعددة متوافقة مع HCS، مطلية على ركائز متوافقة مع المخاريط نمو التصوير (السهم الأصفر) أو غيرها من الهياكل، أو على آبار متعددة مناسبة لتسجيلات صفيف متعددة الأقطاب. قضبان المقياس = 27 ميكرومتر، 5 ميكرومتر، 2.5 ميكرومتر، 130 ميكرومتر (من اليسار إلى اليمين). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
لقد أظهرنا إجراء ً مباشراً لإعادة تعليق وإعادة طلاء الثقافات العصبية البشرية التي تعمل على تحسين الجدوى، ونجاح التمايز، والتصوير دون الخلوي بطريقة متوافقة مع منصات فحص المحتوى العالي، وغيرها من الاختبارات ذات الصلة لاكتشاف المخدرات. ويبين الشكل 6 سير العمل العام والأمثلة على هذه التطبيقات.
على الرغم من أننا ركزنا هنا على الخلايا العصبية المشتقة من hiPSC الموجهة نحو مصير الخلايا العصبية القشرية، ونحن نتوقع أن هذه الطريقة ينبغي أن تكون قابلة للتطبيق على قدم المساواة على الخلايا العصبية الجنينية البشرية المشتقة من الخلايا الجذعية، والخلايا العصبية المشتقة من الخلايا الجذعية الموجهة نحو غيرها من الخلايا العصبية الأنماط الظاهرية العصبية14،15،16،17،18. وعلاوة على ذلك، فإننا نؤكد أن هذا الإجراء البروتياز الموسعة قد تكون مفيدة للحالات الأخرى التي تتطلب إعادة تعليق الخلايا وجود شبكة نيورايت المنشأة، على سبيل المثال لفرز FACS أو تحليلات خلية واحدة من الخلايا العصبية الأولية19 , 20.
إعادة طلاء الخلايا العصبية المستمدة hiPSC يوفر نظام نموذج قابل للتطبيق التي للتحقيق في الآليات الخلوية والجزيئية للعديد من الأحداث البيولوجية الرئيسية. فعلى سبيل المثال، يمكن لهذا الإجراء أن ييسر إجراء دراسات تفصيلية عن نمو النيوريت البشري وخصائص مخروط النمو، ومقارنة النتائج بقاعدة المعارف الواسعة التي بنيت من عقود من دراسة الأنواع الأخرى، الفقارية واللافقارية على حد سواء. نجد أن إجراء إعادة الطلاء جعلت من الأسهل لتحسين الظروف لتوليد أكبر المخاريط النمو التي هيمناسبة تماما للتقييم البصري للبنية دون الخلوية وظيفة (الشكل 6). وعلى سبيل المقارنة، فإن مخاريط النمو التي لوحظت بشكل أكثر عادة خلال التمايز الأولي للخلايا العصبية من hiPSCs تميل إلى أن تكون صغيرة ومدمجة، ومجموعة كثيفة من الخلايا غير العصبية في مثل هذه الثقافات يجعل من الصعب على حد سواء لضبط ظروف الركيزة إلى تعزيز نمو مخروط الانتشار وصورة المخاريط النمو الفردية داخل بيئة الأنسجة المعقدة. وهكذا، إعادة طلاء الخلايا العصبية على طبق جديد يوفر "لائحة أنظف" التي لعرض المخاريط النمو في ظل ظروف التصوير جيدة.
إعادة الطلاء مفيد بشكل خاص عند استخدام منصات ثقافة الخلية مناسبة لHCS لأنه يقلل إلى حد كبير من الوقت الإجمالي الذي تزرع الثقافات في أحجام صغيرة. وعادة ما تتطلب أحجام العمل الصغيرة للآبار الفردية من 96 أو 384 أو 1536 بئراً متعددة الآبار (حوالي 100 و50 و5 ميكرولترات حجم العمل، على التوالي) تغييرات متكررة (أي يومية) في الوسائط لمواجهة التبخر واستنفاد المغذيات. التغييرات الإعلامية المتكررة مكلفة، ليس فقط من حيث الكواشف والعمل، ولكنها يمكن أن تضر بسلامة الثقافات من خلال تخفيف وسائل الإعلام المشروطة وزيادة فرص فصل الخلايا عن الركيزة بسبب الاضطرابات الميكانيكية. إعادة طلاء hiPSCs يمكن أيضا تسهيل تسجيل النشاط الفسيولوجي باستخدام صفائف متعددة الأقطاب21،22، أو التصوير الحي للثقافات في اختبارات الأنماط الظاهرية العصبية الديناميكية23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
هذا العمل هو عنصر من عناصر مجموعات أبحاث الخلايا المعاد برمجتها التعاونية الوطنية (NCRCRG) لدراسة الأمراض العقلية، وكان مدعوما ً بمنحة المعهد الوطني للصحة U19MH1 2015-0644. كما تم دعم العمل الأولي من قبل المعهد الوطني للصحة منحة NS070297. نشكر الدكتوركارول ماركيتو وفريد غيج، معهد سالك، على توفير خط WT 126 من خلايا السلف العصبية، والدكتورين يوجين يو ولورانس غولدشتاين، جامعة كاليفورنيا في سان دييغو لتوفير خط CVB WT24 من خلايا السلف العصبية. نشكر ديبورا بري في مختبر الدكتورة آن بانغ، معهد سانفورد بورنهام بريبيس للاكتشافات الطبية، على المناقشات المفيدة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Post Replating Media | |||
| L-Ascorbic Acid | Sigma | A4403 | Add 1 mL of 200 mM stock to 1 L of N2B27 media |
| Dibutyryl-cAMP | Sigma | D0627 | Add 1 µM |
| Human BDNF | Peprotech | 450-02 | 10 ng/ml final concentration |
| B27 (50x) | Thermofisher Scientific | 17504044 | Add 20 mL to 1 L N2B27 media |
| DMEM/F12 with Glutamax | Thermofisher Scientific | 31331093 | Add N2 and distribute in 50 mL conicals; parafilm wrap lids |
| Human GDNF | Peprotech | 450-10 | 10 ng/mL final concentration |
| Glutamax | Thermofisher Scientific | 35050038 | Add 10 ml to 1 L N2B27 media; glutamine supplement |
| Mouse Laminin | Sigma | P3655-10mg | Add 100 µL to 50 mL N2B27 |
| MEM Nonessential Amino Acids | Thermofisher Scientific | 11140035 | Add 5 mL to 1 L N2B27 media |
| N2 (100x) Supplement | Life Technologies | 17502048 | Add 5 mL to 500 mL media |
| Neurobasal A Media | Thermofisher Scientific | 10888022 | Combine with DMEM/F12 to generate N2B27 media for CVB wt cells; neural basal A media |
| Neurobasal Media | Thermofisher Scientific | 21103049 | for WT126 cells; neural basal media |
| SM1 Supplement | StemCell Technologies | 5711 | Add 1:50 to media |
| Sodium bicarbonate | Thermofisher Scientific | 25080-094 | Add 10 mL to 1 L N2B27 media |
| Plate Preparation | |||
| 10 cm Tissue Culture Dishes | Fisher Scientific | 08772-E | Plastic TC-treated dishes |
| 6-well Tissue Culture Dishes | Thomas Scientific | 1194Y80 | NEST plates |
| Mouse Laminin | Life Technologies | 23017-015 | Add 1:400 on plastic |
| Poly-Ornithine | Sigma | P3655-10mg | Add 1:1,000 on plastic |
| UltraPure Distilled Water | Life Technologies | 10977-015 | To dilute Poly-L-Ornithine |
| Replating Reagents | |||
| 100 mM Cell Strainer | Corning | 431752 | Sterile, individually wrapped |
| 384-well plate, uncoated | PerkinElmer | 6007550 | Coat with PLO and Laminin |
| DPBS | Life Technologies | 14190144 | Dulbecco's phosphate-buffered saline |
| Poly-D-Lysine-Precoated 384-well Plates | PerkinElmer | 6057500 | Rinse before coating with laminin |
| StemPro Accutase | Life Technologies | A1110501 | Apply 1 mL/10 cm plate for 30-45 min; proteolytic enzyme |
| Fixation Materials | |||
| 37% Formaldehyde | Fisher Scientific | F79-1 | Dissolved in PBS |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-12 | 0.8 g per 10 mL of fixative |
| Immunostaining Materials | |||
| Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse | Invitrogen | A-11001 | secondary antibody |
| Alexa Fluor 568 Goat anti-chicken | Invitrogen | A-11041 | secondary antibody |
| Alexa Fluor 647 Goat anti-chicken | Invitrogen | A-21449 | secondary antibody |
| Alexa Fluor 561 Goat anti-rat | Invitrogen | A-11077 | secondary antibody |
| DAPI | Biotium | 40043 | visualizes DNA |
| Mouse antibody against b3-tubulin (TuJ-1) | Neuromics | MO15013 | early stage neuronal marker |
| Rat antibody against CTIP2 | Abcam | ab18465 | layer 5/6 cortical neurons |
| Chicken antibody against MAP2 | LifeSpan Biosciences | LS-B290 | early stage neuronal marker |
| Chicken antibody against NeuN | Millipore | ABN91 | late stage neuronal marker |
| Rabbit antibody against MAP2 | Shelley Halpain | N/A | early stage neuronal marker |
| Mouse antibody against PSD-95 | Sigma | P-246 | post-synaptic marker |
| Rabbit antibody against Synapsin 1 | Millipore | AB1543 | pre-synaptic marker |
| Bovine serum albumin (BSA) | GE Healthcare Life Sciences | SH30574.02 | 10% in PBS for blocking |
| Titon X-100 | Sigma | 9002931 | Dilute to 0.2% on PBS for permeabilization |
| Viability Markers | |||
| Vivafix 649/660 | Biorad | 135-1118 | cell death marker |
| Calcium Imaging | |||
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| AAV8-syn-jGCAMP7f-WPRE | THE SALK INSTITUTE, GT3 Core Facility | N/A | calcium reporter in a viral delivery system |
| hiPSC-derived NPCs | |||
| WT 126 (Y2610) | Gage lab | N/A | Marchetto et al., 2010 |
| CVB WT24 | Yeo and Goldstein labs | N/A | unpublished |
References
- Engel, M., Do-Ha, D., Munoz, S. S., Ooi, L. Common pitfalls of stem cell differentiation: a guide to improving protocols for neurodegenerative disease models and research. Cell and Molecular Life Sciences. 73 (19), 3693-3709 (2016).
- Kim, D. S., Ross, P. J., Zaslavsky, K., Ellis, J. Optimizing neuronal differentiation from induced pluripotent stem cells to model ASD. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 109 (2014).
- Amin, N. D., Paşca, S. P. Building Models of Brain Disorders with Three-Dimensional Organoids. Neuron. 100 (2), 389-405 (2018).
- Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Passaging Cells. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2019).
- Langdon, S. P. Cancer Cell Culture. , Humana Press. New York, NY. (2010).
- Picot, J. Human Cell Culture Protocols. 107, Springer Science & Business Media. Berlin, Germany. (2005).
- Marchetto, M. C., et al. A model for neural development and treatment of Rett syndrome using human induced pluripotent stem cells. Cell. 143 (4), 527-539 (2010).
- Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks. Nature Protocols. 7 (10), 1836-1846 (2012).
- Banker, G., Goslin, K.
- Calabrese, B., Halpain, S. Essential role for the PKC target MARCKS in maintaining dendritic spine morphology. Neuron. 48 (1), 77-90 (2005).
- Mullen, R. J., Buck, C. R., Smith, A. M. NeuN, a neuronal specific nuclear protein in vertebrates. Development. 116 (1), 201-211 (1992).
- Calabrese, B., Saffin, J. M., Halpain, S. Activity-dependent dendritic spine shrinkage and growth involve downregulation of cofilin via distinct mechanisms. PLOS One. 9 (4), 94787 (2014).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. 7 (10), 100 (2006).
- Gupta, S., et al. Deriving Dorsal Spinal Sensory Interneurons from Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Reports. 10 (2), 390-405 (2018).
- Ogura, T., Sakaguchi, H., Miyamoto, S., Takahashi, J. Three-dimensional induction of dorsal, intermediate and ventral spinal cord tissues from human pluripotent stem cells. Development. 145, (2018).
- Playne, R., Jones, K., Connor, B. Generation of dopamine neuronal-like cells from induced neural precursors derived from adult human cells by non-viral expression of lineage factors. Journal of Stem Cells and Regenerative Medicine. 14 (1), 34-44 (2018).
- Rao, M. S., et al. Illustrating the potency of current Good Manufacturing Practice-compliant induced pluripotent stem cell lines as a source of multiple cell lineages using standardized protocols. Cytotherapy. 20 (6), 861-872 (2018).
- Suga, H. Differentiation of pluripotent stem cells into hypothalamic and pituitary cells. Neuroendocrinology. 101 (1), 18-24 (2015).
- Endaya, B., et al. Isolating dividing neural and brain tumour cells for gene expression profiling. Journal of Neuroscience Methods. 257, 121-133 (2016).
- Sergent-Tanguy, S., Chagneau, C., Neveu, I., Naveilhan, P. Fluorescent activated cell sorting (FACS): a rapid and reliable method to estimate the number of neurons in a mixed population. Journal of Neuroscience Methods. 129 (1), 73-79 (2003).
- Frega, M., et al. Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays. Journal of Visualized Experiments. (119), e54900 (2017).
- Grainger, A. I., et al. In vitro Models for Seizure-Liability Testing Using Induced Pluripotent Stem Cells. Frontiers in Neuroscience. 12, 590 (2018).
- Daub, A., Sharma, P., Finkbeiner, S. High-content screening of primary neurons: ready for prime time. Current Opinion in Neurobiology. 19 (5), 537-543 (2009).
