Summary
Este protocolo describe un procedimiento detallado para recuperar y cultivar neuronas derivadas de células madre humanas que previamente se diferenciaron de los progenitores neuronales in vitro durante varias semanas. El procedimiento facilita ensayos basados en imágenes de neurótesis, sinapsis y marcadores neuronales de expresión tardía en un formato compatible con microscopía ligera y cribado de alto contenido.
Abstract
Las neuronas diferenciadas en el cultivo bidimensional de las células progenitoras neuronales derivadas de células madre humanas (NDC) representan un potente sistema modelo para explorar los mecanismos de la enfermedad y llevar a cabo pruebas de detección de alto contenido (HCS) para interrogar a un compuesto bibliotecas o identificar fenotipos de mutación genética. Sin embargo, con las células humanas la transición de NPC a funcional, neurona madura requiere varias semanas. Las sinapsis suelen comenzar a formarse después de 3 semanas de diferenciación en el cultivo monocapa, y varias proteínas específicas de la neurona, por ejemplo el marcador panneuronal nucina NucN, o el marcador de neurona cortical cerebral CTIP2 de capa 5/6, comienzan a expresar alrededor de 4-5 semanas después de la diferenciación. Este largo tiempo de diferenciación puede ser incompatible con las condiciones de cultivo óptimas utilizadas para plataformas HCS de pequeño volumen y varios pozos. Entre los muchos desafíos se encuentran la necesidad de células bien adheridas y distribuidas uniformemente con agrupamiento celular mínimo y procedimientos de cultivo que fomenten la viabilidad a largo plazo y la maduración funcional de la sinapsis. Un enfoque es diferenciar las neuronas en un formato de gran volumen, luego replacarlas en un momento posterior en multi-pozos compatibles con HCS. Algunos de los principales desafíos al utilizar este enfoque de replacado se refieren a la reproducibilidad y la viabilidad celular, debido a la interrupción estresante de la red dendrítica y axonal. Aquí demostramos un procedimiento detallado y confiable para resuspender enzimáticamente las neuronas derivadas de células madre pluripotentes inducidas por el ser humano (hiPSC) después de su diferenciación durante 4-8 semanas en un formato de gran volumen, transfiriéndolas a microtíterdes de 384 polos placas, y el cultivo de ellos para otros 1-3 semanas con excelente supervivencia celular. Este replato de neuronas humanas no sólo permite el estudio del ensamblaje y maduración de la sinapsis dentro de las dos semanas posteriores al replating, sino que también permite estudios de regeneración de neurita y características del cono de crecimiento. Proporcionamos ejemplos de ensayos escalables para neuritogénesis y sinaptogénesis utilizando una plataforma de 384 pozos.
Introduction
Las neuronas derivadas de células madre pluripotentes humanas (hiPSC) son cada vez más relevantes en las áreas de investigación básica, desarrollo de fármacos y medicina regenerativa. Los flujos de trabajo y procedimientos para optimizar su cultivo y mantenimiento, y mejorar la eficiencia de la diferenciación en subtipos neuronales específicos, están evolucionando rápidamente1,2. Para mejorar la utilidad y la rentabilidad de las neuronas derivadas de células madre humanas como sistemas modelo susceptibles de análisis de alto contenido en el descubrimiento de fármacos y la validación de objetivos, es útil disminuir el tiempo de cultivo necesario para generar neuronas, conservando al mismo tiempo la máxima robustez, reproducibilidad y relevancia fenotipo. Aunque los cultivos organoides tridimensionales están impulsando avances en la investigación de desarrollo neurológico3, los cultivos monocapa en 2 dimensiones son especialmente compatibles con aplicaciones automatizadas basadas en imágenes debido a su grosor mínimo de tejido.
Sin embargo, la adaptación de los métodos de detección basados en imágenes a modelos de enfermedades neurológicas y neurodesarrollo humanas se enfrenta a un desafío importante. El prolongado período de tiempo sobre el cual el sistema nervioso humano madura in vivo requiere un tiempo prolongado en el cultivo para acomodar programas naturales de expresión génica y lograr la maduración neuronal.
Una consecuencia práctica del programa de diferenciación neuronal prolongada es que el mantenimiento de cultivos monocapa derivados de hiPSC debe mantenerse durante muchas semanas para lograr una madurez adecuada de la sinapsis. Durante este tiempo, los progenitores neuronales que permanecen indiferenciados continúan dividiéndose. Estos pueden rápidamente sobrecrecer el cultivo y usurpar el contenido de nutrientes necesario para mantener neuronas postmitoticas viables. La división vigorosa de las células progenitoras neuronales (NNJ) también puede competir con las neuronas para el sustrato de crecimiento. Esto puede hacer que estos cultivos sean sujetos a problemas de mala adhesión, una condición inadecuada para ensayos basados en imágenes. Además, muchos investigadores encuentran que cuanto menor sea el volumen de cultivo, mayor será la dificultad para mantener poblaciones sanas de neuronas diferenciadas el tiempo suficiente para observar las últimas etapas de la diferenciación neuronal. En otras palabras, los ensayos de maduración de la sinapsis mediante enfoques de detección de alto contenido (HCS) pueden ser muy difíciles para las neuronas derivadas del ser humano.
Para eludir algunos de estos problemas, se ha utilizado un procedimiento de resupending y replating de neuronas derivadas de hiPSC previamente diferenciadas. En primer lugar, permite el estudio del crecimiento de neurita (o, más exactamente, regeneración de neurita) en una población de neuronas totalmente comprometidas. En segundo lugar, el replato de neuronas previamente diferenciadas de un formato de gran volumen (como placas de 10 cm o más), hasta formatos de volumen pequeño (como placas de microtíter compatibles con HCS de 96 o 384 pocillos) permite una reducción significativa en el tiempo total de cultivo en la condición de volumen pequeño. Esto facilita el estudio del montaje y maduración de la sinapsis durante las semanas posteriores in vitro.
Sin embargo, la replacación de neuronas maduras que ya han establecido neuritas largos y una compleja red de conectividad presenta varios desafíos, uno de los cuales es la tasa a veces alta y variable de muerte celular. Aquí, describimos un procedimiento de replating que resulta en una excelente supervivencia celular y reproducibilidad. Comúnmente, las neuronas están expuestas a enzimas proteolíticas durante períodos cortos de incubación (normalmente 3-10 min) con el fin de separar las células del sustrato antes de la trituración. Este breve tiempo de proteólisis se utiliza habitualmente para resuspender y pasar muchos tipos de células divisorias, incluyendo células no neuronales y progenitores indiferenciados4,5,6. Sin embargo, para las neuronas diferenciadas que soportan neuritas largos e interconectados, es esencial no sólo separar las células del sustrato, sino también para interrumpir la red dendrítica y axonal con el fin de aislar las células individuales mientras se minimiza el daño. De hecho, una malla gruesa de neuronas generalmente tiende a desprenderse del sustrato como una sola hoja, en lugar de como células individuales. Si no se tiene cuidado de aflojar la gruesa red de neurótesis, las neuronas no sólo se dañan irreversiblemente durante la trituración, sino que muchas de ellas no pasan a través del filtro utilizado para eliminar los grumos, lo que resulta en un rendimiento celular deficiente. A continuación describimos una simple modificación de un procedimiento de incubación de proteasa ampliamente utilizado para contrarrestar estas dificultades.
En el protocolo descrito a continuación, las neuronas se incuban durante 40-45 min con una proteasa leve, como la enzima proteolítica (por ejemplo, Accutase). Durante los primeros 5-10 minutos después de agregar la enzima, la red neuronal se levanta del sustrato como una hoja. La incubación con la proteasa procede durante 30-40 minutos adicionales antes de proceder con una suave trituración y filtrado. Este tiempo de incubación adicional ayuda a asegurar que la digestión del material relaja la red intercelular, asegurando así que la posterior trituración produzca una suspensión de células individuales. Este procedimiento maximiza la uniformidad de la distribución celular al replacar mientras minimiza la muerte celular. Hemos aplicado con éxito este método de replacado a cultivos neuronales derivados de hiPSC generados por varios protocolos de diferenciación7,8 y a partir de varias líneas de hiPSC. El procedimiento es nominalmente adecuado para su uso con la mayoría o todas las líneas de neuronas derivadas de células madre. Hemos observado que un tiempo de incubación de proteasa extendido no es absolutamente esencial para los cultivos de replacado a partir de placas de formato pequeño (por ejemplo, 35 mm de diámetro); sin embargo, como mostramos aquí, proporciona un beneficio significativo al replacar a partir de placas de gran diámetro (por ejemplo, 10 cm de diámetro o más), probablemente porque los neurófilos en tales placas pueden extender procesos muy largos y formar una matriz densamente interconectada.
Aquí demostramos este método e ilustramos brevemente su aplicación en ensayos para la neuritogénesis temprana y para la maduración de la sinapsis, que implica la agrupación de proteínas pre y postsinápticas a lo largo de las dendritas y axones, seguido de su posterior la colocación en sitios sinápticos. Los ejemplos destacan las ventajas que ofrece este protocolo para preservar la viabilidad y reproducibilidad celular. En primer lugar, permite a los investigadores estudiar los primeros pasos en la neuritogénesis humana. El entorno experimental es similar a los cultivos primarios comúnmente utilizados de neuronas corticales o hipocampales de roedores, donde las células se extraen del cerebro fetal tardío o postnatal temprano, se disocian por la trituración después de un tratamiento suave contra la proteasa, y se les permite iniciar neurites o regenerar neurites que fueron cortados en el procedimiento9,10. Al igual que estas neuronas primarias de roedores, las neuronas derivadas de hiPSC comienzan a formaro o regenerar sus neuritas en cuestión de horas después de la reposición, lo que permite tomar imágenes de conos de crecimiento y morfología de neurita en un entorno óptimo para imágenes de alta espaciotemporal con menos células indiferenciadas. Hemos observado que el crecimiento de neurita está más sincronizado en comparación con los retrasos variables y las diferentes tasas de crecimiento observadas cuando las neuronas comienzan a diferenciarse de una población progenitora. Además, el replating permite ensayos de neuronas que expresan marcadores neuronales de subtipo que normalmente aparecen más adelante en el desarrollo neuronal, como el factor de transcripción CTIP2 de capa cortical 5/6 (Transcripción del promotor de ovalbumina de pollo proteína interactúe n.o 2), o el marcador panneuronal NeuN11. Una característica especialmente útil del enfoque de replacado es que la sinaptogénesis continúa dentro de un marco de tiempo compatible con HCS.
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Protocol
1. Período de diferenciación antes de la replacación
- Diferenciar las neuronas en platos de 10 cm, utilizando un protocolo de elección7,8 hasta que las neuronas han formado una red gruesa con sus procesos y expresar no sólo los primeros marcadores neuronales como MAP2 o TuJ1, sino también marcadores tardíos como NeuN.
-
Cambiar la mitad del medio de elección cada 4 días durante el proceso de diferenciación neuronal.
NOTA: Los cambios medios más extensos o frecuentes diluyen los factores tróficos esenciales y podrían desfavorecer la maduración.- Para las neuronas WT126 derivadas de iPSC, utilizar los siguientes medios de cultivo posteriores a la diferenciación: suplemento de 5 ml 100x N2, 10 ng/ml BDNF, 10 ng/mL GDNF, 1 g/ml de laminin, ácido ascórbico de 200 m, 1 m de dibutiryl-cAMP y 10 ml DeM1 para el medio de águila modificado de 500 ml de Dulbecco/ mezcla de nutrientes F-12 (DMEM/F12). Poco a poco, utilizando cambios de medios medios, reemplazar con medio basal neural (Tablade Materiales)y los mismos suplementos.
- Para las neuronas CVB WT derivadas de iPSC, utilice el siguiente medio de cultivo posterior a la diferenciación: 500 ml basal neural A medio (Tablade materiales)y 500 mL DMEM/F12 medio con 2 g/ml de laminina, suplemento de glutamina de 10 ml (Tablade materiales), 0,75 mg/ml de bicarbonato sódico, 5 ml de aminoácidos no esenciales de medio esencial mínimo (MEM), ácido ascórbico de 0,2 mM, 10 ng/ml BDNF, 20 ml 50x B27 y suplemento de 10 ml 100x N2.
2. Recubrimiento Multiwells
- El día antes de revestir, cubrir con poli-L-ornitina (PLO). Disolver la OLP en agua estéril para hacer una solución en stock (10 mg/ml). Almacene este stock a -20 oC. Diluir la OLP 1:100 en agua para producir una concentración de 50 g/ml al recubrir el vidrio y una relación de 1:1.000 (10 g/ml) al recubrir el plástico.
- Aplique el recubrimiento directamente sobre las placas de destino. Utilice el volumen de recubrimiento adecuado al tamaño de la placa (es decir, para una placa de 24 pocillos aplique 500 ml de solución de PLO por poca).
- Deje que las placas se sentan en la oscuridad durante la noche a temperatura ambiente.
- Recuperar placas recubiertas el día de replacado y transferir a un gabinete de bioseguridad estéril.
- Aspirar la solución de PLO y enjuagar dos veces con agua estéril.
- Diluir laminina (1,15 mg/ml) en solución salina con fosfato (PBS) a 1:400 de dilución.
NOTA: Descongelar la minin a 4 oC y añadir rápidamente a PBS para evitar la agregación de laminina y recubrimiento desigual. - Aspirar agua estéril y aplicar 500 l de recubrimiento laminino a los pozos previamente recubiertos con OLP.
- Colocar las placas en una incubadora de 37oC durante un mínimo de 4-6 h. Utilizar incubaciones más largas, hasta 16 h, para superficies de vidrio. Utilice tiempos de incubación consistentes.
3. Replating Differentiated Neurons
- Enjuague la placa de las neuronas diferenciadas con PBS una vez suavemente. Disperse PBS suavemente por la pared de la placa, y no directamente sobre las células, para evitar interrumpirlas.
- Aspirar suavemente PBS, teniendo cuidado de evitar tocar las células directamente pero para aspirar desde el borde del plato mientras se inclina hacia el investigador.
- Aplicar al menos 1 ml de la enzima proteolítica (Tablade materiales)por placa de 10 cm y devolver las células a la incubadora. Añadir volúmenes ligeramente más altos si la sala de cultivo de tejidos presenta una alta tasa de evaporación debido a la baja humedad.
- Incubar células con enzima proteolítica durante 40-45 min con el fin de separarlas de la placa y separarlas de otras neuronas dentro de la red neuronal.
NOTA: El tiempo en este paso es crítico. Quemar la proteasa demasiado pronto puede provocar un aumento de la muerte celular después de volver a pestear. El fabricante de enzimas proteolíticas recomienda que se utilicen temperaturas muy inferiores a 37 oC con períodos de incubación más largos para el paso de las líneas celulares (p. ej., durante la noche a 4 oC). Sin embargo, se debe evitar el manejo de las neuronas a 4 oC, ya que a menudo muestran una mala supervivencia después de la exposición al frío. El fabricante también afirma que una incubación de 60 minutos con la enzima a 37 oC conduce a su inactivación enzimática. Sin embargo, en la experiencia de los autores, una incubación de 40-45 minutos de cultivos neuronales derivados de hiPSC a 37 oC es suficiente para una disociación eficiente y una excelente supervivencia neuronal al replacar. - Revise las neuronas en un microscopio de contraste de fase durante el tiempo de incubación y permita que el tratamiento de la proteasa continúe hasta que la red neuronal se separe completamente de la placa y comience a romperse en hojas más pequeñas al agitar brevemente la placa debajo de la Microscopio.
- Quench la actividad de proteasa utilizando 5 ml de medios DMEM frescos por 1 ml de proteasa en la placa de 10 cm para detener la digestión. Triturar suavemente las células contra la placa 5-8 veces para interrumpir la red, utilizando pipetas serológicas. Tenga cuidado de no aplicar demasiada presión al triturar, ya que las neuronas diferenciadas son frágiles. No utilice una punta P1000, ya que el extremo es demasiado afilado y estrecho, y por lo tanto puede pura o dañar las neuronas.
- Aplicar solución con células a través de un colador de células con malla de 100 m de diámetro en un tubo cónico fresco de 50 ml gota a gota.
- Enjuague el colador con 5 ml adicionales de medios DMEM frescos, después de que las células se hayan filtrado.
- Células de giro en centrífuga de sobremesa a 1.000 x g durante 5 min.
- Regrese el tubo cónico al gabinete de bioseguridad y aspire la mayor parte de los medios, dejando alrededor de 250 ol para asegurar que las células conserven la humedad.
- Resuspenda las células suavemente en 2 ml de medios DMEM frescos. No pipetee el pellet contra el lado del tubo. En su lugar, invierta suavemente las células cónicas 2-3 veces y pase las células a través del extremo de un pipeta serológico de 5 ml para desalojarlas.
- Aplicar 10 s de neuronas resuspendidas en el borde de un hemocímetro.
- Agregue 8-10 l de trippan azul a la gota de células para evaluar la viabilidad celular durante este paso de resuspensión. Aplicar 10 l de esta mezcla en el hemocitómetro u otros contadores de células automáticos. Evalúe como viables aquellas células que son fase brillante y excluya el tinte azul trypan.
- Determinar la cantidad de células viables / ml, y prepararse para diluir el contenido del tubo cónico de acuerdo con la densidad celular deseada.
- Placa 10.000 células por pozo para una placa de 384 pocillos; placa de 150.000 a 200.000 de células por pozo para una placa de 24 pocillos.
- Añadir DMEM fresco al tubo cónico de células resuspendidas para lograr la dilución adecuada y añadir suplementos apropiados adicionales como B27 y / o BDNF, dependiendo de los requisitos de la línea celular específica.
- Incline suavemente el tubo cónico para mezclar 2-3 veces.
- Aspirar el recubrimiento de laminina de la placa de 24 pocillos, o de la placa multipocilla de 384 pocillos utilizando un pipeta de 16 canales y enjuague una vez con PBS.
- Aspirar PBS usando un P1000 para la placa de 24 pocillos, o la pipeta de 16 canales para placas de 384 pocillos.
- Aplique la solución celular a cada pocal en una figura de ocho movimiento para evitar aglutinarse. La uniformidad del revestimiento también podría optimizarse mediante el uso de dispositivos automatizados de manipulación de líquidos.
NOTA: La adición de laminina a los medios a partir de 2-4 días después de la reposición también ayuda a mantener una distribución homogénea de las células. - Repita los pasos 3.19 y 3.20 para cada pozo.
- Devolver la placa a la incubadora a 37oC y 5% de CO2.
- Después de 2 días, comience a cambiar la mitad del medio cada 4 días utilizando los medios de cultivo posteriores a la diferenciación descritos en la sección 1.2. Después del tiempo de maduración deseado, fijar los cultivos utilizando 3.7% formaldehído a 37 oC y las células de mancha de acuerdo con los requisitos experimentales.
4. Ensayos de viabilidad celular después de la reproducción
- Añadir al reportero de la muerte de la célula temprana (VivaFix: 0,5 l de la solución de stock de 50 l por medio de cultivo de 500 l por pocto) después de repulsar brevemente la solución de stock.
- Iñénese con las células vivas y muertas cultivadas en multipolos con fondo de vidrio, después de 20 min, sin ningún paso de lavado, ya que el tinte fluoresce sólo una vez dentro de las células, o fijar y co-manchar con 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) y/u otros anticuerpos antes de tomar imágenes utilizando un microscopio confocal.
5. Inmunomanchación
- Fijar cultivos con 3.7% de formaldehído en PBS más 120 mM de sacarosa durante 20 min a 37oC.
- Enjuague y permeabilice con 0.2% Triton X-100 durante 5 min a temperatura ambiente, y luego bloquee durante 30 min con 2% albúmina sérica bovina (BSA).
- Aspirar la BSA sin enjuiciar e incubar durante 1 h a temperatura ambiente con anticuerpo anti-MAP2 de conejo 1:1,000, anticuerpo anti-3 de ratón (TuJ1) 1:2,000, anticuerpo de pollo anti-NeuN (1:100) y anticuerpo anti-CTIP2 de rata (1:500), o con ratón anti-PSD95 ( 1:200), conejo antisináptica 1 (1:200) y anticuerpo anti-MAP2 de pollo para la tinción sináptica.
- Enjuague con PBS e incubar con anticuerpos secundarios conjugados con Alexa Fluor más DAPI durante 45 min a 37 oC.
- Finalmente, lave dos veces con PBS antes de tomar imágenes.
6. Imágenes de calcio
- Infectar las células cultivadas con AAV8-syn-jGCAMP7f-WPRE (The Salk Institute for Biological Studies, GT3 Core Facility) a los 10 días posteriores a la reproducción y la imagen para evaluar los transitorios espontáneos de calcio a las 3-4 semanas posteriores a la reproducción.
7. Adquisición y análisis de imágenes
NOTA: Para obtener más información sobre el sistema de adquisición, consulte Calabrese et al.12.
- Utilice un módulo de imágenes para la adquisición manual o automatizada de imágenes, y un módulo de software de análisis de imágenes, como CellProfiler13,para mediciones morfométricas.
- Calcular la longitud media de los neuritas positivos TuJ1 y las dendritas positivas MAP2 midiendo la longitud total por campo de visión dividido por el número de neuronas (células positivas DAPI + MAP2 o TuJ1) dentro del mismo campo.
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Representative Results
El replating de las neuronas derivadas de hiPSCs que se han diferenciado durante varias semanas ofrece varias ventajas. Sin embargo, separar y replacar las neuronas diferenciadas que tienen dendritas y axones largos e interconectados (Figura1A) puede resultar en una fracción alta de neuronas dañadas irreversiblemente.
Como se describe en la sección de protocolo, utilizamos la incubación con una enzima proteolítica para separar las neuronas del sustrato. Típicamente, debido a su mallado grueso de neurios (Figura1A), las células tienden a separarse todas a la vez como una sola capa de tipo sincitial, que a menudo comienza a flotar en el pozo (Figura1C). Esto sucede bastante rápidamente, y es tal vez por qué la mayoría de los laboratorios tienden a recoger las células después de sólo 5 minutos de incubación con su enzima proteolítica de elección, y para romper inmediatamente la hoja de células por trituración (pipetting arriba y abajo). Sin embargo, esta manipulación mecánica parece resultar en un alto estrés para las neuronas. Creemos que el grado de estrés puede ser proporcional al área cubierta por la red neuronal, porque encontramos que el daño aparente por incubación de proteasa inadecuada es mayor para placas de 10 cm o más grandes que para placas de 35 mm o más pequeñas. Por lo tanto, contraintuitivamente, encontramos que prolongar la incubación enzimática a 40-45 min reduce la muerte celular en el momento de la disociación celular (Figura1C) y permite una recuperación más eficiente de células vivas y saludables que emiten procesos durante horas a los días posteriores al reprecio (Figura1B). Presumiblemente, el tiempo de incubación prolongado con una enzima proteolítica leve permite la digestión parcial de proteínas que se adhieren fuertemente las células y sus procesos entre sí y a la matriz extracelular. Esto permite que el proceso de resuspensión funcione eficientemente para separar las células individuales sin la necesidad de una trituración demasiado vigorosa.
Para cuantificar la eficacia del procedimiento de incubación prolongada de enzimas, evaluamos la viabilidad de las células suspendidas inmediatamente después de la trituración usando el trypan azul (Figura1C),y más tarde a los 1, 3 y 7 días después de la reproducción utilizando una célula temprana marcador de muerte (Figura2). Inmediatamente después de la trituración, la tinción azul trypan indicó que hubo una muerte celular sustancialmente mayor después de una incubación de 5 minutos en comparación con una incubación de 45 minutos con la enzima proteolítica (Figura1C). Las dos líneas iPSC que utilizamos para ilustrar esta observación se diferenciaron en neuronas de la etapa progenitora neuronal utilizando diferentes protocolos, y mostraron una sensibilidad ampliamente diferente al procedimiento de replacado. Los cultivos de la línea WT126 diferenciados en PNJ utilizando el "método de selección de rosetas"7 eran más sensibles al daño que los cultivos diferenciados de la línea CVB WT24 utilizando un método de diferenciación rápida8. Sin embargo, para ambas líneas el grado de muerte celular inmediata se redujo aproximadamente a la mitad mediante el procedimiento de incubación prolongada de enzimas.
Después de replacar, los cultivos mostraron una duplicación aproximada de la viabilidad celular en los días posteriores utilizando el procedimiento de incubación de enzimas extendida, según lo determinado por la densidad de células DAPI positivas (Figura2B,gráfico a la izquierda). Además, la incubación prolongada de enzimas dio lugar a una menor densidad de células muertas o moribundas detectadas utilizando un kit de viabilidad de la exclusión del tinte (Figura2B,gráfico a la derecha). La fracción de las células muertas detectadas mediante el ensayo de viabilidad después de 24 h después de la reposición fue mayor que la que se ve utilizando el azul trypan inmediatamente después de la trituración. Esto probablemente refleja la acumulación de células muertas y moribundas sobre estas primeras 24 h, aunque también es posible que el ensayo de viabilidad detecte con mayor sensibilidad la muerte celular que el ensayo azul de tripa. Las células muertas continuaron detectándose durante 1-7 días después de la reproducción (Figura2B). La densidad inicial de chapado para ambos grupos experimentales (5 min y 45 min) fue idéntica y se basó en recuentos de células vivas hemocitómetros de la suspensión celular posterior a la trituración. Es importante destacar que, en todos los puntos de tiempo posteriores a la reproducción, el número de células vivas y sanas se duplicó aproximadamente después de la incubación enzimática de 45 minutos en comparación con la incubación de 5 minutos. Estas observaciones se confirmaron cualitativamente utilizando la microscopía de contraste de fase para monitorear la morfología celular en cada paso: antes de replacar, durante el replating, y después de replacar (Figura1 y Figura 2).
Una de las ventajas de replacar las neuronas derivadas de hiPSC después de haber sido diferenciadas durante varias semanas es que la mayoría de las células habrán salido de la etapa progenitora y se comprometerán con un fenotipo neuronal en el momento de la reprención. La fase de transición de la diferenciación neuronal de los progenitores neuronales se lleva a cabo durante varios días, con un mayor número de células que expresan gradualmente marcadores neuronales en estadio temprano, como la túbulina beta-III (detectada por el anticuerpo TuJ1) o MAP2. La expresión génica evoluciona a lo largo de varias semanas, lo que eventualmente resulta en la expresión de marcadores panneuronales en etapa tardía, como NeuN, o marcadores específicos de tipo celular para neuronas corticales como CTIP2. Por lo tanto, el replating de neuronas derivadas de hiPSC previamente diferenciadas permite estudiar eventos neuronales tempranos y transitorios, como la iniciación de neuritas, en subtipos identificados de neuronas. La Figura 3 ilustra la presencia inmediata de marcadores neuronales tempranos en cultivos que fueron rechapados después de 4 semanas de pre-diferenciación en un plato de cultivo más grande. Tenga en cuenta que las neuronas neun- y CTIP2-expressing se identifican fácilmente dentro de unos días después de la reproducción (Figura 3). Las características y el momento de la diferenciación neuronal pueden variar entre las líneas hiPSC. Para la línea WT 126 y las líneas CVB WT24 que describimos aquí, 85 a 12% (n a 2) y 52 a 11% (n a 5) de las células, respectivamente, expresaron inmunorreactividad para el marcador de tubulina TuJ1 a los 4 días después de la reorientación mediante el procedimiento de incubación de proteasa extendida. Para ambas líneas, el 30-40% de las células, y el 80-90% de las neuronas también expresan la capa 5/6 marcador neocortical CTIP2. Además de mejorar la viabilidad, el protocolo de proteasa extendida también mejoró moderadamente el crecimiento de la neurita (longitud media de la neurita por neurona), como se muestra en la Figura4. Longitud total de neurita (cuantificada con anticuerpo Tuj1, que mancha tanto axones como dendritas; Figura 4 B, gráfico izquierdo) y crecimiento de dendrita (cuantificado mediante MAP2, que mancha sólo las dendritas; Figura 4 B, gráfico central) fueron favorecidos cuando se utiliza el procedimiento de incubación de proteasa extendida. Tenga en cuenta que el gráfico para los recuentos de celdas DAPI positivos (DAPI (+)) de la Figura 2 se basa en las mismas muestras de imagen que el gráfico de recuento de celdas de la Figura4, pero en la Figura 2 se cuantificaron mediante un método no automatizado asistido por el software de Fiji, mientras que en la Figura 4 se cuantificaron utilizando la plataforma automatizada de software de análisis de imágenes CellProfiler. Estos dos enfoques de análisis de imágenes arrojaron resultados similares.
Replating es útil no sólo para estudiar el crecimiento de neurita, sino también para estudiar las sinapsis u otras características biológicas posteriores de las neuronas. De hecho, después de sólo una semana después de la reproducción observamos marcadores para muchas proteínas presinápticas y postsinápticas que decoran las dendritas neuronales en un patrón de punitactita (Figura5A). Después de 4 semanas también comenzamos a detectar su colocalización, que es un indicador de la formación de sinapsis funcionales (Figura5A). Además, la actividad eléctrica procedente de la despolarización espontánea y las corrientes impulsadas por la sinaptización es detectable mediante imágenes de calcio (Figura5B)o matrices multielectrodos (MEA).
Figura 1 : Preservación superior de la viabilidad neuronal después de una incubación más larga con la enzima proteolítica para la disociación celular. (A) Imagen de contraste de fase de las neuronas derivadas de NPC diferenciadas durante 3 semanas. La región en caja de la imagen izquierda se amplía a la derecha. En esta etapa las neuronas tienen procesos largos, que forman una malla gruesa. Barras de escala a 80 m (izquierda); 35 m (derecha). (B) Imágenes seleccionadas de neuronas derivadas de hiPSC a los 1 y 5 días posteriores al reprecio. Barra de escala a 100 m. (C) Izquierda: las células se separan como una sola hoja dentro de unos minutos después de iniciar el tratamiento con proteasa. Barra de escala a 200 m. Derecha: después de la trituración las células se cuentan en el hemocímetro antes de replacar. Los gráficos muestran la cuantificación de células positivas no viables, trypan-azul después de 5 min o 45 min de incubación con la enzima proteolítica para dos líneas diferentes CVB WT24 (*** p < 0.0003, prueba t no emparejada) y WT 126 (*** p < 0.0001, prueba t sin emparejar). Los valores representan la media de S.E.M de 4 réplicas individuales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Viabilidad neuronal después de varios días después de la reproducción. (A) Imágenes de las neuronas derivadas de LA PNJ WT126 a 1 y 3 días después de la reproducción utilizando 5 min y 45 min de incubación de proteasa. Las células moribundas están etiquetadas con el sensible reportero de muerte temprana. Las imágenes de campo brillante correspondientes se muestran a la izquierda. Algunos desechos celulares (flecha azul) se detectan típicamente después de replacar, especialmente en el grupo de 5 minutos. Barras de escala a 150 m. (B) Imágenes de cultivos derivados de CVB WT24 NPC a 1, 3 y 7 días después de la reproducción utilizando 5 min y 45 min de incubación de proteasa. Las células moribundas están etiquetadas con el sensible reportero de muerte temprana de células (rojo). Todos los núcleos de células vivas y moribundas están etiquetados con DAPI (cian). La señal blanca combinada representa las celdas DAPI y VivaFix positivas (+). Algunas celdas muestran la tinción VivaFix pero carecen de tinción DAPI (células rojas en la imagen combinada a la derecha); estas son probablemente células que estuvieron muertas durante muchas horas. Barras de escala: 25 m. El gráfico derecho muestra la cuantificación de la fracción de células muertas (VivaFix/DAPI) después de un tiempo de incubación diferente con la enzima proteolítica (5 min vs 45 min: * p < 0.05 1 d y *** p < 0.001, 3 d; ANOVA bidireccional, seguido de la prueba post hoc de Multicomparison Bonferroni). El gráfico izquierdo muestra los cambios en la densidad celular general (células DAPI(+) para 5 min vs 45 min: *** p < 0.0001 para todos los puntos de tiempo; ANOVA bidireccional, seguido de la prueba post hoc de Bonferroni multicomparación). Todos los valores se muestran como la media de S.E.M de 3 réplicas, con un mínimo de 1.500 celdas puntuadas por condición. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Expresión detectable de marcadores neuronalesen etapa tardía inmediatamente después de la replacación. Cultivos de células derivadas de hiPSC CVB WT24 se dieron una imagen 4 días después de la replacación, utilizando 45 min de incubación de proteasa, a partir de un plato de 10 cm que se había diferenciado de la etapa NPC durante 4 semanas. Se han teñido los ejemplos para los marcadores panneuronales TuJ1, MAP2 o NeuN; o el marcador de neurona piramidal cortical de capa profunda CTIP2. Tenga en cuenta la presencia de neuritas extensos, y la expresión robusta de TuJ1 y MAP2. Tenga en cuenta especialmente que una fracción sustancial de las neuronas también expresa marcadores de etapa tardía NeuN y CTIP2. Barra de escala de 16 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : Crecimiento de neurita y dendrita con el tiempo después de una incubación enzimática más corta y más larga durante el replating. (A) Las neuronas replacadas CVB WT24 derivadas de hiPSC extienden rápidamente los neurites, tal como se detecta mediante el anticuerpo Tuj1. Tenga en cuenta que el tiempo extendido de incubación de proteasa promueve la neuritogénesis. Barra de escala a 25 m.(B) Cuantificación de la longitud de la neutralita y la dendrita, durante 1, 3 y 7 días después de la reproducción utilizando proteasa de 5 min o 45 min. La longitud total de neurita se cuantificó a partir de la tinción de TuJ1 (III-tubulina); La tinción específica de dendrita se cuantificó a partir del snf de tinción MAP2 corregido para la densidad celular general (gráfico derecho). Todos los valores se muestran como la media de S.E.M de 3 réplicas. Longitud de la neurita 5 min vs 45 min: * p < 0.05 al 1 día y 7 días, ** p < 0.01 a 3 días; Longitud de la dendrita 5 min vs 45 min: ** p < 0.01 a 1 día y 3 días, no significativa (ns) a 7 días; • DAPI(+) 5 min vs 45 min: *** p < 0.0001 para todos los puntos de tiempo; ANOVA bidireccional, seguido de la prueba post hoc de Bonferroni multicomparación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5 : Sinaptogénesis y transitorios espontáneos de calcio en neuronas derivadas de hiPSC diferenciadas después de la replacación. (A) Izquierda: a las 4 semanas posteriores al replating utilizando el protocolo de incubación proteasa extendida, el marcador presináptico sinapsina 1 es detectable en racimos punctatos a lo largo de las dendritas positivas MAP2. Barras de escala de 5 m. Derecha: región dendrítica seleccionada que muestra la colocalización entre cúmulos presinápticos y postsinápticos (flecha amarilla), una indicación de sinapsis potencialmente activas. Barras de escala a 1,5 m. (B) Izquierda: se utilizaron neuronas derivadas de hiPSC infectadas con AAV8-syn-jGCaMP7f-WPRE para controlar los transitorios espontáneos de calcio impulsados por la actividad de la red. La imagen de campo brillante se muestra adyacente a la representación pseudocolor de fluorescencia GCaMP7 en un único punto de tiempo de la serie de lapso de tiempo. La barra de escala a 25 m. Los números de color indican las 4 celdas seleccionadas en las que se midió la fluorescencia GCaMP7 a lo largo del tiempo, como se muestra en las trazas de la derecha. Cada traza de color corresponde a una celda. El asterisco apunta a la hora durante la grabación en vivo a la que corresponde la imagen de la izquierda. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6 : Flujo de trabajo de procedimientos de replating para cultivar hiPSCs para cribado de alto contenido y/o estudios detallados de diferenciación y crecimiento de neurita o grabaciones MEA. A partir de un cultivo diferenciado de neuronas cultivadas durante 4 o más semanas en un formato más grande (por ejemplo, un plato de cultivo de 10 cm), las neuronas se incuban con una proteasa durante 40-45 min, trituradas suavemente para disociar y resuspender. Las células se distribuyen en varios pozos compatibles con HCS, rechapadas en sustratos compatibles con conos de crecimiento de imágenes (flecha amarilla) u otras estructuras, o en multi-pozos adecuados para grabaciones de matriz multielectrodo. Escalonar las barras a 27 m, 5 m, 2,5 m, 130 m (de izquierda a derecha). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Hemos demostrado un procedimiento directo para la resuspensión y reposición de cultivos neuronales humanos que optimiza la viabilidad, el éxito de la diferenciación y las imágenes subcelulares de una manera que es compatible con plataformas de cribado de alto contenido, y otros ensayos relevantes para el descubrimiento de fármacos. La Figura 6 ilustra el flujo de trabajo general y los ejemplos de dichas aplicaciones.
Aunque aquí nos centramos en las neuronas derivadas de hiPSC que se dirigen hacia un destino de neurona cortical, esperamos que este método sea igualmente aplicable a las neuronas derivadas de células madre embrionarias humanas, y a las neuronas derivadas de células madre dirigidas hacia otras Fenotipos neuronales14,15,16,17,18. Además, postulamos que este procedimiento de proteasa extendida podría ser beneficioso para otras situaciones que requieren la resuspensión de células que tienen una malla de neurita establecida, por ejemplo para la clasificación FACS o análisis de una sola célula de las neuronas primarias19 , 20.
Replating de neuronas derivadas de hiPSC proporciona un sistema modelo viable en el que investigar los mecanismos celulares y moleculares de muchos eventos biológicos clave. Por ejemplo, este procedimiento puede facilitar estudios detallados de las características de crecimiento de neurita humana y cono de crecimiento, y la comparación de los hallazgos con la amplia base de conocimientos construida a partir de décadas de estudio de otras especies, tanto vertebrados como invertebrados. Encontramos que el procedimiento de replacado ha hecho que sea más fácil optimizar las condiciones para generar conos de crecimiento más grandes que son adecuados para la evaluación óptica de la estructura y función subcelular (Figura6). En comparación, los conos de crecimiento más típicamente observados durante la diferenciación inicial de las neuronas de los hiPSC tienden a ser pequeños y compactos, y la densa gama de células no neuronales en tales cultivos hace que sea difícil tanto ajustar las condiciones del sustrato a promover la propagación del cono de crecimiento y para imaginar conos de crecimiento individuales dentro del complejo entorno tisular. Por lo tanto, replacar las neuronas en un plato fresco proporciona una "pizarra más limpia" en la que ver los conos de crecimiento en buenas condiciones de imagen.
El replating es particularmente ventajoso cuando se utilizan plataformas de cultivo celular adecuadas para HCS, ya que reduce en gran medida el tiempo total en el que los cultivos se cultivan en pequeños volúmenes. Los pequeños volúmenes de trabajo de los pozos individuales de 96, 384 o 1536 polos múltiples (aproximadamente 100, 50 y 5 microlitros de volumen de trabajo, respectivamente) generalmente requieren cambios frecuentes (es decir, diarios) de los medios de comunicación a la contraactuación y el agotamiento de nutrientes. Los cambios frecuentes en los medios de comunicación son costosos, no sólo en términos de reactivos y mano de obra, sino que pueden comprometer la viabilidad de los cultivos diluyendo medios acondicionados y aumentando las posibilidades de que las células se desprendan del sustrato debido a la turbulencia mecánica. La replacación de hiPSCs también puede facilitar el registro de la actividad fisiológica utilizando matrices multielectrodos21,22,o imágenes en vivo de cultivos en ensayos de fenotipos neuronales dinámicos23.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo es un componente de los Grupos Nacionales de Investigación Celular Reprogramada De Cooperativa (NCRCRG) para estudiar enfermedades mentales y fue apoyado por la subvención de NIH U19MH1 2015-0644. El trabajo inicial también fue apoyado por la concesión de NIH NS070297. Agradecemos a los Doctores Carol Marchetto y Fred Gage, The Salk Institute, por proporcionar la línea WT 126 de células progenitoras neuronales, y a los doctores Eugene Yeo y Lawrence Goldstein, UC San Diego, por proporcionar la línea CVB WT24 de células progenitoras neuronales. Agradecemos a Deborah Pre en el laboratorio de la Dra. Anne Bang, Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute, por discusiones útiles.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Post Replating Media | |||
| L-Ascorbic Acid | Sigma | A4403 | Add 1 mL of 200 mM stock to 1 L of N2B27 media |
| Dibutyryl-cAMP | Sigma | D0627 | Add 1 µM |
| Human BDNF | Peprotech | 450-02 | 10 ng/ml final concentration |
| B27 (50x) | Thermofisher Scientific | 17504044 | Add 20 mL to 1 L N2B27 media |
| DMEM/F12 with Glutamax | Thermofisher Scientific | 31331093 | Add N2 and distribute in 50 mL conicals; parafilm wrap lids |
| Human GDNF | Peprotech | 450-10 | 10 ng/mL final concentration |
| Glutamax | Thermofisher Scientific | 35050038 | Add 10 ml to 1 L N2B27 media; glutamine supplement |
| Mouse Laminin | Sigma | P3655-10mg | Add 100 µL to 50 mL N2B27 |
| MEM Nonessential Amino Acids | Thermofisher Scientific | 11140035 | Add 5 mL to 1 L N2B27 media |
| N2 (100x) Supplement | Life Technologies | 17502048 | Add 5 mL to 500 mL media |
| Neurobasal A Media | Thermofisher Scientific | 10888022 | Combine with DMEM/F12 to generate N2B27 media for CVB wt cells; neural basal A media |
| Neurobasal Media | Thermofisher Scientific | 21103049 | for WT126 cells; neural basal media |
| SM1 Supplement | StemCell Technologies | 5711 | Add 1:50 to media |
| Sodium bicarbonate | Thermofisher Scientific | 25080-094 | Add 10 mL to 1 L N2B27 media |
| Plate Preparation | |||
| 10 cm Tissue Culture Dishes | Fisher Scientific | 08772-E | Plastic TC-treated dishes |
| 6-well Tissue Culture Dishes | Thomas Scientific | 1194Y80 | NEST plates |
| Mouse Laminin | Life Technologies | 23017-015 | Add 1:400 on plastic |
| Poly-Ornithine | Sigma | P3655-10mg | Add 1:1,000 on plastic |
| UltraPure Distilled Water | Life Technologies | 10977-015 | To dilute Poly-L-Ornithine |
| Replating Reagents | |||
| 100 mM Cell Strainer | Corning | 431752 | Sterile, individually wrapped |
| 384-well plate, uncoated | PerkinElmer | 6007550 | Coat with PLO and Laminin |
| DPBS | Life Technologies | 14190144 | Dulbecco's phosphate-buffered saline |
| Poly-D-Lysine-Precoated 384-well Plates | PerkinElmer | 6057500 | Rinse before coating with laminin |
| StemPro Accutase | Life Technologies | A1110501 | Apply 1 mL/10 cm plate for 30-45 min; proteolytic enzyme |
| Fixation Materials | |||
| 37% Formaldehyde | Fisher Scientific | F79-1 | Dissolved in PBS |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-12 | 0.8 g per 10 mL of fixative |
| Immunostaining Materials | |||
| Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse | Invitrogen | A-11001 | secondary antibody |
| Alexa Fluor 568 Goat anti-chicken | Invitrogen | A-11041 | secondary antibody |
| Alexa Fluor 647 Goat anti-chicken | Invitrogen | A-21449 | secondary antibody |
| Alexa Fluor 561 Goat anti-rat | Invitrogen | A-11077 | secondary antibody |
| DAPI | Biotium | 40043 | visualizes DNA |
| Mouse antibody against b3-tubulin (TuJ-1) | Neuromics | MO15013 | early stage neuronal marker |
| Rat antibody against CTIP2 | Abcam | ab18465 | layer 5/6 cortical neurons |
| Chicken antibody against MAP2 | LifeSpan Biosciences | LS-B290 | early stage neuronal marker |
| Chicken antibody against NeuN | Millipore | ABN91 | late stage neuronal marker |
| Rabbit antibody against MAP2 | Shelley Halpain | N/A | early stage neuronal marker |
| Mouse antibody against PSD-95 | Sigma | P-246 | post-synaptic marker |
| Rabbit antibody against Synapsin 1 | Millipore | AB1543 | pre-synaptic marker |
| Bovine serum albumin (BSA) | GE Healthcare Life Sciences | SH30574.02 | 10% in PBS for blocking |
| Titon X-100 | Sigma | 9002931 | Dilute to 0.2% on PBS for permeabilization |
| Viability Markers | |||
| Vivafix 649/660 | Biorad | 135-1118 | cell death marker |
| Calcium Imaging | |||
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| AAV8-syn-jGCAMP7f-WPRE | THE SALK INSTITUTE, GT3 Core Facility | N/A | calcium reporter in a viral delivery system |
| hiPSC-derived NPCs | |||
| WT 126 (Y2610) | Gage lab | N/A | Marchetto et al., 2010 |
| CVB WT24 | Yeo and Goldstein labs | N/A | unpublished |
References
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