Summary
Denne protokol beskriver en detaljeret procedure for tilbage suspendering og dyrkning af humane stamcelle afledte neuroner, der tidligere var differentieret fra neurale progenitorer in vitro i flere uger. Proceduren letter Imaging-baserede assays af neurites, synapser, og sent-udtrykker neuronal markører i et format, der er kompatibelt med lys mikroskopi og høj-indhold screening.
Abstract
Neuroner differentieret i to-dimensionelle kultur fra humane pluripotente stamcelle-afledte neurale stamceller (NPCs) repræsenterer en kraftfuld model system til at udforske sygdomsmekanismer og udføre høj indholds screening (HCS) at afhøre sammensatte biblioteker eller identificere genmutations fænotyper. Men, med humane celler overgangen fra NPC til funktionelle, modne neuron kræver flere uger. Synapser typisk begynder at danne efter 3 ugers differentiering i enkeltlags kultur, og flere neuron-specifikke proteiner, for eksempel den senere udtrykker pan-neuronal markør Neun, eller lag 5/6 cerebral kortikale neuron markør CTIP2, begynde at udtrykke omkring 4-5 uger efter differentiering. Denne lange differentierings periode kan være uforenelig med optimale dyrkningsbetingelser, der anvendes til små, multi-Well HCS-platforme. Blandt de mange udfordringer er behovet for godt overholdt, ensartet fordelte celler med minimal celle klyngedannelse, og kultur procedurer, der fremmer langsigtet levedygtighed og funktionel synapse modning. En tilgang er at differentiere neuroner i et stort volumen format, derefter replate dem på et senere tidspunkt i HCS-kompatible multi-brønde. Nogle af de vigtigste udfordringer ved anvendelse af denne plader-metode vedrører reproducerbarhed og cellelevedygtighed på grund af den stressende forstyrrelse af det dendritiske og axonale netværk. Her viser vi en detaljeret og pålidelig procedure for enzymatisk resuspension af menneskeskabte pluripotente stamceller (hipsc)-afledte neuroner efter deres differentiering for 4-8 uger i et stort volumen format, overføre dem til 384-brønd mikrotiterpladestrimler og dyrkning af dem i yderligere 1-3 uger med fremragende celle overlevelse. Denne plader af menneskelige neuroner giver ikke kun mulighed for studiet af synapse samling og modning inden for to uger fra plader, men også muliggør undersøgelser af neurite regenerering og vækst kegle egenskaber. Vi giver eksempler på skalerbare assays for neuritogenesis og synaptogenesis ved hjælp af en 384-Well platform.
Introduction
Humane pluripotente stamceller (hiPSC)-afledte neuroner er i stigende grad relevante inden for grundforskning, narkotika udvikling, og regenerativ medicin. Arbejdsprocesser og procedurer til at optimere deres kultur og vedligeholdelse, og forbedre effektiviteten af differentiering i specifikke neuronal undertyper, udvikler sig hurtigt1,2. For at forbedre nytten og omkostningseffektiviteten af menneskelige stamcelle-afledte neuroner som modelsystemer, der kan anvendes til højt indhold analyser i Drug Discovery og Target validering, er det nyttigt at mindske dyrknings tiden kræves for at generere modne, funktionelle neuroner, samtidig med at maksimal robusthed, reproducerbarhed og fænotype relevans bevares. Selv om 3-dimensionelle organoid kulturer kører gennembrud i Neuro udvikling forskning3, 2-dimensionelle enkeltlags kulturer er især kompatible med automatiserede Imaging-baserede applikationer på grund af deres minimal vævs tykkelse.
Men tilpasningen af billedbehandlings baserede screeningsmetoder til modeller af menneskelig neurologisk og neuroudviklingsmæssige sygdom står over for en stor udfordring. Den langvarige tidsramme, som det menneskelige nervesystem modnes in vivo nødvendiggør forlænget tid i kulturen til at rumme naturlige programmer for genekspression og opnå neuronal modning.
En praktisk konsekvens af den langvarige neuronal differentiering program er, at vedligeholdelsen af hipsc-afledte enkeltlags kulturer skal opretholdes i mange uger for at opnå tilstrækkelig synapse modenhed. I løbet af denne tid, neurale afkom, der forbliver udifferentieret fortsætte med at opdele. Disse kan hurtigt over vokse kulturen og tilrane sig det næringsstofindhold, der kræves for at opretholde levedygtige postmitotiske neuroner. Kraftigt dividere neurale progenitorceller (NPCs) kan også konkurrere med neuroner for vækst substrat. Dette kan gøre sådanne kulturer underlagt problemer med dårlig vedhæftning, en tilstand uegnet til billedbehandlings baserede assays. Desuden finder mange efterforskere, at jo mindre kultur volumen, jo større er vanskeligheden med at opretholde sunde populationer af differentierede neuroner længe nok til at observere de sene stadier af neuronal differentiering. Med andre ord, assays af synapse modning ved hjælp af højt indhold screening (HCS) tilgange kan være meget udfordrende for menneskelige-afledte neuroner.
For at omgå nogle af disse problemer er der blevet anvendt en procedure for tilbage suspension og plader af tidligere differentierede hipsc-afledte neuroner. For det første giver det mulighed for studiet af neurite udvækst (eller mere præcist neurite regenerering) i en population af fuldt engagerede neuroner. For det andet, at plader af tidligere differentierede neuroner fra et stort volumen format (som 10 cm plader eller større), ned til små volumen formater (som HCs-kompatible 96-eller 384-brønd mikrotiterplader) muliggør en signifikant reduktion i den samlede kultieringstid i den lille volumen tilstand. Dette letter studiet af synapse samling og modning over de efterfølgende uger in vitro.
Men, den plader af modne neuroner, der allerede har etableret lange neurites og en kompleks konnektivitet netværk præsenterer flere udfordringer, hvoraf den ene er den undertiden høj og variabel hastighed af celledød. Her beskriver vi en plader procedure, der resulterer i fremragende celle overlevelse og reproducerbarhed. Almindeligvis er neuroner eksponeret for Proteolytiske enzymer for korte inkubations perioder (typisk ~ 3-10 min) for at frigøre celler fra substratet før trituration. Denne korte proteolyse tid bruges sædvanligvis til at opsuspendere og passaging mange typer af skille celler, herunder ikke-neuronal celler og udifferentierede progenitorer4,5,6. Men for differentierede neuroner, der bærer lange, indbyrdes forbundne neuritter, er det vigtigt ikke blot at frigøre celler fra substratet, men også at forstyrre det dendritiske og axonal netværk for at isolere individuelle celler, samtidig med at skaden minimeres. Faktisk en tyk meshwork af neuroner normalt har tendens til at løsne sig fra substratet som et enkelt ark, snarere end som individuelle celler. Hvis der ikke udvises forsigtighed for at løsne det tykke netværk af neuritter, bliver neuroner ikke kun uopretteligt beskadiget under trituration, men mange af dem undlader at passere gennem filteret, der bruges til at fjerne klumper, hvilket resulterer i dårlig celle udbytte. Nedenfor beskriver vi en simpel modifikation til en bredt anvendt proteaseinkubations procedure for at imødegå disse vanskeligheder.
I den nedenfor beskrevne protokol inkuberet neuroner i 40-45 min med en mild protease, såsom det proteolytiske enzym (f. eks. Accutase). I løbet af de første 5-10 min efter tilsætning af enzymet, det neuronal netværk løfter fra substratet som et ark. Inkubation med proteasehæmmere provenuet for yderligere 30-40 min før du fortsætter med blid formalings og filtrering. Denne ekstra inkubationstid hjælper med at sikre, at fordøjelsen af materialet slapper af det intercellulære netværk, hvilket sikrer, at efterfølgende formalings giver en suspension af individuelle celler. Denne procedure maksimerer ensartetheden af celle fordelingen ved at plader, samtidig med at celledød minimeres. Vi har med succes anvendt denne plader metode til hipsc-afledte neuronal kulturer genereret af forskellige differentiering protokoller7,8 og fra forskellige linjer af hipscs. Proceduren er nominelt egnet til brug med de fleste eller alle linjer af stamcelle-afledte neuroner. Vi har observeret, at en forlænget proteaseinkubationstid ikke er absolut nødvendig for at udfylde kulturer fra små format plader (f. eks. 35 mm diameter); men som vi viser her, det giver en betydelig fordel, når plader fra store diameter plader (f. eks, 10 cm diameter eller større), sandsynligvis fordi neurites i sådanne plader kan forlænge meget lange processer og danne en tæt sammenkoblede array.
Her demonstrerer vi denne metode og illustrerer kort dens anvendelse i assays for tidlig neuritogenesis og for synapse modning, som involverer klyngedannelse af præ-og postsynaptiske proteiner langs dendritter og axoner, efterfulgt af deres senere samlokalisering på synaptisk sites. Eksemplerne fremhæver de fordele, som denne protokol giver for at bevare cellernes levedygtighed og reproducerbarhed. For det første, det tillader efterforskere at studere tidlige trin i human neuritogenesis. Den eksperimentelle indstilling svarer til de almindeligt anvendte primære kulturer af gnaver kortikale eller hippocampus neuroner, hvor cellerne udvindes fra sen føtal eller tidlig postnatale hjerne, dissocieret ved formalings efter blid proteasebehandling, og lov til at initiere neuritter eller regenerere neuritter, der blev afbrudt i proceduren9,10. På samme måde som sådanne gnaver primære neuroner begynder hiPSC-afledte neuroner at danne eller regenerere deres neuriter inden for timer efter replating, hvilket muliggør billeddannelse af vækst kegler og neurite morfologi i et miljø, der er optimalt til høj spatiotemporale billeddannelse med færre omgivende udifferentierede celler. Vi har observeret, at neurite udvækst er mere synkroniseret i forhold til de variable forsinkelser og forskellige udvækst satser set, når neuroner først begynder at skelne fra en stamcelle befolkning. Hertil kommer, at plader muliggør assays af neuroner udtrykker neuronal subtype markører, der typisk optræder senere i neurale udvikling, såsom den kortikale lag 5/6 transkriptionsfaktor CTIP2 (kylling ægalbumin upstream promotor transkription faktor-interagerende protein 2) eller den panneuronale markør NeuN11. En særlig nyttig funktion af den plader tilgang er, at synaptogenesis provenuet inden for en tidsramme kompatibel med HCs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. differentierings periode før Replating
- Differentiere neuroner på 10 cm retter, ved hjælp af en protokol af valg7,8 indtil neuroner har dannet et tykt netværk med deres processer og udtrykke ikke kun tidlige neuronal markører såsom MAP2 eller TuJ1, men også sene markører såsom Neun.
-
Skift halvdelen af valget hver 4 dage under neuronal differentierings processen.
Bemærk: mere omfattende eller hyppige medium ændringer fortynde væsentlige trofiske faktorer, og kunne Unaade modning.- For IPSC-afledte WT126 neuroner, brug følgende post-differentiering dyrkning Media: 5 ml 100x N2 supplement, 10 ng/ml BDNF, 10 ng/ml gdnf, 1 μg/ml Laminin, 200 μM ascorbinsyre, 1 μm dibutyryl-Camp og 10 ml SM1 for 500 ml dulbecco's modificerede eagle's medium/ næringsstof blandingen F-12 (DMEM/F12). Gradvist, ved hjælp af halv-medier ændringer, erstatte med neurale basal medium (tabel over materialer) og de samme kosttilskud.
- For IPSC-afledte CVB WT neuroner, brug følgende post-differentiering dyrkning medium: 500 ml neurale basal A medium (tabel over materialer) og 500 ml DMEM/F12 medium med 2 μg/ml Laminin, 10 ml Glutamin supplement (tabel over materialer), 0,75 mg/mL natriumhydrogencarbonat, 5 mL mindste essentielle medium (MEM) ikke-essentielle aminosyrer, 0,2 mM ascorbinsyre, 10 ng/mL BDNF, 20 mL 50x B27 og 10 mL 100x N2 supplement.
2. belægning Multiwells
- Dagen før replating, frakke med poly-L-ornithine (PLO). PLO opløses i sterilt vand for at lave en stamopløsning (10 mg/mL). Opbevar denne bestand ved-20 °C. PLO 1:100 fortyndes i vand for at give en koncentration på 50 μg/mL ved belægning af glas og 1:1000 ratio (10 μg/mL) ved belægning af plastik.
- Påfør belægningen direkte på målpladerne. Brug den mængde belægning, der passer til pladens størrelse (dvs. for en 24-brønd plade, Anvend 500 μL PLO opløsning pr. brønd).
- Lad pladerne sidde i mørket natten over ved stuetemperatur.
- Hent belagte plader på dagen for plader og Overfør til et sterilt biosikkerheds kabinet.
- Aspirer PLO opløsningen og skyl to gange med sterilt vand.
- Fortyndet Laminin (1,15 mg/mL) i fosfat-bufferet saltvand (PBS) ved 1:400 fortynding.
Bemærk: Tø laminat ved 4 °C og Tilføj hurtigt til PBS for at undgå sammenlægning af Laminin og ujævn belægning. - Aspirer sterilt vand og Påfør 500 μL laminatbelægning til brønde, som tidligere er belagt med PLO.
- Anbring pladerne i en 37 °C-inkubator i mindst 4-6 h. Brug længere inkubning, op til 16 timer, til glasoverflader. Brug konsistente inkubationstider.
3. replating differentierede neuroner
- Skyl pladen af differentierede neuroner med PBS en gang forsigtigt. Disperse PBS forsigtigt ned i væggen af pladen, og ikke direkte på cellerne, for at undgå at forstyrre dem.
- Forsigtigt aspirere PBS, at være omhyggelig med at undgå at røre cellerne direkte, men at aspirere fra kanten af skålen, mens vælte det mod forskeren.
- Påfør mindst 1 mL af det proteolytiske enzym (tabel over materialer) pr. 10 cm plade og returner celler til inkubator. Tilsæt lidt højere volumener, hvis vævskultur rummet udviser en høj Fordampningshastighed på grund af lav luftfugtighed.
- Inkuber celler med proteolytisk enzym i 40-45 min for at frigøre dem fra pladen og frigøre dem fra andre neuroner i neuronal netværket.
Bemærk: Timing på dette trin er kritisk. Quenching proteasehæmmere for tidligt kan føre til øget celledød efter replating. Den proteolytiske enzym producent anbefaler, at temperaturer, der er meget lavere end 37 °C, anvendes med længere inkubationsperioder for passaging cellelinjer (f. eks. natten over ved 4 °C). Håndtering af neuroner ved 4 °C bør dog undgås, da de ofte udviser dårlig overlevelse efter kold eksponering. Producenten anfører også, at en 60 min inkubation med enzymet ved 37 °C fører til dets enzymatiske inaktivering. Men i forfatternes erfaring, en 40-45 min inkubation af hiPSC-afledte neuronal kulturer ved 37 ° c er tilstrækkelig til effektiv dissociation og fremragende neuronal overlevelse ved replating. - Kontrollér neuronerne i et fasekontrast mikroskop under inkubationstiden, og lad proteasebehandlingen fortsætte, indtil det neurale netværk er helt afbrudt fra pladen og begynder at skille sig ud i mindre ark ved kort omrystning af pladen under Mikroskop.
- Dæmper proteaseaktiviteten ved hjælp af 5 mL friske DMEM-medier pr. 1 mL proteasehæmmere i 10 cm pladen for at standse fordøjelsen. Forsigtigt udriv celler mod plade 5-8 gange for at forstyrre netværket, ved hjælp af serologiske pipetter. Vær omhyggelig med ikke at anvende for meget pres, når triturating, som differentierede neuroner er skrøbelige. Brug ikke en P1000 tip, da enden er for skarp og smal, og dermed kan Sheer eller beskadige neuroner.
- Anvend opløsningen med celler gennem en cellefilter med 100 μm diameter mesh i en frisk 50 mL konisk tube dråbe ved dråbe.
- Skyl sien med yderligere 5 mL friske DMEM-medier, efter at cellerne er filtreret igennem.
- Spin celler i stationære centrifuge ved 1.000 x g i 5 min.
- Returner konisk slange til biosikkerhed-kabinettet og Aspirer de fleste af medierne og efterlader ca. 250 μl for at sikre, at cellerne bevarer fugt.
- Resuspendér cellerne forsigtigt i 2 mL friske DMEM-medier. Du må ikke pipettere pellet mod siden af røret. I stedet skal du forsigtigt invertere koniske 2-3 gange og passere celler gennem enden af et 5 mL serologisk pipet for at opløse dem.
- Påfør 10 μL af resuspenderede neuroner på kanten af et hemocytometer.
- Tilsæt 8-10 μL trypan og et blå til dråbe af celler for at vurdere cellens levedygtighed under dette ophængs trin. Påfør 10 μL af denne blanding til hemocytometer eller andre automatiske celle tællere. Vurder som levedygtige de celler, der er fase lyse og udelukke trypan og et blå farvestof.
- Bestem mængden af levedygtige celler/mL, og Forbered dig på at fortynde indholdet af det koniske rør i henhold til den ønskede celletæthed.
- Plade ~ 10.000 celler pr brønd for en 384-brønd plade; plade ~ 150000-200000 celler per brønd for en 24-brønd plade.
- Tilsæt frisk DMEM til det koniske rør af resuspenderede celler for at opnå passende fortynding og tilføje yderligere passende kosttilskud såsom B27 og/eller BDNF, afhængigt af kravene i den specifikke cellelinje.
- VIP forsigtigt konisk slange for at blande 2-3 gange.
- Sug laminatet ud af 24-brønden, eller fra 384-brønd multiwell pladen ved hjælp af et 16-kanals pipet og skyl én gang med PBS.
- Aspirér PBS ved hjælp af en P1000 til 24-brønd pladen, eller 16-kanals pipetten til 384-brønd plader.
- Anvend celle opløsning til hver brønd i en figur otte bevægelse for at undgå klumpning. Plating ensartethed kan også optimeres ved hjælp af automatiserede væske håndterings anordninger.
Bemærk: Tilsætning af Laminin til medierne starter 2-4 dage efter-replating hjælper også med at opretholde en homogen fordeling af cellerne. - Gentag trin 3,19 og 3,20 for hver brønd.
- Pladen tilbage til inkubator indstillet til 37 °C og 5% CO2.
- Efter 2 dage, begynde at ændre halvdelen af mediet hver 4 dage ved hjælp af post-differentiering dyrkning Media beskrevet i punkt 1,2. Efter den ønskede modningstid, fix kulturer ved hjælp af 3,7% formaldehyd ved 37 °C og plette celler i henhold til de eksperimentelle krav.
4. cellelevedygtighed assays post-replating
- Tilføj den tidlige celledød reporter (VivaFix: 0,5 μL af 50 μL stamopløsning pr. 500 μL kultur medie pr. brønd) efter kortvarigt at vortexere stamopløsningen.
- Billede levende og døde celler kultiveret på glas-bund multiwells, efter 20 min, uden vaske trin, da farvestoffet fluorescerer kun én gang inde i cellerne, eller fix og co-Stain med 4 ', 6-diamidino-2-phenylindol (dapi) og/eller andre antistoffer før billeddannelse ved hjælp af et Konfokal mikroskop.
5. immun farvning
- Fix kulturer med 3,7% formaldehyd i PBS plus 120 mM saccharose i 20 min ved 37 °C.
- Skyl og permeabilize med 0,2% Triton X-100 i 5 minutter ved stuetemperatur, og derefter blokere for 30 min med 2% kvægserum albumin (BSA).
- Udsug BSA uden skylning, og Inkuber i 1 time ved stuetemperatur med kanin anti-MAP2 antistof 1:1000, mus anti-β3 Tubulin (TuJ1) antistof 1:2000, anti-NeuN antistof (1:100) og rotte anti-CTIP2 antistof (1:500), eller med mus anti-PSD95 ( 1:200), kanin anti-synapsin 1 (1:200) og kylling anti-MAP2 antistof for synaptisk farvning.
- Skyl med PBS, og der inkuberes ved med Alexa fluor-konjugeret sekundære antistoffer plus dapi for 45 min ved 37 °c.
- Endelig vaskes to gange med PBS før billeddannelse.
6. calcium-billeddannelse
- Inficere dyrkede celler med AAV8-syn-jGCAMP7f-WPRE (Salk Institut for biologiske studier, GT3 Core Facility) på 10 dage efter replating og billede til at vurdere spontane calcium transienter ved 3-4 uger efter-replating.
7. image erhvervelse og analyse
Bemærk: Yderligere oplysninger om anskaffelses systemet findes i Calabrese et al.12.
- Brug et billedbehandlings modul til manuel eller automatiseret billed erhvervelse og et softwaremodul til billedanalyse, såsom CellProfiler13, til morphometriske målinger.
- Beregn gennemsnitlig længde af TuJ1 positive neurites og MAP2 positive dendritter ved at måle den samlede længde pr synsfelt divideret med antallet af neuroner (DAPI + MAP2 eller TuJ1 positiver celler) inden for samme felt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den plader af hipscs-afledte neuroner, der er blevet differentieret i flere uger tilbyder flere fordele. Imidlertid kan afmontering og plader af differentierede neuroner, der har lange, indbyrdes forbundne dendritter og axoner (figur 1A), resultere i en høj fraktion af irreversibelt beskadigede neuroner.
Som beskrevet i afsnittet protokol brugte vi inkubation med et proteolytisk enzym til at frigøre neuronerne fra substratet. Typisk, på grund af deres tykke meshwork af neurites (figur 1A), cellerne har tendens til at løsne alle på én gang som et enkelt syncytial-lignende lag, som ofte begynder at flyde i brønden (figur 1C). Dette sker forholdsvis hurtigt, og er måske grunden til de fleste laboratorier har tendens til at indsamle cellerne efter kun 5 min af inkubation med deres proteolytiske enzym valg, og til straks at bryde ud af arket af celler ved formalings (pipetting det op og ned). Men, denne mekaniske manipulation synes at resultere i høj stress for neuroner. Vi mener, at graden af stress kan være proportional med det område, der er omfattet af neuronal netværk, fordi vi finder, at den tilsyneladende skade fra utilstrækkelig proteaseinkubation er større for 10 cm eller større plader end for 35 mm eller mindre plader. Således, kontraintuitivt, vi fandt, at forlænge den enzymatiske inkubation til 40-45 min reducerer celledød på tidspunktet for celle dissociation (figur 1C) og tillader mere effektiv genopretning af levende, raske celler, der udsender processer over timer dage efter replating (figur 1B). Formentlig, den forlængede inkubationstid med et mildt proteolytisk enzym tillader delvis fordøjelse af proteiner, der stærkt overholder celler og deres processer til hinanden og til den ekstracellulære matrix. Dette gør det muligt for opblanding proces at arbejde effektivt at adskille individuelle celler uden behov for alt for kraftig trituration.
For at kvantificere effektiviteten af den udvidede enzym inkubations procedure vurderede vi, at de suspenderede celler var rentable umiddelbart efter formalings ved hjælp af trypan og et Blue (figur 1C), og senere ved 1, 3 og 7 dage efter at være fyldt med en tidlig celle død markør (figur 2). Umiddelbart efter trituration indikerede trypan og et Blue-farvning, at der var betydeligt større celledød efter en 5 min inkubation sammenlignet med en 45 min inkubation med det proteolytiske enzym (figur 1C). De to IPSC linjer, vi plejede at illustrere denne observation blev differentieret i neuroner fra neurale stamfader fase ved hjælp af forskellige protokoller, og viste stort set forskellig følsomhed over for plader procedure. Kulturer fra WT126 linjen differentieret til NPC'er ved hjælp af "Rosette Selection metode"7 var mere følsomme over for skader end kulturer differentieret fra CVB WT24 linje ved hjælp af en hurtig differentiering metode8. Men for begge linjer var graden af umiddelbar celledød omtrent halveret ved anvendelse af den udvidede enzym inkubations procedure.
Efter replating udviste kulturer en omtrentlig fordobling af celle levedygtigheden over de efterfølgende dage ved hjælp af den udvidede enzym inkubations procedure, som bestemt af tætheden af DAPI-positive celler (figur 2B, graf til venstre). Desuden resulterede den forlængede enzym inkubation i en lavere densitet af døde eller døende celler detekteret ved hjælp af en Dye-udelukkelse levedygtighed Kit (figur 2B, graf til højre). Den fraktion af døde celler, der blev detekteret ved hjælp af levedygtigheds analysen efter 24-timers post-replating, var højere end set med trypan og et Blue umiddelbart efter trituration. Dette afspejler sandsynligvis ophobningen af døde og døende celler over disse første 24 h, selv om det også er muligt, at levedygtigheden assay mere følsomt detekterer celledød end trypan og et blå assay. Døde celler blev fortsat opdaget over 1-7 dage efter replating (figur 2B). Den oprindelige plating tæthed for begge forsøgsgrupper (5 min og 45 min) var identisk og baseret på hemocytometer levende celletal af post-trituration cellesuspension. Vigtigere, på alle tidspunkter post-replating, antallet af levende, raske celler blev omtrent fordoblet efter 45 min enzym inkubation sammenlignet med 5 min inkubation. Disse observationer blev bekræftet kvalitativt ved hjælp af fasekontrast mikroskopi til at overvåge celle morfologi ved hvert trin: før plader, under plader, og efter plader (figur 1 og figur 2).
En af fordelene ved at plader hipsc-afledte neuroner efter de har været differentiere i flere uger er, at de fleste af cellerne vil have forladt stamfader fase og blive forpligtet til en neuronal fænotype på tidspunktet for plader. Overgangsfasen af neuronal differentiering fra neurale progenitorer finder sted over flere dage, med et større antal celler gradvist at udtrykke tidlige stadier neuronal markører, såsom beta-III Tubulin (påvist ved antistof TuJ1) eller MAP2. Genekspression udvikler sig over flere uger, i sidste ende resulterer i udtryk for sene pan-neuronal markører, såsom NeuN, eller celle-typespecifikke markører for kortikale neuroner såsom CTIP2. Derfor, den plader af tidligere differentierede hipsc-afledte neuroner tillader en at studere tidlige og forbigående neuronal begivenheder, såsom neurite indledning, i identificerede undertyper af neuroner. Figur 3 illustrerer den umiddelbare tilstedeværelse af tidlige neuronal markører i kulturer, der blev fyldt efter 4 ugers præ-differentiering i en større kultur skål. Bemærk, at NeuN-og CTIP2-udtrykte neuroner er let identificeres inden for et par dage efter-replating (figur 3). Karakteristika og timing af neuronal differentiering kan variere blandt hiPSC linjer. For WT 126-linjen og CVB WT24-linjerne, som vi beskriver her, er 85 ± 12% (n = 2) og 52 ± 11% (n = 5) af cellerne udtrykt immunoreaktivitet for βIII-Tubulin-mærket TuJ1 4 dage efter at være blevet fyldt med den forlængede proteaseinkubations procedure. For begge linjer, 30-40% af cellerne, og 80-90% af neuroner også udtrykke laget 5/6 neocortical markør CTIP2. Ud over at forbedre levedygtigheden forbedrede den udvidede proteaseprotokol også moderat neurite-udvækst (gennemsnitlig neurite-længde pr. neuron), som vist i figur 4. Begge total neurite længde (kvantificeret ved hjælp af antistof Tuj1, som pletter både axoner og dendritter; Figur 4 B, venstre graf) og dendrit vækst (kvantificeret ved hjælp af MAP2, som kun pletter dendritter; Figur 4 B, Center graf) blev foretrukket, når du bruger den udvidede proteaseinkubations procedure. Bemærk, at grafen for DAPI-positive (DAPI (+)) celletal i figur 2 er baseret på de samme billedeksempler som grafen for celletal i figur 4, men i figur 2 blev de kvantificeret ved hjælp af en ikke-automatiseret metode bistået af Fiji-software, i figur 4 blev de kvantificeret ved hjælp af den automatiserede billedanalyse software platform cellprofiler. Disse to billede analysetilgange gav lignende resultater.
Replating er nyttigt ikke kun at studere neurite outgrowth, men også at studere synapser eller andre senere forekommende biologiske funktioner i neuroner. Faktisk efter blot en uge post-replating vi observere markører for mange præsynaptiske og postsynaptiske proteiner dekorere neuronal dendritter i et punktformig mønster (figur 5a). Efter 4 uger begynder vi også at opdage deres samlokalisering, som er en indikator for dannelsen af funktionelle synapser (figur 5A). Desuden er elektrisk aktivitet fra spontan depolarisering og synaptisk drevne strømme detekterbar ved hjælp af calcium Imaging (figur 5B) eller Multielektrode arrays (MEAs).
Figur 1 : Overlegen bevarelse af neuronal levedygtighed efter længere inkubation med det proteolytiske enzym til celle dissociation. (A) fasekontrast billede af NPC-afledte neuroner differentieret i 3 uger. Det boxed område i venstre billede forstørres til højre. På dette stadium neuroner har lange processer, som danner en tyk meshwork. Skala stænger = 80 μm (venstre); 35 μm (højre). (B) udvalgte billeder af hipsc-afledte neuroner på 1 og 5 dage efter-replating. Scale bar = 100 μm. (C) venstre: cellerne løsnes som et enkelt ark inden for få minutter efter initiering af proteasebehandling. Scale bar = 200 μm. Højre: efter formalings celler tælles på hemocytometer før replating. Grafer viser kvantificering af ikke-levedygtige, trypan-blå positive celler efter 5 min eller 45 min inkubation med det proteolytiske enzym for to forskellige linjer CVB WT24 (* * * p < 0,0003, uparret t-test) og WT 126 (* * * p < 0,0001, uparret t-test). Værdier repræsenterer middelværdien ± S. E. M af 4 individuelle replikater. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Neuronal levedygtighed efter flere dage post-replating. A) billeder af WT126 NPC-afledte neuroner ved 1 og 3 dage efter replating med 5 min og 45 min proteaseinkubation. Døende celler er mærket med den følsomme tidlige celle død reporter. Tilsvarende lysfelt-billeder vises til venstre. Nogle cellulære rester (blå pil) er typisk detekteres efter replating, især i 5 min gruppe. Skala stænger = 150 μm.B) billeder af CVB WT24 NPC-afledte kulturer ved 1, 3 og 7 dage efter replating med 5 min og 45 min proteaseinkubation. Døende celler er mærket med den følsomme tidlige celle død reporter (rød). Alle kerner af levende og døende celler er mærket med DAPI (cyan). Det flettede hvide signal repræsenterer DAPI og VivaFix-positive (+) celler. Et par celler viser VivaFix farvning men mangler DAPI farvning (røde celler i det kombinerede billede til højre); Det er sandsynlige celler, der var døde i mange timer. Skala stænger: 25 μm. Højre graf viser kvantificering af den fraktion af døde celler (VivaFix/DAPI) efter forskellig inkubationstid med proteolytisk enzym (5 min vs 45 min: * p < 0,05 1 d og * * * p < 0,001, 3 d; to-vejs ANOVA, efterfulgt af multicomparison Bonferroni post hoc test). Venstre graf viser ændringer i den samlede celletæthed (# DAPI (+) celler i 5 min vs 45 min: * * * p < 0,0001 for alle tidspunkter; to-vejs ANOVA, efterfulgt af multicomparison Bonferroni post hoc test). Alle værdier vises som middelværdien ± S. E. M af 3 replikater, med mindst 1.500 celler scoret pr. betingelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Detekterbart udtryk for sene neuronal markører umiddelbart efter plader. Kulturer af CVB WT24 hipsc-afledte celler afbildet 4 dage efter replating, ved hjælp af 45 min proteaseinkubation, fra en 10 cm skål, der var blevet differentieret fra NPC scenen i 4 uger. Viste eksempler blev plettet for pan-neuronal markører TuJ1, MAP2 eller NeuN; eller den dybe-lag kortikale pyramideformet neuron markør CTIP2. Bemærk tilstedeværelsen af omfattende neurites, og den robuste udtryk for TuJ1 og MAP2. Bemærk især, at en betydelig brøkdel af neuronerne også udtrykker sene-Stage markører NeuN og CTIP2. Skala bar = 16 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Neurit og dendrit vækst over tid efter kortere og længere enzym inkubation under replating. A) REPLATED CVB WT24 hipsc-afledte neuroner udvider hurtigt neuritterne, som detekteret ved hjælp af antistof Tuj1. Bemærk, at den forlængede proteaseinkubationstid fremmer neuritogenesis. Scale bar = 25 μm.B) kvantificering af neurit-og dendrit længde, over 1, 3 og 7 dage efter replating med enten 5 min eller 45 min protease. Den totale neurite længde blev kvantificeret fra TuJ1 (βIII-Tubulin) farvning; dendrit-specifikke farvning blev kvantificeret fra MAP2 farvning SNF korrigeret for den samlede celletæthed (højre graf). Alle værdier vises som middelværdien ± S. E. M af 3 replikater. Neurite længde 5 min vs 45 min: * p < 0,05 på 1 dag og 7 dage, * * p < 0,01 på 3 dag; dendrit længde 5 min vs 45 min: * * p < 0,01 på 1 dag og 3 dage, ikke signifikant (NS) på 7 dag; # DAPI (+) 5 min vs 45 min: * * * p < 0,0001 for alle tidspunkter; to-vejs ANOVA, efterfulgt af multicomparison Bonferroni post hoc test. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 : Synaptogenesis og spontane calcium transienter i differentierede hiPSC-afledte neuroner efter replating. (A) venstre: ved 4 uger efter replating ved hjælp af den udvidede proteaseinkubations protokol, er den præsynaptiske markør synapsin 1 detekterbar i punktformig KLYNGER langs MAP2 positive dendritter. Skala stænger = 5 μm. Højre: valgt dendritiske region, der viser samlokalisering mellem præsynaptiske og postsynaptiske klynger (gul pil), en indikation af potentielt aktive synapser. Skala stænger = 1,5 μm. (B) venstre: hipsc-afledte neuroner inficeret med AAV8-syn-jGCaMP7f-wpre blev brugt til at overvåge spontane calcium transienter drevet af netværksaktivitet. Billedet lysfelt vises ved siden af farvebillede-gengivelsen af GCaMP7 fluorescens på et enkelt tidspunkt i time-lapse-serien. Scale bar = 25 μm. farvede tal angiver de 4 udvalgte celler, hvor GCaMP7 fluorescens blev målt over tid, som vist i sporene til højre. Hvert farvet spor svarer til en celle. Stjernen peger på det tidspunkt under den live optagelse, som billedet til venstre svarer til. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6 : Workflow af plader procedurer til kultur hipscs for høj indholds screening og/eller detaljerede undersøgelser af differentiering og neurite udvækst eller MEA optagelser. Begyndende fra en differentieret kultur af neuroner, der dyrkes i 4 eller flere uger i et større format (f. eks. en 10 cm kultur skål), inkuberet neuroner med en proteasehæmmere i 40-45 min, findelt forsigtigt for at dissociere og resuspendere. Cellerne fordeles derefter til multi-brønde, der er kompatible med HCS, og som er fyldt på substrater, som er kompatible med Billeddannende vækst kegler (gul pil) eller andre strukturer, eller på multi-brønde, der egner sig til multielektrode array optagelser. Skala stænger = 27 μm, 5 μm, 2,5 μm, 130 μm (fra venstre mod højre). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har demonstreret en straight-Forward procedure for opblanding og plader af menneskelige neuronal kulturer, der optimerer levedygtighed, differentiering succes, og subcellulære Imaging på en måde, der er kompatibel med højt indhold screening platforme, og andre analyser, som er relevante for lægemiddel opdagelsen. Figur 6 illustrerer den overordnede arbejdsgang og eksempler på sådanne applikationer.
Selv om vi her fokuserede på hiPSC-afledte neuroner, der er rettet mod en kortikal neuron skæbne, vi forventer, at denne metode bør også gælde for menneskelige embryonale stamceller-afledte neuroner, og at stamceller afledte neuroner rettet mod andre neuronal fænotyper14,15,16,17,18. Desuden postulerer vi, at denne udvidede proteaseprocedure kan være gavnlig for andre situationer, der kræver opblanding af celler med et etableret neurit meshwork, for eksempel til FACS sortering eller enkelt celle analyser af primære neuroner19 , 20.
Replating hiPSC-afledte neuroner giver et levedygtigt model system til at undersøge cellulære og molekylære mekanismer af mange vigtige biologiske begivenheder. For eksempel kan denne procedure lette detaljerede undersøgelser af humane neurite udvækst og vækst kegle egenskaber, og sammenligning af resultater til den omfattende videnbase bygget fra årtier med at studere andre arter, både hvirveldyr og hvirvelløse dyr. Vi finder, at den plader procedure har gjort det er lettere at optimere betingelserne for at generere større vækst kegler, der er velegnet til optisk evaluering af subcellulære struktur og funktion (figur 6). Til sammenligning, vækst kegler mere typisk observeret under den indledende differentiering af neuroner fra hiPSCs tendens til at være lille og kompakt, og den tætte vifte af ikke-neuronal celler i sådanne kulturer gør det vanskeligt både at justere substrat betingelser for at fremme vækst kegle spredning og til billede individuelle vækst kegler inden for det komplekse væv miljø. Således, plader neuroner på en frisk skål giver en "renere skifer", som at se vækst kegler under gode billeddannelse betingelser.
Replating er særlig fordelagtig, når du bruger cellekultur platforme egnet til HCS, fordi det i høj grad reducerer den samlede tid, hvor kulturer dyrkes i små mængder. Den lille arbejdsmængde af de enkelte brønde af 96, 384 eller 1536-brønd multi-brønde (henholdsvis ca. 100, 50 og 5 mikroliter arbejdsvolumen) normalt kræver hyppige (dvs. daglig) medier ændringer for at modvirke fordampning og næringsstof udtømning. Hyppige ændringer i medierne er dyre, ikke kun i form af reagenser og arbejdskraft, men de kan kompromittere levedygtigheden af kulturer ved at fortynde konditionerede medier og ved at øge chancerne for, at cellerne løsnes fra substratet på grund af mekanisk turbulens. Replating af hipscs kan også lette optagelsen af fysiologiske aktiviteter ved hjælp af multielektrode arrays21,22eller levende billeddannelse af kulturer i assays af dynamiske neuronal fænotyper23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde er en del af de nationale kooperative omprogrammerede celle forskningsgrupper (NCRCRG) for at studere psykisk sygdom og blev støttet af NIH Grant U19MH1 2015-0644. Det oprindelige arbejde blev også støttet af NIH Grant NS070297. Vi takker DRs. Carol Marchetto og fred Gage, Salk Institute, for at levere WT 126 linje af neurale stamceller, og DRS. Eugene Yeo og Lawrence Goldstein, UC San Diego for at levere CVB WT24 linje af neurale stamceller. Vi takker Deborah pre i laboratoriet af Dr. Anne Bang, Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute, for nyttige diskussioner.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Post Replating Media | |||
| L-Ascorbic Acid | Sigma | A4403 | Add 1 mL of 200 mM stock to 1 L of N2B27 media |
| Dibutyryl-cAMP | Sigma | D0627 | Add 1 µM |
| Human BDNF | Peprotech | 450-02 | 10 ng/ml final concentration |
| B27 (50x) | Thermofisher Scientific | 17504044 | Add 20 mL to 1 L N2B27 media |
| DMEM/F12 with Glutamax | Thermofisher Scientific | 31331093 | Add N2 and distribute in 50 mL conicals; parafilm wrap lids |
| Human GDNF | Peprotech | 450-10 | 10 ng/mL final concentration |
| Glutamax | Thermofisher Scientific | 35050038 | Add 10 ml to 1 L N2B27 media; glutamine supplement |
| Mouse Laminin | Sigma | P3655-10mg | Add 100 µL to 50 mL N2B27 |
| MEM Nonessential Amino Acids | Thermofisher Scientific | 11140035 | Add 5 mL to 1 L N2B27 media |
| N2 (100x) Supplement | Life Technologies | 17502048 | Add 5 mL to 500 mL media |
| Neurobasal A Media | Thermofisher Scientific | 10888022 | Combine with DMEM/F12 to generate N2B27 media for CVB wt cells; neural basal A media |
| Neurobasal Media | Thermofisher Scientific | 21103049 | for WT126 cells; neural basal media |
| SM1 Supplement | StemCell Technologies | 5711 | Add 1:50 to media |
| Sodium bicarbonate | Thermofisher Scientific | 25080-094 | Add 10 mL to 1 L N2B27 media |
| Plate Preparation | |||
| 10 cm Tissue Culture Dishes | Fisher Scientific | 08772-E | Plastic TC-treated dishes |
| 6-well Tissue Culture Dishes | Thomas Scientific | 1194Y80 | NEST plates |
| Mouse Laminin | Life Technologies | 23017-015 | Add 1:400 on plastic |
| Poly-Ornithine | Sigma | P3655-10mg | Add 1:1,000 on plastic |
| UltraPure Distilled Water | Life Technologies | 10977-015 | To dilute Poly-L-Ornithine |
| Replating Reagents | |||
| 100 mM Cell Strainer | Corning | 431752 | Sterile, individually wrapped |
| 384-well plate, uncoated | PerkinElmer | 6007550 | Coat with PLO and Laminin |
| DPBS | Life Technologies | 14190144 | Dulbecco's phosphate-buffered saline |
| Poly-D-Lysine-Precoated 384-well Plates | PerkinElmer | 6057500 | Rinse before coating with laminin |
| StemPro Accutase | Life Technologies | A1110501 | Apply 1 mL/10 cm plate for 30-45 min; proteolytic enzyme |
| Fixation Materials | |||
| 37% Formaldehyde | Fisher Scientific | F79-1 | Dissolved in PBS |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-12 | 0.8 g per 10 mL of fixative |
| Immunostaining Materials | |||
| Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse | Invitrogen | A-11001 | secondary antibody |
| Alexa Fluor 568 Goat anti-chicken | Invitrogen | A-11041 | secondary antibody |
| Alexa Fluor 647 Goat anti-chicken | Invitrogen | A-21449 | secondary antibody |
| Alexa Fluor 561 Goat anti-rat | Invitrogen | A-11077 | secondary antibody |
| DAPI | Biotium | 40043 | visualizes DNA |
| Mouse antibody against b3-tubulin (TuJ-1) | Neuromics | MO15013 | early stage neuronal marker |
| Rat antibody against CTIP2 | Abcam | ab18465 | layer 5/6 cortical neurons |
| Chicken antibody against MAP2 | LifeSpan Biosciences | LS-B290 | early stage neuronal marker |
| Chicken antibody against NeuN | Millipore | ABN91 | late stage neuronal marker |
| Rabbit antibody against MAP2 | Shelley Halpain | N/A | early stage neuronal marker |
| Mouse antibody against PSD-95 | Sigma | P-246 | post-synaptic marker |
| Rabbit antibody against Synapsin 1 | Millipore | AB1543 | pre-synaptic marker |
| Bovine serum albumin (BSA) | GE Healthcare Life Sciences | SH30574.02 | 10% in PBS for blocking |
| Titon X-100 | Sigma | 9002931 | Dilute to 0.2% on PBS for permeabilization |
| Viability Markers | |||
| Vivafix 649/660 | Biorad | 135-1118 | cell death marker |
| Calcium Imaging | |||
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| AAV8-syn-jGCAMP7f-WPRE | THE SALK INSTITUTE, GT3 Core Facility | N/A | calcium reporter in a viral delivery system |
| hiPSC-derived NPCs | |||
| WT 126 (Y2610) | Gage lab | N/A | Marchetto et al., 2010 |
| CVB WT24 | Yeo and Goldstein labs | N/A | unpublished |
References
- Engel, M., Do-Ha, D., Munoz, S. S., Ooi, L. Common pitfalls of stem cell differentiation: a guide to improving protocols for neurodegenerative disease models and research. Cell and Molecular Life Sciences. 73 (19), 3693-3709 (2016).
- Kim, D. S., Ross, P. J., Zaslavsky, K., Ellis, J. Optimizing neuronal differentiation from induced pluripotent stem cells to model ASD. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 109 (2014).
- Amin, N. D., Paşca, S. P. Building Models of Brain Disorders with Three-Dimensional Organoids. Neuron. 100 (2), 389-405 (2018).
- Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Passaging Cells. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2019).
- Langdon, S. P. Cancer Cell Culture. , Humana Press. New York, NY. (2010).
- Picot, J. Human Cell Culture Protocols. 107, Springer Science & Business Media. Berlin, Germany. (2005).
- Marchetto, M. C., et al. A model for neural development and treatment of Rett syndrome using human induced pluripotent stem cells. Cell. 143 (4), 527-539 (2010).
- Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks. Nature Protocols. 7 (10), 1836-1846 (2012).
- Banker, G., Goslin, K.
- Calabrese, B., Halpain, S. Essential role for the PKC target MARCKS in maintaining dendritic spine morphology. Neuron. 48 (1), 77-90 (2005).
- Mullen, R. J., Buck, C. R., Smith, A. M. NeuN, a neuronal specific nuclear protein in vertebrates. Development. 116 (1), 201-211 (1992).
- Calabrese, B., Saffin, J. M., Halpain, S. Activity-dependent dendritic spine shrinkage and growth involve downregulation of cofilin via distinct mechanisms. PLOS One. 9 (4), 94787 (2014).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. 7 (10), 100 (2006).
- Gupta, S., et al. Deriving Dorsal Spinal Sensory Interneurons from Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Reports. 10 (2), 390-405 (2018).
- Ogura, T., Sakaguchi, H., Miyamoto, S., Takahashi, J. Three-dimensional induction of dorsal, intermediate and ventral spinal cord tissues from human pluripotent stem cells. Development. 145, (2018).
- Playne, R., Jones, K., Connor, B. Generation of dopamine neuronal-like cells from induced neural precursors derived from adult human cells by non-viral expression of lineage factors. Journal of Stem Cells and Regenerative Medicine. 14 (1), 34-44 (2018).
- Rao, M. S., et al. Illustrating the potency of current Good Manufacturing Practice-compliant induced pluripotent stem cell lines as a source of multiple cell lineages using standardized protocols. Cytotherapy. 20 (6), 861-872 (2018).
- Suga, H. Differentiation of pluripotent stem cells into hypothalamic and pituitary cells. Neuroendocrinology. 101 (1), 18-24 (2015).
- Endaya, B., et al. Isolating dividing neural and brain tumour cells for gene expression profiling. Journal of Neuroscience Methods. 257, 121-133 (2016).
- Sergent-Tanguy, S., Chagneau, C., Neveu, I., Naveilhan, P. Fluorescent activated cell sorting (FACS): a rapid and reliable method to estimate the number of neurons in a mixed population. Journal of Neuroscience Methods. 129 (1), 73-79 (2003).
- Frega, M., et al. Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays. Journal of Visualized Experiments. (119), e54900 (2017).
- Grainger, A. I., et al. In vitro Models for Seizure-Liability Testing Using Induced Pluripotent Stem Cells. Frontiers in Neuroscience. 12, 590 (2018).
- Daub, A., Sharma, P., Finkbeiner, S. High-content screening of primary neurons: ready for prime time. Current Opinion in Neurobiology. 19 (5), 537-543 (2009).
