Summary
Se describe un modelo animal simple y confiable para la esteatohepatitis no alcohólica inducida por la dieta, que se logra a través de la carcasa no SPF de los animales y la administración de una dieta alta en grasas específica. Describimos la identificación de los subconjuntos de células inmunes hepáticas y adiposas para recapitular las condiciones inmunológicas humanas exponiendo ratones a gérmenes ambientales.
Abstract
La obesidad se asocia con la inflamación crónica de bajo grado y la resistencia a la insulina, contribuyendo a una creciente prevalencia de enfermedades metabólicas crónicas, como la diabetes tipo 2 y la esteatohepatitis no alcohólica (NASH). Investigaciones recientes han establecido que las células inmunes pro-inflamatorias infiltran tejido adiposo hipertrófico obeso y el hígado. Dada la importancia emergente de las células inmunitarias en el contexto de la homeostasis metabólica, hay una necesidad crítica de cuantificar y caracterizar su modificación durante el desarrollo de la diabetes tipo 2 y NASH. Sin embargo, los modelos animales que inducen características fisiopatológicas típicas del NASH humano son escasos.
En este artículo, proporcionamos un protocolo detallado para identificar subconjuntos de células inmunitarias aisladas del hígado y el tejido adiposo en un modelo de ratón confiable de NASH, establecido por la vivienda de ratones con dieta alta en grasas (HFD) bajo condiciones no específicas de patógenos (SPF) sin un barrera durante al menos siete semanas. Demostramos el manejo de ratones en condiciones no SPF, digestión de los tejidos y la identificación de macrófagos, células asesinas naturales (NK), células dendríticas, B y células T subconjuntos por citometría de flujo. Se proporcionan diagramas de citometría de flujo representativos de ratones con SPF HFD y ratones que no son SPF. Para obtener datos fiables e interpretables, el uso de anticuerpos, métodos precisos y precisos para la digestión de los tejidos y la correcta compuerta en los experimentos de citometría de flujo son elementos críticos.
La intervención para restaurar la exposición fisiológica del antígeno en ratones alojándolos en condiciones no SPF y la exposición no específica a antígenos microbianos podría proporcionar una herramienta relevante para investigar el vínculo entre las alteraciones inmunológicas, inducida por la dieta obesidad y complicaciones relacionadas a largo plazo.
Introduction
La obesidad es un trastorno multifactorial y un factor de riesgo importante para desarrollar enfermedades cardíacas, accidentes cerebrovasculares, esteatohepatitis no alcohólica (NASH), diabetes tipo 2 (T2D) y algunos tipos de cáncer. La prevalencia de la obesidad está aumentando rápidamente en todo el mundo. Hoy en día, 2,1 mil millones personas — casi el 30% de la población mundial — son obesas o con sobrepeso1. La resistencia a la insulina asociada a la obesidad puede conducir a T2D, cuando las células beta del islote pancreático agotado no logran compensar la mayor necesidad de insulina para mantener la la homeostasis de la glucosa2.
El tejido adiposo se compone de varios tipos de células, incluyendo adipocitos, células endoteliales, fibroblastos y células inmunitarias. Durante la progresión de la obesidad, los cambios en el número y la actividad de las células inmunitarias pueden provocar una inflamación de bajo grado del tejido adiposo hipertrófico3,4. Específicamente, se ha encontrado que la ingesta excesiva de energía, acompañada de niveles crónicamente elevados de glucosa en sangre, triglicéridos y ácidos grasos libres, conduce a la hipoxia adipocíta, estrés retículo endoplásmico, deterioro de la función mitocondrial y mejora de la secreción de citoquinas, lo que resulta en la activación de las células inmunitarias proinflamatorias de la adiposa5,6. Investigaciones pasadas se han centrado principalmente en la inmunidad innata, pero más recientemente las células inmunes adaptables (células T y B) han surgido como reguladores importantes de la homeostasis de la glucosa. Poseen inflamatorios (incluyendo células t CD8+ , Th1, y células B) o principalmente funciones regulatorias (incluyendo células reguladoras t (treg), células Th2) y pueden exacerbar o proteger contra la resistencia a la insulina7,8 , 9.
Además, se propusieron varios mecanismos para explicar cómo la obesidad aumenta la esteatohepatitis, incluyendo el aumento de la producción de citoquinas por tejido adiposo10. NASH, la forma progresiva de hígado graso no alcohólico y una importante carga sanitaria en los países desarrollados, se caracteriza histológicamente por los hepatocitos en globo, la acumulación de lípidos, la fibrosis y la inflamación pericelular y puede progresar hasta cirrosis, enfermedad hepática terminal o carcinoma hepatocelular. Varios régimen (por ejemplo, la dieta deficiente de metionina y colina11) se sabe que inducen la patología hepática como Nash en modelos animales no humanos, pero la mayoría de estos enfoques no recapitulan las condiciones humanas de Nash y su metabolismo consecuencias, ya sea que requieran un nocaut genético específico, manipulaciones dietéticas no fisiológicas o la falta de resistencia a la insulina típica de NASH humano. Por otra parte, nuestra comprensión de los mecanismos subyacentes de las enfermedades metabólicas se basa actualmente en experimentos llevados a cabo con ratones de laboratorio alojados bajo condiciones estándar específicas libres de patógenos (SPF). Esas instalaciones de barrera son anormalmente higiénicas y no consideran la diversidad microbiana que los seres humanos tienen que encontrar, lo que puede tener en cuenta las dificultades en el proceso de traducción de los estudios en animales a los enfoques clínicos12,13 , 14.
Para investigar los diferentes subconjuntos de células inmunes en el tejido adiposo y el hígado durante el desarrollo de la resistencia a la insulina y NASH en un modelo avanzado de ratón que reproduce las condiciones inmunológicas humanas, los ratones se alojaron en jaulas individuales en semi estéril condiciones sin barreras. Los ratones alojados bajo condiciones expuestas al antígeno desarrollaron patología hepática como la de NASH ya después de 15 semanas de alimentación con dieta alta en grasas (HFD)13. En comparación con los ratones SPF adaptados a la edad, desarrollaron esteatosis macrovesicular, infiltración hepática y activación de células inmunitarias.
Este manuscrito describe un análisis robusto de citometría de flujo para definir y contar subconjuntos de células inmunitarias del tejido adiposo del ratón y del hígado en un modelo de NASH. El análisis de citometría de flujo permite la detección de múltiples parámetros de células individuales simultáneamente en contraste con los enfoques RT-PCR o inmunohistoquímica.
En Resumen, nuestro estudio ofrece un modelo de ratón de HFD a corto plazo para la investigación del desarrollo de la resistencia a la insulina y NASH y los mecanismos subyacentes que también exhibe la fidelidad a la condición humana.
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Protocol
Este estudio se llevó a cabo de acuerdo con la guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio de los institutos nacionales de salud y la ley de bienestar animal bajo la supervisión de nuestro Comité institucional de cuidado y uso de animales. Los protocolos de los animales se realizaron de acuerdo con las directrices éticas institucionales de la Charité Berlin, Alemania, y fueron aprobados por el Landesamt für Gesundheit und Soziales y cumplen con las pautas de llegada.
1. modelo animal inducido por la dieta de esteatohepatitis
- Transfiera ratones (C57Bl/6J, macho) a vivienda no SPF a la edad de 4 semanas y expérrelas continuamente a una amplia gama de patógenos/antígenos ambientales. Garantizar la exposición por el manejo diario de los animales de laboratorio como antígenos se distribuyen por el pasaje de aire de esta manera.
- Mantener ratones (C57BL/6J, macho, 12 semanas de edad) en sistemas de enjaular abiertos con filtros convencionales en un ciclo de luz/oscuridad de 12 h:12 h a una temperatura de 22 ° c. No Irradie ni esterilice la dieta y el lecho experimental. Acceso a la vivienda de animales sin máscara o red de pelo. Puertas abiertas entre las habitaciones de animales. No use una ducha de aire.
- Garantizar la manipulación diaria de los animales de laboratorio y las salas de conmutación de forma regular para que los antígenos se distribuyan por conducto de aire. Complementar la vivienda sucia con exposición microbiana no específica diaria a antígenos de la ropa de cama de animales de laboratorio de mamíferos alojados en habitaciones situadas junto a los ratones de laboratorio.
- Mida las proporciones de la memoria CD44-CD62L- EFECTOR de células CD4+ y CD8+ T en sangre y bazo utilizando citometría de flujo (como se describe en refefence13).
Nota: En este sentido definimos un aumento de 20% de la memoria efector de células t CD8+ de células CD8+ t como evidencia de exposición microbiana suficiente. - Comience el HFD (60 kJ% de la grasa, 19 kJ% de proteínas y 21 kJ% de carbohidratos y consumo de libitum de agua con contenido de sacarosa al 6% con ratones masculinos C57Bl/6J de cinco semanas de edad para 7-15 semana. El HFD debe contener 60% kJ de la grasa (como se describió anteriormente) con el fin de inducir el desarrollo de resistencia a la insulina a lo largo del transcurso del experimento.
Nota: Se debe realizar la tinción de hematoxilina y se deben encontrar características histológicas como globos de hepatocitos, cuerpos de Mallory Denk, infiltración de células inmunitarias y esteatosis macrovesicular para demostrar la patología hepática como NASH (como se muestra en la referencia 13).
2. preparación de reactivos y soluciones
- Preparar el 70% de etanol, fosfato salino amortiguado (PBS, sin calcio y magnesio) complementado con 0,5% BSA y ACK (cloruro de amonio-potasio) tampón de lisis.
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Tampón de tinción
- Disolver 10 mL de suero de ternera fetal (FCS) en 500 mL de PBS para obtener 2% FCS PBS. Coloque el tampón de tinción sobre hielo antes de usarlo.
- Almacene la solución en una botella de plástico a 4 ° c.
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Solución de collagenasa para la digestión del tejido adiposo
- Disolver 2,5 g de albúmina sérica bovina (BSA) en 500 mL de PBS para obtener un 0,5% de BSA/PBS.
- Disolver 74,5 g de CaCl2 en 10 mL de 0,5% de BSA/PBS para obtener una solución de 10 mm de CaCl2 .
- Añadir 1 mg de colagenasa tipo II (ver tabla de materiales) a cada ml de 0,5% de BSA con 10 mm CaCl2 PBS.
- Preparar 3 mL de solución de digerido de colagenasa por g de muestra de tejido adiposo. Prepare una nueva solución de colagenasa para cada aislamiento.
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Solución de collagenasa para la digestión del tejido hepático
- Disolver 2,5 g de BSA en 500 mL de solución de sal equilibrada de Hank (HBSS) para obtener 0,5% BSA HBSS.
- Añadir 10 mL de FCS en 500 mL de 0,5% BSA/HBSS para obtener 2% FCS 0,5% BSA/HBSS.
- Añadir 0,5 mg de colagenasa tipo IV (ver tabla de materiales) a cada ml de 2% FCS 0,5% BSA/HbSS.
- Añadir 0,02 mg de DNase por mL de 2% FCS 0,5% BSA/HBSS solución de colagenasa.
- Prepare 13 mL de solución de digestión de colagenasa por muestra de tejido hepático.
- Prepare una nueva solución de colagenasa para cada aislamiento.
3. generación de suspensiones de célula única
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Digestión del tejido adiposo
- Eutanasia ratones a través de la anestesia isoflurana seguida de dislocación cervical. Pulverizar el pecho con etanol al 70%. Cuidadosamente hacer una incisión central de 5-6 cm a través del integumento y la pared abdominal a lo largo de toda la longitud de la caja torácica para exponer la cavidad pleural y el corazón.
Nota: No dañe los órganos subyacentes y mantenga las puntas de las tijeras hacia arriba. - Inyecte al menos 10 mL de solución salina al 0,9% en el vértice del ventrículo izquierdo con una aguja de 26 G.
Nota: La perfusión exitosa se observa mediante el blanqueamiento del hígado. - Abrir la cavidad peritoneal con tijeras y cortar las almohadillas de grasa perigonadal en cada lado con finas tijeras curvadas. Diseccionar los tejidos gonadales con tijeras curvadas finas y pesar tejido adiposo.
- Realizar la disociación mecánica utilizando tijeras y cortar el tejido adiposo en trozos finos en una placa de Petri a 4 ° c. Transferir el tejido adiposo a 50 mL de tubos de centrífuga cónica y enjuagar la placa de Petri con 1 mL de 0,5% de BSA/PBS.
- Añadir 3 mL de solución de digestión de tejido adiposo (como se preparó en el paso 2,3) por gramo de tejido adiposo. Incubar solución de tejido adiposo a 37 ° c durante 20 min bajo agitación suave (200 rpm).
- Añadir 5 mL de 0,5% de BSA/PBS por gramo de tejido adiposo y colóquelo sobre hielo. Triturar la solución numerosas veces con una pildana serológica de 10 mL y pasarla a través de un colador (100 μm) con la ayuda de un émbolo.
- Centrifugar a 500 x g durante 10 min a 4 ° c.
- Retire la fracción de adipocito flotante por pipeteo. Resuspend el pellet de células (fracción vascular stromal) en 1 mL de tampón de lisis de ACK (ver tabla de materiales). Añadir 10 mL de PBS 2% FCS.
- Centrifugar a 500 x g durante 10 min a 4 ° c.
- Supernatante Decant y pellet de resuspendio de células en 250 μL de 2% FCS PBS.
- Cuente el número de células viables en un hemocitómetro utilizando la exclusión de azul Tripan.
- Eutanasia ratones a través de la anestesia isoflurana seguida de dislocación cervical. Pulverizar el pecho con etanol al 70%. Cuidadosamente hacer una incisión central de 5-6 cm a través del integumento y la pared abdominal a lo largo de toda la longitud de la caja torácica para exponer la cavidad pleural y el corazón.
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La digestión del tejido hepático
- Almacene el hígado en un tubo de centrífuga cónico lleno de PBS y transporte sobre hielo.
- Realizar la disociación mecánica utilizando sellos de jeringa en una placa de Petri a 4 ° c. Poner el tejido hepático diseccionado en un tubo cónico de 50 mL de centrífuga que contenga 10 mL de solución de digestión hepática tibia. Enjuagar la placa de Petri con 3 mL de solución de digestión hepática.
- Incubar solución de tejido hepático a 37 ° c durante 20 min bajo agitación suave (200 rpm).
- Añadir 20 mL de HBSS. Triturar la solución numerosas veces con una pildana serológica de 10 mL y pasarla a través de un colador (100 μm) con la ayuda de un émbolo.
- Centrifugar a 500 x g durante 10 min a 4 ° c. Decante el sobrenadante y resuspender el pellet de células en 20 mL de HBSS.
- Centrifugar a 30 x g durante 1 min a temperatura ambiente para extraer la matriz de hepatocitos. Deseche el pellet de células.
- Centrifugar el sobrenadante a 500 x g durante 10 min a 4 ° c. Resuspend el pellet en 10 mL de una solución mediana de gradiente de densidad de baja viscosidad del 33% (ver tabla de materiales) en HBSS seguida de centrifugación (800 x g; 30 min; temperatura ambiente; sin freno).
- Resuspend el pellet en 1 mL de tampón de lisis de ACK e incubar durante 4 min a temperatura ambiente. A continuación, añada 10 mL de HBSS.
Nota: Para descartar el sobrenadante aspirar el sobrenadante con interfásico (hepatocitos) con mucho cuidado con una Pilea de transferencia (tanto como sea posible sin tomar el pellet con células inmunitarias y eritrocitos). - Pase las células a través de un colador de 30 μm en un tubo cónico de centrifugación de 15 mL y centrifugue a 500 x g durante 10 min a 4 ° c. Supernatante Decant y pellet de resuspendio de células en 250 μL de 2% FCS PBS.
- Cuente el número de células viables en un hemocitómetro utilizando la exclusión de azul Tripan.
4. tinción superficial
- Prepare la mezcla de anticuerpos para los subconjuntos de células T (panel 1) y las células inmunitarias innatas (panel 2), tal como se describe en la tabla 1 y en la tabla 2. Los volúmenes están optimizados para una muestra (100 μL) con respecto a las concentraciones de anticuerpos.
Nota: Los linfocitos y las células inmunitarias innatas presentan diferencias en la autofluorescencia y deben analizarse por separado. - Utilice hasta 3 x 106 células en 100 μL en un tubo de poliestireno FACS para tinción superficial. Para bloquear los receptores FC añadir 10 μL de anticuerpo anti-CD16/CD32 (diluido 1:100) e incubar durante 10 min en hielo. Utilice una muestra de control negativo sin teñir para ajustar la dispersión lateral (SSC) y la dispersión hacia adelante (FSC) para determinar la ubicación de la población celular negativa.
- Vórtice y agregue el volumen adecuado de mezcla de anticuerpos para el panel 1 y el panel 2. Añadir 1 μL de colorante de viabilidad a cada muestra para permitir la discriminación de células vivas y muertas. Incubar durante 20 min a 4 ° c y protegido de la luz.
- Lavar dos veces con 2 mL de 2% FCS PBS y centrifugar a 300 x g durante 5 min a 4 ° c.
- Resuspend el pellet de células en 300 μL de 2% FCS PBS y almacene a 4 ° c hasta el análisis de FACS.
Nota: Antes de iniciar la medición pasar las células a través de 30 μm colador de celda en poliestireno FACS tubo y vórtice. La citometría de flujo se realizó con células etiquetadas almacenadas en 2% FCS PBS a 4 ° c para 1-3 h. las células deben analizarse lo antes posible para obtener resultados optimizados.
5. compensación de citometría de flujo, adquisición y compuerta
- Ejecute una muestra de control negativo sin teñir para establecer el FSC y SSC y ajustar los voltajes del CITOMETRO de flujo para detectar poblaciones leucocitas y distinguir entre desechos y células viables. Excluya los desechos y las células muertas.
Nota: La viabilidad de las suspensiones celulares del hígado podría ser menor que la viabilidad de las suspensiones celulares del tejido adiposo perigonadal debido a un paso de separación de densidad adicional. - Ejecute muestras de control único manchado para la compensación multicolor.
Nota: Los granos de captura de anticuerpos también podrían utilizarse para ajustar la superposición espectral si el número de celdas de una población de interés es demasiado bajo para compensar el uso de células. Para detectar posibles señales de Autofluorescencia de la fluorescencia de las células menos uno (FMO) controles para cada anticuerpo se recomiendan pero no se aplicaron en este protocolo. - Inicie la medición, recopile el número adecuado de eventos (al menos 50.000 eventos) y registre los datos experimentales.
- Exporte los archivos de datos FCS para analizarlos y establezca la estrategia de compuerta. Puerta en CD45+ leucocitos para identificar las poblaciones celulares subsiguientes.
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Representative Results
El protocolo descrito permite la caracterización de marcadores superficiales de células inmunitarias innatas y adaptativas aisladas del tejido adiposo de la murina perigonadal y del hígado en un modelo de NASH inducido por la dieta. En este modelo, NASH fue inducido por la administración de HFD más sacarosa (6%) en el agua potable durante 7 a 15 semanas en ratones C57Bl/6J, como se informó anteriormente13. Es importante destacar que los ratones estaban alojados en condiciones semi estériles y, por lo tanto, expuestos a antígenos ambientales a lo largo del experimento. Los ratones alimentados con HFD alojados en condiciones de SPF y ratones con dieta de Chow alojados en condiciones de SPF y no SPF sirvieron como controles. La alimentación por HFD resultó en un aumento significativo de peso corporal ya después de 7 semanas en ambos grupos. Una diferencia significativa en el peso corporal se evidenció por primera vez en la semana 4 (P < 0,001) y permaneció significativa durante las siguientes semanas experimentales. Sin embargo, no se mostraron diferencias significativas en el aumento de peso entre ratones con SPF y no SPF después de 7 semanas13. La fracción vascular del estroma y las células inmunitarias del tejido adiposo perigonadal y los hígados de ratones machos alimentados con un HFD durante 7 semanas fueron aislados por la digestión de la colagenasa. Las células inmunitarias se etiquetaron con anticuerpos primarios conjugados con fluoróforos y las proporciones de células T, células B, macrófagos, células NK, células dendríticas y granulocitos se cuantificaron mediante análisis de citometría de flujo. En la figura 1se ilustra la compuerta para las subpoblaciones de células T, incluida la discriminación de doblete y la tinción de viabilidad, en grasa perigonadal murina. CD45+ leucocitos son primero bloqueado para CD4 y CD8 y posteriormente bloqueado para CD44 y CD62L para discriminar entre la memoria ingenua, central, memoria efector y efector T células. Las células CD44+ se caracterizaron posteriormente con CD127, KLRG1 y PD-1. La figura 2 proporciona la estrategia de compuerta para analizar células B, granulocitos, células NK, macrófagos y células dendríticas.
Los resultados representativos de la tinción extracelular de células T dentro del hígado murino de ratones expuestos con HFD en comparación con ratones HFD SPF se demuestran en la figura 3A. De hecho, un porcentaje más alto de células CD4 + y CD8 + t de memoria de efector pueden detectarse en ratones expuestos al HFD, mientras que las células CD4 + e ingenuas intrahepáticas se descubrió que eran considerablemente más bajas en la exposición en comparación con los ratones SPF en semana 7 (figura 3A).
Para validar estos resultados, la respuesta inflamatoria hepática asociada con la exposición al antígeno se investigó mediante la tinción de hematoxilina/eosina de las secciones hepáticas de 15 semanas alimentadas con ratones13. La esteatosis severa, incluyendo el aumento de grandes gotas de lípidos que resultan en esteatosis macrovesicular, inflamación lobular, globos hepatocelulares y estructura lobular destruida, se encontró en ratones expuestos al HFD, mientras que solo algunos ratones con SPF muestran una grasa leve acumulación en el hígado (figura 3B). Como se informó en la figura 3C, el porcentaje de células NK fue mayor en el tejido adiposo perigonadal de ratones expuestos al HFD, mientras que los ratones con HFD SPF mostraron porcentajes más altos de células dendríticas. No se encontraron diferencias significativas para los macrófagos y monocitos. En conjunto, estos resultados confirman una esteatosis hepática más grave en ratones expuestos a HFD y pequeñas diferencias en el tejido adiposo entre ratones expuestos a HFD y fps.
La tabla 1 muestra los anticuerpos utilizados en el panel 1. En la tabla 2se describen los anticuerpos utilizados en el análisis de citometría de flujo para la tinción extracecullar de células B, macrófagos, células NK, células dendríticas y granulocitos.
Figura 1 : Representación esquemática de la estrategia de compuerta utilizada en el análisis de citometría de flujo de células inmunitarias adiposas (panel 1). En primer lugar, las celdas están cerradas en singlets. Luego, se excluye la suciedad utilizando el área de dispersión hacia adelante (FSC-A) y el área de dispersión lateral (SSC-A) y eligiendo el tamaño correcto. Las células se caracterizan además por la expresión de CD45. Las células viables se seleccionan utilizando el marcador de células vivas/muertas que es un tinte fluorescente reactivo de amina que no es perdestinada a las células vivas, pero persignificaba a las células con membranas comprometidas. Las células t se dividieron en células T citotóxicas (CD8+) y células t-Helper (CD4+) y se SUBDIVIDEN en Naïve (CD44+CD62L-), memoria central (CD44+CD62L+), memoria efector (CD44+CD62L- ) y efector (CD44-CD62L+) T cells. Por último, las celdas CD44+ están cerradas en KLRG1, CD127 y PD-1. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Representación esquemática de la estrategia de compuerta utilizada en el análisis de citometría de flujo de células inmunitarias adiposas (panel 2). La compuerta de las células dendríticas se basó en la expresión CD11b y CD11c. Se definieron las siguientes poblaciones: células B, células NK, macrófagos, monocitos y granulocitos. Los datos se analizaron después de la adquisición con el software adecuado. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Análisis de citometría de flujo representativo de células T aisladas del tejido adiposo de la murina perigonadal y del hígado. (A) las células CD4+ y CD8+ T de hígados MURINOS de ratones con HFD de 7 semanas mantenidos bajo SPF y las condiciones expuestas se analizaron mediante citometría de flujo. (B) tinción representativa de 15 semanas de HFD SPF y ratones expuestos. La infiltración de las células inmunitarias y los hepatocitos en globo (punta de flecha) ilustran NASH. (C) porcentajes de células inmunes innatas adiposas como porcentaje de leucocitos en ratones con HFD mantenidos bajo SPF o condiciones expuestas durante 7 semanas. n = 6-10 ratones por grupo. La significación se determinó mediante la medición múltiple de ANOVA de dos vías. Los datos se representan como media ± SEM. * * P < 0.01, * * * P < 0,001. Esta cifra ha sido modificada de la refefence13. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 1: anticuerpos utilizados en la citometría de flujo para la tinción extracelular (panel 1). La cantidad de anticuerpo descrita es para el análisis de una muestra.
Tabla 2: anticuerpos utilizados en la citometría de flujo para la tinción extracelular (panel 2). La cantidad de anticuerpo descrita es para el análisis de una muestra.
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Discussion
La esteatohepatitis tiene una fuerte asociación con anomalías metabólicas como la obesidad, la resistencia a la insulina y la dislipidemia15. Varios estudios indican que la inflamación del tejido adiposo puede conducir la patogénesis de la diabetes tipo 2, incluidos los niveles alterados de células del sistema inmunitario innato y adaptativo4,5,16,17 . Además, se ha encontrado que la obesidad modula la activación de las vías inmunes, que puede conducir a complicaciones hepáticas18. Hay un creciente interés en la caracterización de los fenotipos de células inmunitarias en la respuesta inflamatoria del hígado y la adiposa porque cada subpoblación de células inmunitarias contribuye de una manera diferente al desarrollo de la resistencia a la insulina y la esteatohepatitis.
Este método proporciona información detallada sobre cómo aislar y cuantificar cantidades relativas de células inmunitarias del tejido adiposo perigonadal y el hígado. Además, los métodos muestran cómo mantener los ratones alimentados con HFD en condiciones no SPF para inducir esteatohepatitis. El protocolo se puede utilizar para estudiar las funciones de las células inmunitarias e investigar las asociaciones de células inmunitarias específicas entre diferentes tejidos en un entorno microbiológicamente normalizado.
En nuestro estudio actual, la alimentación por HFD de ratones no SPF resultó en el desarrollo de resistencia a la insulina y esteatohepatitis, mientras que los ratones con HFD SPF desarrollaron resistencia a la insulina, esteatosis hepática leve, pero no esteatohepatitis según lo determinado por la inmunohistoquímica. Además, los subconjuntos de células inmunitarias adiposas y hepáticas diferían significativamente entre los ratones expuestos al HFD y el SPF, lo que confirma nuestra comprensión de la importancia de las diferentes condiciones de la vivienda. En Resumen, podríamos demostrar que la exposición microbiana a la flora comensal podría influir dramáticamente en las propiedades inmunológicas de los ratones C57Bl/6. Trabajos anteriores han demostrado que la diversidad y función del microbioma intestinal se ve afectada por la obesidad inducida por la dieta19,20 y que la función de la barrera intestinal y la permeabilidad intestinal dependen de las condiciones de vivienda21. Nuestro objetivo es abordar el vínculo entre la colonización intestinal y la inflamación adiposa y hepática en una próxima publicación.
Hay que tener en cuenta varios puntos durante la fase de planificación de los métodos propuestos. En primer lugar, las suspensiones de célula única son necesarias para todos los ensayos de citometría de flujo y la viabilidad celular puede verse afectada por el nivel de disociación del tejido mecánico y la duración de la digestión del tejido enzimático. Con el fin de evitar la destrucción del epitopo de anticuerpos y para maximizar el rendimiento de las células funcionalmente viables, disociadas, el tipo de tejido, la edad del animal, las modificaciones genéticas, las concentraciones de enzimas, la temperatura y los tiempos de incubación deben tomarse en consideración.
En segundo lugar, nuestro protocolo se ha optimizado para determinar cuantitativamente diferentes fenotipos de células inmunitarias de ratones alimentados con HFD obesos con inflamación del tejido adiposo y esteatohepatitis. Como la integridad del tejido, el número de células inmunes y, por lo tanto, la calidad de la digestión de los tejidos, podría verse afectada por los procesos inflamatorios, el protocolo y la colagenasa utilizada deben optimizarse para otros tejidos que el hígado o el tejido adiposo en experimentos específicos relacionados con los métodos de disección, los tiempos de incubación o la colagenasa utilizada para digerir el tejido. En tercer lugar, es importante para el protocolo que cada día se incluyan diferentes grupos experimentales para eliminar los efectos debidos a la variación del día a día del ensayo de citometría de flujo (temperatura, tiempos de incubación, etc.).
Sin embargo, hay algunas limitaciones importantes del método descrito. Con el fin de discriminar las señales positivas versus negativas para ajustar correctamente las puertas para identificar las células positivas para marcadores de superficie específicos en las muestras experimentales, los controles de fluorescencia menos uno (FMO) (un control FMO contiene todos los fluorocromos en se debería haber utilizado un panel, excepto el que se esté midiendo. En este experimento los datos podrían ser compensados apropiadamente y la compuerta estaba clara, pero recomendamos agregar controles FMO a la configuración experimental, siempre que sea posible. Por otra parte, FoxP3, que necesita ser manchado intracelular requiriendo permeabilización de la membrana celular, debería haber sido utilizado para cuantificar las células T reguladoras porque permite una definición más precisa que el uso de CD25 y CD127 (tabla 2). A pesar de que la citometría de flujo permite la cuantificación de varios marcadores de superficie simultáneamente, su número se limita a 12 por muestra debido a la superposición en los espectros de emisión. Para corregir la superposición espectral, se requiere una compensación de fluorescencia intensiva en el tiempo. Para ello, se requiere el desarrollo de paneles estratégicos o el uso de técnicas de citometría de masas. Además, podrían surgir dificultades en la vivienda de los ratones en condiciones no SPF con respecto a las pautas específicas de vivienda de animales, pero el pequeño número actual de estudios sobre roedores no SPF muestra que tales estudios son posibles12,21 . Por ejemplo, se podrían evaluar las instalaciones de animales separadas para ratones con SPF y sin SPF. El desarrollo de un sistema inmunitario humano como adulto se ve comprometido en ratones con SPF12,21, lo que resulta en limitaciones para traducir estrategias de tratamiento de experimentos con animales a estudios clínicos.
En conclusión, proporcionamos un protocolo detallado para la caracterización fenotínica de las células inmunitarias de adiposo murina y hepática utilizando citometría de flujo en un modelo animal inducido por la dieta de Nash y resistencia a la insulina. Teniendo en cuenta la compleja función y regulación de las células innatas y adaptativas en el contexto de la obesidad y la desregulación metabólica, nuestros métodos propuestos deben ayudar a profundizar nuestra comprensión de los mecanismos inmunológicos para equilibrar la la homeostasis metabólica y, por lo tanto, ayudar a desarrollar terapias humanas que pueden restaurar la respuesta inmune antiinflamatoria. En general, el modelo animal proporcionado sirve como un modelo rápido y robusto para evaluar las complicaciones metabólicas asociadas con la obesidad y se puede aplicar a otros modelos de enfermedades.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a Anke Jurisch, Diana Woellner, Dra. Kathrin Witte y Cornelia Heckmann la asistencia con procedimientos experimentales y Benjamin Tiburzy de Biolegend para comentarios útiles sobre la estrategia de la puerta. J.S. fue apoyado por la beca Helmholtz (ICEMED). Este estudio fue apoyado por becas de la unidad de investigación clínica del Instituto de salud de Berlín (BIH), el "BCRT-Grant" por el Ministerio Federal alemán de educación e investigación y la Fundación Einstein. K.S.-B. y H.-D.V. son financiados por FOR2165.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 µm cell strainers | Falcon | 352340 | |
| 1 mL syringe | BD | 309659 | |
| 26 G x 5/8 needles | BD | 305115 | |
| 35 mm Petri Dishes | Falcon | 353001 | |
| 40 µm cell strainers | Falcon | 352340 | |
| ACK lysis buffer | GIBCO | A1049201 | |
| Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45 | Biolegend | 103127 | AB_493714 (BioLegend Cat. No. 103127) |
| Analysis software | FlowJo 10.0.8 software | ||
| APC anti-mouse CD11c Antibody | Biolegend | 117309 | AB_313778 (BioLegend Cat. No. 117309) |
| APC anti-mouse KLRG1 (MAFA) Antibody | Biolegend | 138411 | AB_10645509 (BioLegend Cat. No. 138411) |
| BV421 anti-mouse CD127 Antibody | Biolegend | 135023 | AB_10897948 (BioLegend Cat. No. 135023) |
| BV421 anti-mouse F4/80 Antibody | Biolegend | 123131 | AB_10901171 (BioLegend Cat. No. 123131) |
| BV605 anti-mouse CD279 (PD-1) Antibody | Biolegend | 135219 | AB_11125371 (BioLegend Cat. No. 135219) |
| BV605 anti-mouse NK-1.1 Antibody | Biolegend | 108739 | AB_2562273 (BioLegend Cat. No. 108739) |
| BV650 anti-mouse/human CD11b Antibody | Biolegend | 101239 | AB_11125575 (BioLegend Cat. No. 101239) |
| BV711 anti-mouse/human B220 Antibody | Biolegend | 103255 | AB_2563491 (BioLegend Cat. No. 103255) |
| BV785 anti-mouse CD8a Antibody | Biolegend | 100749 | AB_11218801 (BioLegend Cat. No. 100749) |
| C57Bl/6J mice, male, 5 weeks old | Forschungseinrichtungen für experimentelle Medizin (FEM) | ||
| CaCl2 | Charité - Universitätsmedizin Berlin | A119.1 | |
| Collagenase NB 4G Proved Grade | SERVA | 11427513 | |
| Collagenase Typ I | Worthington | LS004197 | |
| Conical centrifuge tube 15mL | Falcon | 352096 | |
| Conical centrifuge tube 50 mL | Falcon | 352070 | |
| DNAse | Sigma-Aldrich | 4716728001 | |
| Fetal bovine serum | Biochrom | S0115 | |
| Filter 30µm | Celltrics | 400422316 | |
| FITC anti-mouse CD3 Antibody | Biolegend | 100203 | AB_312660 (BioLegend Cat. No. 100203) |
| Flow cytometry | BD-LSR Fortessa | ||
| Forceps | Sigma-Aldrich | F4142-1EA | |
| HBSS | Bioanalytic GmBH | 085021-0500 | |
| High-fat diet | SSNIF | E15741–34 | 60 kJ% from fat, 19 kJ% from proteins, and 21 kJ% from carbohydrates |
| micro dissecting scissors | Sigma-Aldrich | S3146 | used for dissection purposes |
| PE anti-mouse CD25 Antibody | Biolegend | 101903 | AB_312846 (BioLegend Cat. No. 101903) |
| PE/Cy7 anti-mouse CD62L Antibody | Biolegend | 104417 | AB_313102 (BioLegend Cat. No. 104417) |
| PE/Cy7 anti-mouse I-A/I-E (MHCII) Antibody | Biolegend | 107629 | AB_2290801 (BioLegend Cat. No. 107629) |
| PE/Dazzle 594 anti-mouse CD4 Antibody | Biolegend | 100565 | AB_2563684 (BioLegend Cat. No. 100565) |
| Percoll solution | Biochrom | L6115 | |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD44 Antibody | Biolegend | 103031 | AB_2076206 (BioLegend Cat. No. 103031) |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse Gr-1 Antibody | Biolegend | 108427 | AB_893561 (BioLegend Cat. No. 108427) |
| Phosphate buffered saline | Gibco | 12559069 | |
| Round-Bottom Tubes with cell strainer cap | STEMCELL Technologies | 38030 | |
| TruStain fcX anti-mouse CD16/32 | Biolegend | 101301 | AB_312800 (BioLegend Cat. No. 101301) |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T6146 | |
| Zombie NIR Fixable Viability Kit | Biolegend | 423105 | viablity stain |
References
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