Summary
Een eenvoudige en betrouwbare dieet-geïnduceerde knaagdier model voor niet-alcoholische Steatohepatitis (NASH) wordt beschreven, bereikt door niet-SPF huisvesting van de dieren en het beheer van een specifieke high-fat dieet. Wij beschrijven de identificatie van de lever-en vetweefsel immuun cel subsets aan recapituleren menselijke immunologische omstandigheden door bloot muizen aan milieu-kiemen.
Abstract
Obesitas wordt geassocieerd met chronische low-grade ontsteking en insulineresistentie, bij te dragen tot een toenemende prevalentie van chronische metabole ziekten, zoals type 2 diabetes en niet-alcoholische Steatohepatitis (NASH). Recent onderzoek heeft vastgesteld dat pro-inflammatoire immuun cellen infiltreren zwaarlijvige hypertrofische vetweefsel en lever. Gezien het opkomende belang van immune cellen in de context van metabolische homeostase, is er een kritieke behoefte om hun wijziging tijdens de ontwikkeling van type 2 diabetes en NASH te kwantificeren en te karakteriseren. Echter, dierlijke modellen die induceren pathofysiologische kenmerken van de menselijke NASH zijn schaars.
In dit artikel, bieden wij een gedetailleerd protocol te identificeren immuun cel subsets geïsoleerd van lever en vetweefsel in een betrouwbare muismodel van NASH, opgericht door de huisvesting van high-fat Diet (HFD) muizen onder niet-specifieke pathogeen-vrije (SPF) voorwaarden zonder een ten minste zeven weken. We demonstreren de behandeling van muizen in niet-SPF-omstandigheden, de spijsvertering van de weefsels en de identificatie van macrofagen, Natural Killer (NK) cellen, dendritische cellen, B en T-cel subsets door flow Cytometry. Representatieve flow Cytometry percelen van SPF HFD muizen en niet-SPF muizen zijn voorzien. Voor het verkrijgen van betrouwbare en interpreterende gegevens, het gebruik van antilichamen, nauwkeurige en precieze methoden voor de spijsvertering en de juiste gating in flow Cytometry experimenten zijn kritische elementen.
De interventie om de blootstelling van fysiologische antigeen bij muizen te herstellen door ze te bewonen in niet-SPF-omstandigheden en onspecifieke blootstelling aan microbiële antigenen kan een relevant hulpmiddel zijn voor het onderzoeken van het verband tussen immunologische veranderingen, dieet-geïnduceerde obesitas en aanverwante complicaties op lange termijn.
Introduction
Obesitas is een multifactoral stoornis en een belangrijke risicofactor voor het ontwikkelen van hart-en vaatziekten, beroerte, niet-alcoholische Steatohepatitis (NASH), type 2 diabetes (T2D) en sommige vormen van kanker. De prevalentie van obesitas neemt wereldwijd snel toe. Vandaag, 2.100.000.000 mensen-bijna 30% van de wereldbevolking-zijn ofwel zwaarlijvig of overgewicht1. Obesitas-geassocieerde insulineresistentie kan leiden tot T2D, wanneer uitgeput pancreas Islet beta cellen niet te compenseren voor de toegenomen behoefte aan insuline te handhaven glucose homeostase2.
Vetweefsel is samengesteld uit verschillende soorten cellen, waaronder adipocyten, endothelial cellen, fibroblasten en immuun cellen. Tijdens de progressie van obesitas, veranderingen in het aantal en de activiteit van het immuunsysteem cellen kan leiden tot een lage-grade ontsteking van hypertrofische vetweefsel3,4. Concreet is gebleken dat overmatige energie-inname, begeleid door chronisch verhoogde niveaus van bloedglucose, triglyceriden en vrije vetzuren, leidt tot adipocyte hypoxie, endoplasmatisch reticulum stress, verminderde mitochondriale functie en verbeterde cytokine secretie, resulterend in de activering van pro-inflammatoire vetweefsel immuun cellen5,6. Afgelopen onderzoek is vooral gericht op aangeboren immuniteit, maar meer recentelijk adaptieve immuun cellen (T en B-cellen) zijn ontstaan als belangrijke regulatoren van glucose homeostase. Zij bezitten ontstekings (met inbegrip van CD8+ T cellen, Th1, en de cellen van B) of hoofdzakelijk regelgevende functies (met inbegrip van regelgevende T (Treg) cellen, Th2 cellen) en kunnen zowel verergeren of beschermen tegen insulineweerstand7,8 , 9.
Voorts werden verscheidene mechanismen voorgesteld om te verklaren hoe de zwaarlijvigheid Steatohepatitis, met inbegrip van verhoogde productie van cytokines door vetweefsel10toeneemt. NASH, de progressieve vorm van niet-alcoholische vervetting van de leverziekte en een grote gezondheids last in de ontwikkelde landen, is histologisch gekenmerkt door ballon hepatocyten, lipide accumulatie, fibrose en pericellular ontsteking en kan vooruitgang te cirrose, eindstadium leverziekte of hepatocellulair carcinoom. Verschillende regimes (bijvoorbeeld de methionine en choline gebrekkig dieet11) is bekend dat Nash-achtige lever pathologie induceren in niet-menselijke dierlijke modellen, maar de meeste van deze benaderingen niet recapituleren menselijke omstandigheden van Nash en de metabole gevolgen als ze ofwel vereisen specifieke gen knock-out, niet-fysiologische dieet manipulaties of gebrek aan insulineresistentie typisch voor de mens NASH. Bovendien is ons begrip van de onderliggende mechanismen van metabole ziekten momenteel gebaseerd op experimenten uitgevoerd met laboratoriummuizen gehuisvest onder standaard specifieke pathogeen vrije (SPF) voorwaarden. Die barrière faciliteiten zijn abnormaal hygiënisch en beschouwen niet de microbiële diversiteit mensen moeten ontmoeten, die voor moeilijkheden in het vertaalproces van dierlijke studies aan klinische benaderingen kunnen rekenschap nemen12,13 , 14.
Om de verschillende immune cel subsets in vetweefsel en lever tijdens de ontwikkeling van insulineweerstand en NASH in een geavanceerd muismodel te onderzoeken dat menselijke immunologische voorwaarden reproduceert, werden de muizen gehuisvest in individuele kooien in semi steriel omstandigheden zonder barrière. De muizen die onder antigeen blootgestelde voorwaarden worden gehuisvest ontwikkelden NASH-als lever pathologie reeds na 15 weken van high-fat dieet (HFD) het voeden13. Vergeleken met leeftijds gematchte SPF muizen ontwikkelden zij macrovesicular steatose, lever infiltratie en activering van immune cellen.
Dit manuscript beschrijft een robuuste flow Cytometry analyse te definiëren en te tellen immune cel subsets van muis vetweefsel en lever in een model van NASH. Flow Cytometry analyse maakt het mogelijk de detectie van meerdere parameters van individuele cellen gelijktijdig in tegenstelling tot RT-PCR of Immunohistochemistry benaderingen.
Samengevat, onze studie biedt een muismodel van korte-termijn HFD voor het onderzoek naar de ontwikkeling van insulineresistentie en NASH en de onderliggende mechanismen die ook vertoont trouw aan de menselijke conditie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Deze studie werd uitgevoerd in overeenstemming met de gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren van de nationale instituten van gezondheid en de wet van het welzijn van dieren onder toezicht van onze institutionele Commissie van het Dierzorg en gebruik. Dierlijke protocollen werden uitgevoerd volgens de institutionele ethische richtlijnen van de Charité Berlijn, Duitsland, en werden goedgekeurd door de Landesamt für Gesundheit und Soziales en voldoen aan de richtlijnen komen.
1. dieet-geïnduceerde dier model van Steatohepatitis
- Overdracht muizen (C57Bl/6J, mannelijk) naar niet-SPF huisvesting op de leeftijd van 4 weken en bloot hen voortdurend aan een breed scala van milieu-pathogenen/antigenen. Waarborg de blootstelling door dagelijkse behandeling van de laboratoriumdieren aangezien de antigenen door lucht passage op deze wijze worden verdeeld.
- Handhaaf muizen (C57Bl/6J, mannetje, 12 weken oud) in open kooien systemen met conventionele filters op een 12 h:12 h lichte/donkere cyclus bij een temperatuur van 22 °C. Niet bestralen of autoclaaf experimenteel dieet en beddengoed. Toegang tot Animal Housing Facility zonder masker of Hairnet. Open deuren tussen dieren kamers. Geen gebruik maken van een douche.
- De dagelijkse behandeling van de proefdieren en de Schakel kamers op regelmatige basis garanderen, zodat antigenen door de lucht doorgang worden gedistribueerd. Een aanvulling op vuile huisvesting met dagelijkse niet-specifieke microbiële blootstelling aan antigenen van beddengoed van zoogdieren proefdier gehuisvest in de kamers naast het laboratoriummuizen.
- Maatregel proporties van CD44-CD62L- effect geheugen CD4+ en CD8+ T cellen in bloed en milt met behulp van flow Cytometry (zoals beschreven in refefence13).
Opmerking: In dit verband hebben we een toename van 20% van het effect geheugen CD8+ t cellen van CD8+ t cellen als bewijs van voldoende microbiële blootstelling. - Start HFD (60 kJ% van vet, 19 kJ% van eiwitten en 21 kJ% van koolhydraten en ad libitum consumptie van water met 6% sacharosegehalte met vijf weken oude C57Bl/6J mannelijke muizen voor 7-15 weken. De HFD moet bevatten 60% kJ van vet (zoals hierboven beschreven) om de ontwikkeling van insulineresistentie te induceren in de loop van het experiment.
Opmerking: Hematoxyline kleuring moet worden uitgevoerd en histologische kenmerken als hepatocyte ballonvaren, Mallory denk lichamen, immune Cell infiltratie en macrovesicular steatose moet worden gevonden om te demonstreren NASH-achtige lever pathologie (zoals aangegeven in referentie 13).
2. bereiding van reagentia en oplossingen
- Bereid 70% ethanol, fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS, zonder calcium en magnesium) aangevuld met 0,5% BSA en ACK (ammonium-chloride-kalium) lysis buffer.
-
Kleuring buffer
- Los 10 mL foetale kalfsserum (FCS) op in 500 mL PBS om 2% FCS PBS te verkrijgen. Plaats vlekken buffer op ijs voor gebruik.
- Bewaar oplossing in een plastic fles bij 4 °C.
-
Collagenase oplossing voor de spijsvertering van vetweefsel
- Los 2,5 g van boviene serum albumine (BSA) op in 500 mL PBS om een 0,5% BSA/PBS te verkrijgen.
- Los 74,5 g van CaCl2 op in 10 ml 0,5% BSA/PBS om een 10 mm CaCl2 oplossing te verkrijgen.
- Voeg 1 mg Collagenase type II (Zie de materiaallijst) toe aan elke mL van 0,5% BSA met 10 mm CaCl2 PBS.
- Bereid 3 mL Collagenase Digest oplossing per g vetweefsel monster. Bereid verse Collagenase oplossing voor elke isolatie.
-
Collagenase oplossing voor leverweefsel spijsvertering
- Los 2,5 g van BSA op in 500 mL van Hank ´ s evenwichtige zoutoplossing (Peeters) om 0,5% BSA Peeters te verkrijgen.
- Voeg 10 mL FCS in 500 mL van 0,5% BSA/Peeters toe om 2% FCS 0,5% BSA/Peeters te verkrijgen.
- Voeg 0,5 mg Collagenase type IV (Zie de lijst van materialen) aan elke ml van 2% FCS 0,5% BSA/Peeters.
- Voeg 0,02 mg DNase per mL van 2% FCS 0,5% BSA/Peeters Collagenase oplossing toe.
- Bereid 13 mL Collagenase Digest oplossing per leverweefsel monster.
- Bereid verse Collagenase oplossing voor elke isolatie.
3. generatie van enkele schorsingen van de cel
-
Vetweefsel spijsvertering
- Euthanaseren muizen via Isofluraan anesthesie gevolgd door cervicale dislocatie. Spray de borst met 70% ethanol. Maak zorgvuldig een 5-6 cm centrale incisie door de Integument en buikwand langs de gehele lengte van de ribben kooi om de pleuraholte en het hart bloot te leggen.
Opmerking: Niet beschadigen onderliggende organen en houden schaar tips omhoog. - Injecteren ten minste 10 mL van 0,9% zoutoplossing in de top van de linker ventrikel met behulp van een 26 G naald.
Opmerking: Succesvolle doorbloeding wordt opgemerkt door blancheer van de lever. - Open de buikholte met een schaar en knip de perigonadal vette pads aan elke kant met fijne gebogen schaar. Ontleden gonadale weefsels met fijne gebogen schaar en weegt vetweefsel.
- Voer de mechanische dissociatie met behulp van schaar en snijd vetweefsel in fijne stukken in een Petri schaaltje bij 4 ° c. Overdracht vetweefsel naar 50 mL kegel centrifuge buizen en spoel Petri schaal met 1 mL van 0,5% BSA/PBS.
- Voeg 3 mL vetweefsel Digest oplossing (zoals opgesteld in stap 2,3) per gram vetweefsel. Incubeer vetweefsel oplossing bij 37 °C gedurende 20 min onder zacht schudden (200 rpm).
- Voeg 5 mL van 0,5% BSA/PBS per gram vetweefsel en plaats op ijs. Fijnstampen de oplossing meermaals met een serologische Pipet van 10 mL en door een zeef (100 µm) door middel van een zuiger.
- Centrifugeer bij 500 x g voor 10 min bij 4 °c.
- Verwijder de zwevende adipocyte fractie door het pipetteren. Hersuspendeer de cel pellet (stromale vasculaire Fractie) in 1 mL van de ACK lysis buffer (Zie tabel van materialen). Voeg 10 mL van 2% FCS PBS toe.
- Centrifugeer bij 500 x g voor 10 min bij 4 °c.
- Decanteren bovendrijvende en opnieuw op te schorten cel pellet in 250 µ L van 2% FCS PBS.
- Tel het aantal levensvatbare cellen op een hemocytometer met Trypaanblauw blauwe uitsluiting.
- Euthanaseren muizen via Isofluraan anesthesie gevolgd door cervicale dislocatie. Spray de borst met 70% ethanol. Maak zorgvuldig een 5-6 cm centrale incisie door de Integument en buikwand langs de gehele lengte van de ribben kooi om de pleuraholte en het hart bloot te leggen.
-
Leverweefsel spijsvertering
- Store lever in een kegel centrifugebuis gevuld met PBS en transport op ijs.
- Voer de mechanische dissociatie uit met behulp van spuit zegels in een Petri schaaltje bij 4 °C. Zet ontleed leverweefsel in een 50 mL kegel centrifugebuis met 10 mL warme lever Digest oplossing. Spoel de Petri schaal met 3 mL lever Digest oplossing.
- Incubeer leverweefsel oplossing bij 37 °C voor 20 min onder zacht schudden (200 rpm).
- Voeg 20 mL Peeters toe. Fijnstampen de oplossing meermaals met een serologische Pipet van 10 mL en door een zeef (100 µm) door middel van een zuiger.
- Centrifugeer bij 500 x g voor 10 min bij 4 °c. Decanteer de bovendrijvende en hersuspendeer de Cell pellet in 20 mL Peeters.
- Centrifugeer bij 30 x g voor 1 min bij kamertemperatuur om de hepatocyte matrix te verwijderen. Gooi de cel pellet.
- Centrifugeer de bovendrijvende bij 500 x g gedurende 10 min bij 4 °c. De pellet opnieuw op te schorten in 10 mL van 33% lage Viscositeits dichtheid gradiënt medium oplossing (Zie tabel van materialen) in Peeters gevolgd door centrifuge (800 x g; 30 min; kamertemperatuur; geen rem).
- Hersuspendeer de pellet in 1 mL ACK lysis buffer en incubeer gedurende 4 minuten bij kamertemperatuur. Voeg vervolgens 10 mL Peeters toe.
Opmerking: Om de bovendrijvende aspireren de bovendrijvende met Interphase (hepatocyten) zeer zorgvuldig met een transfer Pipet (zoveel mogelijk zonder het nemen van de pellet met afweercellen en bezinkingen). - Pas de cellen door een zeef van 30 μm in een kegel centrifugebuis van 15 mL en centrifugeer bij 500 x g gedurende 10 min bij 4 °c. Decanteren bovendrijvende en opnieuw op te schorten cel pellet in 250 µ L van 2% FCS PBS.
- Tel het aantal levensvatbare cellen op een hemocytometer met Trypaanblauw blauwe uitsluiting.
4. oppervlakte kleuring
- Bereid antilichamen mengsel voor T-cel-subsets (paneel 1) en ingeboren immune cellen (paneel 2) zoals beschreven in tabel 1 en tabel 2. De volumes worden geoptimaliseerd voor één steekproef (100 µ L) betreffende aan antilichamen concentraties.
Opmerking: De lymfocyten en de ingeboren immune cellen presenteren verschillen in autofluorescentie en zouden afzonderlijk moeten worden geanalyseerd. - Gebruik maximaal 3 x 106 cellen in 100 µ l in een polystyreen FACS buis voor oppervlakte vlekken. Om te blokkeren FC receptoren toe te voegen 10 µ L van anti-CD16/CD32 antilichaam (verdund 1:100) en incuberen voor 10 min op ijs. Gebruik een ongekleurd negatief controlemonster om de kant spreiding (SSC) en forward Scatter (FSC) aan te passen om de locatie van de negatieve cel populatie te bepalen.
- Vortex en voeg het juiste volume van het antilichaam mengsel voorpaneel 1 en paneel 2. Voeg 1 µ L van levensvatbaarheid kleurstof aan elk monster toe te staan voor levende en dode cel discriminatie. Incubeer gedurende 20 min bij 4 °C en beschermd tegen licht.
- Was tweemaal met 2 mL 2% FCS PBS en centrifugeer bij 300 x g voor 5 min bij 4 °c.
- Hersuspendeer de Cell pellet in 300 µ L van 2% FCS PBS en bewaar bij 4 °C tot FACS analyse.
Opmerking: Voordat de meting passeren cellen door middel van 30 µm cel zeef in polystyreen FACS buis en Vortex. Flow Cytometry werd uitgevoerd met gelabelde cellen opgeslagen in 2% FCS PBS bij 4 °C voor 1-3 h. cellen moeten zo snel mogelijk worden geanalyseerd voor geoptimaliseerde resultaten.
5. flow Cytometry compensatie, acquisitie, en gating
- Voer ongekleurd negatief controlemonster om de FSC en SSC en aan te passen voltages van de stroming cytometer om leukocyten populaties te detecteren en om onderscheid te maken tussen puin en levensvatbare cellen. Uitsluiten puin en dode cellen.
Opmerking: Levensvatbaarheid van de cel schorsingen van de lever kan lager zijn dan de levensvatbaarheid van de cel schorsingen van perigonadal vetweefsel als gevolg van een extra dichtheid scheiding stap. - Voer enkele gekleurde controlemonsters voor Multi-Color compensatie.
Opmerking: Antilichaam Capture kralen kunnen ook worden gebruikt om aan te passen voor spectrale overlap als het aantal cellen van een cel populatie van belang is te laag om te compenseren met behulp van cellen. Om mogelijke autofluorescentie signalen van de cellen fluorescentie minus één (FMO) controles voor elk antilichaam te ontdekken worden geadviseerd maar niet in dit protocol toegepast. - Start de meting, verzamel het juiste aantal evenementen (minstens 50.000 evenementen) en registreer experimentele gegevens.
- Exporteer FCS-gegevensbestanden voor analyse en stel de gating-strategie in. Poort op CD45+ leukocyten om de volgende cel populaties te identificeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het beschreven protocol maakt het mogelijk de karakterisering van oppervlakte markers van aangeboren en adaptieve immuun cellen geïsoleerd van muizen perigonadal vetweefsel en lever in een model van dieet-geïnduceerde NASH. In dit model werd NASH geïnduceerd door toediening van HFD plus sacharose (6%) in drinkwater gedurende 7 tot 15 weken in C57Bl/6J muizen, zoals eerder gemeld13. Belangrijk is dat muizen werden ondergebracht in semi-steriele omstandigheden en, dus, blootgesteld aan milieu-antigenen gedurende het experiment. HFD Fed muizen gehuisvest in SPF voorwaarden en Chow dieet muizen gehuisvest onder SPF en niet-SPF voorwaarden diende als controles. HFD voeding resulteerde in een significante toename van het lichaamsgewicht al na 7 weken in beide groepen. Een significant verschil in lichaamsgewicht werd voor het eerst duidelijk in week 4 (P < 0,001) en bleef significant gedurende de volgende experimentele weken. Er werden echter geen significante verschillen in gewichtstoename getoond tussen SPF en niet-SPF muizen na 7 weken13. De stromale vasculaire Fractie en het immuunsysteem cellen van perigonadal vetweefsel en levers van mannelijke muizen gevoed een HFD voor 7 weken werden geïsoleerd door Collagenase spijsvertering. Immuun cellen werden geëtiketteerd met fluorophore primaire antilichamen en verhoudingen van T-cellen, B-cellen, macrofagen, NK-cellen, dendritische cellen en granulocyten werden gekwantificeerd via flow Cytometry analyse. Gating voor T-cel subpopulaties, met inbegrip van Doublet discriminatie, en de levensvatbaarheid kleuring, in muizen perigonadal vet is geïllustreerd in Figuur 1. CD45+ leukocyten zijn eerst GATED voor CD4 en CD8 en vervolgens GATED voor CD44 en CD62L te discrimineren tussen naïef, centraal geheugen, effect geheugen en effect T-cellen. CD44+ cellen werden toen verder gekenmerkt met CD127, KLRG1 en pd-1. Figuur 2 geeft de gating strategie voor het analyseren van B-cellen, GRANULOCYTEN, NK-cellen, macrofagen en dendritische cellen.
Representatieve resultaten van de extracellulaire kleuring van T-cellen binnen muizen lever van HFD blootgestelde muizen ten opzichte van HFD SPF muizen worden aangetoond in Figuur 3A. Sterker nog, een hoger percentage van het effect geheugen CD4+ en CD8+ t cellen kunnen worden gedetecteerd in Hfd blootgestelde muizen, terwijl Intrahepatische NAÏEVE CD4+ en CD8+ t cellen bleken aanzienlijk lager in blootgesteld in vergelijking met SPF muizen op week 7 (Figuur 3a).
Om deze resultaten te valideren, werd de lever ontstekingsreactie geassocieerd met antigeen blootstelling onderzocht door hematoxyline/eosine kleuring van lever secties van 15 weken gevoed muizen13. Ernstige steatose, met inbegrip van verhoging van grote lipide druppeltjes resulterend in macrovesicular steatose, lobulair ontsteking, hepatocellulair ballonvaren en vernietigde lobulair structuur, werd gevonden in HFD blootgestelde muizen terwijl slechts sommige SPF muizen een mild vet toonden accumulatie in de lever (Figuur 3B). Zoals gerapporteerd in Figuur 3C, het percentage van de NK-cellen was hoger in perigonadal vetweefsel van Hfd blootgestelde muizen, terwijl Hfd SPF muizen bleek hogere percentages van dendritische cellen. Er zijn geen significante verschillen gevonden voor macrofagen en monocyten. Totaal, bevestigen deze resultaten strengere leversteatose in HFD blootgestelde muizen en minder belangrijke verschillen in vetweefsel tussen HFD blootgestelde en SPF muizen.
Tabel 1 toont de antilichamen die in paneel 1 worden gebruikt. Antilichamen gebruikt in flow Cytometry analyse voor extracecullar kleuring van B-cellen, macrofagen, NK-cellen, dendritische cellen en granulocyten worden afgebeeld in tabel 2.
Figuur 1 : Schematische weergave van gating strategie gebruikt in flow Cytometry analyse van vetcellen (panel 1). Ten eerste, de cellen zijn gated op singlets. Dan, puin wordt uitgesloten door het gebruik van voorwaartse spreiding gebied (FSC-A) en kant Scatter gebied (SSC-A) en het kiezen van de juiste maat. De cellen worden verder gekenmerkt door de uitdrukking van CD45. Levensvatbare cellen worden geselecteerd met behulp van Alive/Dead Cell marker dat is een amine reactieve fluorescerende kleurstof die niet-permeant om cellen te leven, maar permeant aan de cellen met gecompromitteerde membranen. T-cellen werden onderverdeeld in chemo T-cellen (CD8+) en t-helper cellen (CD4+) en onderverdeeld in naïeve (CD44+CD62L-), centraal geheugen (CD44+CD62L+), het geheugen van het effect (CD44+CD62L- ) en effect (CD44-CD62L+) T-cellen. Ten slotte, CD44+ cellen zijn GATED op KLRG1, CD127 en pd-1. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2 : Schematische weergave van gating-strategie gebruikt in flow Cytometry analyse van vetcellen (paneel 2). Gating van dendritische cellen was gebaseerd op CD11b en CD11c expressie. De volgende andere populaties werden gedefinieerd: B-cellen, NK-cellen, macrofagen, monocyten en granulocyten. Gegevens werden geanalyseerd na overname met de juiste software. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3 : Representatieve flow Cytometry analyse van T-cellen geïsoleerd van muizen perigonadal vetweefsel en lever. (A) CD4+ en CD8+ T cellen van muizen levers van 7 week Hfd muizen onderhouden onder SPF en blootgestelde voorwaarden werden geanalyseerd via flow Cytometry. (B) representatieve kleuring van 15 week Hfd SPF en blootgestelde muizen. Infiltratie van immuun cellen en ballon hepatocyten (pijlpunt) illustreren NASH. (C) percentages van vet ingeboren immuun cellen als percentage van LEUKOCYTEN in Hfd muizen gehandhaafd onder SPF of blootgestelde omstandigheden voor 7 weken. n = 6-10 muizen per groep. Significantie werd bepaald met behulp van twee-weg ANOVA meervoudige meting. De gegevens worden vertegenwoordigd als gemiddelde ± SEM. * * P < 0.01, * * * P < 0,001. Dit cijfer is gewijzigd van refefence13. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Tabel 1: antilichamen gebruikt in flow Cytometry voor extracellulaire kleuring (paneel 1). De beschreven hoeveelheid antilichaam is voor de analyse van één steekproef.
Tabel 2: antilichamen gebruikt in flow Cytometry voor extracellulaire kleuring (paneel 2). De beschreven hoeveelheid antilichaam is voor de analyse van één steekproef.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Steatohepatitis heeft een sterke associatie met metabole afwijkingen zoals obesitas, insulineresistentie en dyslipidemie15. De veelvoudige studies wijzen erop dat de ontsteking van het vetweefsel de pathogenese van type 2 diabetes, met inbegrip van veranderde niveaus van cellen van zowel het aangeboren als aanpassings immune systeem4,5,16,17 kan drijven . Daarnaast is gebleken dat obesitas moduleert de activering van het immuunsysteem wegen, wat kan leiden tot lever complicaties18. Er is een toenemende belangstelling voor de karakterisering van de immune Cell fenotypes in obesitas en lever ontstekingsreactie omdat elke immuun cel subpopulatie draagt op een andere manier om de ontwikkeling van insulineresistentie en Steatohepatitis.
Deze methode geeft gedetailleerde informatie over het isoleren en kwantificeren van relatieve hoeveelheden immuun cellen van perigonadal vetweefsel en lever. Bovendien, de methoden laten zien hoe te handhaven HFD gevoed muizen in niet-SPF voorwaarden om te induceren Steatohepatitis. Het protocol kan worden gebruikt om de immune cel functies te bestuderen en verenigingen van specifieke immune cellen tussen verschillende weefsels in een microbiologisch genormaliseerd milieu te onderzoeken.
In onze huidige studie, HFD voeding van niet-SPF muizen resulteerde in de ontwikkeling van insulineresistentie en Steatohepatitis, terwijl HFD SPF muizen ontwikkeld insulineresistentie, milde leversteatose, maar niet Steatohepatitis zoals bepaald door immunohistochemistry. Bovendien, vet en lever immuun cel subsets verschilden significant tussen HFD blootgesteld en SPF muizen, die ons begrip van de betekenis van verschillende huisvestingsvoorwaarden bevestigt. Samengevat kunnen we aantonen dat microbiële blootstelling aan commensale Flora de immunologische eigenschappen van C57Bl/6 muizen drastisch kan beïnvloeden. Vorige werk heeft aangetoond dat de diversiteit en functie van de darm microbiome wordt beïnvloed door dieet-geïnduceerde obesitas19,20 en dat gut barrièrefunctie en intestinale permeabiliteit afhankelijk van de huisvesting voorwaarden21. We streven ernaar om het verband tussen darm kolonisatie en obesitas en leverontsteking te pakken in een aanstaande publicatie.
Tijdens de planningsfase van de voorgestelde methoden moet een aantal punten in overweging worden genomen. Eerste, single-cel schorsingen zijn vereist voor alle flow Cytometry assays en de levensvatbaarheid van cellen kan worden beïnvloed door het niveau van de mechanische weefsel dissociatie en de duur van de enzymatische weefsel spijsvertering. Om de vernietiging van het antilichaam epitope te vermijden en de opbrengst van functioneel levensvatbare, gescheiden cellen te maximaliseren, moet het type van weefsel, leeftijd van het dier, genetische wijzigingen, concentraties van enzymen, temperatuur en incubatietijden worden genomen in aanmerking.
Ten tweede, ons protocol is geoptimaliseerd om kwantitatief te bepalen verschillende immuun cellen fenotypes van zwaarlijvige HFD gevoed muizen met vetweefsel ontsteking en Steatohepatitis. Als weefsel integriteit, zou het aantal immune cellen en, dus, de kwaliteit van weefsel spijsvertering, door ontstekingsprocessen kunnen worden beïnvloed, zou het gebruikte protocol en Collagenase voor andere weefsels moeten worden geoptimaliseerd dan lever of vetweefsel in specifieke experimenten met betrekking tot dissectie methoden, incubatietijden of de Collagenase gebruikt om het weefsel te verteren. Ten derde, is het belangrijk voor het protocol dat de verschillende experimentele groepen elke dag worden omvat om gevolgen te elimineren toe te schrijven aan dag-aan-dag variatie van de Stroom Cytometry assay (temperatuur, incubatietijden, enz.).
Er zijn echter enkele belangrijke beperkingen van de beschreven methode. Om positieve versus negatieve signalen te discrimineren om de poorten goed aan te passen om de cellen positief voor specifieke oppervlakte markeringen in de experimentele steekproeven te identificeren, fluorescentie minus één (FMO) controles (een FMO controle bevat alle fluorochromes in een paneel, met uitzondering van de een die wordt gemeten) had moeten worden gebruikt. In dit experiment kunnen de gegevens goed worden gecompenseerd en de gating was duidelijk, maar we raden aan om FMO controles toe te voegen aan de experimentele Setup, waar mogelijk. Bovendien, FoxP3, die moet worden gebeitst intracellulair vereist permeabilization van de celmembraan, moeten worden gebruikt om de regelgevende T-cellen te kwantificeren, omdat het een nauwkeurigere definitie dan het gebruik van CD25 en CD127 (tabel 2) mogelijk maakt. Hoewel flow Cytometry de kwantificering van meerdere oppervlakte markeringen gelijktijdig toestaat, is hun aantal beperkt tot 12 per monster als gevolg van overlapping in emissie spectra. Om voor spectrale overlapping te verbeteren, is de tijd-intensieve fluorescentie compensatie vereist. Om dit te verantwoorden, is strategische panel ontwikkeling of het gebruik van massa Cytometry technieken vereist. Bovendien kunnen er moeilijkheden ontstaan bij de huisvesting van de muizen in niet-SPF-omstandigheden met betrekking tot specifieke richtlijnen voor huisdieren, maar het huidige kleine aantal studies over niet-SPF-knaagdieren laat zien dat dergelijke studies mogelijk zijn12,21 . Zo kunnen gescheiden dieren voorzieningen voor SPF-en niet-SPF-muizen worden geëvalueerd. De ontwikkeling van een menselijke volwassen-achtige immuunsysteem is aangetast in SPF muizen12,21, wat resulteert in beperkingen van de behandeling strategieën te vertalen van dierproeven tot klinische studies.
Samenvattend, verstrekken wij een gedetailleerd protocol voor fenotypische karakterisering van muizen vet en lever immune cellen gebruikend Stroom Cytometry in een dieet-veroorzaakt dierlijk model van NASH en insulineweerstand. Gezien de complexe functie en de regulering van zowel aangeboren en adaptieve cellen in de context van obesitas en metabole ontregeling, onze voorgestelde methoden moeten helpen om ons begrip van immunologische mechanismen om metabole homeostase evenwicht te verdiepen en, dus, helpen bij de ontwikkeling van de menselijke therapeutische dat kan herstellen anti-inflammatoire immuunrespons. Globaal, dient het verstrekte dierlijke model als snel en krachtig model voor het beoordelen van metabolische complicaties verbonden aan zwaarlijvigheid en kan op andere ziektemodellen worden toegepast.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken Anke Jurisch, Diana Woellner, Dr. Kathrin witte en Cornelia Heckmann voor hulp bij experimentele procedures en Benjamin Tiburzy van biolegend voor nuttige opmerkingen over de gating strategie. J.S. werd ondersteund door de Helmholtz Grant (ICEMED). Deze studie werd ondersteund door subsidies van de Clinical Research Unit van het Berlijnse Instituut voor volksgezondheid (BIH), de "Miguel-Grant" van het Duitse federale ministerie van onderwijs en onderzoek en de Einstein Foundation. KERCKHOFS-B. en H.-Daphne worden gefinancierd door FOR2165.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 µm cell strainers | Falcon | 352340 | |
| 1 mL syringe | BD | 309659 | |
| 26 G x 5/8 needles | BD | 305115 | |
| 35 mm Petri Dishes | Falcon | 353001 | |
| 40 µm cell strainers | Falcon | 352340 | |
| ACK lysis buffer | GIBCO | A1049201 | |
| Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45 | Biolegend | 103127 | AB_493714 (BioLegend Cat. No. 103127) |
| Analysis software | FlowJo 10.0.8 software | ||
| APC anti-mouse CD11c Antibody | Biolegend | 117309 | AB_313778 (BioLegend Cat. No. 117309) |
| APC anti-mouse KLRG1 (MAFA) Antibody | Biolegend | 138411 | AB_10645509 (BioLegend Cat. No. 138411) |
| BV421 anti-mouse CD127 Antibody | Biolegend | 135023 | AB_10897948 (BioLegend Cat. No. 135023) |
| BV421 anti-mouse F4/80 Antibody | Biolegend | 123131 | AB_10901171 (BioLegend Cat. No. 123131) |
| BV605 anti-mouse CD279 (PD-1) Antibody | Biolegend | 135219 | AB_11125371 (BioLegend Cat. No. 135219) |
| BV605 anti-mouse NK-1.1 Antibody | Biolegend | 108739 | AB_2562273 (BioLegend Cat. No. 108739) |
| BV650 anti-mouse/human CD11b Antibody | Biolegend | 101239 | AB_11125575 (BioLegend Cat. No. 101239) |
| BV711 anti-mouse/human B220 Antibody | Biolegend | 103255 | AB_2563491 (BioLegend Cat. No. 103255) |
| BV785 anti-mouse CD8a Antibody | Biolegend | 100749 | AB_11218801 (BioLegend Cat. No. 100749) |
| C57Bl/6J mice, male, 5 weeks old | Forschungseinrichtungen für experimentelle Medizin (FEM) | ||
| CaCl2 | Charité - Universitätsmedizin Berlin | A119.1 | |
| Collagenase NB 4G Proved Grade | SERVA | 11427513 | |
| Collagenase Typ I | Worthington | LS004197 | |
| Conical centrifuge tube 15mL | Falcon | 352096 | |
| Conical centrifuge tube 50 mL | Falcon | 352070 | |
| DNAse | Sigma-Aldrich | 4716728001 | |
| Fetal bovine serum | Biochrom | S0115 | |
| Filter 30µm | Celltrics | 400422316 | |
| FITC anti-mouse CD3 Antibody | Biolegend | 100203 | AB_312660 (BioLegend Cat. No. 100203) |
| Flow cytometry | BD-LSR Fortessa | ||
| Forceps | Sigma-Aldrich | F4142-1EA | |
| HBSS | Bioanalytic GmBH | 085021-0500 | |
| High-fat diet | SSNIF | E15741–34 | 60 kJ% from fat, 19 kJ% from proteins, and 21 kJ% from carbohydrates |
| micro dissecting scissors | Sigma-Aldrich | S3146 | used for dissection purposes |
| PE anti-mouse CD25 Antibody | Biolegend | 101903 | AB_312846 (BioLegend Cat. No. 101903) |
| PE/Cy7 anti-mouse CD62L Antibody | Biolegend | 104417 | AB_313102 (BioLegend Cat. No. 104417) |
| PE/Cy7 anti-mouse I-A/I-E (MHCII) Antibody | Biolegend | 107629 | AB_2290801 (BioLegend Cat. No. 107629) |
| PE/Dazzle 594 anti-mouse CD4 Antibody | Biolegend | 100565 | AB_2563684 (BioLegend Cat. No. 100565) |
| Percoll solution | Biochrom | L6115 | |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD44 Antibody | Biolegend | 103031 | AB_2076206 (BioLegend Cat. No. 103031) |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse Gr-1 Antibody | Biolegend | 108427 | AB_893561 (BioLegend Cat. No. 108427) |
| Phosphate buffered saline | Gibco | 12559069 | |
| Round-Bottom Tubes with cell strainer cap | STEMCELL Technologies | 38030 | |
| TruStain fcX anti-mouse CD16/32 | Biolegend | 101301 | AB_312800 (BioLegend Cat. No. 101301) |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T6146 | |
| Zombie NIR Fixable Viability Kit | Biolegend | 423105 | viablity stain |
References
- Guh, D. P., et al. The incidence of co-morbidities related to obesity and overweight: A systematic review and meta-analysis. BMC Public Health. 9, 88 (2009).
- Prentki, M. Islet β cell failure in type. J Clin Invest. 116 (7), 1802-1812 (2006).
- Shoelson, S. E., Lee, J., Goldfine, A. B.
- Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes. Nature. 444, 840 (2006).
- Exley, M. A., Hand, L., O'Shea, D., Lynch, L. Interplay between the immune system and adipose tissue in obesity. Journal of Endocrinology. 223 (2), R41-R48 (2014).
- Ferrante, A. W. Macrophages, fat, and the emergence of immunometabolism. Journal of Clinical Investigation. 123 (12), 4992-4993 (2013).
- Winer, D. A., et al. B cells promote insulin resistance through modulation of T cells and production of pathogenic IgG antibodies. Nature Medicine. 17, 610 (2011).
- Onodera, T., et al. Adipose tissue macrophages induce PPARγ-high FOXP3(+) regulatory T cells. Scientific Reports. 5, (2015).
- Lackey, D. E., Olefsky, J. M. Regulation of metabolism by the innate immune system. Nature Reviews Endocrinology. 12, 15 (2015).
- Calle, E. E., Kaaks, R. Overweight, obesity and cancer: epidemiological evidence and proposed mechanisms. Nature Reviews Cancer. 4, 579 (2004).
- Ibrahim, S. H., Hirsova, P., Malhi, H., Gores, G. J. Animal Models of Nonalcoholic Steatohepatitis: Eat, Delete, and Inflame. Digestive Diseases and Sciences. 61 (5), 1325-1336 (2016).
- Beura, L. K., et al. Recapitulating adult human immune traits in laboratory mice by normalizing environment. Nature. 532 (7600), 512-516 (2016).
- Sbierski-Kind, J., et al. Distinct Housing Conditions Reveal a Major Impact of Adaptive Immunity on the Course of Obesity-Induced Type 2 Diabetes. Frontiers in Immunology. 9 (1069), (2018).
- Japp, A. S., et al. Wild immunology assessed by multidimensional mass cytometry. Cytometry Part A. 91 (1), 85-95 (2017).
- Benedict, M., Zhang, X. Non-alcoholic fatty liver disease: An expanded review. World Journal of Hepatology. 9 (16), 715-732 (2017).
- McNelis, J. C., Olefsky, J. M. Macrophages, Immunity, and Metabolic Disease. Immunity. 41 (1), 36-48 (2014).
- Ferrante, A. W. The Immune Cells in Adipose Tissue. Diabetes, Obesity & Metabolism. 15, 34-38 (2013).
- Bertola, A., et al. Hepatic expression patterns of inflammatory and immune response genes associated with obesity and NASH in morbidly obese patients. PloS One. 5 (10), e13577 (2010).
- Turnbaugh, P. J., Bäckhed, F., Fulton, L., Gordon, J. I. Diet-Induced Obesity Is Linked to Marked but Reversible Alterations in the Mouse Distal Gut Microbiome. Cell Host & Microbe. 3 (4), 213-223 (2008).
- Singh, R. K., et al. Influence of diet on the gut microbiome and implications for human health. Journal of Translational Medicine. 15 (1), 73 (2017).
- Müller, V. M., et al. Gut barrier impairment by high-fat diet in mice depends on housing conditions. Molecular Nutrition & Food Research. 60 (4), 897-908 (2016).
