Summary
En enkel och pålitlig diet-inducerad gnagare djur modell för alkoholfria steatohepatit (NASH) beskrivs, uppnås genom icke-SPF bostäder av djuren och administrering av en specifik fettrik diet. Vi beskriver identifiering av leverns och fetare immun cells del mängder för att rekapitulera humana immunologiska tillstånd genom att utsätta möss för miljö bakterier.
Abstract
Fetma är förknippad med kronisk låggradig inflammation och insulin resistens, bidrar till en ökande prevalensen av kroniska metabola sjukdomar, såsom typ 2 diabetes och alkoholfria steatohepatit (NASH). Ny forskning har fastställt att pro-inflammatoriska immun celler infiltrerar feta hypertrofiska fett vävnad och lever. Med tanke på den framväxande betydelsen av immun celler i samband med metabolisk homeostas, det finns ett kritiskt behov av att kvantifiera och karakterisera deras modifiering under utvecklingen av typ 2 diabetes och NASH. Emellertid, djur modeller som inducerar patofysiologiska funktioner typiska för mänsklig NASH är glesa.
I den här artikeln ger vi ett detaljerat protokoll för att identifiera immun cells grupper isolerade från levern och fett vävnad i en pålitlig mus modell av NASH, etablerad genom bostäder fettrik diet (HFD) möss under icke-specifika patogen-fria (SPF) villkor utan en barriär i minst sju veckor. Vi visar hantering av möss i icke-SPF villkor, nedbrytning av vävnader och identifiering av makro Fager, naturliga mördare (NK) celler, dendritiska celler, B och T-celler under grupper av flödescytometri. Representativa flödescytometri tomter från SPF HFD möss och icke-SPF-möss tillhandahålls. För att få tillförlitliga och tolknings bara data, användning av anti kroppar, exakta och exakta metoder för vävnads nedbrytning och ordentlig gating i flödescytometri experiment är kritiska element.
Insatsen för att återställa fysiologisk antigen exponering hos möss genom att inhysa dem i icke-SPF-tillstånd och ospecifik exponering för mikrobiella antigener skulle kunna ge ett relevant verktyg för att undersöka sambandet mellan immunologiska förändringar, diet-inducerad fetma och relaterade långvariga komplikationer.
Introduction
Fetma är en multifaktoriell störning och en stor riskfaktor för att utveckla hjärt sjukdom, stroke, alkoholfria steatohepatit (NASH), typ 2-diabetes (T2D) och vissa typer av cancer. Prevalensen av fetma ökar snabbt globalt. Idag, 2 100 000 000 människor-nästan 30% av världens befolkning-är antingen feta eller överviktiga1. Fetma-associerad insulin resistens kan leda till T2D, när utmattad bukspottskörteln Holmen beta celler Miss lyckas med att kompensera för det ökade behovet av insulin för att bibehålla glukos homeostas2.
Fett vävnad består av olika cell typer inklusive adipocyter, endotelceller, fibroblaster och immun celler. Under progression av fetma, förändringar i antal och aktivitet av immun celler kan leda till låggradig inflammation i hypertrofisk fett vävnad3,4. Specifikt, det har kon stater ATS att överdriven energi intag, tillsammans med kroniskt förhöjda nivåer av blods ocker, triglycerider och fria fett syror, leder till fett celler hypoxi, endoplasmatiska Retikulum stress, försämrad mitokondriell funktion och förstärkt cytokin sekretion, vilket resulterar i aktivering av pro-inflammatoriska fett immun celler5,6. Tidigare forskning har främst fokuserat på medfödd immunitet, men mer nyligen adaptiva immun celler (T och B-celler) har dykt upp som viktiga regulatorer av glukos homeostas. De har inflammatoriska (inklusive CD8+ T-celler, Th1, och B-celler) eller främst reglerande funktioner (inklusive regulatoriska T (Treg) celler, Th2 celler) och kan både förvärra eller skydda mot insulin resistens7,8 , och 9.
Dessutom föreslogs flera mekanismer för att förklara hur fetma ökar steatohepatit, inklusive ökad produktion av cytokiner av fett vävnad10. NASH, den progressiva formen av alkoholfria fett lever och en stor hälso börda i utvecklade länder, är histologiskt kännetecknas av luft ballong hepatocyter, lipidackumulering, fibros och pericellulär inflammation och kan utvecklas till levercirros, Terminal lever sjukdom eller hepatocellulär cancer. Flera regim (till exempel metionin och kolin bristfällig diet11) är kända för att inducera Nash-liknande lever patologi i icke-mänskliga djur modeller, men de flesta av dessa metoder inte upprepa mänskliga villkor för Nash och dess metaboliska konsekvenser eftersom de antingen kräver specifik gen knockout, icke-fysiologiska diet manipulationer eller saknar insulin resistens typisk för mänsklig NASH. Dessutom är vår förståelse av de bakomliggande mekanismerna för metabola sjukdomar för närvarande baserad på experiment som utförs med laboratorie möss inrymt under standard specifika patogen fri (SPF) villkor. Dessa barriär anläggningar är onormalt hygieniska och beaktar inte den mikrobiella mångfald som människor måste stöta på, vilket kan ta hänsyn till svårigheter i översättnings processen för djur studier till kliniska metoder12,13 , med 14.
För att undersöka de olika immun cells del mängderna i fett vävnad och levern under utvecklingen av insulin resistens och NASH i en avancerad mus modell som återger humana immunologiska tillstånd, var möss inhysta i enskilda burar i semi-sterila förhållanden utan hinder. Möss inrymt under antigen utsatt tillstånd utvecklat NASH-liknande lever patologi redan efter 15 veckors fettrik diet (HFD) utfodring13. Jämfört med åldersmatchade SPF-möss utvecklade de makrovesikulär steatos, hepatisk infiltration och aktivering av immun celler.
Detta manuskript beskriver en robust flödescytometri analys för att definiera och räkna immun cells del mängder från mus fett vävnad och levern i en modell av NASH. Flödescytometri analys gör det möjligt att upptäcka flera parametrar för enskilda celler samtidigt i motsats till RT-PCR eller immunhistokemi metoder.
Sammanfattnings vis erbjuder vår studie en mus modell av kortsiktiga HFD för att undersöka utvecklingen av insulin resistens och NASH och de underliggande mekanismerna som också uppvisar trohet till människans villkor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denna studie utfördes i enlighet med hand ledningen för skötsel och användning av försöks djur vid nationella hälso institut och djurskydds lagen under överinseende av vår institutions kommitté för djur omsorg och-användning. Djur protokoll genomfördes enligt de etiska rikt linjerna från Charité Berlin i Tyskland och godkändes av Landesamt für gesundheit und Soziales och följer rikt linjerna för ANLÄND.
1. diet-inducerad djur modell av Steatohepatit
- Överför möss (C57Bl/6J, hane) till icke-SPF-hölje vid 4 veckors ålder och exponera dem kontinuerligt för ett brett spektrum av miljöpatogener/antigener. Garantera exponeringen genom daglig hantering av försöks djuren som antigener fördelas genom luft passage på detta sätt.
- Håll möss (C57Bl/6J, hane, 12 veckor gamla) i öppna system med konventionella filter på en 12 h:12 h ljus/mörker-cykel vid en temperatur på 22 ° c. Inte bestrålas eller autoklavera experimentell kost och sängkläder. Till gång djurhus anläggning utan mask eller hårnät. Öppna dörrar mellan djurrum. Använd inte en AIRSHOWER.
- Garantera daglig hantering av försöks djuren och byta rum regelbundet så att antigener fördelas genom luft passage. Komplettera smutsiga bostäder med daglig icke-specifik mikrobiell exponering för antigener från sängkläder av djur från däggdjurs laboratorier som är inhysta i rum bredvid laboratorie mössen.
- Mäta proportioner av CD44-CD62L- effektor minne CD4+ och CD8+ T celler i blod och mjälte med flödescytometri (som beskrivs i refefence13).
Anmärkning: I detta avseende definierade vi en ökning med 20% av effektor minne CD8+ t-celler från CD8+ t-celler som bevis på tillräcklig mikrobiell exponering. - Start HFD (60 kJ% från fett, 19 kJ% från proteiner och 21 kJ% från kolhydrater och AD libitum konsumtion av vatten med 6% sackaroshalt med fem veckors gamla C57Bl/6J hanmöss för 7-15 veckor. HFD ska innehålla 60% kJ från fett (enligt beskrivningen ovan) för att framkalla insulin resistens under hela försöket.
Anmärkning: Hematoxylin färgning bör utföras och histologiska egenskaper som hepatocytballooning, Mallory Denk organ, immun cell infiltration och makrovesikulär steatos måste påvisas för att påvisa NASH-liknande lever patologi (som visas i referens och 13).
2. beredning av reagenser och lösningar
- Förbered 70% etanol, fosfatbuffrad saltlösning (PBS, utan kalcium och magnesium) kompletterad med 0,5% BSA och ACK (ammoniumklorid-kalium) lyseringsbuffert.
-
Infärgningsbuffert
- Lös 10 mL Foster kalv serum (FCS) i 500 mL PBS för att erhålla 2% FCS PBS. Placera infärgningsbufferten på isen före användning.
- Förvara lösningen i en plast flaska vid 4 ° c.
-
Collagenaslösning för nedbrytning av fett vävnad
- Lös upp 2,5 g nötkreatur serumalbumin (BSA) i 500 mL PBS för att erhålla en 0,5% BSA/PBS.
- Lös upp 74,5 g CaCl2 i 10 ml 0,5% BSA/PBS för att erhålla en 10 mm CaCl2 -lösning.
- Tillsätt 1 mg kollagenas typ II (se tabell över material) till varje ml 0,5% BSA med 10 mm CaCl2 PBS.
- Förbered 3 mL kollagenas Digest lösning per g fett vävnad prov. Förbered färsk kollagenaslösning för varje isolering.
-
Kollagenas lösning för nedbrytning av lever vävnad
- Lös upp 2,5 g BSA i 500 mL Hank ́s Balanced salt Solution (HBSS) för att erhålla 0,5% BSA HBSS.
- Tillsätt 10 mL FCS i 500 mL 0,5% BSA/HBSS för att erhålla 2% FCS 0,5% BSA/HBSS.
- Tillsätt 0,5 mg kollagenas typ IV (se tabell över material) till varje ml 2% fcs 0,5% BSA/Hbss.
- Tillsätt 0,02 mg DNase per ml 2% FCS 0,5% BSA/Hbss kollagenas lösning.
- Förbered 13 mL kollagenas Digest lösning per lever vävnad prov.
- Förbered färsk kollagenaslösning för varje isolering.
3. generering av encellig SUS pensioner
-
Fett vävnad nedbrytning
- Euthanize möss via isofluran anestesi följt av cervikal disloksering. Spraya bröstet med 70% etanol. Gör försiktigt en 5-6 cm centralt snitt genom utrustningen och buk väggen längs hela längden på revbenen för att exponera pleuramesoteliom hålighet och hjärta.
Anmärkning: Skada inte underliggande organ och håll saxspetsarna uppe. - Injicera minst 10 mL 0,9% saltlösning i spetsen av den vänstra ventrikeln med en 26 G nål.
Anmärkning: Framgångs rik per fusion noteras genom blanchering av levern. - Öppna peritonealhålan med sax och skär ut perigonadala fett kuddar på varje sida med fina böjda saxar. Dissekera gonadvävnader med fina böjda saxar och väga fett vävnad.
- Utför mekanisk dissociation med sax och skär fett vävnad i fina bitar i en petriskål vid 4 ° c. Överför fett vävnad till 50 mL koniska centrifugeringsrör och skölj petriskål med 1 mL 0,5% BSA/PBS.
- Tillsätt 3 mL fett vävnad smälta lösning (som utarbetats i steg 2,3) per gram fett vävnad. Inkubera fett vävnad lösning vid 37 ° c i 20 min under försiktig skakning (200 rpm).
- Tillsätt 5 mL 0,5% BSA/PBS per gram fett vävnad och placera på is. Triturate lösningen flera gånger med en 10 mL serologiska pipett och passera den genom en sil (100 μm) med hjälp av en kolv.
- Centrifugera vid 500 x g i 10 min vid 4 ° c.
- Ta bort den flytande fett celler fraktionen genom att Pipettera. Omsuspendera cellpelleten (stromal vaskulär fraktion) i 1 mL ACK-lysbuffert (se material tabell). Tillsätt 10 mL 2% FCS PBS.
- Centrifugera vid 500 x g i 10 min vid 4 ° c.
- Decant supernatanten och resuspendera cellpellet i 250 μL 2% FCS PBS.
- Räkna antalet livskraftiga celler på en hemocytometern med Trypan blå uteslutning.
- Euthanize möss via isofluran anestesi följt av cervikal disloksering. Spraya bröstet med 70% etanol. Gör försiktigt en 5-6 cm centralt snitt genom utrustningen och buk väggen längs hela längden på revbenen för att exponera pleuramesoteliom hålighet och hjärta.
-
Nedbrytning av lever vävnad
- Förvara levern i ett koniskt centrifugerör fyllt med PBS och transport på is.
- Utför mekanisk dissociation med hjälp av sprutstämplar i en petriskål vid 4 ° c. Sätt dissekcted lever vävnad i en 50 mL koniskt centrifug tub som innehåller 10 mL varm lever Digest lösning. Skölj petriskål med 3 mL leversammanfattningslösning.
- Inkubera lever vävnads lösning vid 37 ° c under 20 min under försiktig skakning (200 rpm).
- Tillsätt 20 mL HBSS. Triturate lösningen flera gånger med en 10 mL serologiska pipett och passera den genom en sil (100 μm) med hjälp av en kolv.
- Centrifugera vid 500 x g i 10 min vid 4 ° c. Häll av supernatanten och återuppkoppla cellpelleten i 20 mL HBSS.
- Centrifugera vid 30 x g i 1 min vid rums temperatur för att ta bort hepatocytmatrisen. Kassera cellpelleten.
- Centrifugera supernatanten vid 500 x g i 10 min vid 4 ° c. Omsuspendera pelleten i 10 mL 33% låg viskositet densitet gradient medium lösning (se tabell över material) i Hbss följt av centrifugering (800 x g; 30 min; rums temperatur, ingen broms).
- Omsuspendera pelleten i 1 mL ACKLYSNINGSBUFFERT och inkubera i 4 minuter i rums temperatur. Tillsätt sedan 10 mL HBSS.
Anmärkning: För att Kassera supernatanten aspirera supernatanten med Interphase (hepatocyter) mycket noggrant med en överföringspipett (så mycket som möjligt utan att ta pelleten med immun celler och erytrocyter). - Passera cellerna genom en 30 μm sil i ett 15 mL koniskt centrifugerör och centrifugera vid 500 x g i 10 min vid 4 ° c. Decant supernatanten och resuspendera cellpellet i 250 μL 2% FCS PBS.
- Räkna antalet livskraftiga celler på en hemocytometern med Trypan blå uteslutning.
4. ytfärgning
- Förbered anti kropps blandningen för T-cells-under grupper (panel 1) och medfödd immun celler (panel 2) som beskrivs i tabell 1 och tabell 2. Volymerna är optimerade för ett prov (100 μL) avseende anti kropps koncentrationer.
Anmärkning: Lymfocyter och medfödda immun celler närvarande skillnader i autofluorescens och bör analyseras separat. - Använd upp till 3 x 106 celler i 100 μl i ett polystyren-FACS-rör för ytfärgning. För att blockera FC-receptorer tillsätt 10 μL anti-CD16/CD32-antikropp (utspädd 1:100) och inkubera i 10 min på is. Använd ett omålat negativt kontroll prov för att justera sidscatter (SSC) och vidarebefordra scatter (FSC) för att bestämma placeringen av den negativa cell populationen.
- Vortexoch tillsätt lämplig volym av anti kropps blandningen för panel 1 och panel 2. Tillsätt 1 μL livs kraft färg till varje prov för att möjliggöra direkt och död cell diskriminering. Inkubera i 20 min vid 4 ° c och skyddas mot ljus.
- Tvätta två gånger med 2 mL 2% FCS PBS och centrifugera vid 300 x g i 5 min vid 4 ° c.
- Omsuspendera cellpelleten i 300 μL 2% FCS PBS och förvara vid 4 ° c till FACS-analys.
Anmärkning: Innan mätning passera cellerna genom 30 μm cell sil i polystyren FACS röret och virvel. Flödescytometri utfördes med märkta celler lagrade i 2% FCS PBS vid 4 ° c för 1-3 h. cellerna ska analyseras så snart som möjligt för optimerade resultat.
5. Flow Cytometri ersättning, förvärv och gating
- Kör obefläckat negativt kontroll prov för att ställa in FSC och SSC och justera spänningar av flödescytometern för att detektera leukocytpopulationer och för att skilja mellan skräp och livskraftiga celler. Exkludera skräp och döda celler.
Anmärkning: Livs kraft av cell SUS pensioner från levern kan vara lägre än lönsamheten från cell SUS pensioner från perigonadal fett vävnad på grund av en extra densitet separation steg. - Kör enstaka färgade kontroll prover för multi-Color kompensation.
Anmärkning: Anti kroppar fångst pärlor kan också användas för att justera för spektralöverlappning om antalet celler i en cell population av intresse är för låg för att kompensera med hjälp av celler. För att upptäcka eventuella autofluorescens signaler av cellerna fluorescens minus en (FMO) kontroller för varje anti kropp rekommenderas men tillämpades inte i detta protokoll. - Starta mätningen, samla in lämpligt antal händelser (minst 50 000 händelser) och spela in experimentella data.
- Exportera FCS datafiler för analys och ange gating strategi. Gate på CD45+ leukocyter för att identifiera efterföljande cell populationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollet beskrivs tillåter karakterisering av ytan markörer för medfödda och adaptiva immun celler isolerade från murina perigonadal fett vävnad och lever i en modell av diet-inducerad NASH. I denna modell induceras NASH genom administrering av HFD plus sackaros (6%) i dricks vatten i 7 till 15 veckor i C57Bl/6J möss, som tidigare rapporter ATS13. Viktigt, möss var inrymt i semi sterila förhållanden och, därmed, utsätts för miljömässiga antigener under hela experimentet. HFD matas möss inrymt i SPF villkor och Chow diet möss inrymt under SPF och icke-SPF villkor fungerade som kontroller. HFD utfodring resulterade i betydande kropps vikt vinna redan efter 7 veckor i båda grupperna. En signifikant skillnad i kropps vikt visades först vid vecka 4 (P < 0,001) och förblev signifikant under de följande experimentella veckorna. Emellertid, inga signifikanta skillnader i viktökning visades mellan SPF och icke-SPF-möss efter 7 veckor13. Den stromaceller vaskulär fraktion och immun celler från perigonadal fett vävnad och lever av manliga möss matas en HFD i 7 veckor isolerades av kollagenas mat smältning. Immun celler var märkta med fluorophore-konjugerade primära anti kroppar och proportioner av T-celler, B-celler, makro Fager, NK-celler, dendritiska celler och granulocyter kvantifierades via flödescytometrianalys. Gating för T-cells subpopulationer, inklusive Doublet diskriminering och viabilitet färgning, i murina perigonadala fettet illustreras i figur 1. CD45+ leukocyter först GATED för CD4 och CD8 och därefter GATED för CD44 och CD62L att diskriminera mellan naiva, Central minne, effektor minne och effektor T-celler. CD44+ celler karakteriserades därefter med CD127, KLRG1 och PD-1. Figur 2 ger en gating strategi för att analysera B-celler, GRANULOCYTER, NK-celler, makro Fager och dendritiska celler.
Representativa resultat av extracellulär färgning av T-celler inom murina lever av HFD exponerade möss jämfört med HFD SPF-möss visas i figur 3A. Faktum är att en högre andel av effektor minne CD4+ och CD8+ T-celler kan upptäckas i HFD exponerade möss, medan INTRAHEPATISKA naiva CD4+ och CD8+ t-celler KONSTATERADES vara betydligt lägre i exponerade jämfört med SPF-möss vid vecka 7 (figur 3a).
För att validera dessa resultat, det hepatiska inflammatoriska svaret i samband med antigen exponering under Sök tes av hematoxylin/eosin färgning av levern avsnitt av 15 veckor matas möss13. Svår steatos, inklusive ökning av stora lipiddroppar som resulterar i makrovesikulär steatos, Lobulär inflammation, hepatocellulär ballong flygning och förstörd Lobulär struktur, hittades i HFD exponerade möss medan endast vissa SPF-möss visade ett milt fett ackumulering i levern (figur 3B). Som rapporter ATS i figur 3Cvar andelen NK-celler högre i perigonadal fett vävnad av HFD exponerade möss, medan HFD SPF-möss visade högre procent satser av dendritiska celler. Inga signifikanta skillnader hittades för makro Fager och monocyter. Sammantaget bekräftar dessa resultat mer allvarlig leversteatos i HFD exponerade möss och mindre skillnader i fett vävnad mellan HFD exponerade och SPF-möss.
Tabell 1 visar de anti kroppar som används i panel 1. Anti kroppar som används i flödescytometri analys för extracecullar färgning av B-celler, makro Fager, NK celler, dendritiska celler och granulocyter avbildas i tabell 2.
Figur 1 : Schematisk representation av gating strategi som används i flödescytometri analys av fett immun celler (panel 1). Först, cellerna är gated på singlets. Sedan utesluts skräp genom att använda det främre spridnings området (FSC-A) och sido spridnings området (SSC-A) och välja rätt storlek. Celler kännetecknas vidare av uttrycket CD45. Livskraftiga celler väljs med hjälp av levande/död cell markör som är en Amin reaktivt fluorescerande färg ämne som är icke-permenterad till levande celler, men permenade att cellerna med komprometterade membran. T-celler delades in i cytotoxiska T-celler (CD8+) och t-HJÄLPCELLER (CD4+) och INDELADE i naiva (CD44+CD62L-), Central minne (CD44+CD62L+), effektor minne (CD44+CD62L- ) och effektor (CD44-CD62L+) T-celler. Slutligen, CD44+ celler är GATED på KLRG1, CD127 och PD-1. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Schematisk representation av gating strategi som används i flödescytometri analys av fett immun celler (panel 2). Gating av dendritiska celler baserades på CD11b och CD11c uttryck. Följande andra populationer definierades: B-celler, NK-celler, makro Fager, monocyter och granulocyter. Data analyserades efter förvärvet med lämplig program vara. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Representativ flödescytometri analys av T-celler isolerade från murina perigonadal fett vävnad och lever. (A) CD4+ och CD8+ T-celler av murina lever från 7 veckors HFD möss upprätthålls under SPF och exponerade förhållanden analyserades via flödescytometri. Brepresentativ färgning på 15 veckors HFD SPF och exponerade möss. Infiltration av immun celler och luft ballong hepatocyter (pilspets) illustrerar NASH. C) procent andel av fett medfödd immun celler i procent av leukocyter i HFD-möss som underhålls under SPF eller exponerade förhållanden under 7 veckor. n = 6-10 möss per grupp. Signifikans bestämdes med hjälp av tvåvägsanova flera mätningar. Data representeras som medelvärde ± SEM. * * P < 0,01, * * * P < 0,001. Denna siffra har ändrats från refefence13. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tabell 1: anti kroppar som används i flödescytometri för extracellulär färgning (panel 1). Mängden anti kropp som beskrivs är för analys av ett prov.
Tabell 2: anti kroppar som används i flödescytometri för extracellulär färgning (panel 2). Mängden anti kropp som beskrivs är för analys av ett prov.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Steatohepatit har ett starkt samband med metabola avvikelser såsom fetma, insulin resistens och dyslipidemi15. Flera studier tyder på att fett vävnad inflammation kan driva patogenesen av typ 2-diabetes, inklusive förändrade nivåer av celler av både det medfödda och adaptiva immun försvaret4,5,16,17 . Dessutom har det kon stater ATS att fetma modulerar aktiveringen av immun vägar, vilket kan leda till lever komplikationer18. Det finns ett ökande intresse för karakterisering av immun celler fenotyper i fett och lever inflammatorisk respons eftersom varje immun cells subpopulation bidrar på ett annat sätt till utvecklingen av insulin resistens och steatohepatit.
Denna metod ger detaljerad information om hur man isolera och kvantifiera relativa mängder av immun celler från perigonadal fett vävnad och levern. Dessutom, metoderna visar hur man underhåller HFD matas möss i icke-SPF villkor för att inducera steatohepatit. Protokollet kan användas för att studera immun cells funktioner och för att undersöka sammanslutningar av specifika immun celler mellan olika vävnader i en mikrobiologiskt normaliserad miljö.
I vår nuvarande studie, HFD utfodring av icke-SPF-möss resulterade i utvecklingen av insulin resistens och steatohepatit, medan HFD SPF-möss utvecklat insulin resistens, mild leversteatos, men inte steatohepatit som bestäms av immunhistokemi. Dessutom varierade fett och lever immun celler under grupper signifikant mellan HFD exponerade och SPF-möss, vilket bekräftar vår förståelse av betydelsen av olika boende förhållanden. Sammanfattnings vis kan vi visa att mikrobiell exponering för kommensala Flora kan påverka de immunologiska egenskaperna hos C57BL/6 möss dramatiskt. Tidigare arbete har visat att mångfalden och funktionen av gut mikrobiome påverkas av diet-inducerad fetma19,20 och att gut barriär funktion och intestinal permeabilitet beror på boende förhållanden21. Vi strävar efter att ta itu med sambandet mellan tarm kolonisering och fett och lever inflammation i en kommande publikation.
Flera punkter måste övervägas under planerings stadiet av de föreslagna metoderna. Först, Single-cell SUS pensioner krävs för alla flödescytometri analyser och cellernas livs kraft kan påverkas av graden av mekanisk vävnad dissociation och varaktigheten av enzymatisk vävnad mat smältning. För att undvika att anti kropps epitopen förstörs och för att maximera utbytet av funktionellt livskraftiga, separerade celler, typ av vävnad, djurens ålder, genetiska modifieringar, koncentrationer av enzymer, temperatur och inkubations tider bör tas beaktas.
För det andra har vårt protokoll optimerats för att kvantitativt bestämma olika immun celler fenotyper från överviktiga HFD matas möss med fett vävnad inflammation och steatohepatit. Som vävnads integritet, antalet immun celler och därmed kvaliteten på vävnads nedbrytning, kan påverkas av inflammatoriska processer, bör protokollet och kollagenas användas optimeras för andra vävnader än levern eller fett vävnad i specifika experiment för dissektion metoder, inkubations tider eller kollagenas som används för att smälta vävnaden. För det tredje är det viktigt för protokollet att olika experimentella grupper ingår varje dag för att eliminera effekter på grund av den dagliga variationen av flödescytometri-analysen (temperatur, inkubations tid, etc.).
Det finns dock några viktiga begränsningar i den beskrivna metoden. För att diskriminera positiva kontra negativa signaler för att korrekt justera portarna för att identifiera cellerna positiva för specifika ytmarkörer i de experimentella proverna, Fluorescence minus en (FMO) kontroller (en FMO-kontroll innehåller alla fluorkromer i en panel, med undantag för den som mäts) borde ha använts. I det här experimentet kunde data kompenseras ordentligt och gating var klar, men vi rekommenderar att du lägger till FMO-kontroller i experiment inställningarna, när det är möjligt. Dessutom, FoxP3, som måste färgas intracellulärt kräver permeabiliseringen av cell membranet, borde ha använts för att kvantifiera regulatoriska T-celler eftersom det möjliggör en mer exakt definition än användning av CD25 och CD127 (tabell 2). Även om flödescytometri tillåter kvantifiering av flera ytmarkörer samtidigt begränsas deras antal till 12 per prov på grund av överlappning i emissions spektra. För att korrigera för spektralöverlappning krävs tids intensiv fluorescenskompensation. För att ta hänsyn till detta krävs strategisk panel utveckling eller användning av masscytometri tekniker. Dessutom kan svårigheter uppstå i bostäder möss i icke-SPF villkor med avseende på särskilda djur bostäder rikt linjer, men det nuvarande mindre antal studier på icke-SPF gnagare visar att sådana studier är möjliga12,21 . Till exempel kan separerade djur anläggningar för SPF-och icke-SPF-möss utvärderas. Utvecklingen av ett mänskligt vuxen-liknande immun försvar äventyras i SPF-möss12,21, vilket resulterar i begränsningar för att översätta behandlings strategier från djur försök till kliniska studier.
Sammanfattnings vis ger vi ett detaljerat protokoll för fenotypisk karakterisering av murina fett och lever immun celler med flödescytometri i en diet-inducerad djur modell av NASH och insulin resistens. Med tanke på den komplexa funktion och reglering av både medfödda och adaptiva celler i samband med fetma och metabola Dysreglering, våra föreslagna metoder bör bidra till att fördjupa vår förståelse av immunologiska mekanismer för att balansera metabolisk homeostas och därmed bidra till att utveckla humana terapeutiska medel som kan återställa antiinflammatoriska immun svar. Sammantaget, den medföljande djur modellen fungerar som en snabb och robust modell för att bedöma metabola komplikationer i samband med fetma och kan tillämpas på andra sjukdoms modeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Anke Jurisch, Diana Woellner, Dr Kathrin Witte och Cornelia Heckmann för hjälp med experimentella procedurer och Benjamin Tiburzy från Biolegend för hjälpsamma kommentarer om gating strategi. JS stöddes av Helmholtz Grant (ICEMED). Denna studie stöddes av bidrag från den kliniska forsknings enheten vid Berlin Institute of Health (BIH), "BCRT-Grant" av det tyska förbunds ministeriet för utbildning och forskning och Einstein Foundation. K.S.-B. och H.-D.V. finansieras av FOR2165.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 µm cell strainers | Falcon | 352340 | |
| 1 mL syringe | BD | 309659 | |
| 26 G x 5/8 needles | BD | 305115 | |
| 35 mm Petri Dishes | Falcon | 353001 | |
| 40 µm cell strainers | Falcon | 352340 | |
| ACK lysis buffer | GIBCO | A1049201 | |
| Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45 | Biolegend | 103127 | AB_493714 (BioLegend Cat. No. 103127) |
| Analysis software | FlowJo 10.0.8 software | ||
| APC anti-mouse CD11c Antibody | Biolegend | 117309 | AB_313778 (BioLegend Cat. No. 117309) |
| APC anti-mouse KLRG1 (MAFA) Antibody | Biolegend | 138411 | AB_10645509 (BioLegend Cat. No. 138411) |
| BV421 anti-mouse CD127 Antibody | Biolegend | 135023 | AB_10897948 (BioLegend Cat. No. 135023) |
| BV421 anti-mouse F4/80 Antibody | Biolegend | 123131 | AB_10901171 (BioLegend Cat. No. 123131) |
| BV605 anti-mouse CD279 (PD-1) Antibody | Biolegend | 135219 | AB_11125371 (BioLegend Cat. No. 135219) |
| BV605 anti-mouse NK-1.1 Antibody | Biolegend | 108739 | AB_2562273 (BioLegend Cat. No. 108739) |
| BV650 anti-mouse/human CD11b Antibody | Biolegend | 101239 | AB_11125575 (BioLegend Cat. No. 101239) |
| BV711 anti-mouse/human B220 Antibody | Biolegend | 103255 | AB_2563491 (BioLegend Cat. No. 103255) |
| BV785 anti-mouse CD8a Antibody | Biolegend | 100749 | AB_11218801 (BioLegend Cat. No. 100749) |
| C57Bl/6J mice, male, 5 weeks old | Forschungseinrichtungen für experimentelle Medizin (FEM) | ||
| CaCl2 | Charité - Universitätsmedizin Berlin | A119.1 | |
| Collagenase NB 4G Proved Grade | SERVA | 11427513 | |
| Collagenase Typ I | Worthington | LS004197 | |
| Conical centrifuge tube 15mL | Falcon | 352096 | |
| Conical centrifuge tube 50 mL | Falcon | 352070 | |
| DNAse | Sigma-Aldrich | 4716728001 | |
| Fetal bovine serum | Biochrom | S0115 | |
| Filter 30µm | Celltrics | 400422316 | |
| FITC anti-mouse CD3 Antibody | Biolegend | 100203 | AB_312660 (BioLegend Cat. No. 100203) |
| Flow cytometry | BD-LSR Fortessa | ||
| Forceps | Sigma-Aldrich | F4142-1EA | |
| HBSS | Bioanalytic GmBH | 085021-0500 | |
| High-fat diet | SSNIF | E15741–34 | 60 kJ% from fat, 19 kJ% from proteins, and 21 kJ% from carbohydrates |
| micro dissecting scissors | Sigma-Aldrich | S3146 | used for dissection purposes |
| PE anti-mouse CD25 Antibody | Biolegend | 101903 | AB_312846 (BioLegend Cat. No. 101903) |
| PE/Cy7 anti-mouse CD62L Antibody | Biolegend | 104417 | AB_313102 (BioLegend Cat. No. 104417) |
| PE/Cy7 anti-mouse I-A/I-E (MHCII) Antibody | Biolegend | 107629 | AB_2290801 (BioLegend Cat. No. 107629) |
| PE/Dazzle 594 anti-mouse CD4 Antibody | Biolegend | 100565 | AB_2563684 (BioLegend Cat. No. 100565) |
| Percoll solution | Biochrom | L6115 | |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD44 Antibody | Biolegend | 103031 | AB_2076206 (BioLegend Cat. No. 103031) |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse Gr-1 Antibody | Biolegend | 108427 | AB_893561 (BioLegend Cat. No. 108427) |
| Phosphate buffered saline | Gibco | 12559069 | |
| Round-Bottom Tubes with cell strainer cap | STEMCELL Technologies | 38030 | |
| TruStain fcX anti-mouse CD16/32 | Biolegend | 101301 | AB_312800 (BioLegend Cat. No. 101301) |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T6146 | |
| Zombie NIR Fixable Viability Kit | Biolegend | 423105 | viablity stain |
References
- Guh, D. P., et al. The incidence of co-morbidities related to obesity and overweight: A systematic review and meta-analysis. BMC Public Health. 9, 88 (2009).
- Prentki, M. Islet β cell failure in type. J Clin Invest. 116 (7), 1802-1812 (2006).
- Shoelson, S. E., Lee, J., Goldfine, A. B. Inflammation and insulin resistance. Journal of Clinical Investigation. 116 (7), 1793-1801 (2006).
- Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes. Nature. 444, 840 (2006).
- Exley, M. A., Hand, L., O'Shea, D., Lynch, L. Interplay between the immune system and adipose tissue in obesity. Journal of Endocrinology. 223 (2), R41-R48 (2014).
- Ferrante, A. W. Macrophages, fat, and the emergence of immunometabolism. Journal of Clinical Investigation. 123 (12), 4992-4993 (2013).
- Winer, D. A., et al. B cells promote insulin resistance through modulation of T cells and production of pathogenic IgG antibodies. Nature Medicine. 17, 610 (2011).
- Onodera, T., et al. Adipose tissue macrophages induce PPARγ-high FOXP3(+) regulatory T cells. Scientific Reports. 5, (2015).
- Lackey, D. E., Olefsky, J. M. Regulation of metabolism by the innate immune system. Nature Reviews Endocrinology. 12, 15 (2015).
- Calle, E. E., Kaaks, R. Overweight, obesity and cancer: epidemiological evidence and proposed mechanisms. Nature Reviews Cancer. 4, 579 (2004).
- Ibrahim, S. H., Hirsova, P., Malhi, H., Gores, G. J. Animal Models of Nonalcoholic Steatohepatitis: Eat, Delete, and Inflame. Digestive Diseases and Sciences. 61 (5), 1325-1336 (2016).
- Beura, L. K., et al. Recapitulating adult human immune traits in laboratory mice by normalizing environment. Nature. 532 (7600), 512-516 (2016).
- Sbierski-Kind, J., et al. Distinct Housing Conditions Reveal a Major Impact of Adaptive Immunity on the Course of Obesity-Induced Type 2 Diabetes. Frontiers in Immunology. 9 (1069), (2018).
- Japp, A. S., et al. Wild immunology assessed by multidimensional mass cytometry. Cytometry Part A. 91 (1), 85-95 (2017).
- Benedict, M., Zhang, X. Non-alcoholic fatty liver disease: An expanded review. World Journal of Hepatology. 9 (16), 715-732 (2017).
- McNelis, J. C., Olefsky, J. M. Macrophages, Immunity, and Metabolic Disease. Immunity. 41 (1), 36-48 (2014).
- Ferrante, A. W. The Immune Cells in Adipose Tissue. Diabetes, Obesity & Metabolism. 15, 34-38 (2013).
- Bertola, A., et al. Hepatic expression patterns of inflammatory and immune response genes associated with obesity and NASH in morbidly obese patients. PloS One. 5 (10), e13577 (2010).
- Turnbaugh, P. J., Bäckhed, F., Fulton, L., Gordon, J. I. Diet-Induced Obesity Is Linked to Marked but Reversible Alterations in the Mouse Distal Gut Microbiome. Cell Host & Microbe. 3 (4), 213-223 (2008).
- Singh, R. K., et al. Influence of diet on the gut microbiome and implications for human health. Journal of Translational Medicine. 15 (1), 73 (2017).
- Müller, V. M., et al. Gut barrier impairment by high-fat diet in mice depends on housing conditions. Molecular Nutrition & Food Research. 60 (4), 897-908 (2016).
