Summary
Apresentado aqui é um protocolo para o isolamento e amplificação de bactérias comensais anaeróbicas aeróbicas e facultativas de camundongos anastrérmicos utilizando um cotonete de olho único e passo de enriquecimento baseado em cultura com identificação subsequente por métodos à base microbiológica e espectrometria de massa MALDI-TOF.
Abstract
A superfície ocular já foi considerada imuno-privilegiada e abiótica, mas recentemente parece que há uma pequena, mas persistente presença commensal. A identificação e o monitoramento de espécies bacterianas na mucosa ocular têm sido desafiadores devido à sua baixa abundância e disponibilidade limitada de metodologia adequada para crescimento e identificação commensais. Existem duas abordagens padrão: métodos de sequenciamento de cultura ou sequenciamento de DNA. O primeiro método é problemático devido às bactérias recuperáveis limitadas e a segunda abordagem identifica bactérias vivas e mortas levando a uma representação aberrante do espaço ocular. Desenvolvemos um método robusto e sensível para o isolamento bacteriano, baseando-se em técnicas de cultivo microbiológico padrão. Trata-se de uma técnica baseada em swab, utilizando um cotonete fino "em laboratório" que visa a conjuntiva inferior, seguido por um passo de amplificação para genera aeróbico aeróbico e facultativo. Este protocolo nos permitiu isolar e identificar espécies conjuntivistas como Corynebacterium spp., Coagulase Negative Staphylococcus spp., Streptococcus spp. A abordagem é adequada para definir a diversidade commensal em camundongos em diferentes condições de doença.
Introduction
O objetivo deste protocolo é aumentar o isolamento específico de micróbios aeróbicos e anaeróbicos viáveis e facultativos da conjuntiva ocular para caracterizar o microbioma ocular. Estudos extensivos têm perfilado comunidades mucosas commensais nos tratos da pele, intestino, respiratório e genital e mostram que essas comunidades influenciam o desenvolvimento do sistema imunológico e a resposta1,2,3. Comunidades commensais oculares têm sido demonstradas para mudar durante certas patologias da doença, como doença do olho seco4, síndrome de Sjogren5 e diabetes6. No entanto, a capacidade de definir uma comunidade típica de superfície ocular commensal é dificultada por sua abundância relativamente baixa em comparação com os outros sítios mucosas6,7,8. Isso gera controvérsia sobre se existe um microbioma ocular residente e se ele existe, se ele difere do microbioma da pele e, consequentemente, seu efeito local sobre o desenvolvimento e resposta do sistema imunológico inato. Este protocolo pode ajudar a resolver essa questão.
Geralmente, as abordagens para definir o nicho commensal ocular baseiam-se no sequenciamento e nas técnicas baseadas na cultura4,7,9. 16 S rDNA sequenciamento e análise BRISK7 mostram uma diversidade mais ampla do que as técnicas baseadas na cultura, mas são incapazes de diferenciar entre micróbios vivos e mortos. Uma vez que a superfície ocular é hostil a muitos micróbios devido às propriedades antimicrobísis do filme lacrimal4 gerando uma grande variedade de fragmentos de DNA, abordagens baseadas em DNA detectarão esses artefatos que podem distorcer os dados para identificação de bactérias mortas como commensais residentes em vez de contaminantes. Isso resulta na identificação e caracterização aberrante do espaço ocular como sendo maior em abundância de micróbios e diversidade10. Isso dificulta a definição do microbioma ocular residente através de métodos baseados em DNA. Considerando que as técnicas padrão baseadas na cultura são incapazes de detectar commensais porque a carga é muito baixa11. Nosso método melhora as práticas padrão usando um cotonete fino que pode atingir a conjuntiva, evitando assim a contaminação da pele vizinha, bem como o conceito de que organismos viáveis podem ser enriquecidos por uma breve cultura em meios densos de nutrientes com o objetivo de ressuscitar viável, mas não cultural, bem como, enriquecer para micróbios viáveis raros.
Os resultados, abundância relativa de commensais oculares por cotonete ocular, caracterizam o microbioma residente conjuntiva e são importantes para fins comparativos. Nossos dados mostram que há uma diferença entre a pele e a microbiota conjuntivival, bem como maior diversidade com aumento da idade e diferença de sexo específico em abundância. Além disso, essa abordagem tem encontrado diferenças commensais em camundongosnocautes 12. Este protocolo pode ser aplicado para descrever o microbioma ocular que pode variar devido a práticas de caging, geografia ou estado de doença, bem como os efeitos locais de metabólitos commensais e produtos sobre desenvolvimento e resposta do sistema imunológico.
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Protocol
Todos os procedimentos envolvendo camundongos seguem as diretrizes do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais. Siga as diretrizes de segurança laboratorial (conforme orientado pelo departamento de Saúde e Segurança Ambiental Institucional) ao trabalhar com microrganismos e materiais potencialmente contaminados. Utilize recipientes de resíduos adequados e procedimentos de descontaminação antes do descarte de materiais contaminados potencialmente de risco biológico.
1. Preparação do cotonete de olhos, configuração de campo de trabalho, limpeza de olhos de rato e enriquecimento de amostras
- Prepare cotonetes estéreis nos olhos
NOTA: Os cotonetes estéreis são palitos de dente de madeira finamente revestidos com uma fina camada de fibra de algodão e feitos em casa.- Autoclave quantidade apropriada de rebatidas de algodão e palitos de dente para o número de ratos a serem esfregados.
- Belisque um pedaço de algodão de meio centímetro de comprimento batendo com polegar e dedo indicador. Provoque rebater puxando as bordas com polegares e dedos indicadores para formar uma camada porosa única plana, parando pouco antes do rebatedor desmoronar (pequenos pedaços de algodão dispersos ao longo do rebatedor esticado são aceitáveis).
- Gire o rebatedor em torno de uma das extremidades afiadas do palito segurando levemente a peça esticada na ponta do palito enquanto é torcida, veja Figura 1. O cotonete "completo" terá uma camada muito fina de algodão estendida sobre a ponta, estendendo-se aproximadamente meio a um centímetro de distância da ponta.
- Insira cotonetes "completos" em béquer pequeno, cotonete lateral para baixo e cubra. autoclave.
- Configure o espaço de trabalho
- Prepare anestesia contendo 2 mL de cetamina (100 mg/mL), 400 μL de xilazina (100 mg/ml) e 27,6 mL de soro fisiológico estéril (0,9% NaCl em dH2O) em um tubo estéril de centrífuga estéril de 50 mL. Filtrar esterilizar e aliquot anestesia para uso imediato (pode ser armazenado a 4 °C por 1 mês; sempre permitir o equilíbrio à temperatura ambiente antes do uso).
- Limpe e limpe a área de trabalho com desinfetante para minimizar a contaminação.
- Alíquota de 0,5 mL de mídia estéril de infusão cardíaca cerebral (BHI) em tubos de microcentrifuge estéreis de 1,5 mL (1 tubo por rato e controle); organizar em rack microcentrifuge. Coloque o rack no gelo.
- Configurar o fluxo de trabalho da seguinte forma (da esquerda para a direita): estação de anestesia do rato (gaiola contendo ratos experimentais, gaiola estéril vazia, anestesia de temperatura ambiente, agulha de 25 G e seringa de 1 mL), estação de cotonização dos olhos (BHI aliquoted no gelo, cotonetes oculares esterilizados, toalhas de papel limpas, 70% spray de isopropanol) e estação de revestimento (placas de ágar de sangue de temperatura ambiente, 10 μL pipeta , 10 μL pontas descartáveis estéreis, recipiente de resíduos de risco biológico).
- Eye swabbing
- Administre 10 μL de anestesia por 1 g de dosagem de peso do rato de cetamina e xilazina, respectivamente, intraperitoneal para cada rato adulto e coloque em uma gaiola autoclavada. Testar a anestesia apertando a almofada de pé traseiro; nenhum movimento indica anestesia apropriada.
- Atribua uma mão apenas para manusear camundongos anestesiados e a outra mão para apenas manusear o cotonete dos olhos e a cultura. Para limpar, remova o rato totalmente anestesiado da gaiola; colocar em cima da superfície de trabalho limpo posicionado do seu lado com o olho esquerdo exposto. Spray mãos enluvadas com isopropanol, seco com papel toalha limpa.
- Uncap especificamente rotulado bhi micro-centrífuga tubo com mão de manuseio de mídia dedicada. Coloque o tubo de volta no rack de microcrífugas no gelo. Mergulhe a ponta revestida de algodão do cotonete dos olhos em BHI, retire o cotonete do tubo girando a ponta 2 vezes contra o tubo interno para remover o excesso de líquido.
- Com a mão manuseando o mouse, segure suavemente o mouse pelo escroto do pescoço. Por outro lado, coloque a ponta do cotonete dos olhos contra a região de conjuntivival medial do olho esquerdo, veja Figura 2A. Deprimir levemente o globo ocular e mover o cotonete em um movimento de lavagem da janela(Figura 2B) para frente e para trás, entre a pálpebra inferior e o olho, 10 vezes. Mantenha a pressão constante.
- Sem tocar na pele, remova suavemente a ponta do cotonete, perpendicular para onde foi inserido, e coloque o lado do algodão do cotonete diretamente em um tubo de microcrédito rotulado contendo mídia BHI. Aplique um colírio lubrificante no olho esfregado.
- Devolva o rato para a gaiola.
- Deixe o cotonete ficar por 10 a 15 minutos no gelo e remova o cotonete dos olhos com a mão de luva esterilizada misturando a ponta na mídia para 10 rotações. Retire o cotonete girando contra a parede interna do tubo de microcrífugas para 5 rotações. Descarte o cotonete em recipiente de risco biológico.
- Repita as etapas 1.3.2 a 1.3.7 para cada rato e para amostras de controle (swab de pele ou pele). Esterilize as luvas apropriadamente entre cada cotonete.
- enriquecimento
- Enriqueça a amostra incubando o tubo estaticamente por 1 h a 37 °C
- Durante a incubação, rotule uma soja de tripática de temperatura ambiente com 5% de placa de ágar de ovelha (placa TSA) por rato e divida ao meio.
- Após a incubação da cultura do cotonete dos olhos, remova amostras enriquecidas da incubadora e coloque no gelo.
- Brevemente amostras de vórtice para misturar e chapa de acordo com o esquema na Figura 3A. Alíquota 10 μL da amostra na placa TSA e inclinar a placa para formar uma tira, repita 2 vezes.
- Do outro lado da linha divisória da placa, pontuem 10 μL de amostra no ágar, repita 9 vezes.
- Incubar placas a 37 °C durante 18h, 2 dias e 4 dias (em uma câmara limpa que impede a secagem das placas de ágar). Conte colônias em tiras, note morfologia e calcule unidades de formação de colônias (UFC) por cotonete para isolados morfologicamente semelhantes. Olhe para pontos para organismos únicos não capturados em tiras.
2. Placa de mestre, caracterização e identificação de micróbios oculares
-
Placa principal
- Desenhe grades na parte de trás de uma placa TSA(Figura 3B). Escolha uma colônia com um palito estéril de cada placa de cotonete de olho do rato e listrar o quadrado da placa principal (grades), grade de etiqueta com número de colônia e informações do rato. Escolha e emplaque três colônias diferentes para cada colônia morfologicamente distinta.
- Incubar a placa durante a noite a 37 °C. Continue a incubação por 96 horas, verificando diariamente o aparecimento de novos isolados.
NOTA: A população commensal vai variar de acordo com a idade do camundongo, nutrição, estado da doença e práticas de caging. A caracterização isolada baseia-se nas bactérias anaeróbicas aeróbicas e facultativas predominantes encontradas em nosso laboratório.
-
caracterização
- Duplicar13 micróbios de placas de Mannitol Salt Agar (MSA) e MacConkey (MAC), incubar durante a noite a 37 °C. Observe o crescimento para cada isolado e presença de colônias ceradas ou colônias amarelas com halo em MSA.
- Para Gram positivo cocci, teste com o teste de catalase13,14. Coloque uma gota de 3% de peróxido de hidrogênio em uma lâmina de vidro limpa. Usando um palito estéril, escolha o micróbio correspondente da placa do cotonete dos olhos. Nenhuma formação de bolha indica Streptococcus spp., formação de bolhas leves indica Corynebacterium spp. e talvez Aerococcus spp. e formação rápida de bolhas indica Staphylococcus spp.
-
Identificação: Análise MALDI-TOF MS
NOTA: As identificações bacterianas são realizadas utilizando o MALDI-TOF e o Banco de Dados de Software. Este sistema emprega o tempo de desorção a laser assistido por matriz da espectrometria de massa de voo (MALDI-TOF MS) para o desenvolvimento de perfis de espectros que são comparados com espectros bacterianos conhecidos para identificação. E.coli, ATCC 8739, é usado para calibração do sistema.- A placa bacteriana isola em placas TSA contendo 5% de sangue de ovelha e incubam durante a noite com 5% de dióxido de carbono a 37 °C.
- Usando um loop de 1 μL, aplique uma camada fina das bactérias puras no slide de destino MALDI-TOF; 1 μL de solução matricial MALDI-TOF MS CHCA (ácido alfa-cyano-4-hidroxicinâmico) é sobreposta e permitido secar completamente antes de carregar o slide no instrumento MALDI-TOF.
- Cada isolado é visto em duplicata.
- Relatórios contendo escores de probabilidade superiores a 80%, que indicam um alto valor de discriminação, são aceitos como resultados confiáveis e a identificação bacteriana aceita.
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Representative Results
Os resultados representativos para uma placa de cotonete dos olhos que demonstram diferentes métodos de chapeamento são retratados na Figura 3A mostrando isolados morfologicamente diversos do mouse C57BL/6. Para cada isolado distinto, as colônias foram contadas na faixa e a abundância relativa, unidades de formação de colônias únicas (UFC) por cotonete de olhos, calculadas e plotadas para fins de comparação. Para caracterização microbiológica, as bactérias foram colhidas a partir de placas individuais de cotonetes de olhos de rato para produzir uma placa TSA mestre (criada por escolher isolados morfologicamente distintos em triplicado de cada placa de cotonete de olho do rato). A partir da placa principal, no dia seguinte ou quando o crescimento aparece, testes adicionais foram executados para caracterizar ou identificar os micróbios. A placa principal foi usada para fornecer inóculo suficiente para expandir os respectivos isolados.
As espécies foram caracterizadas por técnicas microbiológicas e, em seguida, identificadas pela análise MALDI-TOF MS. Cada isolado da placa principal, foi testado pelo teste catalase13,14 e cultivado em mídia seletiva. Como os micróbios predominantes em nossos estudos são Streptococcus spp., Staphylococcus spp. e Corneybacterium spp., Mannitol Salt Agar (MSA) e Mac Conkey Agar (MAC) foram usados como ágar seletivo13. O crescimento do Mannitol Salt Agar indica Staphylococcus spp13,16. Uma vez que o MSA contém fenol vermelho, um halo amarelo ao redor da colônia indica fermentação de manitol e classificação como Staphylococcus aureus (confirmar com testes alternativos como teste de Coagulase)13. O crescimento do ágar MacConkey indica bactérias gram negativas, uma vez que sais biliais e violeta cristalina são capazes de transgredir a membrana bacteriana e inibir o crescimento bacteriano gram positivo13. O crescimento encerado no MSA indica a produção de ácido mcólico e pode ser devido a organismos como Corneybacterium spp13. Finalmente, o teste de catalase diferencia o Streptococcus spp. de Staphylococcus spp13,16, e, em alguns casos, um teste positivo fraco pode indicar Aerococcus spp15.
Para identificar isolados, uma placa TSA foi listrada e incubada durante a noite em um ambiente de 5% de dióxido de carbono e 37 °C e MALDI-TOF MS realizado. Figura 4 mostra os resultados S. acidominimus (membro dos viridans Streptococcus spp. 17) e A. viridans. Muitas vezes Aerococcus spp. são erroneamente identificados como o grupo viridans de estreptococos18,19, com base em testes bioquímicos e fenotípicos. Maldi-TOF MS foi capaz de identificar os isolados com um nível de confiança de 99,9 sem espécies não identificáveis.
Diferenças tendenciosas do sexo podem ser observadas na Figura 5,onde níveis significativamente diferentes de organismos commensais foram recuperados de camundongos C57BL/6 masculinos e femininos. A abundância relativa para cada isolado foi determinada. Streptococcus acidominimus, Aerococcus viridans e coagulase negativo staphylococcus(CNS) isolam #1 e E. coli spp. foram encontrados em todos os camundongos, com os machos apresentando maior abundância relativa e maior diversidade.
Figura 1: Cotonete de olhos interno.
(A) Um fino, aproximadamente 1 cm, pedaço de algodão puxado foi mantido entre o ponto de palito estéril e o dedo indicador e o palito foi enrolado mantendo leve pressão contra o dedo indicador até que o algodão foi completamente enrolado na ponta do palito. (B) Exemplo de um cotonete para os olhos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Colocação do cotonete de olho conjuntivo do rato.
(A) A ponta do cotonete de olho molhado bhi foi inserida, em um ângulo de 90°, no canto medial do olho esquerdo de um rato anestesiado, deprimindo o globo ocular. (B) O cotonete foi movido ao longo da conjuntiva, mantendo uma leve pressão sobre o olho em um movimento de frente e para trás, 10 vezes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Resultados representativos para o cotonete dos olhos e placas mestras.
(A) 10 μL de swab de olho inoculado mídia enriquecida foi aliquoed no lado direito da placa de ágar sangue e inclinou 30 a 60 graus para permitir que a mídia formasse tiras e no lado esquerdo da placa, dez pontos de 10 μL da amostra foram dispensados. A fotografia da placa incubada mostra colônias individuais e diversidade morfológica. (B) Uma placa mestre de isolados foi criada colhendo uma colônia da placa do cotonete dos olhos e listrando dentro de um dos quadrados (grades). Três colônias morfologicamente semelhantes estão listradas em grades separadas. Cada grade tem três raias da mesma colônia que foi colhida da placa de cotonete do olho do rato. Após o crescimento aparecer nas placas, o isolado foi caracterizado por testes seletivos de chapeamento e catalase. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Exemplo dos resultados maldi-TOF MS.
Cada isolado foi cultivado na TSA durante a noite, aplicado ao slide MALDI-TOF MS e sobreposto com solução MALDI-TOF MS, seco a ar e manchado em duplicata. Os resultados de Streptococcus acidominimus (A) e Aerococcus viridans (B) foram identificados positivamente com um valor de confiança de 99,9. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Crescimento conjuntivo commensal tendencioso.
Os camundongos C57BL6/N com idade foram comparados para a diversidade relativa da commensal. Os olhos foram varridos e organismos commensais identificados. A espécie mais predominante foi o Streptococcus acidominimus, que foi significativamente mais abundante em camundongos machos do que fêmeas (ANOVA de duas vias, p<0,0001). Foram identificados 5 isolados diferentes do CNS, Aerococcus viridans e E.coli. Enquanto alguns dos isolados do CNS não estavam presentes em todos os camundongos, o Streptococcus acidominimus, Aerococcus viridans, CNS isolado 1 e E. coli foram encontrados em todos os camundongos com abundâncias distintas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Devido ao estado paucibacteriano da superfície ocular, muitos laboratórios têm tido dificuldade em isolar as commensals oculares7,20, resultando em baixo número de amostras com crescimento, baixa abundância e baixa diversidade8. Este método melhora significativamente as práticas de cultura padrão4,21 pela adição de uma etapa de enriquecimento, bem como um cotonete ocular redesenhado e identificação por MALDI-TOF MS. A etapa de enriquecimento aborda a baixa recuperação, amplificando a carga bacteriana. O aumento significativo de bactérias recuperáveis de menos de 100 UFC para a abundância relativa de 2.500 UFC por cotonete para camundongos machos do tipo selvagem sugere que a incubação em mídia rica em nutrientes revigora bactérias viáveis, mas não cultivadas22,23,permitindo assim a recuperação de micróbios dormentes. Etapas recentes de enriquecimento baseado em cultura foram incorporadas em estudos de sequenciamento molecular de microbiota para permitir a discriminação entre as assinaturas de acolhimento e expressão microbiana24,25,26e amplificar gêneros raros. Nosso passo de enriquecimento protocolar é o primeiro a ser aplicado a estudos de microbioma ocular e utiliza o enriquecimento para selecionar micróbios vivos, expandir o número de isolados escassos recuperáveis e talvez ressuscitar commensais viáveis, mas não cultivados. Além disso, nosso cotonete de olho feito em casa permite o swabbing direcionado da conjuntiva, reduzindo a contaminação da pele/pele circundante devido ao seu pequeno tamanho e forma afilada pontuda fina. A escolha da espessura e material do revestimento do cotonete é importante21. Este cotonete de olho feito em laboratório é revestido com uma fina camada de rebatidas de algodão nãotóxico, que previne a armadilha commensal esfregada dentro do material do cotonete, bem como, sendo preferível aos cotonetes de olho alginato de cálcio que podem ser citóxicos27. Testes longitudinais mostram que nosso método é reprodutível; com as bactérias dominantes recuperadas de cotonetes oculares, incluindo Streptococcus spp., Coagulase Negative Staphylococcus (CNS) e Corynebacterium spp. Esses resultados concordam com os achados publicados para o gene ocular anaeróbico facultativo dominante7,9,20 detectados por meio de métodos baseados em cultura ou baseados em imagens. Este método encontrou um espectro mais amplo de isolados na conjuntiva, incluindo Escherichia coli e Pseudomonas spp. Além disso, a identificação pelo MALDI-TOF MS permite melhor discriminação entre gêneros e espécies, como o grupo viridans de estreptococos e Aerococci spp. 19,28.
Três passos são fundamentais para maximizar o resultado: fabricação de cotonetes para os olhos, técnica de cotonete para os olhos e seleção isolada única da placa de cotonete dos olhos. Como discutido acima, uma camada plana muito fina de algodão é importante para a captura inicial de commensais da superfície ocular, bem como para sua posterior liberação na mídia de enriquecimento. Cotonetes espessos ou irregulares podem levar à seleção de contaminantes, bem como reter isolados dentro da ponta do cotonete. Em segundo lugar, a depressão contínua do globo ocular enquanto a limpeza é necessária para minimizar a contaminação das superfícies circundantes. A técnica ideal de limpeza envolve a inserção normal (90 graus) do cotonete no conjuntivo inferior medial fornix e pressão de swabbing constante juntamente com movimento contínuo lento. Finalmente, a placa do cotonete dos olhos deve ser monitorada diariamente para selecionar para isolados recém-aparecimento ou aqueles que crescem em uma taxa diferente, a fim de capturar totalmente o microbioma representativo.
Existem algumas limitações de protocolo que podem ser abordadas com uma compreensão clara dos resultados ou modificação do protocolo. Os resultados são uma medida de relativa abundância commensal viável, e não carga bacteriana conjuntiva real, com o objetivo de definir a comunidade commensal ocular. A abundância relativa e a diversidade têm sido utilizadas em nossos estudos para fins comparativos em ceratite bacteriana, bem como, para investigar a resposta imune inata em camundongos do tipo knock-out e selvagem12. Além disso, a identificação pelo MALDI-TOF MS depende de um banco de dados substancial28, fornecendo um resultado de "sem identificação" para perfis de espectros isolados desconhecidos, destacando a importância do uso de um banco de dados atual. Finalmente, este protocolo detecta apenas bactérias anaeróbicas aeróbicas e facultativas, mas sua estrutura é adaptável e pode ser construída para ajudar a definir o espaço microbiano ocular através da modificação de meios de enriquecimento, condições de crescimento de placas e meio de seleção. Alterando as condições de crescimento da placa mestre e do enriquecimento para anaeróbica, pode-se detectar outra commensal ocular comumente isolada, propionibacterium spp. ou outros anaerobes; embora, em nossas mãos não vimos quase nenhum crescimento anaeróbico.
Talvez, esta estrutura possa ser usada em conjunto com técnicas profundas de sequenciamento de DNA. Um grande obstáculo na identificação de micróbios via sequenciamento de DNA é a incapacidade de avaliar a viabilidade10. Este protocolo pode fornecer um método ortogonal modificando a mídia de enriquecimento e as condições de chapeamento para corresponder aos critérios de crescimento preferidos de um candidato (identificado por sequenciamento de DNA). Isso pode resultar em uma valiosa abordagem baseada em cultura para capturar commensais de bactérias viáveis, mas nãocultivaveis ou espécies presentes, mas de baixa abundância.
A definição da comunidade commensal ocular viável é essencial para examinar o perfil de expressão commensal ocular. Pesquisas amplas sugerem que os ácidos graxos de cadeia curta e os produtos microbianos modulam a resposta imune ocular3,29,30,31,32,33, e que sua ação ocorre localmente. Isso sugere que não só a produção distal, mas a produção local desses fatores é importante. Além disso, estados da doença, como doença do olho seco e diabetes, alteram o microbioma da superfície ocular4,6,33,34. Isso destaca a necessidade de um método que faça pontes de sequenciamento baseado em DNA, bem como abordagens baseadas na cultura para que o microbioma ocular viável em saúde e doença possa ser melhor definido.
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Disclosures
Nenhum conflito de interesses para revelar.
Acknowledgments
O financiamento do P30 DK034854 apoiou a VY, LB e estudos no Massachusetts Host-Microbiome Center e financiamento do NIH/NEI R01 EY022054 apoiado MG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 to 10 µl pipet tip | USA Scientific | 1110-300 | autoclave before use |
| 0.5 to 10 µl Eppendorf pipet | Fisher Scientific | 13-690-026 | |
| 1 ml syringe | Fisher Scientific | BD309623 | 1 syringe for each eye swab group |
| 1.5 ml Eppendorf tubes | USA Scientific | 1615-5500 | autoclave before use |
| 1000 µ ml pipet tip | USA Scientific | 1111-2021 | autoclave before use |
| 200 to 1000µl Gilson pipetman (P1000) | Fisher Scientific | F123602G | |
| 25 G needle | Fisher Scientific | 14-826AA | 1 needle per eye swab group |
| 3 % Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | S25359 | |
| 37 ° C Incubator | Lab equipment | ||
| 70 % Isopropanol | Fisher Scientific | PX1840-4 | |
| Ana-Sed Injection (Xylazine 100 mg/ml) | Santa Cruz Animal Health | SC-362949Rx | |
| BD BBL Gram Stain kit | Fisher Scientific | B12539 | |
| Bunsen Burner | Lab equipment | ||
| Clean paper towels | Lab equipment | ||
| Cotton Batting/Sterile rolled cotton | CVS | ||
| Disposable 1 ml Pipets | Fisher Scientific | 13-711-9AM | for Gram stain and catalase tests |
| E.coli | ATTC | ATCC 8739 | |
| Glass slides | Fisher Scientific | 12-550-A3 | for Gram stain and catalase tests |
| Ketamine (100mg/ml) | Henry Schein | 9950001 | |
| Mac Conkey Agar Plates | Fisher Scientific | 4321270 | store at 4 °C until ready to use |
| Mannitol Salt Agar | Carolina Biological Supply | 784641 | Prepare plates according to mfr's instructions, store at 4 °C for 1 week |
| Mice | Jackson Labs | C57/BL6J | |
| Petri Dishes | Fisher Scientific | 08-757-12 | for Mannitol Salt agar plates |
| RPI Brain Heart Infusion Media | Fisher Scientific | 50-488525 | prepare according to directions and autoclave |
| SteriFlip (0.22 µm pore size polyester sulfone) | EMD/Millipore, Fisher Scientifc | SCGP00525 | to sterilize anesthesia |
| Sterile Corning Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 430829 | anesthesia preparation |
| Sterile mouse cage | Lab equipment | ||
| Tooth picks (round bamboo) | Kitchen Essentials | autoclave before use and swab preparation | |
| Trypticase Soy Agar II with 5% Sheep's Blood Plates | Fisher Scientific | 4321261 | store at 4 °C until ready to use |
| Vitek target slide | BioMerieux Inc. Durham,NC | ||
| Vitek-MS | BioMerieux Inc. Durham,NC | ||
| Vitek-MS CHCA matrix solution | BioMerieux Inc. Durham, NC | 411071 | |
| Single use eye drops | CVS Pharmacy | Bausch and Lomb Soothe Lubricant Eye Drops, 28 vials, 0.02 fl oz. each |
References
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