Summary
该协议描述了一种新型基于rAAV的瞬时增强子 - 报告基因测定。该测定可用于在小鼠 大脑中诱导 增强子驱动的体内表达。
Abstract
增强子是多种转录因子的结合平台，可驱动组织和细胞类型特异性基因的特定表达模式。评估非编码DNA和各种染色质状态的多种方法已被证明可用于预测基因组中增强子序列的存在，但验证这些序列的活性并找到它们活跃的器官和发育阶段是一个劳动密集型过程。腺相关病毒（AAV）载体的最新进展使转基因能够广泛递送到小鼠组织，从而能够在不需要转基因动物的情况下进行 体内 增强子测试。该协议显示了在最小启动子的控制下表达EGFP的报告构建体如何用于研究小鼠大脑中候选增强子序列的活动模式，该启动子本身不会驱动显着表达。将AAV包装的报告构建体输送到小鼠大脑并孵育1-4周，之后处死动物，并在显微镜下观察脑切片。EGFP出现在测试增强子足以启动基因表达的细胞中，确定增强子在大脑中活跃的位置和发育阶段。标准的克隆方法、低成本的AAV包装以及扩展的AAV血清型和 体内 递送和标准成像读数的方法使其成为研究大脑中基因表达如何调节的可访问方法。
Introduction
增强子是作为转录因子结合位点的基因组顺式调控元件，可以以时空特异性的方式驱动靶基因的表达1，2。它们在不同的细胞类型、组织和发育阶段中具有差异活性，并且可以是疾病风险相关基因组变异的底物3，4。因此，了解增强子功能动态的需求对于基因组学中转化和基础科学应用的进展至关重要。在计算机中，增强子活性的预测可以作为产生增强子能力假设的极好资源5，6。这种预测的增强子活性可能需要额外的验证和询问，以充分了解功能活性。增强子报告基因测定已被证明在从细胞到动物的各种系统中具有此目的的价值7，8，9。为了在灵活且具有成本效益的瞬时体内环境中扩展这些研究，该协议描述了使用基于体内AAV的方法来测试推定的增强子序列，以了解它们在出生后小鼠大脑中驱动异位报告基因表达的能力。这一系列方法可用于询问单个候选序列或平行文库筛选，并且与基础和转化研究相关。
该方法在单个质粒中将推定的增强子候选DNA序列与报告基因（此处为EGFP）结合，在最小启动子的控制下，单独不驱动显着表达。将质粒包装成重组AAV（rAAV）并注射到动物模型中。虽然这里的应用是大脑，但各种rAAV血清型能够感染不同的组织类型，因此这种方法可以扩展到其他系统10。一段时间后，可以收集大脑并检测报告基因的表达。与对照组相比，强表达表明测试的候选序列能够“增强”基因的表达（图1）。这种简单的设计提供了一种简单明了的方法来测试 大脑中体内 增强子活性的序列。
除了测试序列的增强子能力外，该方法还可以与确定细胞类型增强子活性的技术相结合。在确定差异增强子活性的基于序列的方法中，在DNA和RNA测序之前对细胞类型特异性标记进行分选可以使研究人员确定不同的细胞类型是否显示出差异增强子活性，如Gisselbrecht等人11所述。在基于成像的方法中，将图像与细胞类型特异性标记物共标记，可以检查表现出增强子驱动荧光的细胞是否也显示感兴趣的细胞类型标记物12，13，14，15，16。增强子报告基因测定能够直接测试增强子中与风险相关的等位基因变异对增强子能力的影响。在全基因组关联研究（GWAS）中确定的绝大多数风险位点位于基因组的非编码区域17。这些风险位点的功能注释研究表明，很大一部分可能充当增强子18，19，20。MPRA在体内部署可以测试这些与风险相关的变异，以增强大脑中的活性12，21。最后，不同时间点的交付和收集可以提供对增强子活跃的发育阶段的见解。
增强子-报告质粒设计多种多样，可以定制以适应实验目标。有几种用于增强子研究的最小启动子的选择，例如人β珠蛋白最小启动子22 和小鼠Hsp68最小启动子23。已知这些启动子会驱动低水平的表达，除非与增强子元件耦合来激活它们。相反，组成型启动子元件驱动转基因的强表达，可用于阳性对照或在稳健表达的背景下测试增强子功能。组成型启动子的常见选择包括CAG，一种衍生自鸡β-肌动蛋白启动子和巨细胞病毒即时早期增强子24的杂交启动子24，或人EF1α25。由于已知增强子26双向工作，因此增强子相对于最小启动子的方向和位置是灵活的（图2A）。传统的增强子-报告基因测定将增强子置于启动子的上游，并且在文库递送中，包括报告基因下游的条形码序列，以将测序读数与测试的增强子27相关联。然而，增强子也可以放置在报告基因的开放阅读框架中，并作为它们自己的条形码序列，就像在STARR-seq28中所做的那样。这里描述的方案利用STARR-seq测定设计，将候选增强子序列放入报告基因的3' UTR中。虽然STARR-seq取向提供了更简化的克隆的好处，但与传统方法相比，它不太清楚，并且可能在构建体之间诱导可变的RNA稳定性。所描述的方法可以很容易地适应STARR-seq或常规取向，对克隆过程进行微小的改变，这些改动已在其他地方描述27，29。
可以采用不同的AAV递送方法来进一步定制该技术以适应实验目标（图2B）。直接颅内注射，在本协议中进一步描述，将高浓度的病毒直接输送到大脑30。这提供了以注射部位为中心的高转导效率，使其成为希望最大化组织区域内转导细胞密度的实验的绝佳技术。立体定向注射可以帮助标准化动物的注射部位，以实现可重复的局部转导。颅内注射在出生后早期动物中最直接。作为一种替代技术，全身注射可以使用具有能够穿过血脑屏障的血清型的AAV传递转基因31。尾静脉注射允许病毒在全身循环，从而可以在许多组织中广泛传递10。眶后注射是另一种全身注射技术，可将病毒从眼睛后面输送到眶后窦32。这为AAV从静脉系统到大脑提供了更直接的途径，导致大脑中转导细胞的浓度高于注射到更多外周血管中的浓度33。
这种技术的另一个灵活方面是读出方法。从广义上讲，选项可以描述为基于报告基因或基于测序（图2C）。将荧光报告基因（如GFP）掺入构建体的开放阅读框中，导致荧光蛋白在候选增强子驱动表达的任何转导细胞中的表达。标记和成像技术（如免疫组织化学）可实现信号放大。基于测序的读出技术涉及从组织收集的RNA中从递送的构建体中识别序列。通过量化最初递送的病毒DNA的数量，表达RNA与递送DNA的比较可用于确定测试的增强子序列能够在多大程度上驱动转基因的表达增加，例如，在大规模平行报告测定（MPRA）的背景下。MPRA提供了这些技术的强大扩展，可以同时测试多达数千种候选增强子的活性，并在基因组学研究中进行了广泛的描述12，27，34，35，36。通过批量而不是单独对候选增强子执行克隆、包装、递送和测序步骤，可以实现更高的通量筛选。
候选增强子选择提供了另一个灵活性的机会（图 2D）。例如，该测定可用于鉴定特定基因的增强子，确定感兴趣的非编码DNA区域的功能，或确定增强子活跃的特定细胞类型或发育阶段 - 所有这些都服务于基础科学和疾病研究的目标。通常，候选增强子 的选择是由增强 子活性的计算机预测驱动的。通常， 计算机 预测包括组蛋白修饰的 ChIP-seq，这些修饰指示可能的增强子，例如 H3K27ac37 和染色质可及性映射38。最后，一个不断增长的研究领域是对合成设计的增强子元件进行基于功能的筛选，从而能够研究增强子序列如何指导功能39 和设计具有特定性质的增强子40。
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Protocol
该协议已获得加州大学戴维斯分校机构动物护理和使用委员会（协议#22339）和加州大学戴维斯分校机构生物安全委员会（BUA-R1903）的批准。该协议已在出生后第0-1天在两性的C57BL / 6J小鼠上进行了测试。
1.将增强子候选序列克隆到AAV载体质粒中。
注意：给出了代表性的方案，但克隆策略具有高度的灵活性。
- 选择或设计报告器构造。在这里，增强子候选者入EGFP报告基因的3'非翻译区（UTR），其在Hsp68最小启动子的控制下表达。
注意：许多适用于该测定的MPRA质粒构建体已沉积到Addgene41 中，可用于研究用途。 - 设计PCR引物以扩增目标序列。在引物的5'末端加入适当的同源臂以进行Gibson克隆（~35 bp对应于插入位置上游的序列5'，前向引物的上链和反向引物的底链）。
注意：确保碱基引物序列长度为~18-24 bp，GC含量为~50%-60%，熔解温度约为57-59°C。 - 使用设计的引物从DNA样品中进行PCR。
- 如 表1所述，将PCR反应混合物组装在0.2 mL PCR管中。
- 将PCR反应混合物放在热循环仪上，并根据 表1中提到的程序进行循环。
- 通过在 0.7%-1% 琼脂糖凝胶上以 100 V 运行 5 μL PCR 产物 30-60 分钟来确认 PCR 的成功。检查预测长度的片段。
- 使用商业酶促反应净化柱试剂盒净化PCR产物。最后的洗脱液是克隆插入片段。
- 执行限制性酶切以在独特的克隆位点线性化AAV载体，从而将增强子插入载体中。
- 此处使用的增强子报告构建体的3' UTR中的克隆位点由独特的PacI和AscI限制性位点限定。根据以下参数执行酶切以在该位置线性化质粒（步骤1.4.2-1.4.4）。
- 使用 PacI 和 AscI 消化 1-10 μg 载体 DNA，具体取决于需要多少次克隆反应。根据制造商的说明使用提供的缓冲液制备反应。
- 在37°C孵育1-2小时以消化载体DNA。（如果在 50 μL 反应中消化超过 5 μg，则可能需要更长时间的孵育时间。
- 孵育1-2小时后，通过在65°C孵育20分钟来灭活酶。
- 使用0.7%-1%琼脂糖凝胶通过凝胶电泳分离限制性酶切酶片段，在100 V下运行30-60分钟。
- 切除线性化载体的条带，并使用商业凝胶提取试剂盒纯化。
- 执行吉布森克隆反应和转化
- 使用分光光度计确定纯化载体和克隆插入片段的浓度。
注意：DNA吸收260 nm的光，而污染物吸收230 nm和280 nm的光。260/230和260/280的高比率（>1.8）表明DNA高度纯化。 - 在 0.2 mL PCR 管中组装 Gibson 克隆反应：5 μL 2x Gibson 预混液、0.02-0.5 pmol DNA 片段，插入片段与载体的比例为 3：1（反应的最佳 DNA 浓度应根据经验确定）和无核酸酶水（使体积增加到 10 μL）。
- 在热循环仪中在50°C孵育吉布森反应20分钟。
- 使用分光光度计确定纯化载体和克隆插入片段的浓度。
- 转化重组缺陷（recA-）能力大肠杆菌（大肠杆菌）。
- 将水浴设置为42°C，并在冰上解冻市售的感受态细胞。
注意：此步骤可以在步骤1.4之前完成，并且细胞可以在制备和孵育吉布森反应时解冻。 - 将 30-50 μL 细胞分装到 2.0 mL 微量离心管中。将 2 μL 吉布森反应加入等分试样中，并用吉布森的身份标记试管。将细胞在冰上孵育30分钟。
注意：使用5-10 ng未消化的空载体作为阳性对照，水作为阴性对照。 - 在42°C水浴中对细胞进行热冲击30-45秒，立即将试管放回冰中，并让它们恢复5分钟。
- 在冰上时，加入 400-950 μL 市售回收培养基。
注意：这些实验中使用的回收培养基含有2%植物蛋白胨，0.5%酵母提取物，10mM NaCl，2.5mM KCl，10mM MgCl2，10mM MgSO4和20mM葡萄糖。 - 在冰上恢复后，通过在37°C下以250RPM的温和搅拌孵育30-60分钟来完全恢复细胞。
- 通过以 5，000 x g 离心 5 分钟来沉淀细胞并去除 400 μL 上清液，留下 ~50 μL 细菌进行铺板。
- 在选择性培养基上铺板并在37°C孵育过夜。
注意：这些实验中使用的选择性培养基含有1.0%胰蛋白胨，0.5%酵母提取物，1.0%氯化钠，1-2%琼脂，96-97%水和羧苄青霉素，浓度为100μg/ mL。始终使用重组缺陷的细菌菌株来克隆病毒质粒，因为病毒倒置末端重复序列（ITR）具有匹配的序列并且可以进行同源重组。然而，细菌的recA- 菌株仍然经历低水平的重组。这里使用的报告质粒是一种自互补的AAV，其中一个ITR的序列已被改变，不再与另一个ITR完全匹配。还建议在30°C下培养细菌，以进一步减慢同源重组的速度。
- 将水浴设置为42°C，并在冰上解冻市售的感受态细胞。
- 验证克隆并回收质粒。
- 使用正向和反向引物（材料表）制备PCR预混液，该引物退火到载体上，位于插入位置的两侧。将 10 μL 体积分装到 0.2 mL PCR 试管中。
- 在 14 mL 圆底管中，准备 5 mL 等分试样的抗生素选择性 LB 肉汤，每个通过 PCR 和阴性对照测试的菌落一个。
- 使用无菌牙签或移液器吸头挑选单个菌落，然后将菌落粗略地刮入一个PCR管的底部。
- 当菌落解离到 PCR 预混液中时，将牙签或牙尖放入其中一个 LB 等分试样中，并在 14 mL 管上标记 Gibson 反应和 PCR 管编号。
- 将菌落PCR反应置于热循环仪上，并按照 表2中所述的程序循环。
- 在设置为37°C和180RPM的振荡培养箱中孵育用牙签或移液器吸头接种的5mL液体培养物。
- 在100V下在0.7%-1%琼脂糖凝胶上运行菌落PCR反应30-60分钟，并在凝胶文档成像系统中可视化条带。
- 丢弃未显示预测 PCR 条带的 5 mL 培养物。
- 对于每个成功整合的克隆，让 5 mL 培养物生长过夜，然后使用商业试剂盒从 4.5 mL 进行质粒小型制备。保留0.5mL的液体培养物，并在-80°C下作为甘油储备液保存。
- 使用Sanger测序42确认质粒中包含的转基因没有不需要的突变。
- 确认报告构建体成功克隆后，使用保存的甘油原液接种5mL起始培养物，并在30°C和180RPM的振荡培养箱中生长8-16小时。
- 一旦肉汤浑浊，将发酵剂在250-300mL新鲜选择性LB肉汤中稀释1，000倍，并在30°C和180RPM的振荡培养箱中孵育至少过夜。然后使用商业质粒超大试剂盒纯化质粒。
注意：与37°C相比，细菌在30°C下会生长得更慢，但这是培养大型培养物时减缓自发重组速率的最佳温度。 - 执行 XmaI 摘要以使用步骤 1.4.2-1.4.5 测试 ITR 的重组，替换 XmaI 而不是 PacI 和 AscI。在凝胶文档成像系统上可视化条带。
注意：具有两个ITR的rAAV质粒将在此消化后在凝胶上产生两条条带：一条是rAAV基因组的长度，另一条是质粒骨架其余部分的长度。如果只有一个条带，则ITRs经历了同源重组，rAAV质粒将无法包装病毒颗粒。此处描述的rAAV质粒骨架经过精心设计，使得XmaI位点仅出现在ITR中。如果增强子候选插入片段还包含任何 XmaI 位点，请相应地更新预测条带结果和分析。
2. 获得包装好的 rAAV。
- 使用包装的rAAV（专业或内部）进行本研究的实验。
注意：包装 rAAV 有多种选择。rAAV可以在公司或大学核心设施中进行专业包装。rAAV也可以使用不同的技术在内部包装，这些技术的复杂性和对专用设备的需求不等43，44。 主要关注的是获得高质量的载体，并且感染滴度已确定为高度确定。专业封装和内部封装的rAAV都用于本研究中描述的不同实验。
3.颅内注射rAAV包装的质粒到新生小鼠中。
- 准备rAAV混合物以进行交付。
- 如果目的是比较不同增强子报告病毒之间的表达模式，则通过稀释所有病毒以匹配浓度最低的病毒来平衡要比较的所有病毒的滴度。
- 将2：1或3：1比例的增强子报告病毒和组成型表达的对照报告病毒混合在一起，并加入少量（0.06%终浓度）的Fast Green染料。
注意：Fast Green是一种染料，广泛用于实验动物的注射，包括AAV，以在手术期间和之后立即可视化注射部位45，46，47，48。虽然这是一个重要的质量保证步骤，但添加染料可能会干扰转导。在某些情况下，重新考虑注射染料的使用对于方案优化可能很重要。组成型控制病毒对于比较独立注射绝对至关重要。病毒注射在动物与动物之间转移的位置和程度会有所不同。本构控制将能够从分析中排除失败的注射，并为病毒递送变异的标准化提供标准。 - 打破由μL刻度毛细管制成的无菌拉动玻璃移液管的尖端，方法是将其轻轻刺穿通过浸泡在70%乙醇中消毒的精致湿巾并使其完全干燥。然后将拉动的玻璃移液器插入吸引器组件，该组件由一个用于施加压力的装置连接到 15 英寸长的橡胶管，末端是用于固定微毛细管移液器的橡胶垫圈。
注意：“施加压力的装置”可以是注射器或吹嘴。如果要使用注射器，则需要第二个人通过注射器施加压力，而实验者一只手操纵移液管，另一只手操纵动物。如果使用吹嘴，使实验者能够精细控制动物和移液器的位置以及施加到注射器的压力，则需要格外小心以避免病毒污染。 - 通过吸气器组件施加负压，将少量（~0.2-0.5 μL）矿物油吸入玻璃移液器中。
注意：此步骤对于提供屏障以防止雾化病毒颗粒污染吸气器组件非常重要。 - 将准备好的吸气器组件放在一边，并将病毒放在冰上，直到准备注射。
- 在部分浸没在冰中的干燥塑料盘中冷冻麻醉新生小鼠，直到踏板撤回反射停止（~5分钟）。确保小鼠不与冰直接接触。
- 通过吸液器组件使用负压将病毒混合物吸入拉动的玻璃移液管中，直到弯月面超过2 μL刻度线。
- 将鼠标从冷室中取出并将其放在台面上。定位双侧注射部位在λ和前膛之间的中间以及矢状缝和每只眼睛之间的中间。用酒精湿巾对这两个区域进行消毒。
- 使用拉动的玻璃移液管刺穿新生小鼠的头骨，并在针头进入大脑时通过吸引器组件轻轻施加正压。观察病毒混合物的半月板。当移液器的尖端到达侧心室时，对施加的压力的阻力将降低。分配 1 μL 病毒，取出移液器，然后对另一个侧心室重复此操作。
- 将鼠标放在加热垫或加热室上以恢复。一旦清醒并活跃，将动物放回其家笼。
4.收集组织并进行免疫组织化学。
- 在病毒转导后足够时间后，麻醉小鼠并通过经心灌注处死。
注意：许多实验，包括此处显示的代表性结果，允许病毒在 4 周或更长时间内进行转化。然而，自互补的AAV最早可以在7天12表现出强烈的表达。可能需要根据特定的实验技术和目标优化所需的潜伏期。- 准备带有静脉输液管和 25 G 针头的蠕动泵。
- 准备 1x PBS 和 4% 多聚甲醛 （PFA） 并将它们放在冰上。
- 将管子的进气端放在冰冷的 1x PBS 中。设置流速（P7小鼠为2.5mL / min，P28小鼠为3.5 mL / min）并运行泵，直到缓冲液完全通过管道并清除气泡。将针头放在一边，直到准备好灌注。
- 在通风橱内，将少量异氟醚移液到落罐室底部的纸巾上。将先前注射的鼠标放在纸巾上方的炉排上，确保它不会与异氟醚直接接触。密封腔室以麻醉小鼠。等待~5分钟，然后打开腔室并检查踏板撤回反射。一旦动物失去知觉，继续。
注意：在整个灌注过程中，小鼠应保持使用带有鼻锥的异氟醚，以防止恢复意识。 - 用手术剪刀打开小鼠的腹部和胸部，取出肋骨，露出心脏。
- 用一把虹膜微型剪刀在小鼠右心房做一个小切口，将静脉注射针插入左心室，激活蠕动泵。
- 用冰冷的 1x PBS 灌注动物，直到从右心房切口流出的血液清除。清除血液组织非常重要，因为红细胞具有自发荧光，血管可能会损害对表达报告细胞进行成像的能力。
- 暂停蠕动泵并将进气管从 PBS 移动到 4% PFA。重新激活泵并灌注 1 mL/g 体重，成年小鼠为 ~25 mL。
注意：注视震颤应该是可观察到的，并且鼠标的身体应该变硬。
- 解剖和后期修复大脑。
- 用手术剪刀取下鼠标的头部。
- 使用小手术剪刀，从颅底开始，沿着头部中线切开一个切口，然后拉回皮肤和下面的组织以露出颅骨。
- 使用虹膜剪刀，小心地剪断颅骨后部，从大孔开始，沿着矢状缝线向上，直到嗅球通过。
- 将剪刀插入嗅球上的颅骨，并在头骨上做两个水平切口。在枕骨上做一对类似的水平切口。水平和中线切口在头骨顶部形成一对门状襟翼。
- 剥开颅骨瓣以完全暴露大脑。用一把镊子从头骨上切断嗅球，切断颅神经，将大脑从头骨中解放出来。
- 将大脑放入 15 mL 锥形管中，其中 3-5 mL 的 4% PFA 在 PBS 中。修复后 6 小时至过夜。不要过度固定组织。
- 准备大脑进行冷冻切片。
- 将固定的大脑转移到新的 15 mL 锥形管中，在 PBS 中加入 12-14 mL 的 30% 蔗糖进行脱水。在4°C下孵育，直到大脑沉入管底部（2-3天）。
- 将固定和脱水的大脑浸入最佳切割温度 （OCT） 化合物中 15 mm x 15 mm x 5 mm 冷冻模具中。添加OCT，直到大脑完全覆盖。
- 将冷冻剂放在干冰块上，并将样品冷冻在OCT固体块中（~5分钟）。
注意：OCT块可以在-80°C下储存数月至数年。 - 用样品名称和大脑的方向标记冷冻体。
- 使用低温恒温器切片机获得冠状切片。
- 用铅笔在OCT块上标记大脑的方向，并从低温恒温器内的冷冻体中取出该块。
- 放置OCT块，使大脑的方向是嗅球朝向低温恒温器的叶片，并用一些新鲜的OCT将块粘附在低温恒温器的物体支架上。
- 一旦冷冻到位，开始按照步骤4.4.4-4.4.6通过块切割50μm切片。
- 请勿使用防侧倾板。切片在切割时会卷曲成紧密的卷状，并会聚集在块的顶部或落入收集托盘下方。
- 在前几个切割中观察块的形状。通过块进行垂直切割，在开始切割时产生均匀的面。如果需要，使用样品调整臂调整角度。
- 当嗅球可见时，请密切注意部分的形状。如果一个看起来比另一个大，则切口相对于大脑成一定角度，并且有必要使用样本调整臂将大脑的方向拉直到刀片上。
注意：如果直接切割，皮层应同时开始出现在每个嗅球上方。 - 一旦嗅球被切片并且嘴部脑组织可见，将切割厚度减小到30-35μm并开始收集浮动部分。按照步骤4.4.8-4.4.13对大脑进行切片。
- 从块和对象支架上刷下所有先前的部分，使它们落入收集托盘中。将它们刷到托盘的一侧，并将它们分开。如果堆太大，则清空托盘。
- 将 1 mL PBS 分配到 24 孔板的每个孔中。为每个大脑标记 1 行。
- 切6个冠状部分。使用冷镊子检索切片并将它们排列在低温恒温器载物台上。重复此步骤 2 或 3 次，将 6 个部分的组分开。
- 用PBS弄湿000号画笔，然后在不起毛的纸巾或纸巾上擦去多余的液体。使用画笔轻轻地拾取每个部分，一次一个，并将其放入 24 孔板的适当孔中。
- 将切片组中的 6 个部分之一放入 24 孔板一行的 6 个孔中的每一个中。这确保了每个孔都包含跨越大脑切片区域的代表性部分。
- 继续以6人为一组进行切片，直到大脑皮层的尾端被切片。
- 为了储存，用封口膜密封24孔板并储存在4°C。
注意：切片在4°C下可稳定保存1-2个月。 含有0.1%叠氮化钠的PBS溶液可用于抑制细菌生长并延长切片的保质期。但是，如果切片要储存超过2个月，则应将其置于冷冻保护剂溶液中并在-20°C下冷冻以获得最佳效果。
- 进行免疫组化以报告基因信号扩增。
注意：除抗原修复外的所有步骤都应在轨道振荡器上使用温和至中度搅拌（~100 RPM）进行。为了保留对照报告基因（mRuby3）的天然荧光，所有步骤都应尽可能避光。- 如 表3所述准备必要的缓冲液。
- 准备一个新的24孔板，每个被染色的大脑有一排。在第一列孔中，向每个孔中加入 1 mL PBS。
- 使用 000 号画笔，将原始收集孔中的 1 孔切片轻轻转移到新的 24 孔板中的新鲜 PBS 中，以便快速冲洗以去除残留的 OCT 化合物。
- 将 1 mL ARB 添加到 24 孔板中的下一个孔中，并将部分转移到该孔中。在60°C的烤箱中孵育1小时。
- 让板在室温（RT）下冷却20分钟。
- 将 1 mL PB 加入下一个孔中，并将切片转移到该孔中。在室温下孵育20分钟。
- 向下一个孔中加入 500 μL BB，并将切片转移到该孔中。在室温下孵育1小时。
- 向BB中加入2 mL WB，然后移出~2 mL溶液并丢弃，将稀释的BB溶液留在孔中。重复上述步骤，直到这些部分清晰可见。
- 在BB中稀释一抗（鸡IgY抗GFP，1：1000）。将 350-500 μL 一抗溶液加入下一个孔中，并将切片转移到该孔中。用封口膜密封板并在4°C孵育过夜。
- 像以前一样用WB稀释BB，直到切片清晰可见。
- 向下一个孔中加入 1 mL WB，并将切片转移到该孔中。在室温下孵育20分钟。
- 取出 ~800-900 μL 缓冲液并丢弃。加入 1 mL 新鲜 WB 并孵育 20 分钟。再更换 1 mL WB 4 次，共洗涤 5 次，每次 20 分钟。
- 在BB中稀释二抗（驴抗鸡Alexa Fluor 488偶联，1：500）。将 350-500 μL 二抗溶液加入新孔中。在室温下孵育45分钟至1小时。
注意：这是第七孔，因此如果对来自2个以上大脑的切片进行染色，此时将需要新板。 - 像以前一样用WB稀释BB，并将切片转移到装有1 mL WB的新孔中。像以前一样清洗切片20分钟3次。
- 在PBS中制备DAPI的工作溶液（终浓度0.04-0.8μg/ mL）。保护溶液避光。
- 将 1 mL DAPI 溶液添加到下一个孔中，并将切片转移到该孔中。在室温下孵育~5分钟。
- 将切片移回WB，并使用000号画笔轻轻地安装在显微镜载玻片上。让载玻片风干。
- 用适当的封片剂涂抹盖玻片。让载玻片在室温下在黑暗中固化过夜。
5.成像和分析脑组织切片以增强子活性。
- 使用低放大倍率（5倍）物镜记录跨越大脑部分的荧光图像。
- 定位注射部位并根据红色荧光细胞的密度和强度评估病毒转导的程度。注意比较相似转导的动物。
- 如果需要，可以使用更高放大倍率的物镜（≥25x）记录详细的荧光图像。
注意：始终确保对采集参数使用相同的设置，例如激发光强度、滤光片和要比较的样品之间的曝光时间。 - 使用图像分析软件处理图像。
注意：可以在任何图像分析软件包中进行处理。以下步骤是使用 ImageJ 的开源 FIJI 分布确定序列是否在报告器构建上下文中充当增强子（是或否问题）的建议。在比较增强子变体之间的活性程度时，更深入的光度测定可能是合适的。来自不同样品的图像应始终一致地处理，以便进行比较。- 应用过滤器以减少噪音。在斐济，选择“ 处理噪点” 菜单下的“去斑点”选项>。
注意：这是一个 3 x 3 中值滤波器。 - 按照步骤5.4.3-5.4.6减去背景荧光。
- 分离多通道图像的通道。在斐济，选择选项 分割通道 在下面 图像>颜色 菜单。
- 使用矩形或圆形选择工具在没有任何荧光细胞的图像区域中绘制一个小形状，并使用 “分析>测量”测量背景的平均像素强度。重复此操作以对多个区域进行采样。
注意：确保在“分析>设置测量”菜单中选择了“平均灰度值”。 - 平均 5-8 个背景区域的平均灰度值并删除小数点。使用 “数学运算>>减去”从图像中的每个像素中减去此值。
注意：四舍五入到最接近的整数可能会高估要减去的背景。简单地删除小数点更为保守。例如，6.4 将向下舍入为 6，但 6.5 也应向下舍入为 6，以避免从每个像素中减去 0.5 个单位的实际信号的风险。 - 如果需要，将通道合并回多通道图像。在斐济，使用 图像>颜色>合并频道。
- 将任何重叠的图像拼接在一起。在斐济，使用插件>拼接>网格/集合拼接。
- 调整亮度和对比度。在斐济，使用 图像>调整>亮度/对比度。
注意：始终对要比较的每个图像使用相同的最小值和最大值。 - 按照步骤5.4.10-5.4.12计算绿色荧光细胞的数量。这些是候选增强子序列能够驱动报告基因表达的细胞。
- 首先隐藏绿色通道，然后使用自由形式的选择工具在大脑区域周围绘制一个表达红色荧光的形状。使用斐济的 测量 函数，测量该区域中红色通道的面积、综合密度和平均灰度值。
- 使用多点选择工具，计算该区域中的绿色像元数。
- 通过红色通道的积分密度对绿色像元的数量进行归一化。局部红色通道亮度是病毒暴露程度的代理测量，可以比较不同转导动物之间的增强子活性。
- 应用过滤器以减少噪音。在斐济，选择“ 处理噪点” 菜单下的“去斑点”选项>。
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Representative Results
使用这些方法，测试了基因CACNA1C19，49，50的精神风险相关第三内含子中的915 bp序列在出生后小鼠大脑中的增强子活性。该序列是在以精神和神经风险SNPs 12为中心的345个候选增强子序列的MPRA中发现的，这里将表征实验描述为一般示例。在Hsp68最小启动子和单个候选增强子序列的控制下，在P0上注射AAV9构建体，包装为含有EGFP的自互补载体51的AAV9构建体（图3A）。向额外的小鼠注射含有阴性对照序列的构建体，该结构被预测为没有调节活性（图3B）。这些构建体的病毒滴度归一化为6.85 x 1010 vg/mL。所有注射的小鼠在组成型CAG启动子的控制下，与含有mRuby3的AAV9包装结构体共同注射，以可视化成功转导的区域并控制该部位的潜在变异性和感染的传播。在出生后第（P）28天收集大脑进行免疫组织化学和成像。这些实验证实，CACNA1C中的这种候选增强子区域驱动了P28小鼠大脑中EGFP的表达（图3A），而阴性对照序列则没有（图3B）。这些结果证明了增强子-报告基因测定在小鼠大脑中的应用，能够在使用传统体外模型无法概括的条件下对增强子进行体内研究。
这些方法还可用于使用基于 AAV 的递送方法（例如在 MPRA 中）测试活性的候选增强子序列库。基于文库的报告基因在不同滴度下的表达代表性图像证明了该测定的灵活性以及病毒滴度对转导效率的影响。高滴度（图4A）与低滴度（图4B）病毒制剂导致转导细胞数量的差异，如CAG启动子驱动的阳性对照mRuby3表达和出生后小鼠大脑中候选增强子文库产生的EGFP表达所证明的那样。在某些情况下，高滴度和宽转导或低滴度和稀疏转导可能是首选。
图 1：协议概述。 该测定的关键要素包括候选增强子元件、最小启动子、报告基因，以及根据检测设计，用于唯一标记的条形码序列。将这些元件克隆到AAV质粒骨架中并包装成AAV。病毒被输送给动物并孵育数天或数周。最后，收集感兴趣的组织，并通过成像或测序确定增强子活性。与组成驱动相反，增强子驱动的转基因表达可以产生具有细胞类型、区域和时间特异性的表达。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：检测设计的灵活性。 （A）质粒取向可以将增强子放置在最小启动子的上游或报告基因的下游，如STARR-seq28所示。对于基于序列的读数，条形码包含在报告基因的下游，或者增强子可以在第二个方向上用作自己的条形码。（B）常见的病毒传递到大脑的技术包括颅内注射，眶后注射或尾静脉注射，这可能导致不同组织中转导细胞的密度不同。（C）读数可以基于测序或基于成像。在基于测序的读数中，增强子活性由RNA序列相对于输入DNA序列的相对增加（控制AAV递送）来定义。在成像读数中，在增强子活跃的地方，报告基因的表达增加。（D）强调了精神风险相关基因CACNA1C中潜在的内含子增强子。在上图中，选择了一个广泛的区域，该区域显示与GWAS测试的性状以及通过PLAC-seq20与CACNA1C启动子的相互作用的强烈关联。在插图中，确定了较小的候选区域，这些区域在序列水平上在进化上是保守的，位于开放染色质区域，并显示出指示增强子的表观遗传标记。请点击此处查看此图的大图。
图 3：CACNA1C 中的增强子驱动 P28 小鼠大脑中的 EGFP 表达。 （A）在P0处用增强子-报告构建体（scAAV9-Hsp68-EGFP-CACNA1C_3）颅内注射的小鼠和组成型表达的注射对照（AAV9-CAG-mRuby3）在P28处的皮层中下层显示增强子驱动的EGFP表达。（B）在P0注射具有阴性对照构建体（scAAV9-Hsp68-EGFP-NEG_4）和注射对照的小鼠在P28处未显示EGFP的表达。全脑图像以5倍放大倍率拍摄，插图显示盒装区域的放大视图。 请点击此处查看此图的大图。
图4：AAV递送的不同滴度的增强子-报告文库显示小鼠大脑中的活性。（A）商业包装的高滴度AAV-PHP.eB候选增强子库驱动P7小鼠大脑中广泛的EGFP表达。（B）从包装细胞的条件培养基中沉淀的较低滴度AAV9候选增强子库驱动P7小鼠大脑中稀疏的EGFP表达。图像以5倍放大倍率拍摄。 请点击此处查看此图的大图。
| PCR反应混合物 | |
| 5x 反应缓冲液 | 10 微升 |
| dNTP | 每个最终浓度为 200 μM |
| 克隆引物 | 每个最终浓度为 0.2 μM |
| 模板脱氧核糖核酸 | 50 纳克 |
| 高保真聚合酶 | 终浓度为 0.02 U/μL |
| 无核酸酶水 | 达到 50 μL 最终反应体积 |
| 热循环条件 | |||
| 以下 30 个循环： | 笔记 | ||
| 步 | 温度 | 时间 | |
| 变性 | 98 °C | 10 秒 | |
| 退火 | 60 °C | 20 秒 | 最佳温度可能因引物而异。 |
| 扩展 | 72 °C | 30 秒 | 最佳温度和持续时间可能因聚合酶而异。 |
| 最终延期 | 72 °C | 2 分钟 | 最佳温度和持续时间可能因聚合酶而异。 |
| 拿 | 4°C | ||
表1：PCR反应混合物和热循环条件。
| 热循环条件 | |||
| 以下 30 个循环： | 笔记 | ||
| 步 | 温度 | 时间 | |
| 细胞裂解 | 98 °C | 5 分钟 | |
| 变性 | 98 °C | 10 秒 | |
| 退火 | 55 °C | 15 秒 | 最佳温度可能因引物而异。 |
| 扩展 | 72 °C | 30 秒 | 最佳温度和持续时间可能因聚合酶而异。 |
| 拿 | 4°C | ||
表2：菌落PCR的热循环条件。
| 用于免疫组化的缓冲液 | |
| 缓冲区 | 组成 |
| 1x 公共广播公司 | 137 毫米氯化钠， 2.7 毫米氯化钾， 10 毫米氢氧化钠 2HPO4， 1.8 毫米钾2PO4 |
| 1x 柠檬酸盐抗原修复缓冲液 （ARB）， pH 6.0 | 专有，见材料表 |
| 透化缓冲液 （PB） | 1x PBS + 0.5% 海卫一 X100 |
| 洗涤缓冲液 （WB） | 1x PBS + 0.1% 海卫一 X100 |
| 阻塞缓冲液 （BB） | 白效 + 5% 牛奶 |
表3：免疫组化缓冲液。
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Discussion
该协议描述了一种基于rAAV的方法，用于在出生后小鼠大脑中部署增强子驱动的转基因。在这个通用的方案中，将候选增强子、最小启动子、报告基因和可选的条形码序列克隆到 AAV 质粒骨架中。这些实验可以用单个候选增强子序列或多个序列并行完成。质粒被包装成rAAV并输送到出生后的小鼠大脑。在一段时间允许病毒转导后，收集大脑并进行成像以进行报告基因表达。包括一种组成型表达的报告病毒（CAG-mRuby3）作为注射对照。使用该测定，增强子元件被证明可以驱动小鼠大脑中EGFP的转录，从而证明增强子在 体内的活性。
该测定故障排除和优化的主要目标包括病毒滴度、注射技术和转导时间框架。不同的病毒滴度对转导细胞的密度有很强的影响。虽然对于大多数研究来说，更高的转导效率可能更可取，但最佳转导水平高度依赖于实验目标。颅内注射提供高密度的转导细胞，但在注射部位可能更集中，尽管感染的传播可能取决于病毒血清型和动物的年龄52。眶后注射可能显示转导细胞在整个大脑中的分布更均匀，但不太可能产生任何高度感染的区域。尾静脉注射可以更有效地转导大脑以外的其他组织，但可能会使大脑中转导细胞的密度更低。同样，病毒在大脑中转导的各种时间框架可以用于不同的目的。强烈的scAAV表达最早可以在颅内注射后7天在大脑中发生，尽管更常用28天或更长时间并产生强烈的表达。由于增强剂的活性可能具有时间特异性，因此在确定研究设计时考虑测试增强剂的预测活性非常重要。
这些方法存在一些限制，根据实验目标，这些限制可能会使其他选项成为更合适的选择。由于AAV在基因组中的整合度较低，因此组织在成熟时最有效地转导，并且有丝分裂后细胞的密度很高，因为大量持续的细胞分裂会降低表达转基因细胞的密度。对于将转基因病毒递送到不太成熟的模型，例如仍在生长的组织，慢病毒可能是一个更合适的选择，因为它们整合到基因组中，并且将被转导增殖细胞的所有子细胞遗传。此外，虽然这里描述的报告测定是一种广泛用于顺式调节活性功能研究的技术，但它不能提供调节元件在其天然环境中如何起作用的完整图片。例如，该测定不提供基因组中调控元件可能靶向哪些基因的信息。然而，如果已知增强子的靶基因，则可以利用该信息来确定在该测定中显示表达的细胞类型是否与已知表达增强子靶基因的细胞类型相同，这将为结果的解释提供高生物学有效性。该测定也可能不能完全概括动物的周围基因组序列或正常的生物学和行为活性可能对测试的调节元件的活性产生的影响。最后，该协议描述了STARR-seq报告基因测定设计，其中候选增强子元件在ORF中报告基因的下游克隆，与启动子的上游相反，就像在传统的报告基因克隆方向中一样。由于 RNA 结合蛋白基序、交替剪接位点或可变 GC 含量 36，53 等因素，在报告基因的 ORF 中包含长可变序列可能会导致 RNA 稳定性降低，并且在分析 STARR-seq 数据54，55 时，已经开发了统计方法来解释基于序列的偏差。尽管有这些考虑，STARR-seq MPRA近年来已被广泛用于成功识别顺式调控元件56，57，58，59。这里描述的方法可以很容易地适应于传统的MPRA方向。
增强子的细胞类型特异性使该测定成为驱动体内目标基因的细胞类型特异性表达的有力工具。当前用于所需基因的细胞类型特异性表达的技术可能受到条件表达构建体的可用性的限制，或者需要产生新的转基因小鼠系。使用基于rAAV的增强子驱动系统，通过使用经过验证的细胞类型特异性增强子或启动子来驱动表达13，14，15，可以以时空特异性方式表达目的基因。该技术的最新发展表明，将细胞类型特异性增强子与rAAV血清型与目标细胞或组织的嗜性相结合，可以显示出与转基因动物模型相似的转基因表达特异性60。这为动物模型中体内转基因表达的序列筛选和特异性诱导提供了一种廉价、快速且潜在的高通量方法。
这项技术也具有治疗潜力。临床研究发现，在仅存在缺陷拷贝或基因未以足够的速率转录的情况下，基于rAAV的体内转基因递送可以诱导基因健康拷贝的表达61，62，63。驱动增强子元件的选择有可能实现广义递送，但以细胞类型特异性的方式进行表达诱导。最后，通过rAAV传递转基因也带来了显着的好处;AAV的免疫原性低于通常用于转基因递送的其他病毒64，使其成为用于临床使用的潜在安全病毒载体。
基于体内rAAV的增强子-报告基因测定的具体部署是可定制的，并且可以修改以适应一系列实验目标。通过选择具有细胞类型或时空特异性的AAV血清型或增强子，可以靶向不同的组织和细胞。可以在体内递送一个到数千个增强子-报告构建体，并且可以使用许多基于成像和测序的读数来测定活性，正如使用这种方法的一组新兴研究所显示的那样 15，16，65，66，67，68.构建体设计和交付的一系列选项使该技术能够针对转化和基础科学中的各种用途进行修改，使其成为基因组学和神经科学研究的强大新工具。
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Disclosures
作者声明没有相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
测序在加州大学戴维斯分校DNA技术核心进行。我们感谢加州大学戴维斯分校林田实验室对rAAV包装的培训，并慷慨地赠送给我们AAV助手和代表/帽质粒。这项工作得到了NIH / NIGMS R35GM119831的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Citrate Buffer | Sigma-Aldrich | C9999-1000ML | |
| 5'-gatcactctcggcatggac-3' | Integrated DNA Technologies | N/A: Custom designed | Forward primer for verifying clones after transformation. These primers are specific to the vector used and were designed for the specific vector used in our experiments. |
| 5'-gatggctggcaactagaagg-3' | Integrated DNA Technologies | N/A: Custom designed | Reverse primer for verifying clones after transformation. These primers are specific to the vector used and were designed for the specific vector used in our experiments. |
| Agarose | VWR | VWRVN605-500G | |
| Aspirator tube assemblies | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | for mouth-driven delivery of rAAV |
| Bacteriological petri dishes | Thermo Fisher Scientific | 08-757-100D | |
| Carbenicillin | Sigma-Aldrich | C1389-5G | |
| Chicken IgY anti-GFP | Thermo Fisher Scientific | A10262 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM900 | The images were taken on the LSM800 model, but Zeiss launched the LSM900 model in recent years to replace LSM800. |
| Conical centrifuge tubes 15 mL | Thermo Fisher Scientific | 12-565-269 | |
| Cryomolds | Thermo Fisher Scientific | NC9806558 | These molds are suitable for P28 mouse brain. Other sizes may be more suitable for larger or smaller tissues. |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-10MG | |
| Dissecting scissors, 4.5" | VWR | 82027-578 | |
| Donkey anti-chicken AlexaFlour-488 | Jackson ImmunoResearch | 703-545-155 | |
| Dulbecco's PBS 1x | Thermo Fisher Scientific | MT21031CV | |
| Eppendorf Microcentrifuge tubes 2.0 mL | Thermo Fisher Scientific | 22431048 | |
| Falcon round-bottom tubes 14 mL | Thermo Fisher Scientific | 352059 | |
| Fast Green dye | Grainger | F0099-1G | |
| Fine detail paint brush set | Artbrush Tower | B014GWCLFO | |
| Gibson Assembly Master Mix | NEB | E2611S | |
| Glass capillary tubes | Drummond Scientific Company | 5-000-2005 | |
| HiSpeed Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12663 | Commercial plasmid maxi prep kit |
| HyClone HyPure Molecular Biology Grade Water | VWR | SH30538.03 | |
| IV butterfly infusion set with 12" tubing and 25G needle | Thermo Fisher Scientific | 26708 | |
| Kimwipes | Kimberly Clark | 34155 | Lint-free wipe |
| LB Agar | Thermo Fisher Scientific | BP1425-500 | LB agar pre-mix for selective media |
| McPherson Vannas iris scissor | Integra LifeSciences | 360-215 | |
| Mineral oil | Sigma Life Science | 69794-500ML | |
| NEB Stable Competent E. coli | NEB | C3040I | |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up | Takara | 740609.5 | Kit for enzymatic reaction cleanup and gel extraction |
| OCT medium | VWR | 25608-930 | |
| Orbital shaker | Cole Parmer | 60-100 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | |
| PCR strip tubes 0.2 mL | VWR | 490003-692 | |
| Peristaltic pump | Gilson | F155005 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) 10x | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | |
| Phusion Hot Start II High Fidelity DNA Polymerase | Thermo Fisher Scientific | F549L | |
| Powdered milk | Sunny Select | ||
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36934 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28106 | |
| rCutSmart Buffer | NEB | B6004S | Buffer for restriction digest with PacI, AscI, and XmaI |
| Restriction enzyme: AscI | NEB | R0558L | |
| Restriction enzyme: PacI | NEB | R0547L | |
| Restriction enzyme: XmaI | NEB | R0180L | |
| SOC outgrowth medium | NEB | B0920S | Recovery medium after transformation |
| Sucrose (RNase/DNase free) | Millipore Sigma | 033522.5KG | |
| TAE buffer | Apex | 20-194 | |
| Transfer tubing | Gilson | F1179941 | For peristaltic pump |
| Triton X100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System | Thermo Fisher Scientific | A1460 | Plasmid mini prep kit |
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