Summary
以下方案描述了用于蠕虫培养、荧光成像和自动图像处理的高通量工作流程的开发和优化，以量化聚谷氨酰胺聚集体，以评估蛋白质平衡的变化。
Abstract
多年来，神经退行性蛋白质构象疾病（PCD）患病率的上升引起了人们对这一主题的极大兴趣。这种日益增加的关注要求多样化和改进能够重现PCD患者观察到的疾病表型的动物模型。虽然小鼠模型已被证明是无价的，但它们价格昂贵，并且与费力，低通量的方法有关。使用 秀丽隐杆线虫 模型来研究PCD是合理的，因为它相对容易维护，成本低，生成时间快，允许高通量应用。此外， 秀丽隐杆线虫 和人类基因组之间的高度保守使该模型成为一种宝贵的发现工具。表达荧光标记的组织特异性聚谷氨酰胺 （polyQ） 束的线虫表现出以荧光病灶为特征的年龄和 polyQ 长度依赖性聚集。这些报告员通常被用作代理来监测组织中蛋白质平衡的变化。手动聚合定量非常耗时，限制了实验通量。此外，手动病灶定量可能会引入偏差，因为总体识别可能非常主观。本文对由蠕虫培养、图像采集和数据处理组成的方案进行了标准化，以支持使用表达肠道特异性 polyQ 的秀丽隐杆线虫 进行高通量聚合定量。通过使用图像分析软件CellProfiler实现基于 秀丽隐杆线虫的图像处理管道，该方法已经过优化，可以分离和识别单个蠕虫并枚举它们各自的聚集体。虽然自动化的概念并非完全独一无二，但需要标准化这些程序以实现可重复性，消除手动计数的偏差并提高吞吐量。预计这些方法可以大大简化使用 秀丽隐杆线虫 模型的大型细菌，基因组或药物库的筛选过程。
Introduction
年龄依赖性神经退行性蛋白质构象疾病（PCDs），如阿尔茨海默氏症，帕金森氏症和亨廷顿病，或肌萎缩性侧索硬化症，其特征在于蛋白质折叠错误，导致聚集，细胞死亡和组织变性1。虽然蛋白质折叠错误被认为是罪魁祸首，但这些疾病的病因尚不清楚。因此，由于缺乏对导致疾病发作和进展的因素和条件的知识，有效疗法的发展受到了阻碍。最近的研究表明，微生物组的变化会影响PCDs的发作，进展和严重程度2，3，4。然而，人类甚至小鼠微生物组的复杂性使得很难进行研究来揭示微生物对其宿主的确切影响。因此，更简单的生物体，如秀丽隐杆线虫，经常被用作发现工具5，6，7，8。最近的研究使用秀丽隐杆线虫来研究细菌对宿主蛋白平衡和疾病发病机制的影响9，10。细菌定植、激素形成和基因组变化是影响聚谷氨酰胺 （polyQ） 束聚集9，11，12 的示例性条件之一。此外，这些错误折叠的蛋白质簇在宿主内表现出polyQ长度和年龄依赖性积累，并且与运动受损9，13相关。量化荧光标记的pucta的相对简单的方法可以生成有关影响蛋白质折叠和聚集的条件，因子或药物的重要数据。
虽然荧光点状污染物的定量已被证明是一种可靠且相对简单的程序，但挑战仍然是开发一种方案，以促进对影响蛋白质聚集的化合物，细菌或条件的大规模筛选。自动化 秀丽隐杆线虫 图像处理和穿刺量化的概念并不完全新颖，因为已经开发了许多实用的支持工具14，15。然而，培养、图像采集和处理管道的集成对于消除结果的可变性和允许更高通量的筛选至关重要。
因此，本手稿的目的是标准化用于量化 秀丽隐杆线虫 中polyQ聚集的程序，作为检测蛋白平衡变化的代理。该任务是通过使用CellProfiler来完成的，CellProfiler是一种开源图像分析软件16 ，能够自动识别蠕虫和聚集体，并被集成到用于培养蠕虫、获取图像和处理数据的更大的实验方案中。
Protocol
所有程序都遵循佛罗里达大学机构生物安全委员会审查和批准的安全准则。采取了适当的生物安全措施，以减轻接触生物安全2级细菌的风险。
注意：对于所有实验， 秀丽隐杆线虫 必须在接种有 大肠杆菌 OP50的线虫生长培养基（NGM）板上繁殖和维持。
1. 制备 10 cm NGM 板
- 将3克NaCl，2.5克色氨酸酶 - 肽胨和17克琼脂混合到2升烧瓶中，并用双蒸馏水（ddH2O）填充至1升。在高压灭菌前加入磁力搅拌棒。
- 在121°C和21 psi的压力下高压灭菌混合物45分钟。让混合物在水浴中冷却至50°C。
- 使用无菌技术，加入以下无菌溶液：1 mL 1 M CaCl2·2H2O， 1 毫升 1 M 毫克SO4·7H2O，1 mL 5mg / mL胆固醇溶于100%乙醇（加热至室温）和25mL 1M KH2PO4 （pH = 6.0）。使用磁性搅拌板混合。混合可以在700 RPM下进行1分钟。
- 倒入，直到混合物填满整个10厘米的盘子。或者，使用刻度血清学移液管，每板加入约20 mL混合物。
- 在用细菌接种之前，让板在室温下干燥24小时，或在干燥后将普通板储存在4°C。
注：所有介质组件均使用无菌技术进行处理。步骤1.3-1.4应在层流罩中进行。
2. 在24孔板中用FUDR制备NGM琼脂
- 按照步骤 1.1-1.3 操作。
- 用5-氟-2′-脱氧尿苷（FUDR）补充NGM并混合以达到100μg/ mL的最终浓度。
注意：FUDR抑制DNA复制，结果通过靶向种系和胚胎发生来阻断 秀丽隐杆线虫 的繁殖，最终影响寿命。因此，重要的是让蠕虫在转移到含有FUDR的板之前完全发育成年轻人。
注意：FUDR 是有毒的，应根据制造商的安全数据表进行处理。 - 使用移液枪，将 1 mL NGM-FUDR 分配到每个孔中。
注意：通过使用自动板浇注系统可以促进此过程。 - 让板在室温下干燥24小时，然后用细菌接种或将普通板储存在4°C。
3. 板的播种：OP50和其他测试细菌
- 为了制备过夜 大肠杆菌 OP50培养物，将冷冻储备中的200μL细菌等分试样加入含有250mL新鲜无菌卢里亚肉汤（LB）的500mL锥形瓶中。
注：培养基的体积取决于需要播种的板的数量。为了制备其他细菌培养物，使用无菌微量移液器吸头接种含有5 mL生长培养基的16mL培养管和冷冻储备中的细菌。 - 在37°C培养箱中孵育过夜，以220 RPM（每分钟旋转）摇动。
注：使用至少两倍于工作体积的灭菌烧瓶，并用高压灭菌的铝箔密封。使用无菌技术执行接种步骤和细菌分配。 - 将1-2 mL过夜 大肠杆菌 OP50培养物分配到每个10 cm NGM板的中心。这种培养不需要在NGM板周围传播。
- 在使用/储存之前，让板在室温下干燥。
注意：带盖子的种子板可以放置在有气流的罩中，以方便干燥。
4. 培养和接种板：24孔板
- 准备所需细菌菌株的过夜培养，遵循步骤3.1-3.2中的培养说明。
- 将200μL每个细菌培养物转移到含有NGM琼脂的24孔板的每个孔中。200μL体积的细菌将覆盖整个琼脂区域，最大限度地增加食物量，以确保蠕虫不会避开细菌草坪。
- 将裂开的板放在生物安全柜（BSC）中，以方便干燥。定期检查板以防止过度脱水并改变板方向以促进均匀的气流和干燥。板应在5小时内干燥。
注：任何涉及生物安全2级细菌的工作都必须在经过认证的BSC中进行，并得到机构生物安全委员会的批准。
5. 年龄同步
注意：所有步骤都应使用适当的无菌技术（即，在靠近火焰或在平衡计分卡内工作）执行。
- 使用过滤灭菌的M9溶液（5.8克Na2HPO4·）从10厘米OP50板上洗掉重力雌雄同体7H2O，3.0克KH2PO4，5克氯化钠，0.25克MgSO4·7H2O，在1升ddH2O中）。
- 使用无菌玻璃或塑料血清移液器将M9溶液移液到板上几次，以从细菌草坪上抬起蠕虫。
- 收集蠕虫悬浮液并将溶液转移到15 mL聚苯乙烯锥形管中。
- 在室温（室温，~23°C）下离心2分钟。
- 使用真空捕集瓶吸出并丢弃上清液，使蠕虫沉淀不受干扰。
- 将沉淀重悬于5-10mL M9中以洗涤蠕虫并重复步骤5.2-5.3两次。
- 向管中加入5mL 20%漂白溶液（8.25mL ddH2O，3.75mL 1M NaOH，3.0mL非杀菌漂白剂）并连续倒置以溶解蠕虫。蠕虫一旦几乎完全溶解，就可以离心。
注意：漂白时间和漂白溶液的体积取决于样品的大小。过度漂白和漂白不足是常见的错误。因此，该过程通常需要优化以确定样品何时准备好离心。 - 以423× g 离心2分钟，弃去上清液。
- 加入10 mL无菌M9以重悬卵沉淀。
- 将管以423× g 离心2分钟以沉淀卵。用吸气瓶除去上清液。
- 重复步骤 5.6-5.6.1。
- 将鸡蛋颗粒重悬于5 mL无菌M9中，并将其置于所需温度的螺母上过夜。
注意：年龄同步的L1幼虫将准备在第二天转移到板中。
6. 年龄同步后的蠕虫准备
- 在室温（~23°C）下以270× g 离心年龄同步的蠕虫3分钟。
- 在清洁的环境中吸入上清液，例如流动罩或本生燃烧器旁边。留下约200μL上清液并重悬蠕虫。
- 使用微量移液器，将浓缩的蠕虫悬浮液转移到先前用OP50播种的10 cmNGM板上。
注意：每个盘子可以支撑1，500条蠕虫而不会耗尽食物;然而，这种浓度可能需要根据细菌草坪的密度和生长温度进行调整。建议使用多个板以防止蠕虫挨饿。重要的是要注意，这些板不得含有FUDR。 - 让板干燥;然后倒置并在25°C下储存48小时。
注意：根据屏幕的状况，步骤6.1中的蠕虫可以直接放置在测试板上（含有细菌，药物或测试化合物）。如果所需的测试条件影响发育，则应在含有OP50的NGM上培养蠕虫，直到年轻成虫（约48小时）才将其暴露于测试条件。 - 孵育48小时后，用无菌M9溶液从板中洗涤蠕虫并将其放入锥形管中。
注意：成虫会沉到管子的底部。确切的时间将根据从10厘米板中回收的蠕虫数量而有所不同。在这些条件下，蠕虫在10分钟内沉降。 - 进行目视检查以确定沉降时间的持续时间，以便去除任何残留的卵或孵化的幼虫。
- 再加入 10 mL M9 以冲洗蠕虫体内残留的细菌。
- 在23°C下以270× g 离心蠕虫2-3分钟。
- 再执行3次洗涤步骤。为获得最佳效果，请在最终洗涤后在管中留下约1-1.5 mL的M9溶液。
- 将10μL蠕虫悬浮液转移到载玻片上并计算蠕虫的数量。
- 将蠕虫密度调节为每10μLM9约150个蠕虫。悬浮液中蠕虫的浓度可以通过离心后除去或加入M9溶液来调节。
- 通过平均来自几个不同液滴的计数来确认已建立所需的浓度。建议从至少三滴开始平均计数。
- 使用无菌技术，将含有约150条蠕虫的10μL蠕虫悬浮液转移到测试板的每个孔中。
- 在显微镜下检查孔，以确保每个孔都有足够数量的蠕虫。在孵育之前可以添加额外的蠕虫。
- 让板干燥约10分钟;然后倒置并转移到25°C培养箱中72小时。
注意：可以调整最终的潜伏期以适应实验的需要。72小时孵育时间足以支持在25°C下在24孔板中喂养200μL细菌的150只动物的生长。
7. 准备蠕虫以进行成像
- 为了更有效地沉降并最大限度地减少样品损失，请在洗涤前固定蠕虫以防止游泳。
注意：如果使用少量样品，则可以通过暴露于左旋咪唑（100μM）来实现。但是，如果处理大量样品，可以通过冷冻来固定蠕虫。此外，长时间冷冻（18-24小时）将阻止polyQ骨料在制备过程中的进一步发展。- 将多孔板置于-20°C下15-20分钟或直到蠕虫不再移动。
- 从冰箱中取出样品，让它们静置5分钟。
- 使用微量移液管，将1mL M9，冷却至4°C，加入感兴趣的井中，反复按压并按下柱塞4-6次以洗涤每个孔中的蠕虫。
注意：有时，蠕虫会粘在微量移液器尖端。因此，每个孔之间应使用不同的尖端，以防止蠕虫的混合。 - 将蠕虫悬浮液转移到微量离心管中，让蠕虫沉入底部。
- 吸出并丢弃上清液。将样品共清洗三次。
- 在蠕虫在最后洗涤过程中沉降到底部后，吸取500μL上清液，留下500μL重悬蠕虫。
- 将剩余的蠕虫悬浮液转移到新的平底24孔板中，并将其置于-20°C冰箱中48小时。
注意：冷冻蠕虫可减少背景荧光，并可以更好地可视化聚集体。
8. 成像
- 从冰箱中取出板并解冻，擦去多余的冷凝物，并在成像前取下盖子。
注：图像捕获的详细信息将因所使用的设备和软件而异。本节的协议应仅作为指南，并且需要进行修改。还需要捕获tiff文件格式的图像。 - 在图像捕获过程中，使用以下显微镜设置：曝光时间，500 ms;使用 0.63 倍相机适配器 （25.2x） 时实现 40 倍放大倍率，GFP 强度设置为 100%。
注意：各种显微镜配置和系统可以获取与结果部分提供的图像不同的图像。为了实现对所需图像的更通用的描述，提供了有关图像的更客观的详细信息。聚集体直径必须在1.0-10.0像素之间，荧光强度为0.10-1.0（任意单位，刻度0-1），才能由CellProfiler正确识别。这些聚合图像的荧光背景通常低于0.10阈值。对于明场图像，蠕虫强度范围为0.7-1.0，背景强度为0.1-0.2。明场图像中蠕虫的平均长度从头到尾的长度从250像素到350像素不等。 - 调整透射光控制，直到蠕虫与深色背景相比出现明亮的照明。避免过度曝光;它会增加蠕虫的大小。
- 可能需要改变蠕虫在井内的位置，以防止过度结块。使用移液器吸头分散聚集的蠕虫。
- 将通道设置为 GFP 可为两个图像建立焦平面。
注：必须在GFP通道中确定焦平面。在捕获明场图像时对焦所做的任何改变都会导致图像分析过程中聚集体和蠕虫的错位。 - 捕获明场图像并立即拍摄其相应的荧光图像，而不会干扰板。
- 通过管道运行测试图像，以根据步骤 8.2 之后的“NOTE”确定图像中对象的强度和大小值。
注意：细胞轮廓仪可以在分析之前提供有关物体强度和长度的所有必要信息。 - 要评估图像，请先下载细胞轮廓17。打开软件并将感兴趣的图像拖放到“图像”框中。
- 单击文件列表中的图像以将其打开。
- 在屏幕的左上角有几个图标;使用它们来测量对象的大小或放大特定区域。选择放大镜玻璃以突出显示感兴趣的区域。
- 选择箭头图标以测量蠕虫和聚集体的长度。
- 将鼠标悬停在所需对象上以确定其强度值，该值可以在屏幕的底部看到。
注意：由于所有图像都是以灰度拍摄的，因此所有红色、蓝色和绿色像素值都将相同。
9. 图像分析
- 要利用细胞轮廓图像分析管道，请正确命名图像对。使用以下格式：P1_A01_S1_C1，其中P1表示特定板及其相应的数字名称;“A”，指行，“01”指列;“S”是指单个孔的特定图像对;“C”是指通道，其中“1”用于表示明场图像，“2”用于荧光图像。
- 从官方网站下载小区浏览器（版本4.1.3或更高版本）17.
- 下载管道（补充文件 1）。通过选择“ 文件”>“从文件导入管道”将管道（管道）上载 >到 CellProfiler 中。
注：模块 2 和模块 3 已被禁用，因为它们被认为是不必要的。如果图像分析不能产生令人满意的蠕虫分离和鉴定，则可以恢复其功能;但是，需要修改管道。 - 要合并这些模块，请选择位于每个模块左侧的框。将“解缠蠕虫”模块的输入二进制图像重命名为“转换对象图像”模块中的输出图像。
- 在初始使用过程中，可能会出现与模块 2 相关的错误消息。如果发生这种情况，请继续进行分析。
- 将用于识别蠕虫的训练集上传到“解缠蠕虫”模块。此训练集可在 补充文件 2 中找到。
- 选择“ 解开蠕虫” 模块以打开其设置。
- 标识 训练集文件名 并选择上传文件图标。
- 上传 补充文件 2 （训练集）。
- 通过选择左上角 的“图像 ”模块上传图像。拖放正确命名的图像，如步骤 9.1 中所述。
- 在分析图像之前，请选择将用于存储结果的所需输出文件夹。
- 单击位于程序左下角附近的 “输出设置” 按钮。
- 选择 “默认输出” 右侧的文件夹图标以选择所需的输出位置。
- 选择分析 图像 图标以开始图像分析。
- 如果分析完成时间过长，并且在处理单个图像时卡住，则可能是由于图像采集问题造成的。如果发生这种情况，请中止运行，然后通过对输出文件夹进行排序并记下未找到哪些映像名称来继续标识未处理的图像。
注意：图像可能需要额外的处理，以删除管道无法处理的大光或强烈照明的伪影。在某些情况下，可能需要从分析中排除此类图像。 - 经过全面分析后，软件会将结果整理到一个excel电子表格中，其中包含单个蠕虫（N列）及其各自的聚集体数量（K列）。
注意：成功运行将生成一个 Excel 电子表格，其中包含每个井的每个已识别蠕虫的聚合数。这些数据可以按照实验者确定的方式进行处理。 - 从 补充文件 3 （Windows） 或 补充文件 4 （Mac） 下载元数据管理器（图形用户界面），以方便地组织来自单元格轮廓的输出 CSV 文件中的数据。
注意：此软件没有官方许可证，下载后不会自动打开。 - 如果使用 Windows 操作系统 64 位，请按照步骤 9.14-9.17 进行操作。该软件将无法在视窗 32 位上运行。如果使用 Mac OS，请按照步骤 9.18-9.20 进行操作，步骤 9.21-9.22 对于两种操作系统都是相同的。
- 对于 Windows 操作系统，请找到下载的文件并将其解压缩到所需位置。
- 找到并打开名为gui_windowsOS_64x的提取文件夹，然后单击“gui”应用程序图标启动该应用程序。
- 可能会打开一个提示，请求运行权限。选择“ 更多信息”， 然后单击“ 仍然信任”。
- 元数据管理器已准备好拖放单元格轮廓输出 CSV 文件。继续执行步骤 9.21。
- 对于 Mac OS，找到下载的文件并打开gui_macOS_64x.zip。此步骤应自动提取所有文件。
- 打开在“下载”中找到的解压缩文件夹。
- 右键单击“gui”应用程序，然后选择“ 打开”。将出现一个提示，要求允许打开，因为缺少官方许可证。选择“ 打开 ”并继续执行步骤 9.21。
- 单击“ 在此处上传您的文件 ”或拖放所需的“单元格配置文件”CSV文件。
- 单击“ 组织 ”按钮，这将用户带到带有 “下载文件” 按钮的新屏幕。单击该按钮并选择所需的位置以保存输出文件。输出文件将显示为原始文件名，并在文件名中添加了扩展名为“_organized”。
Representative Results
本文描述的是 秀丽隐杆线虫 工作流程，包括培养，图像采集和处理方案，允许使用24孔板格式作为培养和成像平台，在存在各种细菌的情况下评估polyQ聚集（图1）。该方案可以调整以研究细菌，特定条件，小分子，药物或基因组操作对宿主蛋白平衡的影响。所描述的方法已经使用蠕虫进行了优化，这些蠕虫组成性地表达与黄色荧光蛋白（vha6p：:p olyQ44：：YFP）融合的肠道polyQ;然而，其他报告肌肉或神经元蛋白平衡的模型也可以用于进一步优化。例如，初步实验证明了这些方法在其他组织（如肌肉polyQ）中蛋白质聚集体的定量中的应用（补充图1）。但是，如第 8 节 NOTE 中所述，需要对管道进行修改，以正确调整聚合大小和亮度。
图 1：工作流可视化表示。 该协议的主要步骤包括五个不同的阶段：蠕虫制备和年龄同步（步骤1-5），肠道定植/蠕虫治疗（步骤6），成像样品制备（步骤7），图像采集（步骤8）和图像处理（步骤9）。协议的“部分”在图中称为“步骤”。 请点击此处查看此图的大图。
最初的优化实验揭示了由于大量后代而导致的与过度拥挤相关的各种困难，导致食物消耗更快。第2节中描述的NGM板中FUDR的补充解决了这个问题（图2）。此外，在FUDR存在的情况下，喂养各种细菌的蠕虫具有更一致的体型，这使得更均匀和准确的蠕虫检测成为可能。
图 2：使用 FUDR 通过减少后代来提高图像质量。 与在接种有大肠杆菌OP50的非FUDR对照NGM板上生长的蠕虫相比，FUDR补充板可消除秀丽隐杆线虫的后代。图像以25.2倍放大倍率（使用0.63倍相机适配器时为40倍放大倍率）获取。比例尺 = 500 μm.请点击此处查看此图的大图。
背景荧光导致polyQ聚集体的假阳性检测。为了减少肠道中的这种荧光信号并改善聚集体的自动检测，有必要在成像前冷冻蠕虫。通过消除背景荧光，将蠕虫在-20°C下冷冻18-48小时显着改善了polyQ聚集体检测（图3A）。人眼能够区分聚集体和背景荧光;因此，冻结前后的手动计数是相同的（图3B）。然而，自动计数并不那么准确，但冷冻显着改善了自动计数，其准确性可与手动计数相媲美（图3B）。
图3：冷冻改善了聚集体检测（A）秀丽隐杆线虫在冷冻前后表达肠道polyQ44：：YFP的荧光图像。插入表示所选区域的特写图像。比例尺= 500μm（B）在使用手动或自动（管道）聚集物定量冷冻之前和之后用铜绿假单胞菌MPAO1定植的蠕虫中每个肠的平均聚集体数。数据代表两个生物重复（n = 60-109）。使用学生 t 检验（**** p < 0.0001）计算统计显著性。误差线表示均值 （SEM） 的标准误差。请点击此处查看此图的大图。
使用倒置明场照明来检测整个秀丽隐杆线虫（图4A）和GFP通道，以成像polyQ44：：YFP聚集体（图4B）。通过应用优化的 CellProfiler 图像处理管道（补充文件 1），可以获取每个蠕虫的聚集体数（图 4C-D），从而完成对每个蠕虫的蠕虫检测、解缠和聚合定量。为了测试这种方法的可行性以及自动聚集体检测和定量的准确性，根据既定的方案（第1-7节）培养表达肠道特异性polyQ44：：YFP的蠕虫并进行成像准备。使用自动管道（第 8-9 节）或手动计数评估每个蠕虫的聚集体数。每个实验都在三项独立试验中使用每种病症90-571条蠕虫进行。虽然两项试验获得的每肠聚集体的平均数量没有显着差异，但第三项试验中的蠕虫在使用自动方法定量时聚集体显着减少（图5A）。使用CellProfiler管道进行定量时，三项试验的平均聚集体数量略有增加，但聚集体明显减少（第8-9节）（图5B）。尽管如此，这两种方法之间的差异很小，表明自动化方法可以应用于大规模屏幕。
图 4：使用细胞轮廓仪进行聚合检测 （A） 用于识别蠕虫体的明场图像。（B）使用GFP通道获取的原始荧光图像，用于识别和量化肠道polyQ44：：YFP聚集体的总数。（C） 使用细胞轮廓识别的聚合。（D）在原始荧光图像上叠加有蠕虫和聚集体轮廓的已识别聚集体的总数。使用第8-9节中描述的设置执行图像捕获和处理。面板 E-H 表示图像 A-D 中相应轮廓区域的特写图像。图像以25.2倍放大倍率（使用0.63倍相机适配器时为40倍放大倍率）获取。比例尺 = 500 μm.请点击此处查看此图的大图。
图5：自动聚合量化的功效。 （A）使用手动计数（手动）和基于细胞轮廓的自动定量（管道）对照 组大肠杆菌 OP50定植的蠕虫中每个肠道的平均总和数。结果代表在三项独立试验（T1-T3）（n = 90-571）中分析的数据。（B）使用手动或自动（管道）聚合定量获得每个肠道的平均聚集体数。使用学生 t 检验计算统计显著性（* p < 0.05，** p < 0.01）。误差线代表SEM .请点击此处查看此图的大图。
为了评估结果在不同实验者之间的可重复性，来自包含六口蠕虫的平板的图像，这些蠕虫被喂食铜 绿假单胞菌 MPAO1或 大肠杆菌 OP50，由三个人获得，其中两个人没有使用这些方案成像蠕虫的经验。从每个孔中收集的图像包含30-115个检测到的蠕虫之间的任何地方。在三名实验者成像的相同孔中的蠕虫中检测到聚集的非显着差异。虽然喂养MPAO1和OP50的蠕虫的三个实验者之间每个肠道的平均聚集体数量保持非常一致，但在平均聚集体数量方面存在一些统计学上的显着差异，但仅在MPAO1定植的蠕虫中（补充图2）。这些结果突出了即使在没有经验的实验者之间的结果的可重复性。
为了确保聚集体定量的再现性不受蠕虫位置的显着影响，选择一组15个蠕虫，并在每次使用移液器吸头在每次图像捕获之间搅拌15次后单独成像。使用细胞轮廓仪收集并分析了用 大肠杆菌 OP50和 铜绿假单胞菌 MPAO1喂养的蠕虫中的聚集体图像。来自这些不同图像集的平均聚合数略有差异，但差异不大，进一步支持了这种方法的可重复性（补充图3）。
秀丽隐杆线虫肠道与革兰氏阴性肠道病原体的定植已被证明会破坏组织中的蛋白平衡，铜绿假单胞菌是polyQ聚集9的最有效诱导剂之一。为了确定这些优化方案是否能成功检测和量化铜绿假单胞菌介导的聚集增强，用大肠杆菌OP50（对照菌）定植表达肠道polyQ的蠕虫，并进行铜绿假单胞菌MPAO1，第1-8节。使用细胞轮廓仪分析采集的图像（第9节，补充文件1）。自动定量的结果表明，铜绿假单胞菌MPAO1诱导的聚集体数量显着增加，与使用对照组OP50喂养的蠕虫相比，始终导致两倍的增强（图6）。
图6：在对照组大 肠杆菌 OP50和铜绿 假单胞 菌MPAO1定植的蠕虫中，每个肠道的平均聚集体数。 使用细胞轮廓仪评估每个肠道的聚集体数量（第8-9节）。数据表示为用OP50（n = 1068）和MPAO1（n = 1557）定植的蠕虫中每个肠道的平均聚集数。使用学生 t 检验（**** p < 0.0001）计算统计显著性。误差线代表SEM .请点击此处查看此图的大图。
优化的管道旨在支持影响蛋白质平衡条件的大规模筛选。为了测试这种方法在筛选大型细菌文库对宿主蛋白平衡的影响方面的可行性，本文描述的管道（第1-9节）用于测试90 个铜绿假单胞菌 非必需基因敲除突变菌株对polyQ聚集18的影响。该试验筛是一个更大项目的一部分，该项目旨在筛选所有 铜绿假单胞菌 非必需突变菌株，以观察它们影响宿主蛋白平衡的能力。在测试的90种细菌菌株中，具有一种候选 者的秀丽隐杆线虫 肠道定植显示出聚集体数量的显着减少（图7）。评估该测定的敏感性的后续实验是通过从随机选择的六种铜绿假单胞菌 突变体中手动聚合计数进行的，这些突变体与MPAO1对照无显着差异。这些实验使用更传统的6 cm NGM板进行，将蠕虫作为L1转移到测试菌株上，以概括先前建立的方法9。通过手动计数进行的确认实验显示，没有一个突变体，包括显着减少聚集体数量的突变体（图7）影响polyQ聚集体（补充图4）。此外，在90个突变菌株的筛选中观察到的聚集的细微变化在所选候选物的手动计数中未检测到，这表明由于生物学和实验变异性（例如低n值）可能会出现这种变化。总的来说，结果表明，虽然我们的方法可以可靠地发现重大变化，但可能会错过微妙的变化，并且必须单独确认所有潜在的候选者。
图7：由92种细菌菌株定植的代表性蠕虫样本中每个肠道的聚集体数量。 数据表示为每个肠道的平均聚集体数，归一化为用MPAO1定植的蠕虫的平均聚集数。虚线表示用MPAO1（顶部，开放圆圈）和OP50控制（底部，开放正方形）定植的蠕虫的平均聚集体数。实心符号表示铜 绿假单胞菌 MPAO1的90个不同的敲除突变菌株。在用MPAO1定植的蠕虫和单个突变体之间，每个蠕虫的平均聚集体数具有统计学意义。灰色圆圈表示手动确认的样品（补充图4）。使用单向方差分析（方差分析）计算统计显著性，然后进行多重比较Dunnett的事后检验（**p<0.01，****p<0.0001）。误差线代表SEM .请点击此处查看此图的大图。
为了管理细胞轮廓生成的大量数据，开发了一个图形用户界面（GUI）来自动化数据处理和组织（图8）。GUI是使用特金特开发的，这是一个开源的Python跨平台小部件工具包。从给定的元数据中，应用程序从板中存在的每个孔（列J）中提取聚合体（列K）的数量。一个名为“Pandas”的Python数据处理库用于执行上述过程。GUI 应用程序为用户提供拖放支持以上传数据文件。每个文件中的数据都以称为数据框的二维表格结构的形式存储。为数据帧中找到的每个唯一陡初始化空字典对。接下来，对在每个孔中找到的不同聚合进行计数并附加到它们各自的字典对中。包含较少数据的列用空值字符串填充，以确保每列的大小均匀。最后，将结构转换为数据框，该数据框以电子表格的形式导出到用户指定的目录中。
图 8：图形用户界面，请单击此处查看此图的大图。
补充图1：肌肉特异性polyQ聚集体的检测。 将表达肌肉特异性聚Q35：：YFP的蠕虫接种为L1，并在OP50上培养48 h。一旦蠕虫发育成年轻成虫，就将它们转移到24孔NGM板中，补充100μg/ mL FUDR，并在成像前用MPAO1接种72小时。（A）用于识别蠕虫体的明场图像。（B）使用GFP通道获取的原始荧光图像。（C） 使用细胞轮廓识别的聚合。（D）在原始荧光图像上叠加有蠕虫和聚集体轮廓的已识别聚集体的总数。使用第8-9节中描述的设置执行图像捕获和处理。面板 E-H 表示图像 A-D 中相应轮廓区域的特写图像。比例尺 = 500 μm.请点击此处下载此文件。
补充图2：不同实验者之间聚合定量的再现性。 使用CellProfiler对定植于铜绿假单胞菌MPAO1（黑条）的六 口 蠕虫和用对照 大肠杆菌 OP50（灰色条）定植的六口蠕虫的聚集体的平均数量进行定量。每个孔由三个实验者（AVS，DMC，RDH）成像。数据表示为每个肠道的平均聚集数（n = 30-115）。统计显著性是使用单因子方差分析法计算的，然后进行Tukey的多重比较检验（* p < 0.05，**p <0.01）。误差线代表SEM .请点击这里下载此文件。
补充图3：蠕虫位置对骨料定量重现性的影响。 在对照组大 肠杆菌 OP50（灰色条）和铜绿假单 胞菌 MPAO1（黑条）定植的蠕虫中每个肠道的平均总分数。结果表示使用细胞轮廓量化的每个肠道的平均聚集体数（15≥n≥12）。井内蠕虫的位置在每次采集之间通过搅拌而改变。两组均未发现统计学意义差异。使用单因子方差分析计算统计显著性，然后进行Tukey的多重比较检验。误差线代表SEM .请点击这里下载此文件。
补充图 4：通过手动计数确认先导屏幕。 手动量化每个肠道的平均聚集体数。数据显示了与野生型MPAO1和OP50对照组（n = 30）相比，用六个MPAO1敲除突变体（灰色圆圈 图7）定植的蠕虫的聚集图谱。统计显著性是使用单因子方差分析计算的，然后进行多重比较 Dunnett 的事后检验（**** p < 0.0001）。误差线代表SEM .请点击这里下载此文件。
补充图5：FUDR对肠道多Q聚集的影响。 数据表示为每个肠道的聚Q44：：YFP聚合的平均数量（n = 20）。在 大肠杆菌 OP50上在25°C下生长48小时后，将蠕虫转移到对照组（无FUDR）或含FUDR的板（100μg/ mL）上。在另外48小时后收集手动计数。使用学生的t检验（ns =不显着）计算统计显着性。误差线代表SEM .请点击这里下载此文件。
补充文件1：蛋白质停止管道。可在细胞轮廓仪中使用的可下载图像分析管道。申请说明见第9节。 请按此下载此档案。
补充文件2：训练集解开蠕虫。 要上传到“解缠蠕虫”模块中的文件。此特定训练集特定于初始方法中使用的蠕虫。蜗杆大小和形状的改变将改变识别的准确性和质量。可能需要创建更个性化的训练文件。有关创建新训练集的说明，请访问官方赛尔源网站17。 请按此下载此档案。
补充文件 3：Windows 操作系统的图形用户界面。 gui_windowsOS_64x.zip。 请按此下载此档案。
补充文件4：Mac操作系统的图形用户界面。 gui_MacOS_64x.zip。 请按此下载此档案。
Discussion
所描述的方案概述了 秀丽隐杆线虫 培养，成像和图像处理的程序，该程序结合了开源图像分析软件CellProfiler。具有代表性的结果表明了可重复性、减少偏差和可扩展性。这种标准化程序将改善大型细菌、基因组或药物文库采用的筛选策略。虽然存在其他自动化的 秀丽隐杆线虫 检测方法，但所描述的技术提供了一个标准化的，高通量的管道，集成了培养，图像采集和分析。
必须测试蠕虫培养的几种变体以优化本文中描述的方案。最初，蠕虫在年龄同步（L1阶段）后立即转移到样品细菌中。然而，这种方法导致了不同大小的蠕虫种群，甚至在同一孔内的蠕虫中也是如此。 秀丽隐杆线虫 以避免病原体19而闻名，这可能导致观察到的大小变异性，并最终影响下游成像 - 蠕虫检测，特别是。为了消除这种变异性，每个孔中的整个NGM区域都被测试细菌覆盖。此外，将蠕虫喂食 大肠杆菌 OP50，并允许在25°C下完全发育成年轻成虫48小时。 在将蠕虫转移到测试细菌上之前，让 蠕虫在大肠杆菌 OP50上达到成年期，导致更一致的体型。此外，通过用FUDR补充NGM琼脂，消除了过度拥挤和后代的快速食物消耗。FUDR的实施去除了后代并增强了自动蠕虫鉴定，这被后代与亲本群体的混合所掩盖。然而，在使用FUDR时，重要的是要谨慎并使用适当的对照，因为已知该化合物会影响 秀丽隐杆线虫 的蛋白质平衡和寿命20，21。在该协议中描述的条件下，FUDR不影响肠道polyQ聚集（补充图5）;因此，其利用是合适的，并且有利于所描述的方法。
在成像之前冷冻样品被证明是成功使用管道的关键步骤。冻结前的聚合计数明显高于手动计数（图3B）。在成像之前将蠕虫保持在-20°C下18-48小时可减少背景荧光并最终改善聚集体检测（图3A）。冷冻对聚集体检测的影响仅针对polyQ进行了研究，如果不进一步研究这种影响，则不应推广到其他模型。
尽管所有条件都保持不变，但观察到每条蠕虫的平均聚集体数量在不同的运行之间可能会有所不同，而用OP50定植的动物的聚集体数量与MPAO1之间的比率保持一致（图6， 补充图2， 补充 图5）。因此，在每次运行中始终包括 大肠杆菌 OP50 对照或任何其他合适的参考对照至关重要。实验之间总计数的这种变异性可能受到环境条件（温度，湿度）22，23 或遗传背景8的影响。事实上，观察到在长时间培养后，肠道荧光急剧下降或完全丧失，这需要从冷冻储液中解冻新菌株。观察到的荧光减少可能是抑制有毒转基因（例如表达polyQ的转基因）的遗传变化的结果。尽管如此，在不同实验者之间观察到的结果（补充图2），生物重复之间（图5）和同一样品内（补充图3）的异常再现性强调了这种方法的强度。
许多报告已经使用肠道polyQ来研究蛋白停止9，11，12，13，24，25。然而，由于实验方法和读出方法之间的差异，无法对结果进行直接比较。尽管如此，来自先前发表的数据的一些结果被本文描述的自动定量所概括，包括细菌诱导聚集9，13和相当数量的聚集体11。总的来说，所描述的管道为研究蛋白质平衡提供了有价值的工具。
本文中描述的方法具有一些固有的挑战。例如，它需要足够的时间来掌握该协议的所有组件，对于该协议的第8部分尤其如此，该部分需要熟悉测定以确定所获取的图像是否适合管道分析。与该协议中使用的图像采集设置的偏差是可能的;但是，可能需要修改设置和蠕虫训练集。该管道可以区分各种大小的聚合体和正在接触的聚合体，这限制了聚合体的“混合”并最终提高了检测灵敏度。但是，在尝试识别超过可接受大小范围的大型聚合时，可能会出现问题，因为扩展大小上限阈值可能会导致标识不良导致的错误，例如无法区分正在接触的聚合。在进行图像分析之前，必须在精度、大小和强度之间找到平衡点。通过结合机器学习来创建能够增强聚合检测的神经网络，可以进一步提高聚合识别的效率。目前正在探索这种改进，这将大大有助于解决当前的问题，例如检测位于不同焦平面上或具有异常形状的聚集体。
所描述的方法的一个显着弱点是自动聚集体计数的可变性，因为它们并不总是通过喂养不同细菌菌株的蠕虫的手动计数来概括。例如，根据自动计数，与野生型菌株（MPAO1）相比，喂养 铜绿假单胞菌 突变体53（M53）的蠕虫聚集体明显少于野生型菌株（图7）;然而，对命中的确认显示没有显着差异（补充图4）。一般来说，高通量药物筛选具有较高的假阳性命中检测率，所述方法无一例外26。因此，确认所有潜在命中是协议的关键部分。
虽然该方案经过优化以适应筛选策略以鉴定影响宿主蛋白平衡的细菌，但每个步骤都可以进一步修改以测试基因组RNAi文库，小分子或其他条件的影响。可以在每个步骤中进行其他修改，以适应特定筛选策略的要求。此外，该技术提供了一定程度的灵活性，允许优化每个步骤以适应特定模型。例如，这种方法可以扩展到其他组织中的polyQ聚集或提取图像中检测到的其他特征，例如使用诱导荧光报告基因（例如，热休克基因）监测基因表达，评估蛋白质的亚细胞定位（例如，DAF-16的核定位），研究其他疾病模型中的聚集（Aβ1-42，α突触核蛋白，TDP-43等）或评估生理表型， 如蠕虫大小。
Disclosures
提交人声明不存在利益冲突。
Acknowledgments
这项工作得到了美国国立卫生研究院（1RO3AG069056-01）和美国传染病学会对DMC的资助。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。我们感谢Czyz实验室的成员校对手稿。卡通人物是使用生物渲染付费许可证生成的。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.7 mL Microtubes | Olympus Plastics | Cat#24-282 | Microcentrifuge tubes |
| 10 mL Serological Pipettes | GenClone | Cat#12-104 | Plastic pipettes |
| 15 mL Centrifuge Tubes, Racked | Olympus Plastics | Cat#28-101 | Conical tubes |
| 5-Fluoro-2′-deoxyuridine | Fisher Scientific | D2235100MG | FUDR |
| Accu-jet Pro Pipette Controller | Genesee Scientific | 91-600RB | Pipette gun |
| Agar | Fisher Scientific | Cat#BP1423-2 | Granulated agar |
| BioRender | BioRender | Graphical figure generator | |
| Bleach (Regular) | Clorox | Bar# 044600324111, Splash-less Bleach | 4.5% sodium hypochlorite |
| C. elegans: AM140: rmIs132 [unc-54p::q35::yfp] | Morimoto Lab (Northwestern University) | AM140, Q35::YFP | Muscle polyQ |
| C. elegans: AM738: rmIs297[vha-6p::q44::yfp; rol-6(su1006)] | Morimoto Lab (Northwestern University) | AM738, Q44::YFP | Intestinal polyQ |
| CaCl2·2H2O | Fisher Scientific | Cat#C79-500 | Calcium chloride dihydrate |
| CellProfiler | Broad Institute | Image analysis software | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | Cat#ICN10138201 | Cholesterol |
| Circulating Water Bath Head | Lauda | 26LE | Lauda E 100 |
| CoolLED pE300lite 365 dir mount STEREO | CoolLED | 8114931 | Fluorescent light control and emitter |
| 16 mL Culture Tubes | Olympus Plastics | 21-129 | Culture tubes, 17 mm x 100 mm |
| Escherichia coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | E. coli control strain |
| Ethanol, 200 Proof | Decon Labs, Inc. | 2701 | |
| Eyepiece 10x/23B, adjustable, 3d gen | Leica Microsystems | 10450910 | Eyepiece set |
| Filter Set ET GFP - MZ10F | Leica Microsystems | 10450588 | Filter cube |
| GraphPad Prism v9.2.0 | GraphPad Software, Inc. | Statistical analysis tool | |
| Heratherm Incubator IMP180 | Thermo | 51031562 | Refrigerated incubator |
| Innova 4000 | New Brunswick Scientific | M1192-0000 | Shaking incubator |
| K5 Camera | Leica Microsystems | 11547112 | Stereomicroscope camera |
| KH2P04 | Fisher Scientific | Cat#P285-3 | Potassium phosphate monobasic |
| LAS X Imaging Software | Leica Microsystems | Microscope imaging software | |
| Leica MZ10 F Optics Carrier | Leica Microsystems | 10450103 | Stereomicroscope |
| Levamisole | Fisher Scientific | Cat#0215522805 | Levamisole hydrochloride |
| Luria Broth (Lennox) | Apex Bioresearch Products | Cat#11-125 | LB |
| Magnetic Stir Plate | Fisher Scientific | 11-100-49S | Stir plate |
| MgSO4·7H2O | Alfa Aesar | A14491 | Magnesium sulfate heptahydrate |
| Microscope Slides | Premiere | 8205 | Single frosted microscope slides |
| Na2HPO4·7H2O | Fisher Scientific | Cat#S373-500 | Sodium phosphate dibasic heptahydrate |
| NaCl | Fisher Scientific | Cat#S671-500 | Sodium chloride |
| NaOH | Fisher Scientific | Cat#S318-3 | Sodium hydroxide pellets |
| Objective Achromat, f = 100 mm | Leica Microsystems | 10411597 | Objective microscope lens |
| Petri Dishes | Genesee Scientific | Cat#32-107G | 100 mm x 15 mm |
| Pseudomonas aeruginosa Mutant Library | Manoil Lab (University of Washington) | P. aeruginosa mutant library | |
| Suspension Culture Plate 24-Well, Flat Bottom | Olympus Plastics | 25-102 | Used for worm growth and imaging |
| Trinocular Tube 100% M-series | Leica Microsystems | 10450043 | |
| Trypticase Peptone | ThermoFisher, Difco | Cat#211921 | |
| TX-400 Rotor | Thermo Scientific | Cat#75003181 | Swing bucket rotor |
| Vacuum Driven Filter System | GenClone | Cat#25-227 | 500 mL, PES Membrane, .22 µm |
| Video Objective with C-Mount | Leica Microsystems | 10447367 | 0.63x camera adapter tube |
References
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