Summary
提供了详细的协议和三个Python脚本，用于操作开源机器人液体处理系统，以执行质谱实验的半自动蛋白质样品制备，包括去垢剂去除，蛋白质消化和肽脱盐步骤。
Abstract
基于质谱的鸟枪蛋白质组学实验需要多个样品制备步骤，包括酶蛋白消化和纯化，这可能占用大量的工作台劳动，并存在批次间变异性的来源。使用移液机器人实现实验室自动化可以减少手动工作，最大限度地提高通量，并提高研究的可重复性。尽管如此，标准自动化站的起始价格高昂，使许多学术实验室无法负担得起。本文介绍了使用经济实惠的开源自动化系统（Opentrons OT-2）的蛋白质组学样品制备工作流程，包括设置半自动蛋白质还原，烷基化，消化和纯化步骤的说明;以及随附的开源Python脚本，通过其应用程序编程接口对OT-2系统进行编程。
Introduction
基于质谱的鸟枪蛋白质组学是同时测量生物样品中许多蛋白质丰度的有力工具。具有生物信息学分析的蛋白质组学实验通常用于识别生物标志物并发现支持病理机制的相关生物复合物和途径。凭借其高分析物特异性和潜在的定量准确性，鸟枪蛋白质组学还具有极好的潜力，可以被研究机构和诊断实验室用于临床样品分析，而无需依赖抗体1，2。
为了制备用于鸟枪蛋白质组学分析的蛋白质样品，从生物样品（例如，细胞和组织）中提取的蛋白质通常首先需要使用冗长的方案进行处理，包括测量样品蛋白质浓度，蛋白质还原和烷基化，以及酶消化成肽。此外，在含有去垢剂的普通裂解缓冲液中提取的蛋白质在分析之前通常需要额外的缓冲液交换或去除洗涤剂的步骤，因为洗涤剂会干扰胰蛋白酶消化并显着降低下游液相色谱串联质谱（LC-MS / MS）分析的性能3。肽通常在酶消化后在LC-MS / MS相容性溶剂中进一步脱盐，干燥和重组。这些蛋白质生化程序可能是劳动密集型和耗时的。因此，它们继续限制蛋白质组学工作流程的通量，并导致所获取数据的可变性4，5。人为错误和偏差已被公认为影响数据方差和可重复性的关键因素6，7。为了最大限度地减少质谱样品制备工作流程中的人为错误，已利用自动移液机器人系统来提高鸟枪蛋白质组学和靶向质谱分析中蛋白质鉴定和定量的通量和再现性，其中这些进步被誉为有助于继续推动蛋白质组学技术在关键研究和临床环境中的广泛采用8，9，10，11，12，13。然而，大多数现有的协议都使用机器人液体处理平台，这些平台需要大量的投资和培训，限制了它们在学术环境中的许多实验室中的实用性，或者预算有限。
本文介绍了一种方案，该协议利用低成本、开源的机器人液体处理系统OT-2，对典型的鸟枪蛋白质组学样品制备工作流程进行半自动化。OT-2的成本低于许多其他机器人液体处理系统，在撰写本文时，成本约为5，000美元。当考虑到不同模块和实验室器皿的价格时，在撰写本文时，在该协议中设置实验的总成本约为10，000美元，这使得它对于更广泛的实验室来说比更昂贵的选择更实惠。OT-2通过Python脚本与开源编程兼容，并在用户定义的DIY协议设计中提供了极大的灵活性。使用三个内部开发的脚本，下面的方案涵盖了在OT-2站上执行典型的鸟枪蛋白质组学样品制备工作流程，具有典型的蛋白质标准品（牛血清白蛋白;BSA）和正常人心裂解物的复杂蛋白质样品（图1）。处理（1）BSA样本和（2）复杂心脏裂解物样本的程序分别在方案第1，2，5，6和3，4，5，6节中详细说明。Sera-Mag羧酸盐修饰的磁珠用于单罐固相增强样品制备（SP3），以去除蛋白质和肽样品中的去垢剂和盐。来自牛血清白蛋白和人心脏蛋白的胰蛋白酶消化物通过SP3微球进一步清洁并提交LC-MS / MS分析。然后使用MaxQuant软件分析质谱，以进行肽和蛋白质鉴定。我们执行的代表性结果表明，该协议实现了出色的技术变异系数（CV），同时节省了工作时间，并且不劣于手工消化。
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Protocol
开发的Python脚本已存放在GitHub上，网址为：https://github.com/MaggieLam-Lab/StandardDigestion-Opentrons。脚本的副本在 补充文件 1 中给出。有关最新版本，请参阅 GitHub 存储库。
1. 实验准备
- 在启动协议之前检查所需的硬件。
注：需要以下硬件组件：OT-2 移液器、移液器吸头、4 合 1 管架套件、铝块套件、磁性模块、温度模块、96 孔 2 mL 深孔板（见 材料表）。
2. 使用单一蛋白牛血清白蛋白（BSA）进行质谱（MS）样品制备
- 在文本编辑器中打开 NoSP3_digestion.py 脚本，并在"仅在此处自定义"部分中根据需要指定特定于实验的变量。
注：实验特定变量包括样本数和重复数;样品浓度;试剂二硫代甲状腺素 - DTT，碘乙酰胺 - IAA和胰蛋白酶的体积;DTT和IAA孵育时间，以及移液器P20/P50和P300的起始吸头）。- 打开 Opentrons 应用程序并将脚本上传到 Opentrons 应用程序中的" 协议 "选项卡。
注意：Opentrons 应用程序可以从 Reference14 下载到本地计算机。在撰写本文时，Opentrons P50 电动移液器无法在 Opentrons 商店购买。它已被替换为与协议中规定的体积兼容的P20单通道电动移液器。脚本中已对用 P20 移液器替换 P50 移液器进行了说明和说明。用户可能需要按照Opentrons API指令测试和验证特定移液器与此协议的兼容性。
- 打开 Opentrons 应用程序并将脚本上传到 Opentrons 应用程序中的" 协议 "选项卡。
- 打开"机器人"选项卡，按照Opentrons应用程序中的分步屏幕说明，在"机器人"选项卡中执行机器人甲板校准"校准甲板"。
注意：仅当之前未实施或机器人最近已易位时，才需要此步骤。 - 单击 "管理移液器" 按钮可执行吸头长度校准，然后进行移液器偏移校准以校准默认吸头和移液器组合位置。
注意：如果首次使用移液器，则需要执行此步骤。 - 将所需的实验室器具和移液器放在Python脚本中指定的OT-2甲板中的相应位置（图2）。
注：确保温度模块已连接并通电，并将铝块放置在温度模块的顶部。 - 打开 "校准 "选项卡，并对此 python 脚本中所需的实验室器具和移液器的组合执行校准。
注意：Opentrons 应用程序将记录校准参数，这对于将来使用相同实验室器具和移液器的应用不是必需的。 - 通过将39.53mg ABC溶解在质谱级水中至总体积为5 mL的15 mL锥形管中，制备5 mL的100 mM碳酸氢铵（ABC）（pH〜8.0）溶液。将碳酸氢铵缓冲液置于 15 mL + 50 mL 试管支架顶部的 4 合 1 管架的 A1 孔中。
- 在2.0 mL蛋白质低结合管中制备1mL牛血清白蛋白（BSA）蛋白（见 材料表）。将样品放入4合1管架的A1孔中，顶部有2 mL管架。
- 手动将2.0 mL蛋白质低结合管置于温度模块顶部的铝块中的A1，B1，C1，D1，E1，F1，A2等孔中。
注意：默认情况下，机器人移液器将按垂直顺序分配样品，从A1（第一个样品）开始，直到最后一个样品。可以指定水平点胶。有关详细信息，请参阅15 。需要制备的试管总数应等于样品总数（即生物样品的数量乘以每个样品的技术重复次数）。 - 通过将9.26mg DTT固体溶解在质谱级水中至总体积为1 mL来制备1 mL 60 mM DTT。将 DTT 置于 2 mL 管架顶部的 4 合 1 管架的 A6 孔中。
注意：DTT对人眼、皮肤和呼吸系统有害。穿戴个人防护用品，并将其置于化学罩下。有关正确程序，请参阅制造商的安全数据表。 - 观察机器人将适当体积的ABC缓冲液转移到铝块中的样品管中。
注意：每个试管中ABC和蛋白质混合物的总体积为100μL，ABC缓冲液的体积在脚本中计算（V = 100μL减去100μg蛋白质样品的体积）。 - 确保机器人用ABC缓冲液将100μgBSA蛋白转移到每个试管中。
注意：典型的实验可能使用多达100μg蛋白质进行蛋白质消化，即50μL的2.0μg/ μL用于该BSA样品。 - 手动验证机器人程序是否已暂停并显示消息：在恢复协议之前，请确保DTT已加载到位于插槽4中的2 mL管架的A6中。确保将DTT管放入A6孔中并打开其盖子。单击Opentrons应用程序中的"恢复"按钮以继续。确保机器人将10μLDTT溶液转移到每个样品孔中，然后进行五轮混合。
- 验证机器人程序是否已暂停并显示消息：确保关闭样品管上的盖子。手动关闭管的盖子，然后单击" 恢复" 以继续。等到机器人的温度模块开始加热铝块，直到温度达到55°C，然后孵育5分钟，让样品达到55°C。
注意：机器人将温度保持在55°C下30分钟，以便在孵育期间通过DTT减少蛋白质。 - 在DTT孵育的30分钟内，通过将34.68mg IAA溶解在ABC缓冲液中至总体积为1mL来制备1mL 187.5mM碘乙酰胺（IAA）。用铝箔手动包裹IAA溶液，以避免暴露在光线下。
注意：IAA 可引起严重的眼睛和呼吸道刺激。在化学罩下处理它，穿着适当的PPE。 - 确保机器人的温度模块在完成30分钟的DTT孵育步骤后冷却。
注：模块温度达到22°C后，模块保持温度5分钟，使样品完全冷却。 - 当机器人的程序暂停时，打开样品管的盖子，并显示警告消息：确保打开样品管上的盖子。单击 "恢复" 以继续。
- 手动验证机器人的程序是否已暂停并显示警告消息：在恢复协议之前，请确保IAA已加载到位于插槽4中的2 mL管架的B6中。确认 IAA 管的机架位置并打开管盖。单击 "恢复" 以继续。确保机器人将10μLIAA转移到每个样品管，然后进行五轮混合。
- 当机器人的程序暂停时，盖上样品管并显示消息：关闭样品管上的盖子并用箔覆盖样品管。用一块干净的铝箔覆盖整个铝块。单击 "恢复" 以继续。等到样品在22°C下孵育30分钟。确保机器人的温度模块在完成IAA孵育后停用。
- 在IAA孵育（步骤2.19）期间以0.2μg/ μL的最终浓度制备胰蛋白酶溶液混合物：将20μg质谱/测序级胰蛋白酶溶解在100μLMS级水中。
- 当机器人的程序暂停时，将胰蛋白酶溶液放入2 mL管架的C6孔中，管盖打开并显示警告消息：在恢复方案之前，请确保胰蛋白酶已加载到位于插槽4中的2 mL管架的C6中。单击"恢复"以继续。
- 检查机器人的程序是否已暂停并显示警告消息：打开温度模块上样品管上的盖子。打开样品管的盖子，然后单击" 恢复 "继续。待机旁，机器人将10μL胰蛋白酶转移到每个样品管中，然后进行五轮混合。
- 用石蜡膜包裹样品管盖，将所有样品转移到温控混合器中，并在37°C下孵育16-20小时，振荡600rpm。
注意：胰蛋白酶消化也可以直接在37°C的温度模块上进行。
3. 使用SP3顺磁珠进行肽净化
- 在过夜胰蛋白酶消化后的第二天，使用台式微量离心机（≤2，000× g）短暂旋转样品（见 材料表），并将样品放在磁管架上。让样品静置2分钟。
- 用移液管小心地将上清液转移到一组新的蛋白质低结合微量离心管中。将样品保存在冰箱中，然后继续执行步骤3.2-3.9。
注意：对于长期储存，请将样品储存在-80°C。
- 用移液管小心地将上清液转移到一组新的蛋白质低结合微量离心管中。将样品保存在冰箱中，然后继续执行步骤3.2-3.9。
- 在文本编辑器中打开 SP3_peptide_cleanup.py Python 脚本，并根据需要在"仅在此处自定义"部分中指定。
注意：实验特定的变量包括样品和重复的数量，要转移的肽的体积，试剂（微珠，乙腈，DMSO）的体积，P20 / P50和P300移液器的起始尖端，以及在磁性模块上的深孔板中启动孔。每个BSA酶切样品含有约120μL的消化体积，这些体积将被等分成两个技术重复，每个重复中含有55μL。若要仅清理摘要的一半，请将复制数变量更改为 1。 - 将脚本上传到Opentrons应用程序中的"协议"选项卡。
- 将所需的实验室器皿和移液器放在Python脚本中指定的OT-2甲板中的相应位置（图3）。确保磁性模块已通电并连接到机器人。将新的2 mL 96孔深孔板（见 材料表）放在磁性模块的顶部。
- 打开" 校准 "选项卡，并对此 Python 脚本中所需的实验室器具和移液器的组合执行校准。
注意：相同实验室器具和移液器组合的校准只需执行一次，Opentrons 应用程序将记录校准参数。 - 将消化的样品（在步骤3.1中收集的上清液）垂直顺序放入A1，B1....
- 在 50 mL 锥形管中准备 15 mL LC-MS/MS 相容性乙腈，并将试管放入 A3 孔中，置于 4 合 1 管架上，顶部为 15 mL + 50 mL 管架。
- 通过在15 mL锥形管中加入100μLDMSO和4.9mL质谱级水来制备5 mL 2%DMSO。将管子放入15mL + 50mL管架中的A1孔中。
- 将空的50 mL锥形管标记为废物，并将其放入15mL + 50mL管架中的B3孔中。
- 按照参考文献16准备SP3磁珠。
- 在2.0 mL微量离心管中制备适量的混合微珠。
注意：每个肽净化反应需要10μL混合微珠。例如，制备至少40μL的混合微珠进行四次净化反应。 - 让珠子混合物在磁性支架上放置2分钟。用移液器小心地除去上清液，并用移液器测量上清液的体积。
- 计算珠子的剩余体积，并加入5-10倍质谱级水（例如，100-200μL水用于20μL珠子）和涡旋（速度10）10秒。将磁珠放在磁性支架上2分钟。
- 重复水洗步骤，共洗涤三次。
- 将最终磁珠重悬于MS级水中至终浓度为50μg/μL，将洗涤后的磁珠置于2.0 mL管架的A6孔中。
注：建议将磁珠以10μg/μL16的浓度重悬。在目前的优化工作中，最终浓度被修改为50μg/μL，以最小化珠-肽-乙腈混合物的总体积。
- 在2.0 mL微量离心管中制备适量的混合微珠。
- 确保机器人将55μL消化的样品转移到磁性模块上深孔板中的孔中。
- 验证机器人实验方案是否已暂停并显示以下消息：在恢复实验方案之前，请确保准备好的磁珠已加载到位于插槽4的2 mL管架的A6中。涡旋珠子，然后在迷你台式离心机上短暂旋转5秒，并将珠子放在2 mL管架的A6孔中，盖子打开。待命，机器人通过上下移液将珠子混合10次，持续五轮。
注意：机器人将10μL微珠转移到深孔板中的每个消化样品中，然后进行五次混合。 - 确保机器人将1，292μL乙腈转移到每个孔中，并通过上下移液立即混合10次，以促进肽和珠子结合。
注意：每次转印都要经过几轮才能完成，因为P300移液器一次只能转印多达300 μL。 - 确保机器人通过在深孔板中上下移液将所有样品混合五次。
- 等到磁性模块接合，样品在模块上孵育2分钟。
- 待机旁，移液抽吸和分液速度设置为从默认值150 μL/s减慢至25 μL/s。
注意：机器人从每个孔中缓慢取出上清液，并在磁性模块接合时将其丢弃在废物管中。 - 等到移液抽吸和分配速度恢复到默认设置。观察磁性模块是否脱离。
- 验证机器人的程序是否已暂停并显示以下消息：确保ACN管盖已关闭。手动打开乙腈管的盖子，然后将其放回管架上。单击 "恢复" 以继续。确保机器人转移1 mL乙腈以洗涤每个样品并立即混合10次。
- 确保机器人将所有样品混合10次以清洗样品。
- 待磁模块接合时，待命，将样品孵育 2 分钟。
- 等到机器人将移液吸气速度更改为慢速并缓慢地除去上清液并将其分配到废物管中。
- 观察机器人在磁性模块上孵育样品60秒，以使残留的乙腈蒸发，然后将移液吸出速度变回默认值。观察磁性模块是否脱离。
- 验证机器人的程序是否已暂停并显示消息：再次涡旋DMSO并打开大写字母。手动涡旋2%DMSO10秒，然后将其放回15 mL-50 mL管架中的A1孔中。单击 "恢复" 以继续。
- 确保机器人将80μL的2%DMSO转移到每个孔中，并立即混合10次。
- 确保机器人将所有样品混合10次，再混合五轮。
- 待磁模块接合时，待命，将样品孵育 2 分钟。
- 观察机器人将移液器吸液速度更改为慢速（25μL / s），并缓慢地将上清液转移到深孔板中的空孔中。
- 等到机器人在磁性模块上孵育样品2分钟，以去除样品中的残留珠子。
- 验证机器人的程序是否已暂停并显示消息：将新的2 mL管放入2 mL管架中，并确保管数与样品总数相匹配。
- 在最终的BSA消化样品之后，直接将第一个2mL微量离心管放入孔中。单击 "恢复" 以继续。
注意：例如，在该协议中测试的六个BSA消化样品位于孔A1，B1，C1，D1，A2和B2中。因此，新的2.0 mL管组被放置在井B3，C3，D3，...等等。 - 观察机器人将88μL样品从深孔板中的孔转移到新的2.0 mL管中。
注：实验方案中转印的体积（1.1 x 80 μL）经过优化，可确保将样品的整个体积吸入移液器吸头。 - 待机旁，机器人将移液器吸气速度更改为默认值并脱离磁性模块。
- 在真空蒸发器中手动干燥清洁的肽（见 材料表），然后进入第5部分或将干燥的样品储存在-20°C。
4. 用SP3顺磁性微球制备人心脏蛋白裂解物（5 mg / mL）的MS样品制备
- 打开 "SP3_digestion.py Python"脚本，并在"仅在此处自定义"部分中指定变量的值。
注意：变量包括样品数量和重复次数、样品浓度、试剂（DTT、IAA、胰蛋白酶、微珠、100% 和 80% 乙醇）、DTT 和 IAA 孵育时间、移液器 P20/P50 和 P300 的起始吸头，以及在磁性模块上的深孔板中启动孔。 - 按照第2节中的步骤2.2-2.23进行MS样品制备，使用单一蛋白牛血清白蛋白进行DTT和IAA孵育。有关这些步骤中的机器人甲板设置，请参阅 图1 。
- 在DTT和IAA孵育步骤（步骤2.15和2.19）期间准备新鲜的SP3微球混合物（每次纯化反应20μL微珠）进行蛋白质纯化（如步骤3.10中所述）。将珠子放入D6孔中的2 mL管架上。
- 验证机器人的程序是否已暂停，并显示以下消息：打开管盖。手动打开温度模块顶部铝块中的样品管，然后单击 "恢复 "继续。
- 确保机器人将所有样品从2.0 mL管转移到磁性模块顶部的新深孔板。
- 检查机器人的程序是否已暂停并显示消息：在恢复实验方案之前，确保准备好的磁珠已加载到位于插槽4中的2 mL管架的D6中。打开珠管盖，然后单击" 恢复 "以继续。
- 观察机器人将20μL微珠转移到深孔板中的每个孔中，五轮混合珠子和五轮混合样品珠混合物。
- 验证机器人的程序是否已暂停并显示消息：在恢复协议之前，确保100%乙醇已加载到位于插槽5中的15 mL-50 mL管架的A3中。在50 mL锥形管中准备10-20 mL 100%乙醇（即200证明乙醇，见 材料表），并将其置于机架的A3孔中。单击 "恢复" 以继续。
- 待机旁，机器人将140μL100%乙醇转移到板中的每个孔中，然后立即进行10轮混合，以促进肽与珠子的结合。
- 确保机器人通过每轮上下移液10次来混合每个样品，总共五轮混合。
- 待磁模块接合时待机，并将样品在模块上孵育2分钟。
- 观察机器人将移液速度变慢（25μL / s）并从每个孔中吸出上清液并将其分配到废物管中。
- 等到机器人将移液速度变回默认值并脱离磁性模块。
- 验证机器人的程序是否已暂停并显示消息：在恢复协议之前，确保80%的乙醇已加载到位于插槽5中的15 mL-50 mL管架的A4中。通过将4 mL MS级水与16 mL 100%乙醇（即200证明）混合，手动制备20 mL 80%乙醇。将80%乙醇放入管架的A4孔中。单击 "恢复" 以继续。确保机器人将1 mL的80%乙醇转移到每个孔中，并立即混合10次。
- 观察机器人将移液速度变慢（25μL / s），从每个孔中吸出上清液，然后分配到废液管中。等到机器人将移液速度变回默认值并脱离磁性模块。
- 当机器人的程序暂停时，打开ABC解决方案的盖子，并显示消息：打开ABC管上的盖子。单击 "恢复" 以继续。待机旁，机器人脱离磁性模块，将250μLABC转移到每个孔中，并立即混合10次。
注意：此步骤是用ABC洗涤样品。 - 确保机器人接合磁性模块并将样品在模块上孵育2分钟。
- 观察机器人将移液速度变慢（25μL / s）并将上清液从每个孔转移到废液管。等到机器人将100μLABC缓冲液转移到每个孔中，并立即混合10次。
- 验证机器人的程序是否已暂停并显示消息：在恢复协议之前，请确保已将新的收集管放置在2.0 mL铝块中。在最初进入铝块的最后一个样品管之后，立即将一组新的低蛋白保留微量离心管放入铝块中。单击 "恢复" 以继续。待机旁，机器人将ABC缓冲液中的每个样品转移到新的2.0 mL管中。
注意：检查孔，并在需要时手动将任何残留样品转移到试管中。 - 当机器人的程序暂停并显示以下消息时，通过将20μgMS级胰蛋白酶溶解在MS级水中至0.2μg/ μL的最终浓度来制备适量的MS级胰蛋白酶（每个样品10μL）：确保胰蛋白酶（0.2μg/ μL）已加载到位于插槽4中的2 mL管架的C6中，然后再恢复方案。确保机器人将10μL胰蛋白酶转移到每个样品管中，然后进行五轮混合。
- 用石蜡膜包裹样品管盖，将所有样品转移到温控混合器中，并在37°C下孵育16-20小时，振荡1，000转/分。
注意：建议以1，000 rpm振荡进行消化，以尽量减少珠子在过夜孵育期间的沉淀。
5. 使用SP3顺磁珠进行肽净化
- 按照步骤2中的逐步说明进行，使用SP3顺磁性珠进行肽纯化。
6. 液相色谱和质谱
- 通过将1 mL LC-MS级99%甲酸加入MS水中，将BSA（步骤2-3）和心脏裂解物（步骤4）肽重悬于0.1%甲酸中，总体积为1 L。
注意：甲酸是一种强酸。它对眼睛、皮肤和呼吸系统具有高度腐蚀性。在穿着PPE的化学引擎盖下小心处理。 - 使用定量肽测定试剂盒17 量化消化后肽浓度，并注射0.5μgBSA酶切和1.5μg心脏消化物进行LC-MS / MS分析。
- 设置用于LC-MS / MS分析的液相色谱程序。
注意：在典型的设置中，肽酶切物可以使用补充文件2中提供的参数加载到反相C18柱（3μm颗粒;100 Å孔隙;75μm x 150 mm;见材料表）上。 - 使用质谱仪（参见 材料表）使用 补充文件3中提供的参数获取霰弹枪蛋白质组学数据。
- 在蛋白质数据库中搜索蛋白质鉴定。
- 下载并安装所需的软件 MaxQuant。
注：此处使用 MaxQuant 软件 （v.1.6.10.43） 执行以下步骤（请参见 材料表）。 - 从高质量的蛋白质序列数据库（UniProt/SwissProt）下载精选的人类蛋白质组数据库（见 材料表）。单击" 下载 "按钮，然后选择 "FASTA（规范）"。
注意：如果需要，可以选择下载FASTA（非规范）以在数据库中包括每个基因的蛋白质亚型。 - 在MaxQuant软件界面中，通过导航到 "全局参数 "面板并单击" 序列 "选项卡，指定要用作蛋白质数据库的FASTA文件;然后，单击" 添加 "按钮以指定FASTA文件的文件路径。
- 在MaxQuant软件界面中，指定要分析的采集的原始质谱文件，方法是转到 "原始数据 "面板并单击" 加载 "按钮并选择原始文件。
- 设置搜索参数， 如表1所示。如果需要，启用无标记定量 （LFQ）。
- 等待搜索完成，并在 /combined/txt 文件夹中的 msms.txt 文件中找到通过 FDR 1% 阈值的肽谱匹配 （PSM） 的数量。
注意：在为代表性结果部分进行的比较中，映射到多种蛋白质的PSM被过滤掉，并且保留了映射到一种独特蛋白质的PSM以计数PSM，肽和蛋白质的数量（图4 和 图5）。
- 下载并安装所需的软件 MaxQuant。
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Representative Results
这里提供了三个与OT-2机器人兼容的Python脚本，它们使用单个蛋白质标准牛血清白蛋白（技术复制n = 5个消化）和一个含有洗涤剂的人心脏裂解物样品（n = 5个消化）执行质谱蛋白质组学的样品制备。每个消化产物被分成两个肽纯化反应。在每次运行BSA和心脏样品中，已鉴定的肽谱匹配（PSM），肽和蛋白质的数量如图 4 和 图5所示。BSA样本的中位数为728 PSM和65肽，变异系数（CV）分别为5.2%和3.2%。对于复杂的心脏样本，在10次运行中鉴定出9，526个PSM，7，558个肽和1，336个蛋白质的中位数，变异系数分别为7.6%，5.9%和3.6%。从心脏样本的10次运行中共鉴定出1，935种蛋白质，其中，在两次或多次运行中鉴定出1，677种蛋白质。为了确定肽定量的变异性，计算了映射到独特蛋白质的10种肽的提取离子色谱图（XIC）强度的CV（表2）。使用3种蛋白质标准样品和BCA测定法进一步比较了人类（手动移液）与机器人在测量蛋白质浓度方面的实验结果的变异性。发现机器人BCA测定的平均CV（7.57%）低于人体手动BCA测定（9.22%）（补充表1）。
当BSA消化方案间隔2个月执行并产生可比较的结果时，所述方案随着时间的推移显示出一致的性能。 图2 中唯一PSM和肽的中位数分别为728和65。在OT-2系统上进行的相同实验在2个月前平均产生647个PSM和54个肽（n = 2）（补充表2）。长期稳定性可以类似地估计。
手动工作台处理时间（不包括孵育时间）在机器人协议和人工处理之间计算每个样品制备18 。在没有去除洗涤剂的情况下，在消化方案下进行肽脱盐，机器人系统的手动处理时间为41分钟，而手动处理时间为61分钟。通过去除洗涤剂，消化和肽脱盐方案，机器人系统的手动处理时间为54分钟，而手动处理时间为79分钟。因此，半自动实验方案可减少每个样品约 20-25 分钟的手动工作台处理时间。当处理许多样品时，这种时间减少变得相当可观，并且当并行使用多个OT-2机器人时，可能会进一步改善。
图 1：示意图工作流程。 用洗涤剂辅助剂提取的蛋白质需要在消化前进行额外的洗涤剂去除步骤进行处理。蛋白质样品被消化，肽在OT-2机器人系统上脱盐。将肽消化物注射到Q-Exactive HF质谱仪中，并结合纳米LC。根据蛋白质数据库搜索MS光谱以进行蛋白质鉴定。 请点击此处查看此图的放大版本。
图2：为蛋白质消化设置的机器人甲板。 图中显示了吸头架、样品、垃圾桶、温度模块和磁性模块的指定位置。星号表示只有具有洗涤剂去除步骤的消解方案才需要的实验室器具和试剂。带数字的框表示未占用的甲板位置。 请点击此处查看此图的放大版本。
图 3：为肽纯化脚本设置的机器人甲板。 图中显示了吸头架、样品、垃圾桶和磁性模块的指定位置。带数字的框表示未占用的甲板位置。 请点击此处查看此图的放大版本。
图4：在BSA蛋白消化中检测到的肽谱匹配（PSM）和肽的数量（n = 5）。 每个消化物被分成两个，用于技术复制肽的纯化（R1和R2）。变异系数：PSM为5.2%;肽为3.2%。 请点击此处查看此图的放大版本。
图5：从人心裂解物中鉴定出的PSM，肽和蛋白质的数量。 用SP3洗涤剂去除进行五次消化。每个消化物被分成两个用于肽清除（R1和R2）。变异系数：PSM为7.6%;肽为5.9%;蛋白质为3.6%。 请点击此处查看此图的放大版本。
| 消化酶 | 胰蛋白酶/肽 |
| 最沟缺失 | 2 |
| 固定修改 | 半胱氨酸的氨基甲酰胺甲基化 |
| 变量修改 | N-末端蛋白乙酰化;蛋氨酸的氧化 |
| 肽长度范围 | 7 – 25 aa |
| 前驱体质量公差 | ± 4.5 页/分钟 |
| MS/MS 离子质量公差 | ± 20 页/分钟 |
| 无标记定量 | 低频 |
| 肽谱匹配 （PSM） 的错误发现率 （FDR） | 0.01 |
表1：肽数据库（MaxQuant）的搜索参数。
| 肽 | 蛋白质 ID | 植物生长促进会 | 中位数 XIC 强度 | 简历 | |
| LSTSQIPQSQIR | Q92523 | 7.72E-08 | 1.96E+07 | 6.70% | |
| SEDFSLPAYMDR | P13072 | 9.64E-17 | 8.05E+08 | 7.30% | |
| YLQEIYNSNNQK | P02678 | 2.76E-23 | 9.69E+08 | 7.60% | |
| TDDCHPWVLVVVK | P17173 | 4.51E-14 | 4.60中+08 | 8.60% | |
| VIVVGNPANTNCLTASK | P40924 | 7.90E-29 | 1.17E+09 | 8.70% | |
| DYIWNTLNSGR | O75390 | 1.63E-15 | 1.38E+08 | 8.80% | |
| VSVPTHPEAVGDASLTVVK | P13612 | 1.86E-09 | 6.77E+07 | 9.10% | |
| QVAEQFLNMR | P22696 | 3.25E-08 | 1.09E+08 | 9.30% | |
| NTFWDVDGSMVPPEWHR | Q9UI09 | 2.05E-11 | 4.00中+07 | 9.60% | |
| SASDLTWDNLK | P02786 | 5.29E-11 | 1.92E+09 | 9.80% | |
表2：提取的离子色谱图（XIC）强度定量的10肽。
补充表1：手动和自动BCA测定的比较。请点击此处下载此表格。
补充表2：与图4中处理的样品分开进行2个月的BSA消解。请点击此处下载此表格。
补充文件1：开发的Python脚本的副本。请点击此处下载此文件。
补充文件2： 用于LC-MS/MS分析的液相色谱程序的方法参数。 请单击此处下载此文件。
补充文件3：使用质谱仪获取霰弹枪蛋白质组学数据的方法参数。 请单击此处下载此文件。
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Discussion
协议中的关键步骤
为了获得最佳性能，应使用与OT-2兼容的Opentrons验证的实验室器具，模块和耗材。可以按照 Opentrons 在 Reference14 中的说明创建自定义实验室器具。确保在首次使用时校准OT-2甲板，移液器和实验室器具。遵循SP3磁珠制造商的指南来制备用于肽和蛋白质纯化的微球也至关重要。值得注意的是，在磁珠和肽结合反应过程中，结合反应中乙腈的体积需要≥95%，磁珠浓度需要≥0.1μg/μL。将肽浓度保持在10μg/mL-5mg/mL的范围内。在肽纯化脚本中优化参数的情况下，乙腈体积比为95%，磁珠浓度为0.37 μg/μL，肽浓度在14-37 μg/mL范围内。根据我们的经验，肽质量在100μL消化反应中估计为40-100μg。对于SP3蛋白纯化，使用5-10μg微珠至1μg蛋白，并确保在蛋白结合过程中最小微球浓度为0.5μg/ μL。推荐的蛋白质浓度在10μg/mL-5mg/mL的范围内。使用提供的脚本中的默认参数，1mg磁珠用于100μg蛋白质，结合过程中的磁珠浓度为3.75μg/μL，而蛋白质浓度为0.35mg/mL。
修改和故障排除
Python 脚本中的默认变量针对我们实验室的标准工作流进行了优化。如果需要，用户需要调整变量以使脚本与其应用程序兼容。如果观察到低MS强度，请在蛋白质BCA测定和定量肽测定的每个重要方案部分后检查蛋白质或肽损失。首次在OT-2上使用协议时，请观察机器人对每个步骤的处理，以确保机器人按预期执行程序。在撰写本文时，P50电动移液器在Opentrons商店中不再可用。当前脚本已修改，以指示 P20 移液器在何处使用。如有必要，用户可以参考Opentrons API来修改脚本以使用其他移液器。
该技术的局限性
尽管使用机器人液体处理系统具有优势，但应谨慎对待技术重复之间的流体输送性能。强烈建议在初始设置和液体处理步骤期间监控机器人。在机器人液体转移后，可能需要手动回收残留体积，以避免样品损失并减少可变性。
对现有方法的意义
该协议描述了一种基于半自动质谱的样品制备方法，使用低成本和开源的OT-2液体处理机器人。最近，其他工作也开始将OT-2用于蛋白质组学应用11。与现有方法相比，该协议的显着特征包括使用相对低成本的Python可编程机器人;在样品制备方案的两个步骤中掺入半自动SP3微球，即蛋白质样品洗涤剂去除步骤和肽脱盐/纯化步骤;以及开源Python脚本的可用性，以支持进一步的开发。SP3 顺磁性微球可有效结合蛋白质和肽，并与自动液体处理系统配合使用，用于 MS 样品制备中酶消化前的蛋白质清理/去污剂去除11，13。
向研究人员提供了三个开源Python脚本以及该协议。这些脚本可针对各个实验条件（例如，样品编号、重复次数、孵育温度和时间等）进行定制，并允许进一步开发修改后的工作流程。这些方案在我们实验室的MS运行之间的肽和/或蛋白质鉴定数量方面提供了出色的3%-6%的技术简历，可与以前在其他液体处理系统上的工作（<20%）相媲美9，11。
未来应用
该协议展示了低成本可编程液体处理系统与SP3微球结合使用用于半自动蛋白质组学样品制备的实用性，这可能潜在地适用于质谱实验室和核心设施，以提高样品处理的效率。
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Disclosures
作者没有冲突要声明。
Acknowledgments
这项工作得到了NIH授予YH的F32-HL149191奖的部分支持;R00-HL144829 至 EL;R21-HL150456， R00-HL127302， R01-HL141278 至 MPL. 图 1、 图 2、 图 3 是在基于 Web 的科学插图工具（BioRender.com）的帮助下创建的。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 300 µL pipette tips | Opentrons | ||
| 4-in-1 tube rack set | Opentrons | Each set includes 2 base stands and 4 tube holder tops 1.5mL, 2mL, 15mL + 50mL, 15mL, and 50mL. We use 2mL and 15 mL + 50 mL tops in this study. | |
| Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Column | Thermo Scientific | #164568 | 3 μm particle; 100 Å pore; 75 μm x 150 mm |
| Acetonitrile LC-MS grade | VWR | #JT9829 | |
| Aluminum block set | Opentrons | This block set includes 3 tops that are compatible with 96-well, 2.0 mL tubes and a PCR strip to use with the OT-2 temperature module. We use the 2.0mL tube holder in this manuscript. | |
| Ammonium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | # A6141 | |
| Bovine Serum Albumin Standard, 2 mg/mL | Thermo Scientific | #23210 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) LC-MS grade | Thermo Scientific | #85190 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | #D5545 | |
| EASY-Spray HPLC Columns | Thermo Scientific | #ES800A | |
| EasynLC 1200 Nano LC | Thermo Scientific | #LC140 | |
| Ethanol Proof 195-200 | Fisher | #04-355-720 | |
| Formic Acid LC-MS grade | Thermo Scientific | #85178 | |
| Human heart lysate | Novus Biologicals | NB820-59217 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | #I1149 | |
| Magnetic tube rack | Thermo Scientific | #MR02 | |
| MAXQuant v.1.6.10.43 | Tyanova et al., 2016 (https://www.maxquant.org/) | ||
| mySPIN 6 Mini Centrifuge | Thermo Scientific | #75004061 | benchtop mini centrifuge for quick spin |
| NEST 2 mL 96-Well Deep Well Plate, V Bottom | Opentrons | ||
| OT-2 magnetic module | Opentrons | GEN1 | |
| OT-2 P300 single channel pipette | Opentrons | GEN1 | |
| OT-2 P50 single channel pipette | Opentrons | GEN1 | |
| OT-2 robot pipetting robot | Opentrons | OT-2 | |
| OT-2 temperature module | Opentrons | GEN1 | |
| Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Scientific | #23275 | |
| Protein LoBind tubes 2.0 mL | Eppendorf | #022431102 | |
| Protein Sequence Database | UniProt/SwissProt | https://www.uniprot.org/uniprot/?query=proteome:UP000005640% 20reviewed:yes |
|
| Sera-Mag SpeedBead Carboxylate-Modified Magnetic Particles, Hydrophobic | Cytiva | #65152105050250 | |
| Sera-Mag SpeedBead Carboxylate-Modified Magnetic Particles, Hydrophylic | Cytiva | #45152105050250 | |
| SpeedVac | Thermo Scientific | Vacuum evaporator | |
| Thermo Q Exactive HF Mass Spectrometer | Thermo Scientific | #IQLAAEGAAPFALGMBFZ | |
| Trypsin MS Grade | Thermo Scientific | #90057 | |
| Water LC-MS grade | VWR | #BDH83645.400 |
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