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Biochemistry

शॉटगन प्रोटिओमिक्स नमूना प्रसंस्करण एक ओपन-सोर्स लैब रोबोट द्वारा स्वचालित

Published: October 28, 2021 doi: 10.3791/63092
Automatic Translation
1,3, 1,3, 1,3, 1,3, 1,2,3
1Department of Medicine-Cardiology, University of Colorado Anschutz Medical Campus, 2Department of Biochemistry & Molecular Genetics, University of Colorado Anschutz Medical Campus, 3Consortium for Fibrosis Research & Translation, School of Medicine, University of Colorado Anschutz Medical Campus

Summary

मास स्पेक्ट्रोमेट्री प्रयोगों के लिए अर्ध-स्वचालित प्रोटीन नमूना तैयारी करने के लिए एक ओपन-सोर्स रोबोटिक लिक्विड हैंडलिंग सिस्टम के संचालन के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल और तीन पायथन स्क्रिप्ट प्रदान किए जाते हैं, जिसमें डिटर्जेंट हटाने, प्रोटीन पाचन और पेप्टाइड डिसाल्टिंग चरणों को कवर किया जाता है।

Abstract

मास स्पेक्ट्रोमेट्री-आधारित शॉटगन प्रोटिओमिक्स प्रयोगों के लिए एंजाइमेटिक प्रोटीन पाचन और क्लीन-अप सहित कई नमूना तैयारी चरणों की आवश्यकता होती है, जो महत्वपूर्ण व्यक्ति-घंटे के बेंच श्रम को ले सकते हैं और बैच-टू-बैच परिवर्तनशीलता का स्रोत प्रस्तुत कर सकते हैं। pipetting रोबोट के साथ प्रयोगशाला स्वचालन मैनुअल काम को कम कर सकते हैं, थ्रूपुट को अधिकतम, और अनुसंधान reproducibility में वृद्धि. फिर भी, मानक स्वचालन स्टेशनों की खड़ी शुरुआती कीमतें उन्हें कई अकादमिक प्रयोगशालाओं के लिए अफोर्डेबल बनाती हैं। यह आलेख वर्णन करता है कि एक प्रोटिओमिक्स नमूना तैयारी वर्कफ़्लो एक सस्ती, ओपन-सोर्स स्वचालन प्रणाली (Opentrons OT-2) का उपयोग करके, जिसमें अर्ध-स्वचालित प्रोटीन कमी, अल्काइलेशन, पाचन और क्लीन-अप चरणों को सेट करने के लिए निर्देश शामिल हैं; साथ ही साथ अपने एप्लिकेशन प्रोग्रामिंग इंटरफ़ेस के माध्यम से ओटी -2 सिस्टम को प्रोग्राम करने के लिए ओपन-सोर्स पायथन स्क्रिप्ट के साथ।

Introduction

मास स्पेक्ट्रोमेट्री-आधारित शॉटगन प्रोटिओमिक्स एक साथ जैविक नमूनों में कई प्रोटीनों की बहुतायत को मापने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण के साथ प्रोटिओमिक्स प्रयोगों को नियमित रूप से बायोमार्कर की पहचान करने और संबंधित जैविक परिसरों और पैथोलॉजिकल तंत्रों को रेखांकित करने वाले मार्गों की खोज करने के लिए नियोजित किया जाता है। अपनी उच्च विश्लेषक विशिष्टता और संभावित मात्रात्मक सटीकता के साथ, शॉटगन प्रोटिओमिक्स में एंटीबॉडी 1,2 पर भरोसा करने की आवश्यकता के बिना नैदानिक नमूना विश्लेषण के लिए अनुसंधान सुविधाओं और नैदानिक प्रयोगशालाओं द्वारा अपनाए जाने की उत्कृष्ट क्षमता भी है।

शॉटगन प्रोटिओमिक्स विश्लेषण के लिए प्रोटीन के नमूने तैयार करने के लिए, जैविक नमूनों (जैसे, कोशिकाओं और ऊतकों) से निकाले गए प्रोटीन को आमतौर पर पहले लंबे प्रोटोकॉल का उपयोग करके संसाधित करने की आवश्यकता होती है, जिसमें नमूना प्रोटीन एकाग्रता, प्रोटीन में कमी और अल्काइलेशन, और पेप्टाइड्स में एंजाइमेटिक पाचन को मापना शामिल है। इसके अलावा, डिटर्जेंट युक्त सामान्य लाइसिस बफर में निकाले गए प्रोटीन को अक्सर विश्लेषण से पहले बफर एक्सचेंज या डिटर्जेंट हटाने के अतिरिक्त चरणों की आवश्यकता होती है क्योंकि डिटर्जेंट ट्रिप्सिन पाचन में हस्तक्षेप कर सकता है और डाउनस्ट्रीम तरल क्रोमैटोग्राफी-टैंडेम मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एमएस / एमएस) विश्लेषण 3 के प्रदर्शन को काफी नीचा दिखा सकता है। पेप्टाइड्स आमतौर पर एंजाइमेटिक पाचन के बाद एलसी-एमएस / एमएस संगत सॉल्वैंट्स में आगे desalted, सूखे और पुनर्गठित होते हैं। ये प्रोटीन जैव रसायन प्रक्रियाएं श्रम-गहन और समय लेने वाली हो सकती हैं। इस प्रकार, वे प्रोटिओमिक्स वर्कफ़्लोज़ के थ्रूपुट को सीमित करना जारी रखते हैं और अधिग्रहित डेटा 4,5 की परिवर्तनशीलता में योगदान करते हैं। मानव त्रुटियों और पूर्वाग्रहों को डेटा विचरण और पुनरुत्पादन 6,7 को प्रभावित करने वाले महत्वपूर्ण कारकों के रूप में पहचाना गया है। मास स्पेक्ट्रोमेट्री नमूना तैयारी वर्कफ़्लो में मानव त्रुटियों को कम करने के लिए, स्वचालित पिपेटिंग रोबोटिक सिस्टम का उपयोग शॉटगन प्रोटिओमिक्स और लक्षित मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण से प्रोटीन की पहचान और परिमाणीकरण के थ्रूपुट और पुनरुत्पादन में सुधार करने के लिए किया गया है, जहां इस तरह की प्रगति को महत्वपूर्ण अनुसंधान और नैदानिक सेटिंग्स में प्रोटिओमिक्स प्रौद्योगिकियों को व्यापक रूप से अपनाने के लिए धक्का जारी रखने के लिए सहायक के रूप में स्वागत किया गया है8, 9,10,11,12,13. हालांकि, अधिकांश मौजूदा प्रोटोकॉल रोबोट तरल हैंडलिंग प्लेटफार्मों का उपयोग करते हैं जिनके लिए पर्याप्त निवेश और प्रशिक्षण की आवश्यकता होती है, अकादमिक वातावरण में या अन्यथा सीमित बजट के साथ कई प्रयोगशालाओं में उनकी उपयोगिता को सीमित करता है।

यह आलेख वर्णन करता है कि एक प्रोटोकॉल जो एक विशिष्ट शॉटगन प्रोटिओमिक्स नमूना तैयारी वर्कफ़्लो को अर्ध-स्वचालित करने के लिए कम लागत, ओपन-सोर्स रोबोट तरल हैंडलिंग सिस्टम, OT-2 का उपयोग करता है। ओटी -2 में कई अन्य रोबोट तरल हैंडलिंग सिस्टम की तुलना में कम लागत है, और लेखन के समय, लगभग $ 5,000 अमेरिकी डॉलर की लागत आती है। जब विभिन्न मॉड्यूल और लैबवेयर की कीमतों में फैक्टरिंग होती है, तो लेखन के समय इस प्रोटोकॉल में प्रयोगों को स्थापित करने की कुल लागत लगभग $ 10,000 होती है, जो इसे अधिक महंगे विकल्पों पर प्रयोगशालाओं के काफी व्यापक सेट के लिए अधिक सस्ती बनाती है। ओटी -2 पायथन स्क्रिप्ट के माध्यम से ओपन-सोर्स प्रोग्रामिंग के साथ संगत है और उपयोगकर्ता-परिभाषित DIY प्रोटोकॉल डिजाइन में महान लचीलापन प्रदान करता है। तीन इन-हाउस विकसित लिपियों का उपयोग करते हुए, नीचे दिए गए प्रोटोकॉल एक ठेठ शॉटगन प्रोटिओमिक्स नमूना तैयारी वर्कफ़्लो को ओटी -2 स्टेशन पर एक ठेठ एटिपिकल प्रोटीन मानक (गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन) के साथ निष्पादित करते हैं; बीएसए) और एक सामान्य मानव हृदय लिसेट का एक जटिल प्रोटीन नमूना (चित्रा 1)। प्रसंस्करण के लिए प्रक्रियाएं (1) एक बीएसए नमूना और (2) एक जटिल कार्डियक लिसेट नमूना क्रमशः प्रोटोकॉल अनुभागों 1, 2, 5, 6 और 3, 4, 5, 6, में विस्तृत हैं। सेरा-मैग कार्बोक्सीलेट-संशोधित चुंबकीय मोतियों का उपयोग प्रोटीन और पेप्टाइड नमूनों में डिटर्जेंट और लवण को हटाने के लिए एकल-पॉट ठोस-चरण-संवर्धित नमूना तैयारी (एसपी 3) में किया जाता है। गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन और मानव हृदय प्रोटीन से ट्राइप्टिक डाइजेस्ट को एसपी 3 मोतियों द्वारा आगे साफ किया जाता है और एलसी-एमएस / एमएस विश्लेषण के लिए प्रस्तुत किया जाता है। मास स्पेक्ट्रा तो पेप्टाइड और प्रोटीन की पहचान के लिए MaxQuant सॉफ्टवेयर का उपयोग कर विश्लेषण कर रहे हैं. हमारे द्वारा किए गए प्रतिनिधि परिणामों से पता चलता है कि प्रोटोकॉल बेंच समय की बचत करते हुए भिन्नता (सीवी) के उत्कृष्ट तकनीकी गुणांक प्राप्त करता है और हाथ को पचाने के लिए गैर-अवर है।

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Protocol

विकसित पायथन लिपियों को गिटहब पर जमा किया गया है: https://github.com/MaggieLam-Lab/StandardDigestion-Opentrons। लिपियों की एक प्रति अनुपूरक फ़ाइल 1 में दी गई है। कृपया नवीनतम संस्करणों के लिए GitHub रिपॉजिटरी देखें।

1. प्रयोगात्मक तैयारी

  1. प्रोटोकॉल शुरू करने से पहले आवश्यक हार्डवेयर की जाँच करें।
    नोट: निम्नलिखित हार्डवेयर घटकों की आवश्यकता होती है: OT-2 पिपेट, पिपेट युक्तियाँ, 4-इन-1 ट्यूब रैक सेट, एल्यूमीनियम ब्लॉक सेट, चुंबकीय मॉड्यूल, तापमान मॉड्यूल, 96-अच्छी तरह से 2 mL गहरी अच्छी तरह से प्लेटें ( सामग्री की तालिका देखें)।

2. मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) एक एकल प्रोटीन गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (बीएसए) के साथ नमूना तैयारी

  1. किसी पाठ संपादक में NoSP3_digestion.py स्क्रिप्ट खोलें और केवल यहाँ अनुकूलित करें अनुभाग में आवश्यकतानुसार प्रयोग-विशिष्ट चर निर्दिष्ट करें.
    नोट:: प्रयोग-विशिष्ट चर नमूनों की संख्या और प्रतिकृति शामिल हैं; नमूना एकाग्रता; अभिकर्मकों dithiothreitol की मात्रा - डीटीटी, iodoacetamide - IAA, और ट्रिप्सिन; डीटीटी और आईएए समय इनक्यूबेशन, और पिपेट पी 20 / पी 50 और पी 300 के लिए शुरुआती टिप)।
    1. Opentrons अनुप्रयोग खोलें और Opentrons अनुप्रयोग में प्रोटोकॉल टैब के लिए स्क्रिप्ट अपलोड करें।
      नोट:: Opentrons अनुप्रयोग संदर्भ 14 से एक स्थानीय कंप्यूटर के लिए डाउनलोड किया जा सकता है। लेखन के समय, Opentrons P50 इलेक्ट्रॉनिक पिपेट Opentrons स्टोर में खरीद के लिए अनुपलब्ध है। इसे प्रोटोकॉल में निर्दिष्ट वॉल्यूम के साथ संगत P20 सिंगल-चैनल इलेक्ट्रॉनिक पिपेट के साथ बदल दिया गया है। P50 पिपेट को P20 पिपेट के साथ बदलने के लिए स्क्रिप्ट में नोट्स और निर्देश बनाए गए हैं। उपयोगकर्ताओं को Opentrons API निर्देश के बाद इस प्रोटोकॉल के साथ विशेष पिपेट की संगतता का परीक्षण और सत्यापित करने की आवश्यकता हो सकती है।
  2. रोबोट टैब खोलें और Opentrons अनुप्रयोग में चरण-दर-चरण ऑन-स्क्रीन निर्देशों का पालन करते हुए रोबोट टैब में रोबोट डेक अंशांकन कैलिब्रेट डेक निष्पादित करें।
    नोट:: यह चरण केवल तभी आवश्यक है जब इसे पहले लागू नहीं किया गया है या रोबोट को हाल ही में स्थानांतरित किया गया है।
  3. टिप लंबाई अंशांकन करने के लिए PIPETTES प्रबंधित करें बटन पर क्लिक करें, इसके बाद डिफ़ॉल्ट टिप और पिपेट संयोजन स्थिति को कैलिब्रेट करने के लिए पिपेट ऑफसेट अंशांकन किया जाता है।
    नोट:: यह चरण आवश्यक है यदि पहली बार के लिए एक पिपेट का उपयोग किया जाता है।
  4. पायथन स्क्रिप्ट (चित्रा 2) में निर्दिष्ट OT-2 डेक में संबंधित स्थान पर आवश्यक लैबवेयर और पिपेट्स रखें।
    नोट: सुनिश्चित करें कि तापमान मॉड्यूल जुड़ा हुआ है और पर संचालित है, और एल्यूमीनियम ब्लॉक तापमान मॉड्यूल के शीर्ष पर रखा गया है।
  5. कैलिब्रेट टैब खोलें और इस पायथन स्क्रिप्ट में आवश्यक लैबवेयर और पिपेट्स के संयोजन के लिए अंशांकन करें।
    नोट:: Opentrons अनुप्रयोग अंशांकन पैरामीटर, जो एक ही labware और पिपेट्स के साथ भविष्य के अनुप्रयोगों के लिए आवश्यक नहीं है रिकॉर्ड करेगा।
  6. 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में 5 एमएल की कुल मात्रा में मास स्पेक्ट्रोमेट्री-ग्रेड पानी में एबीसी के 39.53 मिलीग्राम को भंग करके 100 एमएम अमोनियम बाइकार्बोनेट (एबीसी) (पीएच ~ 8.0) समाधान के 5 एमएल तैयार करें। अमोनियम बाइकार्बोनेट बफर 15 एमएल + 50 एमएल ट्यूब धारक शीर्ष के साथ 4-इन-1 ट्यूब रैक के ए 1 कुएं में रखें।
  7. एक 2.0 मिलीलीटर प्रोटीन कम बाइंड ट्यूब में गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (बीएसए) प्रोटीन के 1 एमएल तैयार करें ( सामग्री की तालिका देखें)। 2 एमएल ट्यूब धारक शीर्ष के साथ 4-इन-1 ट्यूब रैक के ए 1 कुएं में नमूना रखें।
  8. मैन्युअल रूप से तापमान मॉड्यूल के शीर्ष पर एल्यूमीनियम ब्लॉक में A1, B1, C1, D1, E1, F1, A2, आदि के कुओं में 2.0 mL प्रोटीन कम-बाइंड ट्यूब रखें।
    नोट:: रोबोट पिपेट A1 (पहला नमूना) से शुरू होने वाले ऊर्ध्वाधर क्रम में डिफ़ॉल्ट रूप से अंतिम नमूना तक नमूने वितरित करेगा। क्षैतिज वितरण निर्दिष्ट किया जा सकता है। विवरण के लिए 15 देखें। तैयार किए जाने वाले ट्यूबों की कुल संख्या नमूनों की कुल संख्या के बराबर होनी चाहिए (यानी, प्रति नमूना तकनीकी प्रतिकृतियों की संख्या से गुणा किए गए जैविक नमूनों की संख्या)।
  9. 1 मिलीलीटर की कुल मात्रा के लिए मास स्पेक्ट्रोमेट्री ग्रेड पानी में डीटीटी ठोस के 9.26 मिलीग्राम को भंग करके 60 एमएम डीटीटी के 1 एमएल तैयार करें। डीटीटी को 2 एमएल ट्यूब होल्डर टॉप के साथ 4-इन-1 ट्यूब रैक के ए 6 कुएं में रखें।
    सावधानी: डीटीटी मानव आंखों, त्वचा और श्वसन प्रणाली के लिए हानिकारक है। पीपीई पहनें और इसे एक रासायनिक हुड के तहत संभालें। उचित प्रक्रियाओं के लिए निर्माता की सुरक्षा डेटा शीट देखें।
  10. निरीक्षण करें, जबकि रोबोट एल्यूमीनियम ब्लॉक में नमूना ट्यूबों के लिए एबीसी बफर की एक उपयुक्त मात्रा स्थानांतरित करता है।
    नोट: प्रत्येक ट्यूब में ABC और प्रोटीन मिश्रण की कुल मात्रा 100 μL है, और ABC बफर की मात्रा स्क्रिप्ट में गणना की जाती है (V = 100 μL प्रोटीन नमूने के 100 μg की मात्रा को घटाकर)।
  11. सुनिश्चित करें कि रोबोट एबीसी बफर के साथ प्रत्येक ट्यूब के लिए बीएसए प्रोटीन के 100 μg स्थानांतरित करता है।
    नोट: एक विशिष्ट प्रयोग प्रोटीन पाचन के लिए प्रोटीन के 100 μg तक का उपयोग कर सकता है, यानी, इस BSA नमूने के लिए 2.0 μg / μL के 50 μL।
  12. मैन्युअल रूप से सत्यापित करें कि रोबोट प्रोग्राम को रोक दिया गया है और संदेश प्रदर्शित करता है: सुनिश्चित करें कि प्रोटोकॉल को फिर से शुरू करने से पहले स्लॉट 4 में स्थित 2 एमएल ट्यूब रैक के ए 6 में डीटीटी लोड किया गया है। सुनिश्चित करें कि एक डीटीटी ट्यूब को ए 6 कुएं में रखा गया है और इसकी टोपी खोलें। जारी रखने के लिए Opentrons एप्लिकेशन में फिर से शुरू बटन पर क्लिक करें। सुनिश्चित करें कि रोबोट प्रत्येक नमूने में डीटीटी समाधान के 10 μL को अच्छी तरह से स्थानांतरित करता है, इसके बाद पांच मिश्रण राउंड होते हैं।
  13. सत्यापित करें कि रोबोट प्रोग्राम रोक दिया गया है और संदेश प्रदर्शित करता है: नमूना ट्यूबों पर कैप्स बंद करने के लिए सुनिश्चित करें। मैन्युअल रूप से ट्यूबों की टोपी को बंद करें और जारी रखने के लिए फिर से शुरू पर क्लिक करें। तब तक प्रतीक्षा करें जब तक कि रोबोट का तापमान मॉड्यूल एल्यूमीनियम ब्लॉक को गर्म करना शुरू न कर दे जब तक कि तापमान 55 डिग्री सेल्सियस तक नहीं पहुंच जाता है, इसके बाद नमूनों को 55 डिग्री सेल्सियस तक पहुंचने की अनुमति देने के लिए 5 मिनट का इनक्यूबेशन होता है।
    नोट: रोबोट इनक्यूबेशन के दौरान डीटीटी द्वारा प्रोटीन में कमी की अनुमति देने के लिए 30 मिनट के लिए 55 डिग्री सेल्सियस पर तापमान रखेगा।
  14. डीटीटी इनक्यूबेशन के 30 मिनट के दौरान, एबीसी बफर में 34.68 मिलीग्राम आईएए को 1 एमएल की कुल मात्रा में 1 एमएल करने के लिए एबीसी बफर में 34.68 मिलीग्राम आईएए को भंग करके 187.5 एमएम आयोडोएसीटमाइड (आईएए) का 1 एमएल तैयार करें। प्रकाश के संपर्क से बचने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी के साथ आईएए समाधान को मैन्युअल रूप से लपेटें।
    सावधानी: आईएए गंभीर आंखों और श्वसन जलन का कारण बन सकता है। उचित पीपीई पहने हुए एक रासायनिक हुड के नीचे इसे संभालें।
  15. सुनिश्चित करें कि रोबोट का तापमान मॉड्यूल 30 मिनट डीटीटी इनक्यूबेशन चरण को पूरा करने पर ठंडा हो जाता है।
    नोट: मॉड्यूल का तापमान 22 डिग्री सेल्सियस तक पहुंचने के बाद, मॉड्यूल नमूनों को पूरी तरह से ठंडा करने की अनुमति देने के लिए 5 मिनट के लिए तापमान बनाए रखता है।
  16. रोबोट के कार्यक्रम को रोक दिया जाता है और चेतावनी संदेश प्रदर्शित करते समय नमूना ट्यूबों को अनकैप करें: नमूना ट्यूबों पर कैप्स खोलने के लिए सुनिश्चित करें। जारी रखने के लिए Resume पर क्लिक करें।
  17. मैन्युअल रूप से सत्यापित करें कि रोबोट के प्रोग्राम को चेतावनी संदेश के साथ रोक दिया गया है: सुनिश्चित करें कि प्रोटोकॉल को फिर से शुरू करने से पहले स्लॉट 4 में स्थित 2 एमएल ट्यूब रैक के बी 6 में आईएए लोड किया गया है। IAA ट्यूब के रैक स्थान की पुष्टि करें और ट्यूब कैप खोलें। जारी रखने के लिए Resume पर क्लिक करें। सुनिश्चित करें कि रोबोट पांच मिश्रण दौर के बाद प्रत्येक नमूना ट्यूब के लिए आईएए के 10 μL स्थानांतरित करता है।
  18. रोबोट के कार्यक्रम को रोक दिया जाता है और संदेश प्रदर्शित करते समय नमूना ट्यूबों को कैप करें: नमूना ट्यूबों पर कैप बंद करें और पन्नी के साथ नमूना ट्यूबों को कवर करें। पन्नी के एक साफ टुकड़े के साथ पूरे एल्यूमीनियम ब्लॉक को कवर करें। जारी रखने के लिए Resume पर क्लिक करें। तब तक प्रतीक्षा करें जब तक कि नमूने 30 मिनट के लिए 22 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट न हो जाएं। सुनिश्चित करें कि रोबोट का तापमान मॉड्यूल आईएए इनक्यूबेशन के पूरा होने पर निष्क्रिय हो जाता है।
  19. 0.2 μg / μL की अंतिम एकाग्रता पर IAA इनक्यूबेशन (चरण 2.19) के दौरान ट्रिप्सिन समाधान का मिश्रण तैयार करें: एमएस-ग्रेड पानी के 100 μL में द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री / अनुक्रमण-ग्रेड ट्रिप्सिन के 20 μg को भंग करें।
  20. जब रोबोट के कार्यक्रम को रोक दिया जाता है और चेतावनी संदेश प्रदर्शित करता है तो ट्यूब कैप के साथ 2 एमएल ट्यूब रैक के सी 6 कुएं में ट्रिप्सिन समाधान रखें और चेतावनी संदेश प्रदर्शित करता है: सुनिश्चित करें कि प्रोटोकॉल को फिर से शुरू करने से पहले स्लॉट 4 में स्थित 2 एमएल ट्यूब रैक के सी 6 में ट्रिप्सिन लोड किया गया है। जारी रखने के लिए Resume पर क्लिक करें।
  21. जाँचें कि रोबोट का प्रोग्राम रोक दिया गया है और चेतावनी संदेश प्रदर्शित करता है: तापमान मॉड्यूल पर नमूना ट्यूबों पर कैप खोलें। नमूना ट्यूबों को अनकैप करें और जारी रखने के लिए फिर से शुरू करें पर क्लिक करें। जब रोबोट पांच मिश्रण दौर के बाद प्रत्येक नमूना ट्यूब के लिए ट्रिप्सिन के 10 μL स्थानांतरित करता है, तो खड़े हो जाओ।
  22. पैराफिन फिल्म के साथ नमूना ट्यूब कैप लपेटें, एक तापमान-नियंत्रित मिक्सर के लिए सभी नमूनों को स्थानांतरित करें, और 600 आरपीएम मिलाने के साथ 16-20 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    नोट: ट्रिप्सिन पाचन भी सीधे 37 डिग्री सेल्सियस पर तापमान मॉड्यूल पर किया जा सकता है।

3. पेप्टाइड सफाई SP3 पैरामैग्नेटिक मोतियों का उपयोग कर अप

  1. रात भर ट्रिप्सिन पाचन के बाद अगले दिन, संक्षेप में एक बेंचटॉप माइक्रोसेंट्रिफ्यूज (≤2,000 एक्स जी) का उपयोग करके नमूनों को स्पिन करें ( सामग्री की तालिका देखें) और नमूनों को चुंबकीय ट्यूब रैक पर रखें। नमूनों को 2 मिनट के लिए खड़े होने दें।
    1. प्रोटीन कम बांध microcentrifuge ट्यूबों के एक नए सेट के लिए एक पिपेट के साथ सावधानी से supernatant स्थानांतरण. नमूनों को एक रेफ्रिजरेटर में रखें और चरण 3.2-3.9 पर आगे बढ़ें।
      नोट:: लंबी अवधि के भंडारण के लिए, -80 °C पर नमूने संग्रहीत करें।
  2. किसी पाठ संपादक में SP3_peptide_cleanup.py पायथन स्क्रिप्ट खोलें और केवल यहाँ अनुकूलित करें अनुभाग में आवश्यकतानुसार निर्दिष्ट करें.
    नोट: प्रयोग-विशिष्ट चर में नमूनों और प्रतिकृतियों की संख्या, पेप्टाइड्स की मात्रा को स्थानांतरित करने के लिए, अभिकर्मकों की मात्रा (मोती, एसिटोनिट्राइल, डीएमएसओ), P20 / P50 और P300 पिपेट्स के लिए शुरुआती टिप, और चुंबकीय मॉड्यूल पर गहरी-अच्छी तरह से प्लेट में अच्छी तरह से शुरू करना शामिल है। प्रत्येक बीएसए डाइजेस्ट नमूने में पाचन की मात्रा के बारे में 120 μL होता है, जिसे प्रत्येक प्रतिकृति में 55 μL के साथ दो तकनीकी प्रतिकृतियों में एलीकोट किया जाएगा। केवल आधे डाइजेस्ट को साफ करने के लिए, प्रतिकृति संख्या चर को 1 में बदलें।
  3. Opentrons अनुप्रयोग में प्रोटोकॉल टैब के लिए स्क्रिप्ट अपलोड करें।
  4. पायथन स्क्रिप्ट (चित्रा 3) में निर्दिष्ट ओटी -2 डेक में संबंधित स्थान पर आवश्यक लैबवेयर और पिपेट्स रखें। सुनिश्चित करें कि चुंबकीय मॉड्यूल पर संचालित है और रोबोट से जुड़ा हुआ है। चुंबकीय मॉड्यूल के शीर्ष पर एक नया 2 एमएल 96-अच्छी तरह से गहरी अच्छी तरह से प्लेट ( सामग्री की तालिका देखें) रखें।
  5. कैलिब्रेट टैब खोलें और इस पायथन स्क्रिप्ट में आवश्यक लैबवेयर और पिपेट्स के संयोजन के लिए अंशांकन करें।
    नोट:: एक ही labware और पिपेट संयोजन के लिए अंशांकन केवल एक बार किया जा करने की जरूरत है, और Opentrons अनुप्रयोग अंशांकन पैरामीटर रिकॉर्ड करेगा।
  6. कुओं A1, B1 में ऊर्ध्वाधर क्रम में 2.0 mL ट्यूब रैक करने के लिए पचे हुए नमूनों (चरण 3.1 पर एकत्र supernatant) जगह ....
  7. 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में एलसी-एमएस / एमएस-संगत एसिटोनिट्राइल के 15 एमएल तैयार करें और 15 एमएल + 50 एमएल ट्यूब होल्डर टॉप के साथ 4-इन-1 ट्यूब रैक में अच्छी तरह से ए 3 में ट्यूब रखें।
  8. 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में 4.9 एमएल मास स्पेक्ट्रोमेट्री-ग्रेड पानी के साथ 100 μL DMSO जोड़कर 2% DMSO के 5 mL तैयार करें। 15mL + 50mL ट्यूब रैक में अच्छी तरह से A1 में ट्यूब रखें।
  9. एक खाली 50 मिली शंक्वाकार ट्यूब को अपशिष्ट के रूप में लेबल करें और इसे 15mL + 50mL ट्यूब रैक में अच्छी तरह से B3 में रखें।
  10. संदर्भ16 के बाद SP3 मोती तैयार करें।
    1. एक 2.0 mL माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में मिश्रित मोतियों की एक उचित मात्रा तैयार करें।
      नोट: प्रत्येक पेप्टाइड क्लीन-अप प्रतिक्रिया को मिश्रित मोतियों के 10 μL की आवश्यकता होती है। उदाहरण के लिए, चार क्लीन-अप प्रतिक्रियाओं के लिए मिश्रित मोतियों का न्यूनतम 40 μL तैयार करें।
    2. मनका मिश्रण को चुंबकीय स्टैंड पर 2 मिनट के लिए बैठने दें। एक पिपेट के साथ supernatant ध्यान से निकालें और एक पिपेट के साथ supernatant की मात्रा को मापने.
    3. मोतियों की शेष मात्रा की गणना करें और 5-10 गुना मास स्पेक्ट्रोमेट्री ग्रेड पानी जोड़ें (उदाहरण के लिए, मोतियों के 20 μL के लिए 100-200 μL पानी) और 10 सेकंड के लिए भंवर (गति 10)। 2 मिनट के लिए चुंबकीय स्टैंड पर मोतियों को बैठें।
    4. कुल तीन धोने के लिए पानी धोने के चरणों को दोहराएं।
    5. MS-ग्रेड पानी में अंतिम मोतियों को 50 μg/μL की अंतिम सांद्रता के लिए पुन: निलंबित करें। धोए गए चुंबकीय मोतियों को 2.0 mL ट्यूब रैक में अच्छी तरह से A6 में रखें।
      नोट: मोतियों को 10 μg / μL16 की एकाग्रता पर पुन: निलंबित करने की सिफारिश की जाती है। वर्तमान अनुकूलन प्रयास में, अंतिम एकाग्रता को 50 μg / μL में संशोधित किया गया था ताकि मनका-पेप्टाइड-एसिटोनिट्राइल मिश्रण की कुल मात्रा को कम किया जा सके।
  11. सुनिश्चित करें कि रोबोट चुंबकीय मॉड्यूल पर गहरी अच्छी तरह से प्लेटों में कुओं के लिए पचे हुए नमूनों के 55 μL स्थानांतरित करता है।
  12. सत्यापित करें कि रोबोट प्रोटोकॉल को रोक दिया गया है और संदेश प्रदर्शित करता है: सुनिश्चित करें कि तैयार मोतियों को प्रोटोकॉल को फिर से शुरू करने से पहले स्लॉट 4 में स्थित 2 एमएल ट्यूब रैक के ए 6 में लोड किया गया है। भंवर मोती, और फिर संक्षेप में एक मिनी benchtop सेंट्रीफ्यूज पर 5 s के लिए नीचे स्पिन और टोपी खुला के साथ 2 mL ट्यूब रैक के A6 अच्छी तरह से में मोती जगह. जब रोबोट ऊपर और नीचे pipetting द्वारा पांच दौर के लिए मोतियों 10 बार मिश्रण द्वारा खड़े हो जाओ.
    नोट: रोबोट गहरी अच्छी तरह से प्लेटों में प्रत्येक पचे हुए नमूने के लिए मोतियों के 10 μL स्थानांतरित करता है, जिसके बाद मिश्रण के पांच गुना होता है।
  13. सुनिश्चित करें कि रोबोट प्रत्येक अच्छी तरह से एसिटोनिट्राइल के 1,292 μL को स्थानांतरित करता है और पेप्टाइड्स और मोतियों को बांधने की सुविधा के लिए ऊपर और नीचे पाइपिंग करके तुरंत 10 बार मिलाता है।
    नोट:: P300 पिपेट केवल एक समय में 300 μL करने के लिए स्थानांतरित कर सकते हैं, क्योंकि प्रत्येक स्थानांतरण कई राउंड में पूरा हो गया है।
  14. सुनिश्चित करें कि रोबोट गहरी अच्छी तरह से प्लेट में ऊपर और नीचे pipetting द्वारा सभी नमूनों को पांच बार मिलाता है।
  15. चुंबकीय मॉड्यूल लगे हुए है और नमूने 2 मिनट के लिए मॉड्यूल पर incubated कर रहे हैं जब तक प्रतीक्षा करें।
  16. जब pipetting आकांक्षा और वितरण गति 150 μL / s के डिफ़ॉल्ट से 25 μL / s पर धीमा करने के लिए सेट कर रहे हैं द्वारा खड़े हो जाओ।
    नोट: रोबोट धीरे-धीरे प्रत्येक अच्छी तरह से supernatant को हटा देता है और चुंबकीय मॉड्यूल लगे हुए है, जबकि अपशिष्ट ट्यूब में इसे छोड़ देता है।
  17. पिपेटिंग आकांक्षा और वितरण गति डिफ़ॉल्ट सेटिंग पर वापस आ जाने तक प्रतीक्षा करें। ध्यान दें कि चुंबकीय मॉड्यूल अलग हो जाता है।
  18. सत्यापित करें कि रोबोट का प्रोग्राम रोक दिया गया है और संदेश प्रदर्शित करता है: सुनिश्चित करें कि ACN ट्यूब कैप बंद है। मैन्युअल रूप से acetonitrile ट्यूब uncap और यह ट्यूब रैक करने के लिए वापस जगह है। जारी रखने के लिए Resume पर क्लिक करें। सुनिश्चित करें कि रोबोट प्रत्येक नमूने को धोने के लिए एसिटोनिट्राइल के 1 मिलीलीटर को स्थानांतरित करता है और तुरंत 10 बार मिश्रण करता है।
  19. सुनिश्चित करें कि रोबोट नमूनों को धोने के लिए सभी नमूनों को 10 बार मिलाता है।
  20. जब चुंबकीय मॉड्यूल लगे हुए हैं और 2 मिनट के लिए नमूनों incubates द्वारा खड़े हो जाओ.
  21. जब तक रोबोट pipetting आकांक्षा गति को धीमा करने के लिए बदलता है और धीरे-धीरे supernatant को हटा देता है और इसे अपशिष्ट ट्यूब में वितरित करता है तब तक प्रतीक्षा करें।
  22. निरीक्षण करें कि रोबोट 60 s के लिए चुंबकीय मॉड्यूल पर नमूनों को इनक्यूबेट करता है ताकि अवशिष्ट एसिटोनिट्राइल को वाष्पित करने की अनुमति मिल सके, फिर पिपेटिंग आकांक्षा गति को डिफ़ॉल्ट रूप से वापस बदल देता है। ध्यान दें कि चुंबकीय मॉड्यूल अलग हो जाता है।
  23. सत्यापित करें कि रोबोट का प्रोग्राम रोक दिया गया है और संदेश प्रदर्शित करता है: भंवर DMSO फिर से और खुली कैप्स। मैन्युअल रूप से 10 s के लिए 2% DMSO भंवर और यह वापस 15 mL-50 mL ट्यूब रैक में A1 अच्छी तरह से जगह है. जारी रखने के लिए Resume पर क्लिक करें।
  24. सुनिश्चित करें कि रोबोट प्रत्येक अच्छी तरह से 2% DMSO के 80 μL स्थानांतरित करता है और तुरंत 10 बार मिश्रण करता है।
  25. सुनिश्चित करें कि रोबोट अतिरिक्त पांच राउंड के लिए सभी नमूनों को 10 बार मिलाता है।
  26. जब चुंबकीय मॉड्यूल लगे हुए हैं और 2 मिनट के लिए नमूनों incubates द्वारा खड़े हो जाओ.
  27. निरीक्षण करें कि रोबोट पिपेट आकांक्षा गति को धीमा (25 μL / s) में बदलता है और धीरे-धीरे supernatant को गहरी अच्छी तरह से प्लेट में खाली कुओं में स्थानांतरित करता है।
  28. जब तक रोबोट नमूनों में अवशिष्ट मोतियों को हटाने के लिए 2 मिनट के लिए चुंबकीय मॉड्यूल पर नमूनों को इनक्यूबेट नहीं करता तब तक प्रतीक्षा करें।
  29. सत्यापित करें कि रोबोट के कार्यक्रम को रोक दिया गया है और संदेश प्रदर्शित करता है: 2 एमएल ट्यूब रैक में नए 2 एमएल ट्यूब रखें और सुनिश्चित करें कि ट्यूबों की संख्या नमूनों की कुल संख्या से मेल खाती है।
  30. अंतिम बीएसए डाइजेस्ट नमूने के बाद सीधे कुएं में पहले 2 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब रखें। जारी रखने के लिए Resume पर क्लिक करें।
    नोट:: उदाहरण के लिए, इस प्रोटोकॉल में परीक्षण किए गए छह BSA डाइजेस्ट नमूने कुओं A1, B1, C1, D1, A2, और B2 में हैं। इसलिए, 2.0 mL ट्यूबों का नया सेट कुओं B3, C3, D3, ... और इसी तरह।
  31. निरीक्षण करें, जबकि रोबोट 2.0 मिलीलीटर ट्यूबों के नए सेट के लिए गहरी अच्छी तरह से प्लेट में कुओं से नमूनों के 88 μL स्थानांतरित करता है।
    नोट:: प्रोटोकॉल में स्थानांतरित मात्रा (1.1 x 80 μL) यह सुनिश्चित करने के लिए ऑप्टिमाइज़ किया गया है कि नमूने की पूरी मात्रा पिपेट युक्तियों में एस्पिरेटेड है।
  32. जब रोबोट पिपेट आकांक्षा गति को डिफ़ॉल्ट रूप से बदलता है और चुंबकीय मॉड्यूल को अलग करता है तो खड़े हो जाओ।
  33. एक वैक्यूम बाष्पीकरणकर्ता में साफ-अप पेप्टाइड्स को मैन्युअल रूप से सुखाएं ( सामग्री की तालिका देखें) और अनुभाग 5 पर आगे बढ़ें या सूखे नमूनों को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

4. SP3 पैरामैग्नेटिक मोतियों के साथ मानव दिल (5 मिलीग्राम / एमएल) के प्रोटीन लिसेट के साथ एमएस नमूना तैयारी

  1. SP3_digestion.py Python स्क्रिप्ट खोलें और केवल यहाँ अनुकूलित करें अनुभाग में चर के मान निर्दिष्ट करें।
    नोट: चर में नमूनों की संख्या और प्रतिकृति, नमूना एकाग्रता, अभिकर्मकों की मात्रा (डीटीटी, आईएए, ट्रिप्सिन, मोती, 100% और 80% इथेनॉल), डीटीटी और आईएए समय इनक्यूबेशन, पिपेट्स पी 20 / पी 50 और पी 300 के लिए टिप शुरू करना, और चुंबकीय मॉड्यूल पर गहरी-अच्छी तरह से प्लेट में अच्छी तरह से शुरू करना शामिल है।
  2. डीटीटी और आईएए इनक्यूबेशन के लिए एकल प्रोटीन गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन के साथ एमएस नमूना तैयारी के लिए अनुभाग 2 में 2.2-2.23 चरणों का पालन करें। उन चरणों में रोबोट डेक सेटअप के लिए चित्रा 1 देखें।
  3. एक ताजा SP3 मोती मिश्रण (20 μL मोती प्रति क्लीन-अप प्रतिक्रिया) प्रोटीन क्लीन-अप के लिए तैयार करें (जैसा कि चरण 3.10 में निर्दिष्ट किया गया है) डीटीटी और आईएए इनक्यूबेशन चरणों (चरण 2.15 और 2.19) के दौरान। 2 एमएल ट्यूब रैक पर डी 6 अच्छी तरह से मोती रखें।
  4. सत्यापित करें कि रोबोट का प्रोग्राम संदेश के साथ रोक दिया गया है: ट्यूब कैप खोलें। मैन्युअल रूप से तापमान मॉड्यूल के शीर्ष पर एल्यूमीनियम ब्लॉक में नमूना ट्यूब ों को अनकैप करें और जारी रखने के लिए फिर से शुरू पर क्लिक करें।
  5. सुनिश्चित करें कि रोबोट चुंबकीय मॉड्यूल के शीर्ष पर एक नई गहरी अच्छी तरह से प्लेट के लिए 2.0 मिलीलीटर ट्यूबों से सभी नमूनों को स्थानांतरित करता है।
  6. जांचें कि रोबोट के कार्यक्रम को रोक दिया गया है और संदेश प्रदर्शित करता है: सुनिश्चित करें कि तैयार मोतियों को प्रोटोकॉल को फिर से शुरू करने से पहले स्लॉट 4 में स्थित 2 एमएल ट्यूब रैक के डी 6 में लोड किया गया है। मोती ट्यूब टोपी खोलें और जारी रखने के लिए फिर से शुरू पर क्लिक करें।
  7. निरीक्षण करें, जबकि रोबोट मोतियों के मिश्रण के पांच दौर और नमूना-मोतियों के मिश्रण के पांच दौर के साथ गहरी अच्छी तरह से प्लेट में प्रत्येक अच्छी तरह से मोती के लिए 20 μL मोतियों को स्थानांतरित करता है।
  8. सत्यापित करें कि रोबोट के कार्यक्रम को रोक दिया गया है और संदेश प्रदर्शित करता है: सुनिश्चित करें कि प्रोटोकॉल को फिर से शुरू करने से पहले स्लॉट 5 में स्थित 15 एमएल -50 एमएल ट्यूब रैक के ए 3 में 100 प्रतिशत इथेनॉल लोड किया गया है। 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में 100% इथेनॉल (यानी, 200 प्रूफ इथेनॉल, सामग्री की तालिका देखें) के 10-20 मिलीलीटर तैयार करें और इसे रैक के ए 3 कुएं में रखें। जारी रखने के लिए Resume पर क्लिक करें।
  9. जब रोबोट प्लेट में प्रत्येक अच्छी तरह से 100% इथेनॉल के 140 μL को स्थानांतरित करता है, तो इसके बाद मोतियों के लिए पेप्टाइड्स के बंधन की सुविधा के लिए मिश्रण के 10 दौर होते हैं।
  10. सुनिश्चित करें कि रोबोट मिश्रण के कुल पांच दौर के लिए प्रत्येक दौर में 10 बार ऊपर और नीचे pipetting द्वारा प्रत्येक नमूने को मिलाता है।
  11. जब चुंबकीय मॉड्यूल लगे हुए हैं और 2 मिनट के लिए मॉड्यूल पर नमूनों को इनक्यूबेट करता है, तो खड़े हो जाओ।
  12. निरीक्षण करें कि रोबोट पिपेटिंग गति को धीमा करने के लिए बदलता है (25 μL / s) और प्रत्येक कुएं से supernatant aspirates और इसे अपशिष्ट ट्यूब में वितरित करता है।
  13. तब तक प्रतीक्षा करें जब तक कि रोबोट पिपेटिंग गति को डिफ़ॉल्ट रूप से वापस नहीं बदलता है और चुंबकीय मॉड्यूल को अलग कर देता है।
  14. सत्यापित करें कि रोबोट के कार्यक्रम को रोक दिया गया है और संदेश प्रदर्शित करता है: सुनिश्चित करें कि प्रोटोकॉल को फिर से शुरू करने से पहले स्लॉट 5 में स्थित 15 mL-50 mL ट्यूब रैक के A4 में 80 प्रतिशत इथेनॉल लोड किया गया है। मैन्युअल रूप से 100% इथेनॉल (यानी, 200 सबूत) के 16 मिलीलीटर के साथ 4 मिलीलीटर एमएस-ग्रेड पानी के मिश्रण से 80% इथेनॉल के 20 मिलीलीटर तैयार करें। ट्यूब रैक में ए 4 कुएं में 80% इथेनॉल रखें। जारी रखने के लिए Resume पर क्लिक करें। सुनिश्चित करें कि रोबोट प्रत्येक अच्छी तरह से 80% इथेनॉल के 1 मिलीलीटर को स्थानांतरित करता है और तुरंत 10 बार मिश्रण करता है।
  15. निरीक्षण करें कि रोबोट पिपेटिंग गति को धीमा करने के लिए बदलता है (25 μL / s), प्रत्येक कुएं से supernatant aspirates, और अपशिष्ट ट्यूब में dispenses। तब तक प्रतीक्षा करें जब तक कि रोबोट पिपेटिंग गति को डिफ़ॉल्ट रूप से वापस नहीं बदलता है और चुंबकीय मॉड्यूल को अलग कर देता है।
  16. जब रोबोट के प्रोग्राम को रोक दिया जाता है तो ABC समाधान की टोपी खोलें और संदेश प्रदर्शित करता है: ABC ट्यूब पर ओपन कैप। जारी रखने के लिए Resume पर क्लिक करें। जब रोबोट चुंबकीय मॉड्यूल को अलग करता है, तो खड़े हो जाओ, प्रत्येक अच्छी तरह से एबीसी के 250 μL को स्थानांतरित करता है, और तुरंत 10 बार के लिए मिश्रण करता है।
    नोट:: यह चरण ABC के साथ नमूने धोने के लिए है।
  17. सुनिश्चित करें कि रोबोट चुंबकीय मॉड्यूल को संलग्न करता है और 2 मिनट के लिए मॉड्यूल पर नमूनों को इनक्यूबेट करता है।
  18. निरीक्षण करें कि रोबोट पिपेटिंग गति को धीमा करने के लिए बदलता है (25 μL / s) और प्रत्येक कुएं से अपशिष्ट ट्यूब में supernatant स्थानांतरित करता है। तब तक प्रतीक्षा करें जब तक कि रोबोट प्रत्येक अच्छी तरह से एबीसी बफर के 100 μL को स्थानांतरित नहीं करता है और तुरंत 10 बार के लिए मिश्रण करता है।
  19. सत्यापित करें कि रोबोट के कार्यक्रम को रोक दिया गया है और संदेश प्रदर्शित करता है: सुनिश्चित करें कि प्रोटोकॉल को फिर से शुरू करने से पहले नए संग्रह ट्यूबों को 2.0 एमएल एल्यूमीनियम ब्लॉक में रखा गया है। ब्लॉक में शुरू में अंतिम नमूना ट्यूब के तुरंत बाद एल्यूमीनियम ब्लॉक में कम प्रोटीन-प्रतिधारण माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों का एक नया सेट रखें। जारी रखने के लिए Resume पर क्लिक करें। जब रोबोट एबीसी बफर में प्रत्येक नमूने को नए 2.0 एमएल ट्यूबों में स्थानांतरित करता है, तो खड़े हो जाओ।
    नोट: कुओं की जांच करें और मैन्युअल रूप से किसी भी अवशिष्ट नमूने को ट्यूबों में स्थानांतरित करें यदि आवश्यक हो।
  20. एमएस-ग्रेड ट्रिप्सिन (प्रति नमूना 10 μL) की एक उचित मात्रा तैयार करें एमएस-ग्रेड पानी में एमएस-ग्रेड ट्रिप्सिन के 20 μg को 0.2 μg / μL की अंतिम एकाग्रता में भंग करके जब रोबोट के कार्यक्रम को रोक दिया जाता है और संदेश प्रदर्शित करता है: सुनिश्चित करें कि ट्रिप्सिन (0.2 μg / μL) को प्रोटोकॉल को फिर से शुरू करने से पहले स्लॉट 4 में स्थित 2 एमएल ट्यूब रैक के C6 में लोड किया गया है। सुनिश्चित करें कि रोबोट प्रत्येक नमूना ट्यूब में ट्रिप्सिन के 10 μL स्थानांतरित करता है, इसके बाद मिश्रण के पांच दौर होते हैं।
  21. पैराफिन फिल्म के साथ नमूना ट्यूब कैप लपेटें, सभी नमूनों को तापमान-नियंत्रित मिक्सर में स्थानांतरित करें, और 1,000 आरपीएम मिलाने के साथ 16-20 ज के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    नोट: 1,000 आरपीएम मिलाते हुए के साथ पाचन प्रदर्शन रात भर के इनक्यूबेशन के दौरान मोतियों की वर्षा को कम करने की सिफारिश की जाती है।

5. पेप्टाइड सफाई SP3 पैरामैग्नेटिक मोतियों का उपयोग कर अप

  1. चरण 2 में stepwise निर्देशों का पालन करें, पेप्टाइड सफाई SP3 पैरामैग्नेटिक मोतियों का उपयोग कर.

6. तरल क्रोमैटोग्राफी और मास स्पेक्ट्रोमेट्री

  1. बीएसए (चरण 2-3) और दिल लिसेट (चरण 4) पेप्टाइड्स को 0.1% फॉर्मिक एसिड में 1 एमएल एलसी-एमएस ग्रेड 99% फॉर्मिक एसिड जोड़कर एमएस पानी में 1 एल की कुल मात्रा में फिर से निलंबित कर दिया।
    सावधानी: फॉर्मिक एसिड एक मजबूत एसिड है। यह आंखों, त्वचा और श्वसन प्रणाली के लिए अत्यधिक संक्षारक है। पीपीई पहने हुए एक रासायनिक हुड के तहत देखभाल के साथ संभालें।
  2. एक मात्रात्मक पेप्टाइड परख kit17 का उपयोग कर पोस्ट डाइजेस्ट पेप्टाइड एकाग्रता की मात्रा निर्धारित करें और एलसी-एमएस / एमएस विश्लेषण के लिए बीएसए डाइजेस्ट और 1.5 μg दिल के पचाने के 0.5 μg इंजेक्ट करें।
  3. एलसी-एमएस / एमएस विश्लेषण के लिए तरल क्रोमैटोग्राफी कार्यक्रम स्थापित करें।
    नोट: एक विशिष्ट सेटअप में, पेप्टाइड डाइजेस्ट को पूरक फ़ाइल 2 में प्रदान किए गए मापदंडों का उपयोग करके एक उलट-चरण C18 कॉलम (3 μm कण; 100 Å pore; 75 μm x 150 mm; सामग्री की तालिका देखें) पर लोड किया जा सकता है।
  4. पूरक फ़ाइल 3 में प्रदान किए गए मापदंडों का उपयोग करके एक द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमीटर (सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके शॉटगन प्रोटिओमिक्स डेटा प्राप्त करें।
  5. प्रोटीन पहचान के लिए प्रोटीन डेटाबेस खोजें।
    1. डाउनलोड करें और आवश्यक सॉफ़्टवेयर, MaxQuant स्थापित करें।
      नोट:: MaxQuant सॉफ़्टवेयर (v.1.6.10.43) यहाँ निम्न चरणों के लिए उपयोग किया गया था ( सामग्री की तालिका देखें)।
    2. एक उच्च गुणवत्ता वाले प्रोटीन अनुक्रम डेटाबेस (UniProt / SwissProt) से क्यूरेटेड मानव proteome डेटाबेस डाउनलोड करें ( सामग्री की तालिका देखें)। डाउनलोड बटन पर क्लिक करें और FASTA (canonical) चुनें।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, डाउनलोड FASTA (गैर-विहित) डेटाबेस में प्रत्येक जीन के प्रोटीन isoforms शामिल करने के लिए, यदि वांछित है।
    3. MaxQuant सॉफ़्टवेयर इंटरफ़ेस में, वैश्विक पैरामीटर पैनल पर नेविगेट करके प्रोटीन डेटाबेस के रूप में उपयोग की जाने वाली FASTA फ़ाइल निर्दिष्ट करें और अनुक्रम टैब पर क्लिक करें; उसके बाद, FASTA फ़ाइल के लिए फ़ाइल पथ निर्दिष्ट करने के लिए जोड़ें बटन पर क्लिक करें।
    4. MaxQuant सॉफ़्टवेयर इंटरफ़ेस में, कच्चे डेटा पैनल पर जाकर और लोड बटन पर क्लिक करके विश्लेषण किए जाने वाले अधिग्रहित कच्चे द्रव्यमान स्पेक्ट्रम फ़ाइलों को निर्दिष्ट करें और कच्ची फ़ाइल (फ़ाइलों) का चयन करें।
    5. तालिका 1 में दिखाए गए अनुसार खोज पैरामीटर सेट अप करें. यदि आवश्यक हो तो लेबल-मुक्त परिमाणीकरण (LFQ) सक्षम करें.
    6. खोज को पूरा करने के लिए प्रतीक्षा करें, और पेप्टाइड-स्पेक्ट्रम मैचों (PSMs) की संख्या का पता लगाएं जो /combined/txt फ़ोल्डर में msms.txt फ़ाइल में FDR 1% थ्रेशोल्ड पास करते हैं।
      नोट: प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग के लिए यहां की गई तुलनाओं में, एकाधिक प्रोटीनों के लिए मैप किए गए PSM को फ़िल्टर किया गया था, और PSM को एक अद्वितीय प्रोटीन में मैप किया गया था PSM, पेप्टाइड्स और प्रोटीन (चित्रा 4 और चित्रा 5) की संख्या की गणना करने के लिए बनाए रखा गया था।

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Representative Results

यहां तीन पायथन स्क्रिप्ट प्रदान किए गए हैं जो ओटी -2 रोबोट के साथ संगत हैं, और जो एक एकल प्रोटीन मानक गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (तकनीकी प्रतिकृति एन = 5 पाचन) और एक डिटर्जेंट युक्त मानव हृदय लिसेट नमूना (एन = 5 पाचन) के साथ मास स्पेक्ट्रोमेट्री प्रोटिओमिक्स के लिए नमूना तैयारी करते हैं। प्रत्येक डाइजेस्ट उत्पाद को दो पेप्टाइड क्लीन-अप प्रतिक्रियाओं में विभाजित किया जाता है। बीएसए और दिल के नमूनों के प्रत्येक रन में पहचाने गए पेप्टाइड-स्पेक्ट्रम मैचों (पीएसएम), पेप्टाइड्स और प्रोटीन की संख्या को चित्र 4 और चित्रा 5 में दिखाया गया है। बीएसए नमूने के साथ 728 पीएसएम और 65 पेप्टाइड्स की एक औसत की पहचान की गई थी, जिसमें क्रमशः भिन्नता (सीवी) के 5.2% और 3.2% गुणांक थे। जटिल दिल के नमूने के साथ, 9,526 PSMs, 7,558 पेप्टाइड्स और 1,336 प्रोटीन की एक औसत की पहचान 7.6%, 5.9%, और भिन्नता के 3.6% गुणांक के साथ 10 रन में की गई थी। दिल के नमूने के 10 रन से कुल 1,935 प्रोटीन की पहचान की गई थी, और उनमें से, 1,677 प्रोटीन ों की पहचान दो या दो से अधिक रनों में की गई थी। पेप्टाइड परिमाणीकरण में परिवर्तनशीलता को निर्धारित करने के लिए, निकाले गए आयन क्रोमैटोग्राम (XIC) तीव्रता के CV की गणना 10 पेप्टाइड्स के लिए की गई थी जो एक अद्वितीय प्रोटीन (तालिका 2) में मैप किए गए थे। प्रोटीन एकाग्रता को मापने पर मानव (हाथ-pipetted) बनाम रोबोट प्रयोगात्मक परिणामों की variabilities आगे बीसीए परख के साथ तीन प्रोटीन मानक नमूनों का उपयोग कर तुलना की गई थी। रोबोट बीसीए परख का औसत सीवी (7.57%) मानव मैनुअल बीसीए परख (9.22%) (पूरक तालिका 1) से कम पाया गया था।

वर्णित प्रोटोकॉल ने समय के साथ लगातार प्रदर्शन दिखाया जब बीएसए पाचन प्रोटोकॉल 2 महीने के अलावा किया गया था और तुलनीय परिणाम उत्पन्न किए गए थे। चित्र 2 में अद्वितीय PSM और पेप्टाइड्स की औसत संख्या क्रमशः 728 और 65 है। ओटी -2 सिस्टम पर किए गए समान प्रयोगों ने 647 पीएसएम और 54 पेप्टाइड्स (एन = 2) (पूरक तालिका 2) का औसत उत्पन्न करने से 2 महीने पहले ओटी -2 सिस्टम पर किया था। दीर्घावधि स्थिरता का अनुमान इसी तरह लगाया जा सकता है।

मैनुअल बेंच प्रोसेसिंग समय (इनक्यूबेशन समय शामिल नहीं है) की गणना रोबोट प्रोटोकॉल और प्रति नमूना तैयारी 18 मानव प्रसंस्करण के बीच की जाती है। डिटर्जेंट हटाने के बिना पाचन प्रोटोकॉल के साथ पेप्टाइड desalting के बाद, मैनुअल प्रसंस्करण समय हाथ से 61 मिनट बनाम रोबोट प्रणाली के साथ 41 मिनट है। डिटर्जेंट हटाने, पाचन, और पेप्टाइड desalting प्रोटोकॉल के साथ, मैनुअल प्रसंस्करण समय हाथ से 79 मिनट बनाम रोबोट प्रणाली के साथ 54 मिनट है। इसलिए, अर्ध-स्वचालित प्रोटोकॉल प्रति नमूना लगभग 20-25 मिनट के हाथों पर बेंच प्रोसेसिंग समय को कम कर देता है। इस बार कमी काफी हो जाती है जब कई नमूनों को संसाधित किया जाता है और समानांतर में कई ओटी -2 रोबोट का उपयोग किए जाने पर और सुधार किया जा सकता है।

Figure 1
चित्र 1: योजनाबद्ध वर्कफ़्लो. डिटर्जेंट सहायता के साथ निकाले गए प्रोटीन को पाचन से पहले डिटर्जेंट हटाने के एक अतिरिक्त चरण के साथ प्रसंस्करण की आवश्यकता होगी। प्रोटीन के नमूने पचाए जाते हैं, और पेप्टाइड्स को ओटी -2 रोबोटिक सिस्टम पर डीसाल्ट किया जाता है। पेप्टाइड डाइजेस्ट को एक नैनो-एलसी के साथ युग्मित क्यू-सटीक एचएफ मास स्पेक्ट्रोमीटर में इंजेक्ट किया जाता है। एमएस स्पेक्ट्रा प्रोटीन पहचान के लिए एक प्रोटीन डेटाबेस के खिलाफ खोज कर रहे हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: रोबोट डेक प्रोटीन पाचन के लिए स्थापित किया गया है। टिप रैक, नमूने, कचरा, तापमान मॉड्यूल, और चुंबकीय मॉड्यूल के निर्दिष्ट पदों को दिखाया गया है। तारांकन प्रयोगशाला और अभिकर्मकों को निरूपित करता है जो केवल डिटर्जेंट हटाने के चरणों के साथ पाचन प्रोटोकॉल के लिए आवश्यक होते हैं। संख्याओं वाले बक्से खाली डेक पदों को दर्शाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: रोबोट डेक पेप्टाइड क्लीन-अप स्क्रिप्ट के लिए सेट अप। टिप रैक, नमूने, कचरा, और चुंबकीय मॉड्यूल के निर्दिष्ट पदों को दिखाया गया है। संख्याओं वाले बक्से खाली डेक पदों को दर्शाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: बीएसए प्रोटीन (एन = 5) के पाचन में पाए गए पेप्टाइड-स्पेक्ट्रम मैचों (पीएसएम) और पेप्टाइड्स की संख्या। प्रत्येक डाइजेस्ट को तकनीकी प्रतिकृति पेप्टाइड क्लीन-अप (आर 1 और आर 2) के लिए दो में विभाजित किया गया था। विविधताओं का गुणांक: PSMs के लिए 5.2%; पेप्टाइड्स के लिए 3.2%। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: PSMs, पेप्टाइड्स, और प्रोटीन की संख्या एक मानव दिल lysate से पहचाना. पांच पाचन SP3 डिटर्जेंट हटाने के साथ किया गया था। प्रत्येक डाइजेस्ट को पेप्टाइड क्लीन-अप (आर 1 और आर 2) के लिए दो में विभाजित किया गया था। भिन्नता के गुणांक: PSMs के लिए 7.6%; पेप्टाइड्स के लिए 5.9%; प्रोटीन के लिए 3.6%। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पाचन एंजाइम ट्रिप्सिन/पी
अधिकतम चूक विदलन 2
निश्चित संशोधन सिस्टीन का कार्बामिडोमिथाइलेशन
चर संशोधन एन-टर्मिनल प्रोटीन एसिटिलेशन; मेथिओनिन ऑक्सीकरण
पेप्टाइड लंबाई सीमा 7 – 25 aa
अग्रदूत जन सहिष्णुता ± 4.5 ppm
एमएस / एमएस आयनों बड़े पैमाने पर सहिष्णुता ± 20 पीपीएम
लेबल-मुक्त परिमाणीकरण LFQ
पेप्टाइड-स्पेक्ट्रम मिलान (PSM) के लिए झूठी खोज दर (FDR) 0.01

तालिका 1: पेप्टाइड डेटाबेस (MaxQuant) खोज पैरामीटर।

पेप्टाइड प्रोटीन आईडी पीईपी माध्यिका XIC तीव्रता CV
LSTSQIPQSQIR Q92523 7.72E-08 1.96E+07 6.70%
SEDFSLPAYMDR P13073 9.64E-17 8.05E+08 7.30%
YLQEIYNSNNQK P02679 2.76E-23 9.69E+08 7.60%
TDDCHPWVLPVVK P17174 4.51E-14 4.60E+08 8.60%
VIVVGNPANTNCLTASK P40925 7.90E-29 1.17E+09 8.70%
DYIWNTLNSGR O75390 1.63E-15 1.38E+08 8.80%
VSVPTHPEAVGDASLTVVK P13611 1.86E-09 6.77E+07 9.10%
QVAEQFLNMR P22695 3.25E-08 1.09E+08 9.30%
NTFWDVDGSMVPPEWHR Q9UI09 2.05E-11 4.00E+07 9.60%
SASDLTWDNLK P02787 5.29E-11 1.92E+09 9.80%

तालिका 2: निकाले गए आयन क्रोमैटोग्राम (XIC) 10 पेप्टाइड्स की तीव्रता परिमाणीकरण।

अनुपूरक तालिका 1: मैनुअल और स्वचालित बीसीए assays की तुलना। इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक तालिका 2: बीएसए पाचन ने चित्र 4 में संसाधित नमूनों के अलावा 2 महीने का प्रदर्शन किया। इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक फ़ाइल 1: विकसित पायथन लिपियों की एक प्रति। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

अनुपूरक फ़ाइल 2: LC-MS/MS विश्लेषण के लिए तरल क्रोमैटोग्राफी प्रोग्राम के लिए विधि पैरामीटर। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक फ़ाइल 3: एक मास स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग करके शॉटगन प्रोटिओमिक्स डेटा को प्राप्त करने के लिए विधि पैरामीटर। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम
सबसे अच्छा प्रदर्शन के लिए, Opentrons-सत्यापित labware, मॉड्यूल, और OT-2 के साथ संगत consumables का उपयोग किया जाना चाहिए। कस्टम labware संदर्भ 14 पर Opentrons के निर्देश के बाद बनाया जा सकता है. पहली बार उपयोग किए जाने पर ओटी -2 डेक, पिपेट्स और लैबवेयर को कैलिब्रेट करना सुनिश्चित करें। पेप्टाइड और प्रोटीन क्लीन-अप के लिए मोतियों को तैयार करने के लिए एसपी 3 मोतियों के निर्माता से दिशानिर्देशों का पालन करना भी महत्वपूर्ण है। विशेष रूप से, मनका और पेप्टाइड बाइंडिंग प्रतिक्रिया के दौरान, बाध्यकारी प्रतिक्रिया में एसिटोनिट्राइल की मात्रा को ≥95% होने की आवश्यकता होती है, और मनका एकाग्रता को ≥0.1 μg / μL होना चाहिए। पेप्टाइड एकाग्रता को 10 μg / mL -5 mg / mL की सीमा में रखें। पेप्टाइड क्लीन-अप स्क्रिप्ट में अनुकूलित मापदंडों के साथ, एसिटोनिट्राइल वॉल्यूम अनुपात 95% है, मनका एकाग्रता 0.37 μg / μL है, और पेप्टाइड एकाग्रता 14-37 μg / mL की सीमा में है। पेप्टाइड्स द्रव्यमान हमारे अनुभव से पाचन प्रतिक्रिया के 100 μL में 40-100 μg होने का अनुमान है। एसपी 3 प्रोटीन क्लीन-अप के लिए, प्रोटीन के 1 μg के लिए मोतियों के 5-10 μg का उपयोग किया गया था और यह सुनिश्चित किया गया था कि प्रोटीन बाइंडिंग के दौरान न्यूनतम मोतियों की एकाग्रता 0.5 μg / μL है। अनुशंसित प्रोटीन सांद्रता 10 μg / mL -5 mg / mL की सीमा में है। प्रदान की गई स्क्रिप्ट में डिफ़ॉल्ट पैरामीटर के साथ, 100 μg प्रोटीन के लिए 1 मिलीग्राम मोतियों का उपयोग किया जाता है, और बंधन के दौरान मनका एकाग्रता 3.75 μg / μL है, जबकि प्रोटीन एकाग्रता 0.35 मिलीग्राम / एमएल है।

संशोधन और समस्या निवारण
पायथन स्क्रिप्ट में डिफ़ॉल्ट चर हमारी प्रयोगशाला में मानक वर्कफ़्लो के लिए अनुकूलित हैं। उपयोगकर्ताओं को यदि आवश्यक हो तो स्क्रिप्ट को अपने अनुप्रयोगों के साथ संगत बनाने के लिए चर को समायोजित करने की आवश्यकता है। यदि कम एमएस तीव्रता देखी जाती है, तो प्रोटीन बीसीए परख और मात्रात्मक पेप्टाइड परख के साथ प्रत्येक महत्वपूर्ण प्रोटोकॉल अनुभाग के बाद प्रोटीन या पेप्टाइड हानि की जांच करें। पहली बार ओटी -2 पर प्रोटोकॉल का उपयोग करते समय, यह सुनिश्चित करने के लिए प्रत्येक चरण के लिए रोबोट हैंडलिंग का निरीक्षण करें कि रोबोट अपेक्षित प्रक्रियाओं को निष्पादित करता है। लेखन के समय, P50 इलेक्ट्रॉनिक पिपेट अब Opentrons स्टोर में उपलब्ध नहीं है। वर्तमान स्क्रिप्ट को यह इंगित करने के लिए संशोधित किया गया है कि P20 पिपेट का उपयोग इसके स्थान पर कहां किया जा सकता है। यदि आवश्यक हो, तो उपयोगकर्ता अन्य पिपेट्स का उपयोग करने के लिए स्क्रिप्ट को संशोधित करने के लिए Opentrons API का संदर्भ ले सकते हैं।

तकनीक की सीमाएं
एक रोबोट तरल हैंडलिंग सिस्टम का उपयोग करने के फायदों के बावजूद, तकनीकी प्रतिकृतियों के बीच द्रव हस्तांतरण के प्रदर्शन पर सावधानी बरतनी चाहिए। प्रारंभिक सेटअप और तरल हैंडलिंग चरणों के दौरान रोबोट की निगरानी अत्यधिक अनुशंसित है। रोबोट तरल हस्तांतरण के बाद, नमूना हानि से बचने और वैरिएबिलिटी को कम करने के लिए अवशिष्ट मात्रा की मैन्युअल वसूली की आवश्यकता हो सकती है।

मौजूदा तरीकों के संबंध में महत्व
यह प्रोटोकॉल कम लागत और ओपन-सोर्स ओटी -2 तरल हैंडलिंग रोबोट का उपयोग करके एक अर्ध-स्वचालित मास स्पेक्ट्रोमेट्री-आधारित नमूना तैयारी विधि का वर्णन करता है। हाल ही में, अन्य कार्यों ने भी प्रोटिओमिक्स अनुप्रयोगों 11 की ओर ओटी -2 का उपयोग करना शुरू कर दिया है। मौजूदा तरीकों की तुलना में, इस प्रोटोकॉल की विशिष्ट विशेषताओं में अपेक्षाकृत कम लागत वाले, पायथन-प्रोग्राम योग्य रोबोट का उपयोग शामिल है; नमूना तैयारी प्रोटोकॉल में दो चरणों में अर्ध-स्वचालित एसपी 3 मोतियों को शामिल करना, अर्थात्, प्रोटीन नमूना डिटर्जेंट हटाने के चरण और पेप्टाइड डिसाल्टिंग / क्लीन-अप चरण; साथ ही आगे के विकास का समर्थन करने के लिए ओपन-सोर्स पायथन स्क्रिप्ट की उपलब्धता। SP3 पैरामैग्नेटिक मोती प्रोटीन और पेप्टाइड्स को कुशलतापूर्वक बांधते हैं और एमएस नमूना तैयारी 11,13 में एंजाइमेटिक पाचन से पहले प्रोटीन क्लीन-अप / डिटर्जेंट हटाने में अनुप्रयोगों की ओर स्वचालित तरल हैंडलिंग सिस्टम के साथ युग्मित किए गए हैं।

शोधकर्ताओं को इस प्रोटोकॉल के साथ तीन ओपन-सोर्स पायथन स्क्रिप्ट प्रदान किए जाते हैं। स्क्रिप्ट अलग-अलग प्रयोगात्मक स्थितियों (जैसे, नमूना संख्या, प्रतिकृति संख्या, इनक्यूबेशन तापमान और समय, आदि) के लिए अनुकूलन योग्य हैं और संशोधित वर्कफ़्लो के लिए आगे विकास की अनुमति देते हैं। प्रोटोकॉल ने हमारी प्रयोगशाला में एमएस रन के बीच पेप्टाइड्स और / या प्रोटीन की पहचान की संख्या में एक उत्कृष्ट 3% -6% तकनीकी सीवी प्रदान किया, जो अन्य तरल हैंडलिंग सिस्टम (<20%) 9,11 पर पिछले काम के साथ तुलनीय है।

भविष्य के अनुप्रयोग
यह प्रोटोकॉल अर्ध-स्वचालित प्रोटिओमिक्स नमूना तैयारी के लिए एसपी 3 मोतियों के साथ संयोजन के रूप में एक कम लागत वाले प्रोग्राम योग्य तरल हैंडलिंग सिस्टम की उपयोगिता को दर्शाता है, जो नमूना प्रसंस्करण की दक्षता में सुधार करने के लिए बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री प्रयोगशालाओं और कोर सुविधाओं पर संभावित रूप से लागू हो सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास घोषणा करने के लिए कोई संघर्ष नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को एनआईएच पुरस्कारों F32-HL149191 द्वारा YH को भाग में समर्थित किया गया था; R00-HL144829 EL के लिए; R21-HL150456, R00-HL127302, R01-HL141278 MPL करने के लिए। चित्रा 1, चित्रा 2, चित्रा 3 एक वेब आधारित विज्ञान चित्रण उपकरण की सहायता से बनाए गए हैं, BioRender.com।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
300 µL pipette tips Opentrons
4-in-1 tube rack set Opentrons Each set includes 2 base stands and 4 tube holder tops 1.5mL, 2mL, 15mL + 50mL, 15mL, and 50mL. We use 2mL and 15 mL + 50 mL tops in this study.
Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Column Thermo Scientific #164568 3 μm particle; 100 Å pore; 75 μm x 150 mm
Acetonitrile LC-MS grade VWR #JT9829
Aluminum block set Opentrons This block set includes 3 tops that are compatible with 96-well, 2.0 mL tubes and a PCR strip to use with the OT-2 temperature module. We use the 2.0mL tube holder in this manuscript.
Ammonium Bicarbonate Sigma-Aldrich # A6141
Bovine Serum Albumin Standard, 2 mg/mL Thermo Scientific #23210
Dimethylsulfoxide (DMSO) LC-MS grade Thermo Scientific #85190
Dithiothreitol Sigma-Aldrich #D5545
EASY-Spray HPLC Columns Thermo Scientific #ES800A
EasynLC 1200 Nano LC Thermo Scientific #LC140
Ethanol Proof 195-200 Fisher #04-355-720
Formic Acid LC-MS grade Thermo Scientific #85178
Human heart lysate Novus Biologicals NB820-59217
Iodoacetamide Sigma-Aldrich #I1149
Magnetic tube rack Thermo Scientific #MR02
MAXQuant v.1.6.10.43 Tyanova et al., 2016 (https://www.maxquant.org/)
mySPIN 6 Mini Centrifuge Thermo Scientific #75004061 benchtop mini centrifuge for quick spin
NEST 2 mL 96-Well Deep Well Plate, V Bottom Opentrons
OT-2 magnetic module Opentrons GEN1
OT-2 P300 single channel pipette Opentrons GEN1
OT-2 P50 single channel pipette Opentrons GEN1
OT-2 robot pipetting robot Opentrons OT-2
OT-2 temperature module Opentrons GEN1
Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay Thermo Scientific #23275
Protein LoBind tubes 2.0 mL Eppendorf #022431102
Protein Sequence Database UniProt/SwissProt https://www.uniprot.org/uniprot/?query=proteome:UP000005640%
20reviewed:yes
Sera-Mag SpeedBead Carboxylate-Modified Magnetic Particles, Hydrophobic Cytiva #65152105050250
Sera-Mag SpeedBead Carboxylate-Modified Magnetic Particles, Hydrophylic Cytiva #45152105050250
SpeedVac Thermo Scientific Vacuum evaporator
Thermo Q Exactive HF Mass Spectrometer Thermo Scientific #IQLAAEGAAPFALGMBFZ
Trypsin MS Grade Thermo Scientific #90057
Water LC-MS grade VWR #BDH83645.400

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References

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जैव रसायन अंक 176
शॉटगन प्रोटिओमिक्स नमूना प्रसंस्करण एक ओपन-सोर्स लैब रोबोट द्वारा स्वचालित
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Han, Y., Thomas, C. T., Wennersten, S. A., Lau, E., Lam, M. P. Y. Shotgun Proteomics Sample Processing Automated by an Open-Source Lab Robot. J. Vis. Exp. (176), e63092, doi:10.3791/63092 (2021).

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