Summary
Dieses Protokoll bietet eine einfache, kostengünstige DNA-Isolationsmethode für die Analyse von Veränderungen der Mikrobiota des murinen Darms während der Entwicklung von Autoimmunerkrankungen.
Abstract
Die Darmmikrobiota spielt eine wichtige Rolle bei der Aufklärung des Immunsystems. Diese Beziehung ist äußerst wichtig für das Verständnis von Autoimmunerkrankungen, die nicht nur durch genetische Faktoren angetrieben werden, sondern auch durch Umweltfaktoren, die den Ausbruch auslösen und/oder den Krankheitsverlauf verschlimmern können. Eine zuvor veröffentlichte Studie über die Dynamik der Darmmikrobiota bei lupusanfälligen MRL / lpr-weiblichen Mäusen zeigte, wie Veränderungen der Darmmikrobiota das Fortschreiten der Krankheit verändern können. Hier wird ein Protokoll zur Extraktion repräsentativer Proben aus der Darmmikrobiota für Studien der Autoimmunität beschrieben. Mikrobiota-Proben werden aus dem Anus entnommen und verarbeitet, aus denen die DNA mit einem Phenol-Chloroform-Verfahren extrahiert und durch Alkoholfällung gereinigt wird. Nach der PCR werden gereinigte Amplicons mit einer Next Generation Sequencing-Plattform am Argonne National Laboratory sequenziert. Schließlich werden die 16S ribosomalen RNA-Gensequenzierungsdaten analysiert. Als Beispiel werden Daten aus Darmmikrobiota-Vergleichen von MRL/lpr-Mäusen mit oder ohne CX3CR1 gezeigt. Die Ergebnisse zeigten signifikante Unterschiede in Gattungen, die pathogene Bakterien enthalten, wie die im Stamm Proteobacteria sowie in der Gattung Bifidobacterium, die als Teil der gesunden kommensalen Mikrobiota gilt. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese einfache, kostengünstige DNA-Isolierungsmethode zuverlässig ist und bei der Untersuchung von Darmmikrobiota-Veränderungen im Zusammenhang mit Autoimmunerkrankungen helfen kann.
Introduction
Mensch und Bakterien existieren schon lange nebeneinander. Sie haben eine co-abhängige Beziehung mit gegenseitig vorteilhaften Effekten aufgebaut, die die Immunantwort des Wirts quantitativ und qualitativ beeinflusst1. Neuere Studien deuten auf einen Zusammenhang zwischen der Zusammensetzung der Darmmikrobiota und der Pathogenese von Autoimmunerkrankungen hin, zu denen Multiple Sklerose 2, rheumatoide Arthritis3,Typ-2-Diabetes 4, entzündliche Darmerkrankungen5 und systemischer Lupus erythematodes (SLE) gehören6. Ob die Darmmikrobiota jedoch die Hauptursache oder eine Nebenwirkung dieser Autoimmunerkrankungen ist, ist noch unklar7. Möglicherweise könnte die Darmmikrobiota die Krankheit während der Effektorphase von Autoimmunerkrankungen verschlimmern oder eine Rolle bei der Regulierung der Induktion dieser Krankheiten spielen8.
Intestinale Dysbiose wurde bei weiblichen Lupus-anfälligen MRL / Mp-Faslpr (MRL / lpr) Mäusen berichtet, und Darmmikrobiota-Veränderungen mit einer signifikanten Erschöpfung von Laktobazillen wurden beobachtet9. Wenn eine Mischung aus fünf Lactobacillus-Stämmen oral verabreicht wurde, wurden die lupusähnlichen Symptome bei diesen Mäusen weitgehend abgeschwächt, was auf eine wesentliche Rolle der Mikrobiota bei der Regulierung der SLE-Pathogenese hindeutet.
Die folgende Technik der DNA-Extraktion ermöglicht es, Mikrobiota-Fluktuationen zu verfolgen und sie qualitativ und quantitativ im Verlauf der murinen SLE-ähnlichen Erkrankung bei zu Lupus neigenden Mäusen zu analysieren. Unabhängig davon, ob die gesunde Darmmikrobiota untersucht oder Dysbiose definiert werden soll, ist es wichtig, kritisch zu untersuchen, wie Daten gesammelt werden und ob sie genau und reproduzierbar sind10. Jeder Schritt ist in diesem Prozess entscheidend. Eine geeignete Methodik muss verwendet werden, um mikrobielle DNA zu extrahieren, da jedes mögliche Problem, das Verzerrungen während des DNA-Extraktionsprozesses einführt, zu einer ungenauen mikrobiellen Repräsentation führen könnte. Während die Phenol-Chloroform-Methode hier beschrieben wird, gibt es kommerziell erhältliche Kits zur Extraktion von DNA aus Bakterien, die in bestimmten Fällen gut funktionieren11. Ihre Verwendbarkeit ist jedoch durch die Kosten und die erforderliche Probenmenge begrenzt.
Das hier vorgestellte Protokoll ist kostengünstig und erfordert nur eine geringe Probenmenge. Es funktioniert gut mit jeder Art von Stuhlprobe und ist nützlich bei der Untersuchung der Dynamik der Darmmikrobiota im Laufe der Zeit sowie bei Vergleichen zwischen Gruppen. DNA wird mit einer Methode der Alkoholreinigung isoliert, die Phenol, Chloroform und Isoamylalkohol verwendet. Die alkoholbasierte Extraktion hilft, die Probe von Proteinen und Lipiden zu reinigen und zu entfernen, wo im letzten Schritt DNA ausgefällt wird. Die vorgeschlagene Methode hat eine signifikant hohe Effizienz und Qualität und hat sich bei der Identifizierung von Bakterienpopulationen als genau erwiesen. Ein kritischer Hinweis während des Verfahrens ist, dass DNA-Kontaminationen auftreten können und daher eine angemessene Probenhandhabung erforderlich ist12.
Die DNA wird dann von den Next Generation Sequencing-Plattformen auf das 16S rRNA-Gen, wie das Illumina MiSeq, analysiert. Insbesondere wird die hypervariable Region V4 analysiert, um eine bessere Quantifizierung für hochrangige Taxa13 zu ermöglichen. Die anschließende bioinformatische Analyse wird ausgelagert, gefolgt von einer Inhouse-Analyse mit statistischen Standardmethoden. Es gibt zahlreiche Open-Source-Bioinformatik-Softwareprogramme für die nachgelagerte Sequenzierung, und die Art der durchgeführten Analysen hängt stark von der spezifischen biologischen Fragestellung von Interesseab 14. Dieses Protokoll konzentriert sich speziell auf die experimentellen Schritte vor der Sequenzierung und bietet eine vielseitigere, kostengünstigere, vergleichbare und effizientere Methode zur Gewinnung von DNA aus Stuhlproben.
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Protocol
Der Cx3cr1 gfp/gfp-Locus von B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J-Mäusen wurde für 10 Generationen zu MRL/MpJ-Fas lpr/J (MRL/lpr) zurückgekreuzt, um MRL/lpr-CX 3 CR1gfp/gfp-Mäuse zu erzeugen. Das Genom-Screening mit Einzelnukleotid-Polymorphismus (SNP)-Panels bestätigte, dass der genetische Hintergrund neu erzeugter Mäuse zu mehr als 97% mit dem von MRL/LPR identisch war. Danach wurden Mäuse in einer spezifischen pathogenfreien Umgebung gezüchtet und gehalten, die den spezifischen Anforderungen des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) an der Virginia Tech entsprach. Die Proben wurden gesammelt, als die Mäuse 13, 14 und 15 Wochen alt waren.
1. Entnahme von Mikrobiota-Proben von Mäusen
- Nehmen Sie jede Maus einzeln aus ihrem Käfig. Sammeln Sie ein Kotpellet direkt aus dem Anus und lagern Sie es bei -80 °C bis zur Verarbeitung. Verarbeiten Sie die Proben mit sterilen und sauberen Pinzetten, Röhrchen und Handschuhen.
HINWEIS: Ein Behälter (z. B. ein Becherglas) kann verwendet werden, um die Maus zu platzieren, während auf die Kotprobe gewartet wird. Reinigen Sie den Behälter vor und nach jeder Maus mit Ethanol. - Fügen Sie ein gefrorenes Pellet in ein vorgewogenes 2-ml-Schraubverschlussrohr hinzu. Notieren Sie das Kotgewicht in Gramm, das zwischen 0,02-0,05 g pro Kotpellet liegen sollte.
- Fügen Sie dem Pellet eine dünne Schicht aus 0,1 mm Glasperlen, 500 μL Lysepuffer (50 mM NaCl, 5 mM Tris und 50 mM EDTA) und 200 μL 20% SDS hinzu.
- Schlagen Sie die Röhre 4 Minuten lang in einem Homogenisator (bei maximaler Leistung), gefolgt von 3-5 Minuten Wirbel.
- Drehen Sie sich kurz, um die Blasen und den Schaum zu entfernen (drücken Sie den Knopf an der Zentrifuge, bis sie 1.000-1.200 x g erreicht, und lassen Sie sie dann los).
2. DNA-Extraktion
- Übertragen Sie 350 μL des in Schritt 1.5 erhaltenen Überstands (um sicherzustellen, dass keine Ablagerungen transportiert werden) in ein neues 1,5-ml-Schnappverschlussrohr. 500 μL Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol (PCI; 25:24:1, v/v) Gemisch zugeben und 1 min durchziehen.
HINWEIS: Von nun an müssen Proben in einer chemischen Haube gehandhabt werden. PCI ist giftig. - Bei 6.000 x g 3 min bei 4 °C schleudern. 180 μL der wässrigen Phase (oberste Schicht) in ein neues 1,5 ml Schnappverschlussrohr überführen. 180 μL (1:1) Chloroform hinzufügen, invertieren und mischen.
HINWEIS: Minimieren Sie die Kontamination durch die untere Schicht, wenn Sie die oberste Schicht übertragen. - Bei 18.400 x g 3 min bei 4 °C schleudern. 180 μL der wässrigen Phase in ein neues Schnappverschlussrohr überführen.
HINWEIS: Nach dem Verwerfen von PCI und Chloroform können die folgenden Schritte in einer biologischen Sicherheitswerkbank durchgeführt werden. - Fügen Sie 180 μL kaltes Isopropanol und 36 μL 5M NH4Ac. Einige Male umdrehen, um zu mischen, und legen Sie das Röhrchen für 20 min auf Eis.
- Bei 18.400 x g 20 min bei 4 °C schleudern. Gießen, um den Überstand zu verwerfen. Waschen Sie das Pellet mehrmals mit 500 μL kaltem 70% Ethanol beim Invertieren.
HINWEIS: Ethanol sollte mit doppelt entionisiertem sterilem Wasser verdünnt werden. - Bei 18.400 x g 3 min bei 4 °C schleudern. Verwerfen Sie den Überstand, um Restethanol zu entfernen.
- Trocknen Sie das Röhrchen kopfüber auf Seidenpapier 20 min an der Luft, bis das Pellet klar ist. Suspendieren Sie das Pellet in 50 μL molekularem Wasser. Erhitzen Sie die Flüssigkeit bei 37 °C für 10 min, um große DNA-Pellets vollständig aufzulösen.
- Schleudern Sie die Rohre nach dem Erhitzen, um Kondensationströpfchen auf dem Deckel zurückzugewinnen (3.400 x g für 1 min).
- Messen Sie die Konzentration und erhalten Sie das Verhältnis 260/280 mit einem Spektralphotometer. Verwenden Sie molekulares Wasser als Rohling. Gute Qualität DNA sollte 260/280 Verhältnisse zwischen 1,8 und 2 haben.
HINWEIS: Die erwartete DNA-Ausbeute beträgt mindestens 0,03 g pro Kotpellet.
3. Probenvorbereitung für die 16S rRNA-Gensequenzierung
- Senden Sie die DNA-Proben an das Argonne National Laboratory, wo sie einer Bibliotheksvorbereitung unterzogen und auf der Illumina Miseq sequenziert werden.
- Senden Sie Proben in vollständig umrandeten 96-Well-Platten, wobei die Proben in Reihen angeordnet sind (A1-A12, B1-B12 usw.) und mit Folienplattendichtungen versiegelt sind.
- Senden Sie ein Endvolumen von 20 μL pro Probe und Vertiefung mit einer Konzentration von 1-50 ng/μL.
HINWEIS: Verdünnungen sollten mit molekularem Wasser durchgeführt werden. - Nach der Vorbereitung der Proben bei 600 x g für 1 min bei Raumtemperatur schleudern, bevor die Proben bei -80 °C für 24 h eingefroren werden.
- Über Nacht auf Trockeneis schicken.
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Representative Results
Die Ergebnisse des Argonne National Laboratory werden von einem qualifizierten Bioinformatiker analysiert, gefolgt von einer internen Analyse der Daten mit statistischen Standardmethoden. Typische Mikrobiomanalysen beinhalten die Clusterung ähnlicher Sequenzen in operationelle taxonomische Einheiten (OTUs) oder Amplikonsequenzvarianten (ASVs) als Proxy für verschiedene Mikroorganismen in einer Probe. Die Anzahl der OTUs oder ASVs über Stichproben hinweg kann dann verwendet werden, um auf Änderungen der Diversität innerhalb der Stichprobe (Alpha) und der Diversität zwischen den Stichproben (Beta) zu testen. Sie können auch verwendet werden, um auf Taxa zu testen, die über Metadatenkategorien von Interesse unterschiedlich häufig vorhanden sind.
Wie in Abbildung 1 gezeigt, hat der Mausstamm, dem der Rezeptor CX3CR1 fehlt, eine andere Darmmikrobiota-Zusammensetzung. Im Vergleich zu Wildtyp-MRL/lpr zeigen MRL/lpr-CX3 CR1 gfp/gfp-Mäuse (die das grün fluoreszierende Protein anstelle von CX3CR1 exprimieren) signifikante Unterschiede in bestimmten Gattungen, die für potenziell pathogene Bakterien relevant sind, wie z.B. die im Stamm Proteobacteria. Darüber hinaus wurden einige Unterschiede für "gesunde" kommensale Bakterien wie Bifidobacterium, aber nicht für Lactobacillus festgestellt.
Abbildung 1: Vergleiche der Darmmikrobiota auf Gattungsebene für MRL/lpr und MRL/lpr-CX3CR1 Mäuse. Die Häufigkeit verschiedener Gattungen im Alter von 13, 14 und 15 Wochen (n = 5 weibliche Mäuse pro Gruppe). Zwei-Wege-ANOVA wurde durchgeführt. Keine Signifikanz ('ns'), *P < 0,05, **P < 0,01. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Eine ausgewogene Darmmikrobiota kann den menschlichen Körper vor Krankheiten schützen. Sobald dieses Gleichgewicht durch externe oder interne Auslöser gestört wird, können die Folgen verheerend sein. Diese Methode bietet eine Möglichkeit, die Dynamik der Darmmikrobiota in Mausmodellen zu analysieren. Die Methode eignet sich nicht nur für Vergleiche zwischen Gruppen, sondern auch für die Verfolgung der Darmmikrobiota im Zeitverlauf, um zeitabhängige Faktoren, die die Darmmikrobiota stören, besser zu identifizieren.
Alle Mäuse im Experiment müssen in der gleichen Umgebung behandelt werden. Eine wesentliche Angelegenheit, die beim Sammeln von Stuhlproben zu berücksichtigen ist, ist die Übereinstimmung mit Zeit, Tag und Ort. Mäuse sind koprophagisch. Dies bedeutet, dass sie ihren Kot oder die um sie herum essen, um essentielle Nährstoffe zu erhalten. Daher kann Kot nicht aus dem Käfig gesammelt werden. Die Proben müssen frisch und direkt aus dem Anus entnommen werden. Die beste Methode ist, die Maus zu massieren, während Sie sie halten, oder die Maus in einen Behälter zu legen. Darüber hinaus wird empfohlen, die Proben gleichzeitig zu verarbeiten und bei -80 °C einzufrieren, während darauf gewartet wird, dass alle Proben fertig sind.
Die DNA-Extraktion ist extrem empfindlich gegenüber Pipettieren und Handhabung, daher sollten alle Proben gleichzeitig verarbeitet werden. Eine weitere Überlegung ist die Vermeidung von Umweltverschmutzung; Daher sollte jeder einzelne Schritt, der aufgrund der toxischen Reagenzien nicht unbedingt in der chemischen Haube durchgeführt wird, in einer biologischen Sicherheitswerkbank durchgeführt werden. Obwohl die Wahrscheinlichkeit einer Umweltkontamination gering ist und es keinen Schritt gibt, um Bakterien wachsen zu lassen, ist diese Methode äußerst empfindlich und es wird dringend empfohlen, eine mögliche Kontamination zu vermeiden. Darüber hinaus trägt das Wiegen der Pellets dazu bei, die Konsistenz zwischen den Proben zu erhöhen. Als Vorteil gegenüber handelsüblichen Kits eignet sich diese Methode besonders gut, um hohe DNA-Konzentrationen zu erreichen. Die mit diesem Protokoll erhaltene DNA-Ausbeute liegt zwischen 0,03 g und 0,07 g, abhängig vom Gewicht des Kotpellets. Im Vergleich dazu können kommerzielle Kits zwischen 0,005 g und 0,05 g liefern, jedoch mit einer höheren Sättigungswahrscheinlichkeit, die durch den Säulenretentionsschritt begrenzt ist.
Der Perlenschlagschritt ist wichtig, um das Fäkalienpellet in kleine Stücke zu brechen, damit das Lysemittel alle Bakterien erreichen kann. Wenn dieser Schritt nicht gut durchgeführt wird, können Pellets teilweise zerfallen und weniger repräsentative Bakterien erreicht werden. Darüber hinaus ist beim Transfer von Überständen ein korrektes Pipettieren wichtig, da das Tragen eines Teils des Restpuffers aus dem vorherigen Schritt die Ausbeute und Qualität der DNA am Ende verändern würde.
Bei der Verdünnung der Proben für die 16S ribosomale RNA-Gensequenzierung ist es wichtig, schnell zu handeln, bevor die Proben in den Gefrierschrank gegeben werden. Es ist auch wichtig, die Proben vor der Durchführung von Verdünnungen gut zu mischen. Vermeiden Sie es, Proben über einen längeren Zeitraum bei Raumtemperatur zu lassen. Da die Volumina klein sind, hilft das Einfrieren der Proben in der Platte vor dem Versand, den Verlust zu minimieren.
Das Argonne National Laboratory analysiert die V4-Region des 16S rRNA-Gens. Die V4-Region ist besser erhalten als die anderen Regionen und hat eine bessere Schätzung für hochrangige Taxa13. Während die anderen Regionen besser für die Analyse sich schnell entwickelnder Arten geeignet sind und helfen können, Gattungen oder Arten zu identifizieren und besser zu unterscheiden, akkumulieren diese Regionen Mutationen schneller als V4.
Sobald die Ergebnisse vorliegen und von einem qualifizierten Bioinformatiker analysiert wurden, kann eine statistische Software verwendet werden, um die Ergebnisse darzustellen und Gruppen zu vergleichen. Es ist wichtig, die Grenzen dieser Technik und die Ergebnisse nach der bioinformatischen Analyse zu verstehen. Je niedriger das taxonomische Niveau, desto geringer die Genauigkeit oder desto größer die Abweichungen. Vom Stamm bis zur Familie und sogar die Gattungsebene kann zuverlässig analysiert werden. Anmerkungen auf Artebene sind mit dieser Methode jedoch nicht genau. Die Schrotflintensequenzierung hingegen kann die Artenebene erreichen; Obwohl sie mehr Einblick in die biologischen Funktionen einer Gemeinschaft geben kann, ist die 16S-rRNA-Gensequenzierung immer noch eine genaue und kostengünstige Methode zur Quantifizierung taxonomischer Verteilungen einer mikrobiellen Gemeinschaft15.
Zusammenfassend wurde ein kosteneffizientes Protokoll beschrieben, um die Darmmikrobiota zu analysieren und ihre Dynamik mit der maximalen Genauigkeit zu untersuchen, die helfen kann, longitudinale Veränderungen im Laufe der Zeit sowie Unterschiede zwischen Gruppen aufzudecken.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.
Acknowledgments
Wir schätzen die Hilfe des Argonne National Laboratory und unserer kooperierenden Bioinformatiker. Diese Arbeit wird durch verschiedene NIH- und interne Zuschüsse unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 mm glass beads | BioSpec Products | 11079101 | |
| 2 mL screw cap tubes | Thermo Fisher Scientific | 3488 | |
| 20% SDS | FisherScientific | BP1311-1 | SDS 20% |
| 96% Ethanol, Molecular Biology Grade | Thermo Fisher Scientific | T032021000CS | |
| Ammonium Acetate (5 M) | Thermo Fisher Scientific | AM9071 | NH4AC 5M |
| B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J | Jackson Laboratory | 005582 | |
| Bullet Blender storm 24 | Next Advance | 4116-BBY24M | Homogenizer |
| Chloroform | FisherScientific | C298-500 | |
| DEPC-Treated Water | Thermo Fisher Scientific | AM9916 | |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid | FisherScientific | BP118-500 | EDTA |
| Foil plate seal | FisherScientific | NC0302491 | |
| Kimwipes-Kimtech 34256 | FisherScientific | 06-666C | |
| MRL/MpJ-Faslpr/J (MRL/lpr) mice | Jackson Laboratory | 000485 | |
| Nanodrop 2000 spectrophotomer | Thermo Fisher Scientific | ND2000CLAPTOP | |
| Phenol: chloroform: isoamylalchohol (25:24:1) | FisherScientific | BP1752I-400 | PCI |
| Scale with 4 decimals | Mettler Toledo | MS205DU | |
| Skirted 96-well plates | Thermo Fisher Scientific | AB-0800 | |
| Sodium chloride | FisherScientific | 15528154 | NaCl |
| Tris Hydrochloride | FisherScientific | BP1757-100 | |
| Vortex | Scientific Industries | SI-0236 |
References
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