간단하고 비용 효율적인 DNA 분리 방법을 사용한 루푸스 경향 마우스의 분변 미생물 역학 분석

요약

이 프로토콜은 자가면역 질환 발병 중 쥐 장내 미생물 변화를 분석하기 위한 간단하고 비용 효율적인 DNA 분리 방법을 제공합니다.

초록

장내 미생물총은 면역 체계를 교육하는 데 중요한 역할을 합니다. 이 관계는 유전적 요인뿐만 아니라 발병을 유발하거나 질병 경과를 악화시킬 수 있는 환경적 요인에 의해 유발되는 자가면역 질환을 이해하는 데 매우 중요합니다. 루푸스가 발생하기 쉬운 MRL/lpr 암컷 마우스에서 장내 미생물총의 역학에 대해 이전에 발표된 연구는 장내 미생물총의 변화가 질병 진행을 어떻게 변화시킬 수 있는지 보여주었습니다. 여기서는자가 면역 연구를 위해 장내 미생물 총에서 대표 샘플을 추출하기위한 프로토콜이 설명됩니다. 미생물 총을 항문에서 채취하여 처리하고, 페놀 - 클로로포름 방법을 사용하여 DNA를 추출하고 알코올 침전으로 정제합니다. PCR이 수행된 후, 정제된 앰플리콘은 아르곤 국립 연구소의 차세대 시퀀싱 플랫폼을 사용하여 시퀀싱됩니다. 마지막으로 16S 리보솜 RNA 유전자 시퀀싱 데이터를 분석합니다. 예를 들어, CX₃CR1이 있거나없는 MRL / lpr 마우스의 장내 미생물 비교에서 얻은 데이터가 표시됩니다. 결과는 프로테오박테리아 문과 같은 병원성 박테리아를 포함하는 속과 건강한 공생 미생물총의 일부로 간주되는 비피도박테리움 속에서 상당한 차이를 보여주었습니다. 요약하면, 이 간단하고 비용 효율적인 DNA 분리 방법은 신뢰할 수 있으며 자가면역 질환과 관련된 장내 미생물 변화를 조사하는 데 도움이 될 수 있습니다.

서론

인간과 박테리아는 오랫동안 공존해 왔습니다. 그들은 양적 및 질적 방식으로 숙주 면역 반응에 영향을 미치는 상호 유익한 효과와 상호 의존적 관계를 확립했습니다¹. 최근 연구에 따르면 장내 미생물총과 다발성 경화증 2, 류마티스 관절염³, 제²형 당뇨병^{4, 염증성} 장 질환⁵ 및 전신성 홍반성 루푸스(SLE)⁶를 포함하는 자가면역 질환의 발병기전이 연관되어 있습니다. 그러나 장내 미생물이 이러한자가 면역 질환의 주요 원인인지 또는 2 차 효과인지는 여전히 불분명합니다⁷. 잠재적으로, 장내 미생물총은 자가면역 질환의 이펙터 단계에서 질병을 악화시키거나^{이러한 질병의 유도}를 조절하는 역할을 할 수 있다8.

암컷 루푸스 경향이 있는 MRL/Mp-Faslpr(MRL/lpr) 마우스에서 장내 dysbiosis가 보고되었으며, 락토바실러스의 상당한 고갈과 함께 장내 미생물총의^{변화가 관찰되었....}

프로토콜

B6.129P2(Cg)-Cx3cr1^tm1Litt/J 마우스의 Cx3cr1 gfp/gfp 유전자좌를 MRL/Lpr-CX3 CR1 gfp/^gfp 마우스를 생성하기 위해 10세대 동안 MRL/MpJ-Fas lpr/J(MRL^/lpr)로 역교배하였다. 단일 염기 다형성(SNP) 패널을 사용한 게놈 스크리닝은 새로 생성된 마우스의 유전적 배경이 MRL/lpr의 유전적 배경과 97% 이상 동일하다는 것을 확인했습니다. 그 후, 마우스는 버지니아 공대의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 특정 요구 사항에 따라 특정 병원체가없는 환경에서 사육되고 유지되었습니다. 마우스가 13, 14 및 15 주령이었을 때 샘플을 수집했습니다.

1. 생쥐의 미생물 검체 채취

1. 케이지에서 각 마우스를 개별적으로 꺼냅니다. 항문에서 직접 대변 펠릿을 수집하고 처리 될 때까지 -80 ° C에서 보관하십시오. 멸균되고 깨끗한 집게, 튜브 및 장갑으로 샘플을 처리하십시오.
   참고: 용기(예: 비커)를 사용하여 분변 샘플을 기다리는 동안 마우스를 놓을 수 있습니다. 각 마우스 전후에 에탄올로 용기....

결과

아르곤 국립 연구소의 결과는 자격을 갖춘 생물 정보학자가 분석 한 다음 표준 통계 방법을 사용하여 데이터를 사내 분석합니다. 일반적인 마이크로바이옴 분석에는 샘플의 다른 미생물에 대한 프록시로서 유사한 서열을 작동 분류학적 단위(OTU) 또는 앰플리콘 서열 변이체(ASV)로 클러스터링하는 것이 포함됩니다. 그런 다음 샘플 전체의 OTU 또는 ASV 수를 사용하여 샘플 내(알파) 다양성 및 샘플 간(베타) 다이버시티의 변화를 테스트할 수 있습니다. 또한 관심 있는 메타데이터 범주에 걸쳐 차등적으로 풍부한 분류군을 테스트하는 데 사용할 수도 있습니다.

도 1에 나타낸 바와 같이, 수용체_CX3CR1이 결여된 마우스 균주는 상이한 장내 미생물 구성을 갖는다. 야생형 MRL/lpr과 비교하여 MRL/lpr-CX 3 CR1 gfp^/gfp 마우스(CX₃CR1 대신 녹색 형광 단백질.......

토론

균형 잡힌 장내 미생물은 질병으로부터 인체를 보호 할 수 있습니다. 이 균형이 외부 또는 내부 트리거에 의해 중단되면 결과는 치명적일 수 있습니다. 이 방법은 쥐 모델에서 장내 미생물의 역학을 분석하는 방법을 제시합니다. 이 방법은 그룹 간의 비교뿐만 아니라 시간이 지남에 따라 장내 미생물총을 추적하여 장내 미생물총을 방해하는 시간 의존적 요인을 더 잘 식별하는 데에도 적합합니다.

실험의 모든 마우스는 동일한 환경에서 처리되어야 합니다. 분변 샘플을 수집 할 때 고려해야 할 한 가지 필수 사항은 시간, 요일 및 장소와 일치해야합니다. 마우스는 공생식입니다. 이것은 필수 영양소를 얻기 위해 대변이나 주변 음식을 먹는다는 것을 의미합니다. 따라서 케이지에서 대변을 수집 할 수 없습니다. 샘플은 항문에서 직접 수집해야합니다. 가장 좋은 방법은 마우스를 잡고 마사지하거나 마우스를 용기에 넣는 것입니다. 또한 샘플을 동시에 처리하고 모든 샘플이 준비되기를 기다리는 동안 -80 ° C에서 .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.1 mm 유리 구슬	BioSpec 제품	11079101
2 mL 스크류 캡 튜브	Thermo Fisher Scientific	3488
20%	SDS FisherScientific	BP1311-1	SDS 20%
96% 에탄올, 분자생물학 등급	Thermo Fisher Scientific	T032021000CS
암모늄 아세테이트(5 M)	Thermo Fisher Scientific	AM9071	NH4AC 5M
B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J	Jackson Laboratory	005582
Bullet Blender storm 24	다음 사전	4116-BBY24M	균질화기
클로로포름	FisherScientific	C298-500
DEPC 처리수	Thermo Fisher Scientific	AM9916
에틸렌디아민 테트라아세트산	FisherScientific	BP118-500	EDTA
호일 플레이트 씰	FisherScientific	NC0302491
Kimwipes-Kimtech 34256	FisherScientific	06-666C
MRL/MpJ-Faslpr/J (MRL/lpr) 마우스	Jackson Laboratory	000485
Nanodrop 2000 분광 광도체	Thermo Fisher Scientific	ND2000CLAPTOP
페놀: 클로로포름: 이소아밀알콜 (25:24:1)	FisherScientific	BP1752I-400	PCI
스케일 (소수점 이하 4개)	Mettler Toledo	MS205DU
Skirted 96-well plates	Thermo Fisher Scientific	AB-0800
염화나트륨	FisherScientific	15528154	NaCl
Tris Hydrochloride	FisherScientific	BP1757-100
소용돌이	과학 산업	SI-0236