Summary
이 프로토콜은 자가면역 질환 발병 중 쥐 장내 미생물 변화를 분석하기 위한 간단하고 비용 효율적인 DNA 분리 방법을 제공합니다.
Abstract
장내 미생물총은 면역 체계를 교육하는 데 중요한 역할을 합니다. 이 관계는 유전적 요인뿐만 아니라 발병을 유발하거나 질병 경과를 악화시킬 수 있는 환경적 요인에 의해 유발되는 자가면역 질환을 이해하는 데 매우 중요합니다. 루푸스가 발생하기 쉬운 MRL/lpr 암컷 마우스에서 장내 미생물총의 역학에 대해 이전에 발표된 연구는 장내 미생물총의 변화가 질병 진행을 어떻게 변화시킬 수 있는지 보여주었습니다. 여기서는자가 면역 연구를 위해 장내 미생물 총에서 대표 샘플을 추출하기위한 프로토콜이 설명됩니다. 미생물 총을 항문에서 채취하여 처리하고, 페놀 - 클로로포름 방법을 사용하여 DNA를 추출하고 알코올 침전으로 정제합니다. PCR이 수행된 후, 정제된 앰플리콘은 아르곤 국립 연구소의 차세대 시퀀싱 플랫폼을 사용하여 시퀀싱됩니다. 마지막으로 16S 리보솜 RNA 유전자 시퀀싱 데이터를 분석합니다. 예를 들어, CX3CR1이 있거나없는 MRL / lpr 마우스의 장내 미생물 비교에서 얻은 데이터가 표시됩니다. 결과는 프로테오박테리아 문과 같은 병원성 박테리아를 포함하는 속과 건강한 공생 미생물총의 일부로 간주되는 비피도박테리움 속에서 상당한 차이를 보여주었습니다. 요약하면, 이 간단하고 비용 효율적인 DNA 분리 방법은 신뢰할 수 있으며 자가면역 질환과 관련된 장내 미생물 변화를 조사하는 데 도움이 될 수 있습니다.
Introduction
인간과 박테리아는 오랫동안 공존해 왔습니다. 그들은 양적 및 질적 방식으로 숙주 면역 반응에 영향을 미치는 상호 유익한 효과와 상호 의존적 관계를 확립했습니다1. 최근 연구에 따르면 장내 미생물총과 다발성 경화증 2, 류마티스 관절염3, 제2형 당뇨병4, 염증성 장 질환5 및 전신성 홍반성 루푸스(SLE)6를 포함하는 자가면역 질환의 발병기전이 연관되어 있습니다. 그러나 장내 미생물이 이러한자가 면역 질환의 주요 원인인지 또는 2 차 효과인지는 여전히 불분명합니다7. 잠재적으로, 장내 미생물총은 자가면역 질환의 이펙터 단계에서 질병을 악화시키거나이러한 질병의 유도를 조절하는 역할을 할 수 있다8.
암컷 루푸스 경향이 있는 MRL/Mp-Faslpr(MRL/lpr) 마우스에서 장내 dysbiosis가 보고되었으며, 락토바실러스의 상당한 고갈과 함께 장내 미생물총의변화가 관찰되었습니다9. 5 가지 락토 바실러스 균주의 혼합물을 경구 투여했을 때,이 마우스에서 루푸스와 유사한 증상이 크게 약화되어 SLE 병인을 조절하는 데 미생물 총의 필수적인 역할을 시사합니다.
다음의 DNA 추출 기술은 루푸스 경향이있는 마우스에서 쥐 SLE와 유사한 질병의 과정에서 미생물 변동을 추적하고 정 성적 및 정량적으로 분석 할 수있게합니다. 건강한 장내 미생물을 검사하든 dysbiosis를 정의하든 데이터 수집 방법과 정확하고 재현 가능한지 비판적으로 조사하는 것이 중요합니다10. 이 과정에서 모든 단계가 중요합니다. DNA 추출 과정에서 편향을 도입할 수 있는 문제가 있으면 부정확한 미생물 표현이 발생할 수 있으므로 미생물 DNA를 추출하려면 적절한 방법론을 사용해야 합니다. 페놀-클로로포름 방법이 여기에 설명되어 있지만, 특정 경우에 잘 작동하는 박테리아로부터 DNA를 추출하는 시판되는 키트가 있습니다11. 그러나 유용성은 비용과 필요한 샘플 수량에 의해 제한됩니다.
여기에 제시된 프로토콜은 비용 효율적이며 소량의 샘플 만 필요합니다. 모든 종류의 대변 샘플에서 잘 작동하며 시간이 지남에 따라 장내 미생물의 역학과 그룹 간의 비교를 연구하는 데 유용합니다. DNA는 페놀, 클로로포름 및 이소아밀 알코올을 사용하는 알코올 정제 방법으로 분리됩니다. 알코올 기반 추출은 최종 단계에서 DNA가 침전되는 단백질 및 지질 샘플을 세척하고 제거하는 데 도움이 됩니다. 제안 된 방법은 상당히 높은 효율성과 품질을 가지며 박테리아 개체군을 식별하는 데 정확한 것으로 입증되었습니다. 절차 중 한 가지 중요한 점은 DNA 오염이 발생할 수 있으므로 적절한 샘플 처리가 필요하다는 것입니다12.
그런 다음 DNA는 Illumina MiSeq와 같은 16S rRNA 유전자에 대한 차세대 시퀀싱 플랫폼에 의해 분석됩니다. 특히, V4 초가변 영역은 상위 순위 분류군(13)에 대한 더 나은 정량화를 제공하기 위해 분석된다. 후속 생물 정보학 분석은 아웃소싱되고 표준 통계 방법을 사용한 사내 분석이 이어집니다. 다운스트림 시퀀싱에 사용할 수 있는 수많은 오픈 소스 생물정보학 소프트웨어 프로그램이 있으며 수행되는 분석 유형은 관심 있는 특정 생물학적 질문에 따라 크게 달라집니다14. 이 프로토콜은 특히 시퀀싱 이전의 실험 단계에 초점을 맞추고 분변 샘플에서 DNA를 얻기 위한 보다 다양하고 비용 효율적이며 비교 가능하고 효율적인 방법을 제공합니다.
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Protocol
B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J 마우스의 Cx3cr1 gfp/gfp 유전자좌를 MRL/Lpr-CX3 CR1 gfp/gfp 마우스를 생성하기 위해 10세대 동안 MRL/MpJ-Fas lpr/J(MRL/lpr)로 역교배하였다. 단일 염기 다형성(SNP) 패널을 사용한 게놈 스크리닝은 새로 생성된 마우스의 유전적 배경이 MRL/lpr의 유전적 배경과 97% 이상 동일하다는 것을 확인했습니다. 그 후, 마우스는 버지니아 공대의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 특정 요구 사항에 따라 특정 병원체가없는 환경에서 사육되고 유지되었습니다. 마우스가 13, 14 및 15 주령이었을 때 샘플을 수집했습니다.
1. 생쥐의 미생물 검체 채취
- 케이지에서 각 마우스를 개별적으로 꺼냅니다. 항문에서 직접 대변 펠릿을 수집하고 처리 될 때까지 -80 ° C에서 보관하십시오. 멸균되고 깨끗한 집게, 튜브 및 장갑으로 샘플을 처리하십시오.
참고: 용기(예: 비커)를 사용하여 분변 샘플을 기다리는 동안 마우스를 놓을 수 있습니다. 각 마우스 전후에 에탄올로 용기를 청소하십시오. - 미리 계량된 2mL 스크류 캡 튜브에 냉동 펠릿을 추가합니다. 분변 중량을 그램 단위로 기록하면 분변 펠릿 당 0.02-0.05g 사이 여야합니다.
- 0.1 mm 유리 비드, 500 μL의 용해 완충액 (50 mM NaCl, 5 mM 트리스 및 50 mM EDTA) 및 20 μL의 20 % SDS의 얇은 층을 펠릿에 첨가한다.
- 균질화기(최대 출력에서)에서 4분 동안 튜브를 비드로 두드린 다음 3-5분 동안 와동을 일으킵니다.
- 기포와 거품을 제거하기 위해 짧은 시간 동안 회전하십시오 (원심 분리기의 버튼을 1,000-1,200 x g에 도달 할 때까지 누른 다음 놓습니다).
2. DNA 추출
- 1.5단계에서 얻은 상청액 350μL(파편이 운반되지 않도록 보장)를 새 1.5mL 스냅 캡 튜브로 옮깁니다. 500μL의 페놀-클로로포름-이소아밀 알코올(PCI; 25:24:1, v/v) 혼합물을 넣고 1분 동안 와동시킵니다.
알림: 이제부터는 샘플을 화학 후드 내부에서 처리해야합니다. PCI는 독성이 있습니다. - 4°C에서 3분 동안 6,000 x g 로 회전합니다. 180μL의 수성 상(최상층)을 새로운 1.5mL 스냅 캡 튜브로 옮깁니다. 클로로포름 180μL(1:1)를 넣고 뒤집어 혼합합니다.
알림: 상단 레이어를 전송할 때 하단 레이어의 오염을 최소화하십시오. - 4°C에서 3분 동안 18,400 x g 로 회전합니다. 180 μL의 수성 상을 새로운 스냅 캡 튜브로 옮깁니다.
알림: PCI 및 클로로포름을 폐기한 후 생물학적 안전 캐비닛에서 다음 단계를 수행할 수 있습니다. - 180μL의 차가운 이소프로판올과 36μL의 5M NH4Ac를 넣고 몇 번 뒤집어 혼합하고 튜브를 얼음 위에 20 분 동안 놓습니다.
- 4°C에서 20분 동안 18,400 x g 로 회전합니다. 상청액을 버리기 위해 붓는다. 뒤집는 동안 500μL의 차가운 70% 에탄올로 펠릿을 여러 번 세척합니다.
알림: 에탄올은 이중 탈 이온수 멸균 수로 희석해야합니다. - 4°C에서 3분 동안 18,400 x g 로 회전합니다. 상청액을 버리고 잔류 에탄올을 제거한다.
- 펠릿이 깨끗해질 때까지 튜브를 티슈 페이퍼에 거꾸로 20분 동안 자연 건조합니다. 펠릿을 분자 등급 물 50μL에 현탁합니다. 액체를 37°C에서 10분 동안 가열하여 큰 DNA 펠릿을 완전히 용해시킵니다.
- 가열 후 스핀 튜브를 사용하여 뚜껑의 응결 방울을 회수합니다(1분 동안 3,400 x g ).
- 농도를 측정하고 분광 광도계를 사용하여 260/280 비율을 구한다. 분자 등급의 물을 블랭크로 사용하십시오. 양질의 DNA는 1.8과 2 사이의 260/280 비율을 가져야 합니다.
참고: 예상 DNA 수율은 분변 펠릿당 최소 0.03g입니다.
3. 16S rRNA 유전자 시퀀싱을 위한 샘플 준비
- DNA 샘플을 아르곤 국립 연구소로 보내 도서관 준비를 거쳐 Illumina Miseq에서 시퀀싱합니다.
- 샘플을 완전히 스커트된 96웰 플레이트에 보내고 샘플은 줄(A1-A12, B1-B12 등)로 배열하고 호일 플레이트 씰로 밀봉합니다.
- 웰당 시료당 20 μL의 최종 부피를 보내며, 농도는 1-50 ng/μL입니다.
알림: 희석은 분자 등급의 물로 수행해야 합니다. - 샘플을 준비한 후 실온에서 1분 동안 600 x g 로 회전시킨 후 샘플을 -80°C에서 24시간 동안 동결시킵니다.
- 드라이 아이스에서 밤새 보내십시오.
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Representative Results
아르곤 국립 연구소의 결과는 자격을 갖춘 생물 정보학자가 분석 한 다음 표준 통계 방법을 사용하여 데이터를 사내 분석합니다. 일반적인 마이크로바이옴 분석에는 샘플의 다른 미생물에 대한 프록시로서 유사한 서열을 작동 분류학적 단위(OTU) 또는 앰플리콘 서열 변이체(ASV)로 클러스터링하는 것이 포함됩니다. 그런 다음 샘플 전체의 OTU 또는 ASV 수를 사용하여 샘플 내(알파) 다양성 및 샘플 간(베타) 다이버시티의 변화를 테스트할 수 있습니다. 또한 관심 있는 메타데이터 범주에 걸쳐 차등적으로 풍부한 분류군을 테스트하는 데 사용할 수도 있습니다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 수용체CX3CR1이 결여된 마우스 균주는 상이한 장내 미생물 구성을 갖는다. 야생형 MRL/lpr과 비교하여 MRL/lpr-CX 3 CR1 gfp/gfp 마우스(CX3CR1 대신 녹색 형광 단백질을 발현함)는 프로테오박테리아문과 같은 잠재적으로 병원성 박테리아와 관련된 특정 속에서 상당한 차이를 보입니다. 또한 비피도박테리움과 같은 "건강한" 공생 박테리아에 대해서는 약간의 차이가 있었지만 락토바실러스는 그렇지 않았습니다.
그림 1 : MRL / lpr 및 MRL / lpr-CX3CR1 마우스에 대한 속 수준의 장내 미생물 비교. 13, 14, 15 주령에 다른 속의 풍부함 (n = 그룹 당 5 마리의 암컷 마우스). 양방향 분산 분석이 수행되었습니다. 유의성 없음('ns'), *P < 0.05, **P < 0.01. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
균형 잡힌 장내 미생물은 질병으로부터 인체를 보호 할 수 있습니다. 이 균형이 외부 또는 내부 트리거에 의해 중단되면 결과는 치명적일 수 있습니다. 이 방법은 쥐 모델에서 장내 미생물의 역학을 분석하는 방법을 제시합니다. 이 방법은 그룹 간의 비교뿐만 아니라 시간이 지남에 따라 장내 미생물총을 추적하여 장내 미생물총을 방해하는 시간 의존적 요인을 더 잘 식별하는 데에도 적합합니다.
실험의 모든 마우스는 동일한 환경에서 처리되어야 합니다. 분변 샘플을 수집 할 때 고려해야 할 한 가지 필수 사항은 시간, 요일 및 장소와 일치해야합니다. 마우스는 공생식입니다. 이것은 필수 영양소를 얻기 위해 대변이나 주변 음식을 먹는다는 것을 의미합니다. 따라서 케이지에서 대변을 수집 할 수 없습니다. 샘플은 항문에서 직접 수집해야합니다. 가장 좋은 방법은 마우스를 잡고 마사지하거나 마우스를 용기에 넣는 것입니다. 또한 샘플을 동시에 처리하고 모든 샘플이 준비되기를 기다리는 동안 -80 ° C에서 동결하는 것이 좋습니다.
DNA 추출은 피펫팅 및 취급에 매우 민감하므로 모든 샘플을 동시에 처리해야 합니다. 또 다른 고려 사항은 환경 오염을 피하는 것입니다. 따라서 독성 시약으로 인해 화학 후드에서 반드시 수행되는 것은 아닌 모든 단일 단계는 생물학적 안전 캐비닛에서 수행되어야합니다. 환경 오염 가능성이 낮고 박테리아가 자랄 수있는 단계가 없더라도이 방법은 매우 민감하며 가능한 오염을 피하는 것이 절대적으로 권장됩니다. 또한 펠릿을 칭량하면 샘플 간의 일관성을 높이는 데 도움이 됩니다. 시판되는 키트에 비해 장점으로서, 이 방법은 고농도의 DNA를 달성하는데 특히 좋다. 이 프로토콜로 얻은 DNA 수율은 분변 펠릿의 무게에 따라 0.03g에서 0.07g 사이입니다. 이에 비해 상용 키트는 0.005g에서 0.05g 사이를 산출할 수 있지만 컬럼 머무름 단계에 의해 제한되는 포화 가능성이 더 높습니다.
비드 박동 단계는 분변 펠릿을 작은 조각으로 분해하여 용해제가 모든 박테리아에 도달할 수 있도록 하는 데 중요합니다. 이 단계가 잘 수행되지 않으면 펠릿이 부분적으로 분해 될 수 있으며 더 적은 수의 대표적인 박테리아에 도달 할 수 있습니다. 또한 상청액을 이송할 때 이전 단계에서 잔류 완충액의 일부를 운반하면 마지막에 DNA의 수율과 품질이 변경되기 때문에 올바른 피펫팅이 중요합니다.
16S 리보솜 RNA 유전자 시퀀싱을 위해 샘플을 희석할 때 샘플을 냉동실에 넣기 전에 신속하게 행동하는 것이 중요합니다. 희석을 수행하기 전에 샘플을 잘 혼합하는 것도 중요합니다. 샘플을 실온에 장기간 방치하지 마십시오. 부피가 작기 때문에 배송하기 전에 플레이트의 샘플을 냉동하면 손실을 최소화하는 데 도움이 됩니다.
아르곤 국립 연구소는 16S rRNA 유전자의 V4 영역을 분석합니다. V4 지역은 다른 지역보다 더 잘 보존되며 상위 분류군13에 대해 더 나은 추정치를 갖습니다. 다른 영역은 빠르게 진화하는 종의 분석에 더 좋고 속 또는 종을 식별하고 더 잘 구별하는 데 도움이 될 수 있지만 해당 영역은 V4보다 빠르게 돌연변이를 축적합니다.
자격을 갖춘 생물 정보학자가 결과를 다시 분석하고 분석하면 통계 소프트웨어를 사용하여 결과를 플롯하고 그룹을 비교할 수 있습니다. 이 기술의 한계와 생물 정보학 분석 후 결과를 이해하는 것이 중요합니다. 분류 수준이 낮을수록 정확도가 떨어지거나 변동이 커집니다. 문에서 가족까지, 심지어 속 수준까지도 신뢰성있게 분석 할 수 있습니다. 그러나 종 수준의 주석은이 방법으로 정확하지 않습니다. 반면에 산탄 총 시퀀싱은 종 수준에 도달 할 수 있습니다. 그러나, 군집의 생물학적 기능에 대한 더 많은 통찰력을 제공할 수 있지만, 16S rRNA 유전자 시퀀싱은 여전히 미생물 군집의 분류학적 분포를 정량화하는 정확하고 비용 효율적인 방법이다(15).
요약하면, 장내 미생물총을 분석하고 시간 경과에 따른 종단 변화와 그룹 간의 차이를 밝히는 데 도움이 될 수 있는 최대 정확도로 역학을 연구하기 위해 비용 효율적인 프로토콜이 설명되었습니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
아르곤 국립 연구소와 협력하는 생물 정보학자의 도움에 감사드립니다. 이 작업은 다양한 NIH 및 내부 보조금으로 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 mm glass beads | BioSpec Products | 11079101 | |
| 2 mL screw cap tubes | Thermo Fisher Scientific | 3488 | |
| 20% SDS | FisherScientific | BP1311-1 | SDS 20% |
| 96% Ethanol, Molecular Biology Grade | Thermo Fisher Scientific | T032021000CS | |
| Ammonium Acetate (5 M) | Thermo Fisher Scientific | AM9071 | NH4AC 5M |
| B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J | Jackson Laboratory | 005582 | |
| Bullet Blender storm 24 | Next Advance | 4116-BBY24M | Homogenizer |
| Chloroform | FisherScientific | C298-500 | |
| DEPC-Treated Water | Thermo Fisher Scientific | AM9916 | |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid | FisherScientific | BP118-500 | EDTA |
| Foil plate seal | FisherScientific | NC0302491 | |
| Kimwipes-Kimtech 34256 | FisherScientific | 06-666C | |
| MRL/MpJ-Faslpr/J (MRL/lpr) mice | Jackson Laboratory | 000485 | |
| Nanodrop 2000 spectrophotomer | Thermo Fisher Scientific | ND2000CLAPTOP | |
| Phenol: chloroform: isoamylalchohol (25:24:1) | FisherScientific | BP1752I-400 | PCI |
| Scale with 4 decimals | Mettler Toledo | MS205DU | |
| Skirted 96-well plates | Thermo Fisher Scientific | AB-0800 | |
| Sodium chloride | FisherScientific | 15528154 | NaCl |
| Tris Hydrochloride | FisherScientific | BP1757-100 | |
| Vortex | Scientific Industries | SI-0236 |
References
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