Summary
このプロトコルは、自己免疫疾患の発症中のマウス腸内細菌叢の変化を分析するためのシンプルで費用効果の高いDNA単離方法を提供します。
Abstract
腸内細菌叢は、免疫系の教育に重要な役割を果たしています。この関係は、遺伝的要因だけでなく、発症の引き金となったり、病気の経過を悪化させたりする可能性のある環境要因によって引き起こされる自己免疫疾患を理解するために非常に重要です。狼瘡が発生しやすいMRL / lpr雌マウスの腸内細菌叢の動態に関する以前に発表された研究は、腸内細菌叢の変化が病気の進行をどのように変えることができるかを示しました。ここでは、自己免疫の研究のために腸内細菌叢から代表的なサンプルを抽出するためのプロトコルについて説明します。微生物叢サンプルは肛門から収集され、処理され、そこからフェノール - クロロホルム法を用いてDNAが抽出され、アルコール沈殿によって精製される。PCRを実行した後、精製されたアンプリコンは、アルゴンヌ国立研究所の次世代シーケンシングプラットフォームを使用してシーケンスされます。最後に、16SリボソームRNA遺伝子シーケンシングデータを解析します。例として、CX3CR1の有無にかかわらずMRL/lprマウスの腸内細菌叢の比較から得られたデータが示されている。結果は、プロテオバクテリア門などの病原性細菌を含む属と、健康な共生微生物叢の一部と考えられている ビフィズス菌属に有意差を示しました。要約すると、このシンプルで費用効果の高いDNA単離方法は信頼性が高く、自己免疫疾患に関連する腸内細菌叢の変化の調査に役立ちます。
Introduction
人間とバクテリアは長い間共存してきました。彼らは、宿主の免疫応答に定量的および定性的な方法で影響を与える相互有益な効果との共依存関係を確立しました1。最近の研究では、腸内細菌叢の組成と、多発性硬化症2、関節リウマチ3、2型糖尿病4、炎症性腸疾患5、全身性エリテマトーデス(SLE)6などの自己免疫疾患の病因との関連が示唆されています。しかし、腸内細菌叢がこれらの自己免疫疾患の主な原因なのか二次的な影響なのかはまだ不明です7。潜在的に、腸内細菌叢は自己免疫疾患のエフェクター段階で病気を悪化させたり、これらの病気の誘発を調節する役割を果たす可能性があります8。
腸内細菌叢症は、狼瘡が発生しやすいMRL/Mp-Faslpr(MRL/lpr)マウスで報告されており、乳酸菌の有意な枯渇を伴う腸内細菌叢の変化が観察されました9。5種類のラクトバチルス菌株を混合して経口投与したところ、狼瘡様症状は大きく軽減され、SLEの病態調節における微生物叢の重要な役割が示唆された。
以下のDNA抽出技術は、狼瘡を起こしやすいマウスのマウスSLE様疾患の過程で微生物叢の変動を追跡し、定性的および定量的に分析することを可能にする。健康な腸内細菌叢を調べるか、嚥下障害を定義するかにかかわらず、データがどのように収集され、それが正確で再現性があるかどうかを批判的に検討することが重要です10。このプロセスでは、すべてのステップが重要です。DNA抽出プロセス中にバイアスを導入する可能性のある問題は、微生物の表現が不正確になる可能性があるため、微生物DNAを抽出するには適切な方法論を使用する必要があります。フェノール-クロロホルム法がここに記載されているが、特定のケースでうまく機能する細菌からDNAを抽出するための市販のキットがあります11。ただし、それらの使いやすさは、コストと必要なサンプル量によって制限されます。
ここで紹介するプロトコルは費用対効果が高く、少量のサンプルしか必要としません。あらゆる種類の便サンプルで問題なく機能し、時間の経過に伴う腸内細菌叢のダイナミクスの研究やグループ間の比較に役立ちます。DNAは、フェノール、クロロホルム、イソアミルアルコールを使用するアルコール精製法で単離されます。アルコールベースの抽出は、最終ステップでDNAが沈殿するタンパク質や脂質のサンプルを洗浄して除去するのに役立ちます。提案手法は、効率と品質が著しく高く、細菌集団の同定において正確であることが証明されています。手順中の重要な注意点の1つは、DNA汚染が発生する可能性があるため、適切なサンプルの取り扱いが必要であることです12。
次に、DNAは、イルミナMiSeqなどの16S rRNA遺伝子の次世代シーケンシングプラットフォームによって分析されます。特に、V4超可変領域は、高ランク分類群13のより良い定量化を提供するために分析されます。その後のバイオインフォマティクス解析は外部委託し、その後、標準的な統計手法を用いた社内解析を行います。ダウンストリームシーケンシングに利用できるオープンソースのバイオインフォマティクスソフトウェアプログラムは多数あり、実行される分析の種類は、関心のある特定の生物学的問題に大きく依存します14。このプロトコルは、シーケンシング前の実験ステップに特に焦点を当てており、糞便サンプルからDNAを取得するためのより用途が広く、費用効果が高く、比較可能で効率的な方法を提供します。
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Protocol
B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/JマウスのCx3cr1 gfp/gfp遺伝子座をMRL/MpJ-Fas lpr/J(MRL/lpr)に10世代にわたってバッククロスさせ、MRL/lpr-CX 3CR1 gfp/gfpマウスを作製した。一塩基多型(SNP)パネルを用いたゲノムスクリーニングにより、新たに作製したマウスの遺伝的背景はMRL/LPRと97%以上同一であることが確認された。その後、マウスは、バージニア工科大学の施設内動物管理使用委員会(IACUC)の特定の要件に従って、特定の病原体のない環境で飼育および維持され、サンプルは、マウスが13、14、および15週齢のときに収集されました。
1.マウスからの微生物叢サンプルの収集
- 各マウスを個別にケージから取り出します。糞便ペレットを肛門から直接採取し、処理されるまで-80°Cで保管します。滅菌済みの清潔な鉗子、チューブ、手袋でサンプルを処理します。
注意: 容器(ビーカーなど)を使用して、糞便サンプルを待っている間にマウスを置くことができます。各マウスの前後にエタノールで容器を洗浄します。 - 凍結ペレットを事前に計量した2 mLスクリューキャップチューブに追加します。糞便重量をグラム単位で記録し、糞便ペレットあたり0.02〜0.05 gにする必要があります。
- 0.1 mmガラスビーズの薄層、500 μLの溶解バッファー(50 mM NaCl、5 mM Tris、および50 mM EDTA)、および200 μLの20% SDSをペレットに加えます。
- チューブをホモジナイザーで4分間(最大出力で)ビーズビートした後、3〜5分間ボルテックスします。
- 泡と泡を取り除くために短時間回転します(遠心分離機のボタンを1,000〜1,200 x gに達するまで押してから解放します)。
2.DNA抽出
- ステップ1.5で得られた上清350 μL(破片を運ばないように)を新しい1.5 mLスナップキャップチューブに移します。500 μLのフェノール-クロロホルム-イソアミルアルコール(PCI;25:24:1、v / v)混合物を加え、1分間ボルテックスします。
注:今後、サンプルは化学フード内で取り扱う必要があります。PCIは有毒です。 - 6,000 x g で4°Cで3分間スピンします。 180 μLの水相(最上層)を新しい1.5 mLスナップキャップチューブに移します。180 μL(1:1)のクロロホルムを加え、反転させて混合します。
注意: 最上層を転送するときは、最下層からの汚染を最小限に抑えてください。 - 18,400 x g で4°Cで3分間スピンします。 180 μLの水相を新しいスナップキャップチューブに移します。
注意: PCIとクロロホルムを廃棄した後、生物学的安全キャビネットで次の手順を実行できます。 - 180 μLの冷イソプロパノールと36 μLの5M NH4Acを加え、数回反転させて混合し、チューブを氷上に20分間置きます。
- 18,400 x g で4°Cで20分間スピンします。 上清を捨てるために注ぐ。反転させながら、500μLの冷たい70%エタノールでペレットを数回洗浄します。
注:エタノールは二重脱イオン滅菌水で希釈する必要があります。 - 18,400 x g で4°Cで3分間スピンします。 上清を廃棄して残留エタノールを除去する。
- ペレットが透明になるまで、ティッシュペーパー上でチューブを逆さまに20分間風乾します。ペレットを50 μLの分子グレードの水に懸濁します。液体を37°Cで10分間加熱して、大きなDNAペレットを完全に溶解します。
- 加熱後にチューブを回転させて、蓋の結露液滴を回収します(3,400 x g で1分間)。
- 濃度を測定し、分光光度計を使用して260/280比を取得します。ブランクとして分子グレードの水を使用してください。良質のDNAは、1.8から2の範囲の260/280の比率を持つ必要があります。
注:予想されるDNA収量は、糞便ペレットあたり少なくとも0.03gです。
3. 16S rRNA遺伝子シーケンシングのためのサンプル調製
- DNAサンプルをアルゴンヌ国立研究所に送り、そこでライブラリの準備を行い、イルミナミセックで配列決定します。
- サンプルをフルスカートの96ウェルプレートで送り、サンプルを列(A1-A12、B1-B12など)に配置し、ホイルプレートシールで密封します。
- 1ウェルあたりサンプルあたり20 μLの最終容量を、1〜50 ng / μLの濃度で送ります。
注:希釈は分子グレードの水で行う必要があります。 - サンプルを調製した後、室温で600 x g で1分間回転してから、サンプルを-80°Cで24時間凍結します。
- ドライアイスで一晩送ってください。
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Representative Results
アルゴンヌ国立研究所の結果は、資格のあるバイオインフォマティシャンによって分析され、続いて標準的な統計的手法を使用して社内でデータが分析されます。典型的なマイクロバイオーム分析では、サンプル中のさまざまな微生物の代理として、類似した配列を操作分類単位(OTU)またはアンプリコン配列バリアント(ASV)にクラスター化します。次に、サンプル全体のOTUまたはASVの数を使用して、サンプル内(アルファ)の多様性とサンプル間(ベータ)の多様性の変化を検定できます。また、関心のあるメタデータ カテゴリ間で差異的に豊富に存在する分類群をテストするためにも使用できます。
図1に示すように、受容体CX3CR1を欠くマウス系統は、異なる腸内細菌叢組成を有する。野生型MRL/LPRと比較して、MRL/lpr-CX 3 CR1 gfp/gfpマウス(CX3CR1の代わりに緑色蛍光タンパク質を発現する)は、プロテオバクテリア門のような潜在的に病原性細菌に関連する特定の属において有意差を示す。さらに、ビフィズス菌などの「健康な」共生細菌についてはいくつかの違いが見られましたが、ラクトバチルスについては見られませんでした。
図1:MRL/lprおよびMRL/lpr-CX3CR1マウスの属レベルでの腸内細菌叢の比較。 13、14、および15週齢での異なる属の存在量(n = 1群あたり5匹の雌マウス)。二元配置分散分析を実施した。有意性なし ('ns'), *P < 0.05, **P < 0.01.この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
バランスの取れた腸内細菌叢は、人体を病気から守ることができます。このバランスが外部または内部のトリガーによって乱されると、結果は壊滅的なものになる可能性があります。この方法は、マウスモデルにおける腸内細菌叢の動態を分析する方法を提示します。この方法は、グループ間の比較だけでなく、腸内細菌叢を経時的に追跡して、腸内細菌叢を破壊する時間依存の要因をより適切に特定するのにも適しています。
実験中のすべてのマウスは、同じ環境で取り扱う必要があります。糞便サンプルを収集する際に考慮すべき重要な事項の1つは、時間、曜日、場所と一致することです。マウスは食作用性です。これは、彼らが必須栄養素を得るために彼らの糞便または彼らの周りのものを食べることを意味します。したがって、ケージから糞を集めることはできません。サンプルは新鮮で肛門から直接収集する必要があります。最良の方法は、マウスを持ちながらマッサージするか、マウスをコンテナに入れることです。さらに、サンプルを同時に処理し、すべてのサンプルの準備が整うのを待って-80°Cで凍結することをお勧めします。
DNA抽出はピペッティングと取り扱いに非常に敏感であるため、すべてのサンプルを同時に処理する必要があります。別の考慮事項は、環境汚染を回避することです。したがって、有毒な試薬のために必ずしも化学フード内で実行されるとは限らないすべてのステップは、生物学的安全キャビネットで実行する必要があります。環境汚染の可能性は低く、細菌を増殖させるステップはありませんが、この方法は非常に敏感であり、汚染の可能性を回避することが絶対に推奨されます。さらに、ペレットの重量を量ると、サンプル間の一貫性を高めるのに役立ちます。市販のキットに対する利点として、この方法は高濃度のDNAを達成するのに特に適しています。このプロトコルで得られたDNA収量は、糞便ペレットの重量に応じて0.03gから0.07gの範囲です。比較すると、市販のキットは0.005 gから0.05 gの間で得られますが、カラム保持ステップによって制限されるため、飽和する可能性が高くなります。
ビーズビートステップは、糞便ペレットを細かく砕いて、溶解剤がすべての細菌に到達できるようにするのに重要です。このステップがうまく行われない場合、ペレットは部分的に崩壊し、より少ない代表的な細菌に達することができる。さらに、上清を移す場合、前のステップからの残留バッファーの一部を運ぶと、最後にDNAの収量と品質が変化するため、正しいピペッティングが重要です。
16SリボソームRNA遺伝子シーケンシングのためにサンプルを希釈する場合、サンプルを冷凍庫に入れる前に迅速に行動することが重要です。また、希釈を行う前にサンプルを十分に混合することも重要です。サンプルを室温で長時間放置しないでください。体積が小さいため、出荷前にプレート内のサンプルを凍結すると、損失を最小限に抑えるのに役立ちます。
アルゴンヌ国立研究所は、16S rRNA遺伝子のV4領域を分析しています。V4地域は他の地域よりも保存状態が良く、上位分類群13の推定値も優れています。他の領域は急速に進化する種の分析に適しており、属または種を特定してよりよく識別するのに役立ちますが、これらの領域はV4よりも速く突然変異を蓄積します。
結果が戻ってきて、資格のあるバイオインフォマティシャンによって分析されると、統計ソフトウェアを使用して結果をプロットし、グループを比較できます。この手法の限界とバイオインフォマティクス解析後の結果を理解することが重要です。分類レベルが低いほど、精度は低下するか、バリエーションが大きくなります。門から家族まで、そして属レベルさえも確実に分析することができます。ただし、種レベルでの注釈は、この方法では正確ではありません。一方、ショットガンシーケンシングは種レベルに達する可能性があります。ただし、コミュニティの生物学的機能についてより多くの洞察を提供できる一方で、16S rRNA遺伝子シーケンシングは、微生物コミュニティの分類学的分布を定量化するための正確で費用効果の高い方法です15。
要約すると、腸内細菌叢を分析し、そのダイナミクスを最大限の精度で研究するための費用効果の高いプロトコルが説明されており、時間の経過に伴う縦方向の変化やグループ間の違いを明らかにするのに役立ちます。
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Disclosures
著者は、利益相反はないと宣言しています。
Acknowledgments
アルゴンヌ国立研究所と協力しているバイオインフォマティシャンの支援に感謝します。この作業は、さまざまなNIHおよび内部助成金によってサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 mm glass beads | BioSpec Products | 11079101 | |
| 2 mL screw cap tubes | Thermo Fisher Scientific | 3488 | |
| 20% SDS | FisherScientific | BP1311-1 | SDS 20% |
| 96% Ethanol, Molecular Biology Grade | Thermo Fisher Scientific | T032021000CS | |
| Ammonium Acetate (5 M) | Thermo Fisher Scientific | AM9071 | NH4AC 5M |
| B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J | Jackson Laboratory | 005582 | |
| Bullet Blender storm 24 | Next Advance | 4116-BBY24M | Homogenizer |
| Chloroform | FisherScientific | C298-500 | |
| DEPC-Treated Water | Thermo Fisher Scientific | AM9916 | |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid | FisherScientific | BP118-500 | EDTA |
| Foil plate seal | FisherScientific | NC0302491 | |
| Kimwipes-Kimtech 34256 | FisherScientific | 06-666C | |
| MRL/MpJ-Faslpr/J (MRL/lpr) mice | Jackson Laboratory | 000485 | |
| Nanodrop 2000 spectrophotomer | Thermo Fisher Scientific | ND2000CLAPTOP | |
| Phenol: chloroform: isoamylalchohol (25:24:1) | FisherScientific | BP1752I-400 | PCI |
| Scale with 4 decimals | Mettler Toledo | MS205DU | |
| Skirted 96-well plates | Thermo Fisher Scientific | AB-0800 | |
| Sodium chloride | FisherScientific | 15528154 | NaCl |
| Tris Hydrochloride | FisherScientific | BP1757-100 | |
| Vortex | Scientific Industries | SI-0236 |
References
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