Summary
פרוטוקול זה מספק שיטת בידוד דנ"א פשוטה וחסכונית לניתוח שינויים במיקרוביוטה של מורין במעיים במהלך התפתחות מחלות אוטואימוניות.
Abstract
למיקרוביוטה של המעיים יש תפקיד חשוב בחינוך מערכת החיסון. קשר זה חשוב ביותר להבנת מחלות אוטואימוניות שאינן מונעות רק על ידי גורמים גנטיים, אלא גם גורמים סביבתיים שיכולים לעורר את הופעת המחלה ו/או להחמיר אותה. מחקר שפורסם בעבר על הדינמיקה של מיקרוביוטה של המעיים אצל נקבות MRL/lpr המועדות לזאבת הראה כיצד שינויים במיקרוביוטה של המעיים יכולים לשנות את התקדמות המחלה. כאן מתואר פרוטוקול לחילוץ דגימות מייצגות מהמיקרוביוטה של המעיים למחקרים על אוטואימוניות. דגימות מיקרוביוטה נאספות מפי הטבעת ומעובדות, מהן מופק הדנ"א בשיטת פנול-כלורופורם ומטוהר על ידי משקעי אלכוהול. לאחר ביצוע PCR, אמפליקונים מטוהרים מרוצפים באמצעות פלטפורמת ריצוף מהדור הבא במעבדה הלאומית ארגון. לבסוף, נתוני ריצוף הגנים של RNA ריבוזומלי 16S מנותחים. לדוגמה, מוצגים נתונים שהתקבלו מהשוואות מיקרוביוטה של המעיים של עכברי MRL/lpr עם או בלי CX3CR1. התוצאות הראו הבדלים משמעותיים בסוגים המכילים חיידקים פתוגניים כמו אלה שבגוף הפרוטאובקטריה, כמו גם בסוג ביפידובקטריום, שנחשב לחלק מהמיקרוביוטה הבריאה. לסיכום, שיטת בידוד הדנ"א הפשוטה והחסכונית הזו אמינה ויכולה לסייע בחקר שינויים במיקרוביוטה של המעיים הקשורים למחלות אוטואימוניות.
Introduction
בני אדם וחיידקים התקיימו בדו-קיום במשך זמן רב. הם יצרו מערכת יחסים של תלות הדדית עם השפעות מועילות הדדיות המשפיעות על תגובות החיסון של המארח בדרכים כמותיות ואיכותיות1. מחקרים אחרונים מצביעים על קשר בין הרכב המיקרוביוטה של המעיים לבין הפתוגנזה של מחלות אוטואימוניות הכוללות טרשת נפוצה 2, דלקת מפרקים שגרונית3, סוכרת מסוג2 4, מחלות מעי דלקתיות5 וזאבת אדמנתית מערכתית (SLE)6. עם זאת,עדיין לא ברור אם המיקרוביוטה של המעיים היא הגורם העיקרי או ההשפעה המשנית של המחלות האוטואימוניות הללו. באופן פוטנציאלי, מיקרוביוטה של המעיים עלולה להחמיר את המחלה במהלך שלב ההשפעה של הפרעות אוטואימוניות או למלא תפקיד בוויסות האינדוקציה של מחלות אלה8.
דווח על דיסביוזיס במעיים אצל נקבות הנוטות לזאבת MRL/Mp-Faslpr (MRL/lpr),ונצפו שינויים במיקרוביוטה של המעיים עם דלדול משמעותי של לקטובצילי 9. כאשר תערובת של חמישה זני לקטובצילוס ניתנה דרך הפה, תסמינים דמויי זאבת נחלשו במידה רבה בעכברים אלה, מה שמרמז על תפקיד חיוני של מיקרוביוטה בוויסות פתוגנזה של SLE.
הטכניקה הבאה של מיצוי DNA מאפשרת לעקוב אחר תנודות מיקרוביוטה ולנתח אותם איכותית וכמותית במהלך מחלת מורין SLE בעכברים נוטים זאבת. בין אם לבחון את המיקרוביוטה הבריאה של המעיים או להגדיר דיסביוזיס, חשוב לבחון באופן ביקורתי כיצד הנתונים נאספים והאם הם מדויקים וניתנים לשחזור10. כל שלב הוא קריטי בתהליך זה. יש להשתמש במתודולוגיה מתאימה כדי לחלץ דנ"א מיקרוביאלי, שכן כל בעיה אפשרית בהטיות במהלך תהליך מיצוי הדנ"א עלולה לגרום לייצוג מיקרוביאלי לא מדויק. בעוד ששיטת הפנול-כלורופורם מתוארת כאן, ישנן ערכות זמינות מסחרית לחילוץ דנ"א מחיידקים שעובדות היטב במקרים מסוימים11. עם זאת, השימושיות שלהם מוגבלת על ידי העלות וכמות המדגם הנדרשת.
הפרוטוקול המוצג כאן הוא חסכוני ודורש רק כמות קטנה של דגימה. הוא עובד מצוין עם כל סוג של דגימת צואה, והוא שימושי בחקר הדינמיקה של המיקרוביוטה של המעיים לאורך זמן, כמו גם בהשוואות בין קבוצות. הדנ"א מבודד בשיטה של טיהור אלכוהול, המשתמשת בפנול, כלורופורם ואלכוהול איזואמיל. מיצוי על בסיס אלכוהול מסייע לנקות ולהסיר את הדגימה של חלבונים ושומנים, שם DNA הוא זירז בשלב האחרון. השיטה המוצעת היא בעלת יעילות ואיכות גבוהות משמעותית והוכחה כמדויקת בזיהוי אוכלוסיות חיידקים. הערה קריטית אחת במהלך ההליך היא שזיהום DNA יכול להתרחש, ולכן נדרש טיפול מתאים בדגימה12.
לאחר מכן, הדנ"א מנותח על ידי פלטפורמות הריצוף של הדור הבא עבור הגן 16S rRNA, כגון Illumina MiSeq. בפרט, אזור ההיפר-משתנה V4 מנותח כדי לספק כימות טוב יותר עבור טקסהבדרגה גבוהה 13. ניתוח הביואינפורמטיקה שלאחר מכן הוא במיקור חוץ, ואחריו ניתוח פנימי בשיטות סטטיסטיות סטנדרטיות. ישנן תוכנות ביואינפורמטיקה רבות בקוד פתוח הזמינות לריצוף במורד הזרם, וסוג הניתוחים המבוצעים תלוי במידה רבה בשאלה הביולוגית הספציפית המעניינת14. פרוטוקול זה מתמקד באופן ספציפי בשלבי הניסוי לפני הריצוף ומספק שיטה רב-תכליתית, חסכונית, דומה ויעילה יותר להשגת דנ"א מדגימות צואה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
לוקוס Cx3cr1 gfp/gfp של עכברי B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J הוחזר לעכברי MRL/MpJ-Fas lpr/J (MRL/lpr) במשך 10 דורות כדי ליצור עכברי MRL/lpr-CX 3 CR1gfp/gfp. בדיקת גנום באמצעות לוחות פולימורפיזם של נוקלאוטיד יחיד (SNP) אישרה כי הרקע הגנטי של עכברים חדשים שנוצרו היה זהה ביותר מ-97% לזה של MRL/lpr. לאחר מכן, עכברים גודלו ותוחזקו בסביבה ספציפית נטולת פתוגנים בהתאם לדרישות הספציפיות של הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) בווירג'יניה טק.
1. איסוף דגימות מיקרוביוטה מעכברים
- הוציאו כל עכבר בנפרד מהכלוב שלו. לאסוף כדור צואה ישירות מפי הטבעת ולאחסן אותו ב -80 מעלות צלזיוס עד לעיבוד. מעבדים את הדגימות בעזרת מלקחיים, צינורות וכפפות סטריליים ונקיים.
הערה: ניתן להשתמש במכל (לדוגמה,) כדי למקם את העכבר בזמן ההמתנה לדגימת הצואה. נקו את המיכל עם אתנול לפני ואחרי כל עכבר. - הוסף גלולה קפואה לצינור מכסה בורג במשקל 2 מ"ל ששקל מראש. להקליט את משקל הצואה בגרמים, אשר צריך להיות בין 0.02-0.05 גרם לכל גלולה צואה.
- הוסיפו לכדור שכבה דקה של חרוזי זכוכית בקוטר 0.1 מ"מ, 500 מיקרון ליטר של חיץ ליזה (50 mM NaCl, 5 mM Tris ו-50 mM EDTA), ו-200 μL של 20% SDS.
- חרוז-להכות את הצינור במשך 4 דקות הומוגנייזר (בעוצמה מקסימלית), ואחריו 3-5 דקות של מערבולת.
- סובבו לזמן קצר כדי לחסל את הבועות והקצף (לחצו על הכפתור בצנטריפוגה עד שהיא מגיעה ל-1,000-1,200 x גרם, ואז שחררו).
2. מיצוי דנ"א
- העבר 350 μL של supernatant שהושגו בשלב 1.5 (תוך הקפדה שלא לשאת פסולת) לצינור חדש של מכסה הצמדה של 1.5 מ"ל. הוסיפו 500 μL של תערובת פנול-כלורופורם-איזואמיל אלכוהול (PCI; 25:24:1, v/v) ומערבולת למשך דקה אחת.
הערה: מעתה והלאה, יש לטפל בדגימות בתוך מכסה מנוע כימי. PCI הוא רעיל. - סובב ב- 6,000 x g למשך 3 דקות ב- 4 °C. העבר 180 μL מהפאזה המימית (השכבה העליונה) לצינור חדש של מכסה הצמדה של 1.5 מ"ל. מוסיפים 180 μL (1:1) של כלורופורם, היפוך וערבוב.
הערה: צמצם את הזיהום מהשכבה התחתונה בעת העברת השכבה העליונה. - סובבו ב-18,400 x גרם למשך 3 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. העבר 180 μL של הפאזה המימית לתוך צינור מכסה הצמדה חדש.
הערה: לאחר השלכת PCI וכלורופורם, ניתן לבצע את השלבים הבאים בארון בטיחות ביולוגי. - הוסיפו 180 μL של איזופרופנול קר ו-36 μL של 5M NH4Ac. הפוך כמה פעמים כדי לערבב, והניחו את הצינור על קרח למשך 20 דקות.
- סובב ב 18,400 x גרם במשך 20 דקות ב 4 °C. יוצקים כדי להשליך את הסופרנטנט. לשטוף את הכדור מספר פעמים עם 500 μL של קר 70% אתנול תוך היפוך.
הערה: אתנול צריך להיות מדולל עם מים סטריליים דה-יוניזציה כפולה. - סובבו ב-18,400 x גרם למשך 3 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. השליכו את הסופרנטנט כדי להסיר אתנול שיורי.
- יש לייבש באוויר את הצינור במהופך על נייר טישו למשך 20 דקות, עד שהכדור מתבהר. להשעות את הכדור ב 50 μL של מים ברמה מולקולרית. מחממים את הנוזל בטמפרטורה של 37°C למשך 10 דקות כדי להמיס באופן מלא כדורי DNA גדולים.
- סובבו צינורות לאחר חימום כדי לשחזר טיפות עיבוי על המכסה (3,400 x גרם למשך דקה אחת).
- מדוד את הריכוז וקבל את היחס 260/280 באמצעות ספקטרופוטומטר. השתמש במים ברמה מולקולרית כריק. דנ"א באיכות טובה צריך להיות בעל יחסים של 260/280 הנעים בין 1.8 ל-2.
הערה: תפוקת הדנ"א הצפויה היא לפחות 0.03 גרם לכל כדור צואה.
3. הכנת דגימה לריצוף גנים 16S rRNA
- שלח את דגימות הדנ"א למעבדה הלאומית ארגון, שם הן עוברות הכנה לספרייה ומרוצפות על האילומינה מיסק.
- שלח דגימות בלוחות 96 בארות מלאים, עם דגימות מסודרות בשורות (A1-A12, B1-B12 וכו '), ואטום עם אטמי לוחות נייר כסף.
- שלח נפח סופי של 20 μL לכל דגימה לכל באר, בריכוז הנע בין 1-50 ng/μL.
הערה: דילולים צריכים להיעשות עם מים ברמה מולקולרית. - לאחר הכנת הדגימות, סובבו ב-600 x g למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר לפני הקפאת הדגימות ב-80°C- למשך 24 שעות.
- יש לשלוח למשך הלילה על קרח יבש.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
התוצאות מהמעבדה הלאומית של ארגון מנותחות על ידי ביואינפורמטיקאי מוסמך, ולאחר מכן ניתוח פנימי של הנתונים בשיטות סטטיסטיות סטנדרטיות. ניתוחי מיקרוביום טיפוסיים כוללים אשכולות של רצפים דומים ליחידות טקסונומיות תפעוליות (OTUs) או וריאנטים של רצפי אמפליקון (ASVs) כפרוקסי למיקרואורגניזמים שונים בדגימה. לאחר מכן ניתן להשתמש בספירות של OTUs או ASVs על פני דגימות כדי לבדוק אם יש שינויים במגוון בתוך הדגימה (אלפא) ובגיוון בין הדגימות (בטא). הם יכולים לשמש גם כדי לבדוק עבור taxa כי הם נפוצים באופן דיפרנציאלי על פני קטגוריות מטא נתונים של עניין.
כפי שניתן לראות באיור 1, לזן העכבר שחסר את הקולטן CX3CR1 יש הרכב מיקרוביוטה שונה של המעיים. בהשוואה לעכברי MRL/lpr, עכברי MRL/lpr-CX 3 CR1 gfp/gfp (המבטאים את החלבון הפלואורסצנטי הירוק במקוםCX3CR1) מראים הבדלים משמעותיים בסוגים מסוימים הרלוונטיים לחיידקים פתוגניים פוטנציאליים, כגון אלה שבפרוטאובקטריה. בנוסף, כמה הבדלים צוינו עבור חיידקים "בריאים" commensal כגון ביפידובקטריום, אבל לא לקטובצילוס.
איור 1: השוואות של מיקרוביוטה של המעיים ברמת הסוג עבור עכברי MRL/lpr ועכברי MRL/lpr-CX3CR1. שפע הסוגים השונים בגיל 13, 14 ו-15 שבועות (n = 5 נקבות עכברים בכל קבוצה). בוצע ANOVA דו-כיווני. ללא משמעות ('ns'), *P < 0.05, **P < 0.01. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מיקרוביוטה מאוזנת של המעיים יכולה להגן על גוף האדם מפני מחלות. ברגע שאיזון זה מופר על ידי טריגרים חיצוניים או פנימיים, התוצאות יכולות להיות הרסניות. שיטה זו מציגה דרך לנתח את הדינמיקה של מיקרוביוטה של המעיים במודלים של מורין. השיטה מתאימה לא רק להשוואות בין קבוצות, אלא גם למעקב אחר המיקרוביוטה של המעיים לאורך זמן כדי לזהות טוב יותר גורמים תלויי זמן המשבשים את המיקרוביוטה של המעיים.
כל העכברים בניסוי חייבים להיות מטופלים באותה סביבה. אחד הנושאים החיוניים שיש לקחת בחשבון בעת איסוף דגימות צואה הוא להיות עקביים עם השעה, היום והמקום. עכברים הם קופרופאגיים. משמעות הדבר היא כי הם אוכלים את הצואה שלהם או את אלה סביבם כדי לקבל חומרים מזינים חיוניים. לכן, לא ניתן לאסוף צואה מהכלוב. דגימות צריך להיות נאסף טרי ישירות מן פי הטבעת. השיטה הטובה ביותר היא לעסות את העכבר תוך כדי החזקתו או להניח את העכבר במיכל. בנוסף, מומלץ שהדגימות יעובדו בו זמנית ויוקפאו בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס בזמן ההמתנה שכל הדגימות יהיו מוכנות.
מיצוי דנ"א רגיש ביותר לצנרת ולטיפול, ולכן יש לעבד את כל הדגימות בו זמנית. שיקול נוסף הוא להימנע מזיהום סביבתי; לכן, כל צעד שאינו מבוצע בהכרח במכסה המנוע הכימי בשל הריאגנטים הרעילים צריך להיעשות בארון בטיחות ביולוגי. למרות שהסיכויים לזיהום סביבתי נמוכים ואין צעד שיאפשר לחיידקים לגדול, שיטה זו רגישה ביותר, ומומלץ בהחלט להימנע מכל זיהום אפשרי. בנוסף, שקילת הכדורים תסייע להגביר את העקביות בין הדגימות. כיתרון על פני ערכות זמינות מסחרית, שיטה זו טובה במיוחד להשגת ריכוזים גבוהים של DNA. תפוקת הדנ"א המתקבלת עם פרוטוקול זה נעה בין 0.03 גרם ל -0.07 גרם בהתאם למשקל כדור הצואה. לשם השוואה, ערכות מסחריות יכולות להניב בין 0.005 גרם ל-0.05 גרם, אך עם סיכוי גבוה יותר לרוויה כפי שמוגבל על ידי שלב שימור העמודה.
שלב הכאת החרוזים חשוב בשבירת כדור הצואה לחתיכות קטנות כדי שחומר התזה יוכל להגיע לכל החיידקים. אם שלב זה אינו מבוצע היטב, כדוריות יכול להיות מתפורר חלקית, ופחות חיידקים מייצגים ניתן להגיע. בנוסף, בעת העברת supernatants, פיפטינג נכון חשוב, שכן נשיאת חלק מהמאגר השיורי מהשלב הקודם תשנה את התשואה והאיכות של הדנ"א בסוף.
כאשר מדללים את הדגימות לריצוף הגן RNA ריבוזומלי 16S, חשוב לפעול במהירות לפני שהדגימות מוכנסות למקפיא. חשוב גם לערבב דגימות היטב לפני ביצוע דילולים. יש להימנע מהשארת דגימות בטמפרטורת החדר לפרקי זמן ארוכים. מכיוון שהנפחים קטנים, הקפאת הדגימות בצלחת לפני שליחתן תסייע למזער את האובדן.
המעבדה הלאומית ארגון מנתחת את אזור V4 של הגן 16S rRNA. אזור V4 שמור טוב יותר מהאזורים האחרים ויש לו הערכה טובה יותר עבור טקסה13 בדרגה גבוהה. בעוד שהאזורים האחרים טובים יותר לניתוח של מינים המתפתחים במהירות ויכולים לסייע בזיהוי והבחנה טובה יותר בין סוגים או מינים, אזורים אלה צוברים מוטציות מהר יותר מ-V4.
לאחר שהתוצאות חוזרות ומנותחות על ידי ביואינפורמטיקאי מוסמך, ניתן להשתמש בתוכנה סטטיסטית כדי להתוות את התוצאות ולהשוות בין קבוצות. חשוב להבין את המגבלות של טכניקה זו ואת התוצאות לאחר ניתוח ביואינפורמטיקה. ככל שהרמה הטקסונומית נמוכה יותר, כך הדיוק קטן יותר או גדול יותר הווריאציות. מ phylum למשפחה, ואפילו את רמת הסוג ניתן לנתח עם אמינות. עם זאת, ביאורים ברמת המין אינם מדויקים בשיטה זו. רצף רובה ציד, לעומת זאת, יכול להגיע לרמת המין; עם זאת, בעוד שהוא יכול לספק תובנה רבה יותר לגבי הפונקציות הביולוגיות של קהילה, ריצוף גנים 16S rRNA הוא עדיין שיטה מדויקת וחסכונית לכימות התפלגויות טקסונומיות של קהילה מיקרוביאלית15.
לסיכום, תואר פרוטוקול חסכוני לניתוח המיקרוביוטה של המעיים ולחקר הדינמיקה שלה בדיוק מרבי שיכול לסייע בחשיפת שינויים אורכיים לאורך זמן, כמו גם הבדלים בין קבוצות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין ניגוד עניינים.
Acknowledgments
אנו מעריכים את העזרה מהמעבדה הלאומית של ארגון ומהביואינפורמטיקאים המשתפים פעולה שלנו. עבודה זו נתמכת על ידי מענקים שונים של NIH ומענקים פנימיים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 mm glass beads | BioSpec Products | 11079101 | |
| 2 mL screw cap tubes | Thermo Fisher Scientific | 3488 | |
| 20% SDS | FisherScientific | BP1311-1 | SDS 20% |
| 96% Ethanol, Molecular Biology Grade | Thermo Fisher Scientific | T032021000CS | |
| Ammonium Acetate (5 M) | Thermo Fisher Scientific | AM9071 | NH4AC 5M |
| B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J | Jackson Laboratory | 005582 | |
| Bullet Blender storm 24 | Next Advance | 4116-BBY24M | Homogenizer |
| Chloroform | FisherScientific | C298-500 | |
| DEPC-Treated Water | Thermo Fisher Scientific | AM9916 | |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid | FisherScientific | BP118-500 | EDTA |
| Foil plate seal | FisherScientific | NC0302491 | |
| Kimwipes-Kimtech 34256 | FisherScientific | 06-666C | |
| MRL/MpJ-Faslpr/J (MRL/lpr) mice | Jackson Laboratory | 000485 | |
| Nanodrop 2000 spectrophotomer | Thermo Fisher Scientific | ND2000CLAPTOP | |
| Phenol: chloroform: isoamylalchohol (25:24:1) | FisherScientific | BP1752I-400 | PCI |
| Scale with 4 decimals | Mettler Toledo | MS205DU | |
| Skirted 96-well plates | Thermo Fisher Scientific | AB-0800 | |
| Sodium chloride | FisherScientific | 15528154 | NaCl |
| Tris Hydrochloride | FisherScientific | BP1757-100 | |
| Vortex | Scientific Industries | SI-0236 |
References
- Lee, Y. K., Mazmanian, S. K. Has the microbiota played a critical role in the evolution of the adaptive immune system. Science. 330 (6012), 1768-1773 (2010).
- Lee, Y. K., Menezes, J. S., Umesaki, Y., Mazmanian, S. K. Proinflammatory T-cell responses to gut microbiota promote experimental autoimmune encephalomyelitis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, Suppl 1 4615-4622 (2011).
- Yeoh, N., Burton, J. P., Suppiah, P., Reid, G., Stebbings, S. The role of the microbiome in rheumatic diseases. Current Rheumatology Reports. 15 (3), 314 (2013).
- Larsen, N., et al. Gut microbiota in human adults with type 2 diabetes differs from non-diabetic adults. PLoS One. 5 (2), 9085 (2010).
- Alam, M. T., et al. Microbial imbalance in inflammatory bowel disease patients at different taxonomic levels. Gut Pathogens. 12 (1), (2020).
- Vieira, S. M., Pagovich, O. E., Kriegel, M. A. Diet, microbiota and autoimmune diseases. Lupus. 23 (6), 518-526 (2014).
- Mu, Q., Zhang, H., Luo, X. M. SLE: another autoimmune disorder influenced by microbes and diet. Frontiers of Immunology. 6, 608 (2015).
- Tektonidou, M. G., Wang, Z., Dasgupta, A., Ward, M. M. Burden of serious infections in adults with systemic lupus erythematosus: a national population-based study. Arthritis Care & Research. 67 (8), 1078-1085 (2015).
- Mu, Q., et al. Control of lupus nephritis by changes of gut microbiota. Microbiome. 5 (1), 73 (2017).
- Panek, M., et al. Methodology challenges in studying human gut microbiota - effects of collection, storage, DNA extraction and next generation sequencing technologies. Scientific Reports. 8 (1), 5143 (2018).
- Fiedorová, K., et al. The impact of dna extraction methods on stool bacterial and fungal microbiota community recovery. Frontiers in Microbiology. 10, 821 (2019).
- Gerasimidis, K., et al. The effect of DNA extraction methodology on gut microbiota research applications. BMC Research Notes. 9, 365 (2016).
- Bukin, Y. S., et al. The effect of 16S rRNA region choice on bacterial community metabarcoding results. Scientific Data. 6 (1), 190007 (2019).
- Galloway-Peña, J., Hanson, B.
- Sharpton, T. J. An introduction to the analysis of shotgun metagenomic data. Frontiers in Plant Science. 5, 209 (2014).
