Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Laser mikrodissektion til artsagnostiske enkeltvævsapplikationer

Published: March 31, 2022 doi: 10.3791/63666
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 3, 1
1Center for Developmental Genetics, New York University, 2Sacred Heart University, 3Baylor School

Summary

En protokol er beskrevet, der bruger lasermikrodissektion til at isolere individuelle nematodevæv til RNA-sekventering. Protokollen kræver ikke artsspecifikke genetiske værktøjssæt, der gør det muligt at sammenligne genekspressionsprofiler mellem forskellige arter på niveau med enkeltvævsprøver.

Abstract

Enkeltcellemetoder har revolutioneret analysen af transkriptomerne af specifikke celletyper. Imidlertid kræver de ofte artsspecifikke genetiske "værktøjssæt", såsom promotorer, der driver vævsspecifik ekspression af fluorescerende proteiner. Endvidere fjerner protokoller, der forstyrrer væv for at isolere individuelle celler, celler fra deres oprindelige miljø (f.eks. Signalering fra naboer) og kan resultere i stressresponser eller andre forskelle fra indfødte genekspressionstilstande. I den nuværende protokol er lasermikrodissektion (LMD) optimeret til at isolere individuelle nematodehalespidser til undersøgelse af genekspression under mandlig halespidsmorfogenese.

LMD tillader isolering af en del af dyret uden behov for cellulær forstyrrelse eller artsspecifikke værktøjssæt og kan således anvendes på alle arter. Efterfølgende kan enkeltcelleDE RNA-seq-biblioteksforberedelsesprotokoller såsom CEL-Seq2 påføres LMD-isolerede enkeltvæv og analyseres ved hjælp af standardrørledninger, da et velannoteret genom eller transkriptom er tilgængeligt for arten. Sådanne data kan bruges til at fastslå, hvor konserverede eller forskellige transkriptomerne er, der ligger til grund for udviklingen af dette væv i forskellige arter.

Begrænsninger inkluderer evnen til at skære vævet af interesse og prøvestørrelsen ud. En effektanalyse viser, at der kræves så få som 70 halespidser pr. Tilstand for 80% effekt. Stram synkronisering af udvikling er nødvendig for at opnå dette antal dyr på samme udviklingsstadium. Således beskrives også en metode til at synkronisere dyr med 1 timers intervaller.

Introduction

Nematoder - især rhabditid nematoderne relateret til modelsystemet Caenorhabditis elegans - er en vidunderlig gruppe dyr til evolutionær udviklingsbiologi (EDB) af mange grunde 1,2. Fordele inkluderer deres lille antal celler, definerede og konsistente cellelinjer, gennemsigtighed og let kultur og husdyrhold. Der er også mange ressourcer til rådighed, herunder genomer af høj kvalitet til flere arter og til C. elegans, omfattende molekylærgenetiske værktøjer og viden om udvikling, genetik, anatomi og fysiologi 3,4,5,6.

Som med mange andre organismer har evnen til at karakterisere transkriptomdynamik i enkeltvæv eller enkeltceller revolutioneret analysen af udvikling i C. elegans 7,8,9,10. At være i stand til at sammenligne enkeltcelle transkriptomer på tværs af nematoder ville ligeledes transformere EDB ved hjælp af disse organismer. For eksempel ville sådanne sammenligninger give indsigt i, hvordan genregulerende netværk har udviklet sig for tegn (træk), der er blevet bevaret, for tegn, der har divergeret, eller for tegn, der udviklede sig uafhængigt.

Men at isolere bestemte væv eller celler fra nematoder er en af de store udfordringer. For mange organismer kan enkeltceller adskilles fra væv og høstes på en upartisk måde eller kan mærkes med vævsspecifik ekspression af et fluorescerende protein og sorteres ved fluorescensaktiveret cellesortering (FACS)11. I C. elegans, høj-gennemstrømning (HTP) isolering af celler har været begrænset hovedsagelig til embryoner, fordi den hårde ydre neglebånd (og hydrostatisk skelet) har hæmmet celleisolering fra larver og voksne. For at omgå denne udfordring har nogle metoder anvendt genetiske værktøjer i hele C. elegans orme, såsom vævsspecifik mRNA-mærkning12 og differentialekspressionssammenligninger mellem vildtype og mutanter, der påvirker en celletype13. Nyere metoder har overvundet udfordringen ved at opløse neglebåndet for at isolere kerner14 eller hele celler 8,9,15. Celleisolering og cellekultur har imidlertid de åbenlyse ulemper, at celler fjernes fra deres naturlige udviklingsmæssige eller anatomiske kontekst - fx væk fra cellecellesignalering og kontakt med den ekstracellulære matrix - som forventes at påvirke genekspressionsprofilen15. Desuden er de genetiske værktøjer og vævsspecifikke markører artsspecifikke (dvs. de kan kun bruges i C. elegans).

LMD giver en alternativ metode til isolering af væv uden at forstyrre cellernes naturlige kontekst. Væsentligt for EDB tillader LMD også transkriptomer fra homologt væv af forskellige arter at blive sammenlignet uden behov for artsspecifikke genetiske værktøjssæt, hvis genom- eller hel transkriptomsekvenser af disse arter er tilgængelige. LMD involverer målretning af væv ved direkte mikroskopisk observation og ved hjælp af en lasermikrobeam - integreret i mikroskopets optik - til at skære ud og høste (fange) vævet af interesse16. Begrænsninger af LMD er, at det ikke er befordrende for meget HTP tilgange (selv om transkriptionsprofilerne for halespidser, som beskrevet i denne protokol, var robuste med ~ 70 prøver), visse prøver kan være vanskelige at dissekere ud, og nedskæringer er begrænset til laserens præcision og hvad der kan visualiseres i mikroskopet.

Formålet med denne protokol er at beskrive, hvordan LMD, efterfulgt af enkeltvævs RNA-Seq, kan anvendes til at opnå scene- og vævsspecifikke transkriptomdata fra nematoder. Specifikt demonstrerer det LMD til isolering af halespidser fra fjerde trin larver (L4) af C. elegans. Denne metode kan dog tilpasses andre væv og selvfølgelig forskellige arter.

I C. elegans er der 4 celler, der gør halespidsen hos både mænd og hermafroditter. Under L4-stadiet hos mænd - men ikke hos hermafroditter - ændrer halespidscellerne deres form og migrerer anteriort og indad. Denne proces forekommer også i nogle, men ikke alle andre rhabditid nematode arter. Derfor er halespidsen en god model for udviklingen af seksuel dimorf morfogenese. På grund af sin position er halespidsen også let at isolere med LMD.

For at opnå transkriptomprofiler fra halespidser bruger den nuværende protokol CEL-Seq2, en RNA-seq-metode udviklet til enkeltceller17,18. Denne metode har flere fordele for LMD-afledte væv. CEL-Seq2 er meget følsom og effektiv ved hjælp af unikke molekylære identifikatorer (UMI'er) for at muliggøre ligefrem kvantificering af mRNA-læsninger, in vitro-transkription for at sikre lineær forstærkning og stregkodning, der muliggør multiplexing af individuelle vævsprøver. Den eneste begrænsning ved CEL-Seq2 er, at genvundne aflæsninger er partiske til 3' enden af mRNA'er, og de fleste isoformer kan derfor ikke skelnes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Synkronisering af orm

BEMÆRK: To metoder er beskrevet nedenfor for at synkronisere udviklingen af C. elegans og andre rhabditidarter.

  1. Synkroniser ved første larvetrin (L1) anholdelse efter alkalisk hypochlorit (blegemiddel) behandling.
    BEMÆRK: Denne metode er tidligere beskrevet detaljeret19. Denne metode er afhængig af to træk ved C. elegans , der også gælder for flere andre rhabditidarter: (1) Æggeskallen er resistent over for blegemiddel, mens neglebåndet omkring voksne og larveorme ikke er det. (2) Larver i første fase arresterer udviklingen, når de opbevares uden mad20.
    1. Behandl gravide hermafroditter (eller kvinder) med en fortyndet blegemiddelopløsning for at bryde deres neglebånd op og frigive embryoner.
    2. Fjern embryonerne fra blegemidlet og opbevar dem uden mad, indtil alle L1 er klækket.
    3. Placer den arresterede L1 på mad, hvor alle genoptager udviklingen på omtrent samme tid.
      BEMÆRK: Udgang fra L1-anholdelse kan ske inden for en time.
  2. Synkronisering med "hatch-off" -metoden (bruges her; Figur 1 øverst):
    BEMÆRK: Hatch-off-metoden giver mulighed for tæt synkronisering uden afbrydelse af udviklingen (L1-anholdelse påvirker udviklingen selv i senere stadier21). Protokollen er tilpasset fra Pepper et al.22. Formålet med denne metode er at indsamle L1, der er klækket over en bestemt periode fra en plade, der kun indeholder embryoner.
    1. Vælg mødre: Aftenen før du udfører lugen, skal du plukke ~ 30 gravide hermafroditter på en plade podet med E. coli OP50.
    2. Der inkuberes ved 25 °C til æglægning natten over.
      BEMÆRK: Vælg en plade uden revner eller bobler, hvor orme kan sidde fast. Undgå plader med en meget tyk bakteriel græsplæne, da det vil være svært at fjerne alle orme senere. Hvis du arbejder med en temperaturfølsom stamme, skal du justere æglægningstiden for at tage højde for længere embryogenese. Vælg mødre på det maksimale æglægningsstadium.
    3. Fjern mødre og larver: Næste morgen, under dissekeringsmikroskopet (20x forstørrelse), pipetter forsigtigt 1-2 ml M9 buffer mod pladens væg uden at sprøjte; hvirvl pladen for at løsne ormene.
    4. Fjern og kassér al væske og orme ved at placere pipettespidsen mod pladens væg ved kanten af agaren for at undgå at stikke huller. Kontroller, at der ikke er orme (og kun æg / embryoner) tilbage på pladen, især ikke L1'er; Ellers gentages vasken.
    5. Anbring pladen ved 25 °C i 1 time, og vent på, at nogle L1'er klækkes.
    6. Saml nyklækkede L1'er: Slip forsigtigt 1 ml M9 buffer på agaren. Hvirvl pladen for at løsne L1, men ikke embryoner. Pipetter forsigtigt buffer og orme i et 1 ml centrifugerør.
    7. Centrifuger røret i 1 minut ved ~18.000 × g. Fjern supernatanten.
    8. Pipetter L1 direkte på bakterieplænen på en frøet plade. Kontroller under dissektionsmikroskopet, at der ikke er voksne orme eller embryoner til stede.
    9. Hold orme ved 25 °C, indtil de har udviklet sig til det ønskede stadium.
      BEMÆRK: Hvis forholdene er optimale, kan yderligere to partier L1 opsamles fra samme plade. Undersøg den oprindelige plade for at sikre, at der ikke er L1 til stede. Vask om nødvendigt igen. Trin 1.2.5-1.2.9 gentages.
    10. Tjek udviklingstiming. Før du går videre til downstream-applikationen, skal du inspicere nogle orme under et sammensat mikroskop ved 400x forstørrelse for at bekræfte, at de nåede det ønskede udviklingsstadium, her L3.
      BEMÆRK: Migrationsafstand af distale spidsceller eller linkerceller kan bruges som vejledning ud over vulvaudvikling. Til vulvaudvikling giver Mock et al.23 en nyttig vejledning, selvom timingen i denne undersøgelse blev bestemt ved 20 ° C. Ved 25 °C vil vildtype C. eleganer gennemgå L3-L4 molten 24 timer efter klækning.

2. Indsamling af L4-hanner og hermafroditter og fiksering

  1. Tilbered RNAsefri, kold (-20 °C), 70 % methanol før fiksering.
  2. Under et dissektionsmikroskop ved 30-50x forstørrelse skal du begynde at plukke hanner og hermafroditter fra synkroniseringspladerne på separate useedede plader, så snart kønnene kan skelnes (~ 21 timer efter udklækning, figur 2), og fortsæt med at plukke i 1-2 timer eller indtil 200 dyr er samlet.
  3. Hold ormene ved 25 °C, indtil de når det ønskede stadium for eksperimentet.
  4. Vask ormene af pladen med 1-2 ml M9-buffer ved hjælp af en pipettespids, der er forvasket med M9-buffer indeholdende 0,01% vaskemiddel (for at forhindre orme i at klæbe til spidsen).
  5. Overfør ormene til et 1 ml centrifugerør.
  6. Drej i 1 minut ved 21.000 × g for at pelletere ormene. Fjern supernatanten.
  7. Tilsæt 1 ml M9 buffer og bland for at bryde pelleten op.
  8. Drej i 1 min ved 21.000 × g for at pelletere ormene. Fjern supernatanten.
  9. Gentag vasken.
  10. Tilsæt 1 ml iskold 70% methanol og bland godt.
  11. Drej i 1 minut ved 21.000 × g for at pelletere ormene. Fjern supernatanten.
  12. Gentag trin 2.10 og 2.11.
  13. Der tilsættes 500 μL 70 % methanol, blandes og opbevares ved 4 °C i 1 time til natten over.

3. Laser mikrodissektion

BEMÆRK: Herfra skal du bruge RNase-fri reagenser og forbrugsstoffer; brug filterspidser.

  1. Hvis CEL-Seq2-metoden anvendes til at behandle prøverne, skal der fremstilles en masterblanding for hver CEL-Seq2-primer (supplerende tabel S1): pipette 2 μL CEL-Seq2-primer, 1 μL 10 mM dNTP og 9 μL 1% β-Mercaptoethanol (i RNase-frit vand) i et mærket 200 μL rør.
  2. Montering på dias
    1. Under et dissektionsmikroskop pipetteres 20 μL af de faste orme (20-40 orme fra trin 2.13) på den matte side af et polyethylennaphthalat (PEN)-membranglasglas (hvor membranen er).
    2. Vent på, at methanol fordamper. Brug en glidevarmer til at fremskynde fordampningen.
      BEMÆRK: Yderligere dråber methanol kan påføres, og en pipettespids bruges til at sprede ormene ud, hvis de begynder at klumpe, når de tørrer. Når orme er i klumper, kan de være vanskelige at dissekere.
  3. Opsætning af mikroskopet
    BEMÆRK: Følgende protokol er specifik for det instrument, der er angivet i materialetabellen. Det skal justeres, hvis der anvendes et andet LMD-mikroskop.
    1. Placer en stationær luftfugter bag scenen på siden af LMD-mikroskopet. Sørg for, at dampen blæser direkte på scenen.
      BEMÆRK: Luftfugteren er nyttig til at reducere statisk elektricitet, som ellers kan forhindre den lille membransektion i at falde ned i rørhætten.
    2. Drej nøglen for laserkraft.
    3. Tænd for trinstyring.
    4. Tænd for mikroskopkontrolboksen.
    5. Åbn Laser Microdissection software.
    6. Fjern plastskærmen over scenen.
    7. Klik på aflæsningsknappen med pil opad for indlæsning af membranslides.
    8. Sørg for, at diaset er helt tørt, vend, så membranen vender nedad.
    9. Indsæt sliden, og klik på Fortsæt i vinduet med ændringseksempel .
    10. Udskift plastskærmen.
    11. Nederst på skærmen skal du vælge, hvilken slideholder der indeholder sliden.
    12. For at indlæse rørene skal du klikke på aflæsningsknappen med pil ned.
    13. Træk bakken ud, og fjern rørblokken.
      BEMÆRK: Rørblokken, der anvendes til dette eksperiment, er til 500 μL PCR-rør.
    14. Indsæt rørhætterne på 500 μL PCR-rør i holderen, og fold røret under.
    15. Sæt blokken tilbage i bakken, og skub bakken tilbage i mikroskopstadiet.
    16. I popup-vinduet til ændring af samlerenhed skal du vælge PCR-rør og klikke på ok.
    17. Klik på den tomme rørplacering nederst til venstre på skærmen under kollektorenhedens rørhætter.
    18. I mikroskopets kontrolpanel skal du vælge TL-BF til transmitteret lysbelysning.
  4. Stikling
    BEMÆRK: Denne protokol er specifik for det instrument, der er angivet i materialetabellen.
    1. Brug 2,5x linsen til at justere fokus, indtil ormene og membranens struktur er synlige.
    2. Skift til 20x linsen.
    3. Flyt scenen til en region uden orme. Juster fokus, så de boblelignende strukturer i membranen har en gullig farve (figur 3A, B) for at fokusere laseren på det korrekte brændplan.
    4. Indstil laserparametrene; for halespidser skal du starte med Power 45, blænde 30 og hastighed 20.
    5. I laserkontrolpanelet skal du vælge kalibrer. Følg vejledningen.
      BEMÆRK: Instrumentet udfører dette trin automatisk. Det vil sikre, at en form tegnet med musen på skærmen er identisk med den form, der er skåret ud af laseren.
    6. Nederst på skærmen ved samleanordningens rørhætter skal du klikke på position A.
    7. I højre side af skærmen skal du vælge enkelt figur | Tegn + Klip. I venstre side af skærmen skal du vælge PtoP.
    8. Tegn en linje.
    9. Klik på Start Klip , så laseren skærer gennem membranen.
      BEMÆRK: Det kan også ætse en linje ind i glasset.
    10. Hvis dette test-snit ser godt ud (membranen er skåret, kanter af snit ser glatte ud), skal du fortsætte med næste trin. Ellers skal du justere fokus og skære en anden linje.
    11. Find en orm. Skift til Flyt + Klip og brug musen til at skære gennem halen.
      BEMÆRK: Hvis laseren ikke skærer gennem halen, skal du justere fokus og øge lasereffekten. For tykkere væv skal lasereffekten muligvis indstilles til 60.
    12. Gem parametrene: fanen Filer | Gem applikationskonfiguration; til senere hentning, Gendan applikationskonfiguration.
    13. For at indsamle prøven skal du skifte til indstillingen Draw + Cut med PtoP-funktionen og tegne en form for at fuldføre snittet af en membransektion (figur 3C).
      BEMÆRK: Større membransektioner og sektioner formet som rektangler eller trekanter snarere end cirkler eller ovaler er lettere at lokalisere i kollektorrørhætten.
    14. Vælg det næste rør på Collector Device Tube Cap nederst på skærmen, og klip den næste halespids.
    15. Når fire haler er skåret, skal du aflæse rørstativet (klik på Aflæs med pil nedad) og finde membransektionerne under et dissekeringsmikroskop (figur 3D).
      BEMÆRK: Sektionerne kan være placeret i midten af rørhætten eller fastgjort til siden af hætten.
    16. Fortsæt med downstream-applikationen. For CEL-Seq2 pipetteres 1,2 μL af en CEL-Seq2 primermasterblanding (fra trin 3.1) direkte oven på prøven.
    17. Luk røret, mærk med primernummer, og placer straks rørhætten direkte på et stykke tøris for at flashfryse prøven og forhindre RNA-nedbrydning.
    18. Læg flere rør, returner rørblokken til scenen, og skær flere prøver. Tilsæt en anden CEL-Seq2 primerblanding til hver halespids.
    19. Alle rør opbevares ved -70 °C.

4. Enkelthale RNA-sekventering med CEL-Seq2

BEMÆRK: For alle detaljer om CEL-Seq2-protokollen, se Yanai og Hashimshony18.

  1. Rengør laboratoriebænkområdet med RNase-dekontamineringsopløsning for at forhindre RNA-nedbrydning.
  2. Forbered masterblandinger og hold dem på is.
    1. Forbered masterblandingen med omvendt transkription: 0,4 μL første strengbuffer, 0,1 μL 0,1 M DTT, 0,1 μL RNase-hæmmer og 0,1 μL omvendt transkriptase pr. Prøve.
    2. Den anden strengreaktionsmasterblanding forberedes: 7 μL vand, 2,31 μL anden strengbuffer, 0,23 μL dNTP, 0,08 μL E. coli ligase, 0,3 μL E. coli DNA-polymerase, 0,08 μL RNaseH pr. prøve.
  3. Brud på celler og udglødning med primere (se supplerende tabel S1 for den fulde liste over primere):
    1. Programmer termocyklisten og dens låg til 65 °C.
    2. Hent prøverne fra -70 °C og inkuber dem i termocyklisten i 2,5 min.
    3. Spin ved 21.000 × g i 30-40 s.
    4. Inkuberes ved 65 °C i 2,5 min.
    5. Flyt dem straks til is.
    6. Drej ved 21.000 × g i 30-40 s og returner dem til is.
  4. Konvertering af RNA til cDNA:
    1. Der tilsættes 0,8 μL af den omvendte transkriptionsblanding til hver halespids.
    2. Inkuberes ved 42 °C i 1 time.
    3. Varmeinaktiveres ved 70 °C i 10 min.
    4. Flyt det straks til is.
    5. Tilsæt 10 μL af den anden strengblanding til hver halespids.
    6. Svip med eksemplerne.
    7. Spin ved 21.000 × g i 30-40 s.
    8. Inkuberes ved 16 °C i 2 timer.
  5. cDNA oprydning:
    1. Forvarm DNA-oprydningsperlerne til stuetemperatur.
    2. Saml op til 40 prøver i et 1,5 ml centrifugerør (op til 480 μL).
    3. Perlerne blandes, indtil de er godt dispergerede, og der tilsættes 20 μL perler og 100 μL perlebindende buffer for hver 100 μL af den samlede prøve (for 480 μL prøve tilsættes 480 μL perlebuffer og 96 μL perler til et slutvolumen op til 1,056 μL). Bland godt ved pipettering.
    4. Inkuberes ved stuetemperatur i 15 min.
    5. Placer på et magnetisk stativ i mindst 5 minutter, indtil væsken ser klar ud.
    6. Fjern og kassér alle supernatanten undtagen 20 μL.
    7. Der tilsættes 200 μL frisklavet 80% ethanol.
    8. Inkuber i mindst 30 s, fjern supernatanten ved at pipettere den uden at forstyrre perlerne. Kassér supernatanten.
    9. Trin 4.5.7 og 4.5.8 gentages én gang.
    10. Lufttør perlerne i 15 min eller indtil de er helt tørre.
    11. Resuspend perlerne (~ 6,4 μL) med 6,4 μL vand. Bland grundigt ved at pipettere hele volumen op og ned ti gange.
    12. Inkuberes ved stuetemperatur i 2 min.
    13. Gå direkte til in vitro transkription (IVT).
  6. In vitro transkription og fragmentering:
    1. Til røret indeholdende 6,4 μL prøve og perlerne tilsættes følgende blanding (9,6 μL i alt): 1,6 μL 10x T7 Buffer, 1,6 μL ATP, 1,6 μL UTP, 1,6 μL CTP og 1,6 μL GTP (hver dNTP ved 75 mM koncentration) 1,6 μLof T7 enzym.
    2. Der inkuberes i 13 timer ved 37 °C med et lastrum på 4 °C.
    3. Tilsæt 6 μL exonukleaseopløsning (endeligt volumen skal være 22 μL).
    4. Inkuberes i 15 minutter ved 37 °C.
    5. Røret anbringes på is igen, og der tilsættes 5,5 μL fragmenteringsbuffer (0,25 × reaktionsvolumen).
    6. Inkuberes i 3 minutter ved 94 °C.
    7. Rør straks til is og tilsæt 2,75 μL fragmenteringsstopbuffer (0,5 × volumen fragmenteringsbuffer tilsat).
    8. Fjern perlerne ved at placere røret på magnetstativet i mindst 5 minutter, indtil væsken ser klar ud.
    9. Overfør supernatanten til et nyt rør.
  7. Amplified RNA (aRNA) oprydning:
    1. Forvarm RNA-oprydningsperlerne til stuetemperatur.
    2. Bland perlerne, indtil de er godt spredt.
    3. Pipetter 55 μL perler (1,8 × reaktionsvolumen).
    4. Inkuber dem ved stuetemperatur i 10 min.
    5. Anbring røret på magnetstativet i mindst 5 minutter, indtil væsken ser klar ud.
    6. Fjern og kassér 80 μL af supernatanten.
    7. Der tilsættes 200 μL frisklavet 70% ethanol.
    8. Inkuber i mindst 30 s, fjern supernatanten ved pipettering uden at forstyrre perlerne. Kassér supernatanten.
    9. Gentag ethanolvasken to gange mere.
    10. Lufttør perlerne i 15 min eller indtil de er helt tørre.
    11. Resuspend perlerne med 7 μL vand. Pipetter hele lydstyrken op og ned 10 gange for at blande grundigt.
    12. Inkuberes ved stuetemperatur i 2 min.
    13. Placer røret med perlerne på magnetstativet i 5 minutter, indtil væsken ser klar ud.
    14. Overfør supernatanten til et nyt rør.
      BEMÆRK: Stoppested: Prøverne kan opbevares ved -70 °C.
  8. Valgfrit: Kontroller aRNA-mængden og kvaliteten med et automatiseret elektroforesesystem efter producentens protokol.
  9. Forberedelse af bibliotek:
    1. Til 5 μL RNA tilsættes 1 μL 100 μM tilfældig hexamer RT primer (se materialetabellen) og 0,5 μL 10 mM dNTP.
    2. Inkuberes ved 65 °C i 5 min.
    3. Der tilsættes 4 μL af følgende blanding ved stuetemperatur: 2 μL First Strand buffer, 1 μL 0,1 M DDT, 0,5 μL RNase inhibitor, 0,5 μL reverse transkriptase.
    4. Inkuberes ved 25 °C i 10 min.
    5. Inkuberes ved 42 °C i 1 time (i en hybridovn eller en forvarmet varmecykel med låget indstillet til 50 °C).
    6. Inkuberes ved 70 °C i 10 min.
    7. Overfør 5 μL til et nyt rør (hold resten af reaktionen ved -20 °C). Tilsæt 5,5 μL ultrarent vand, 1 μL RNA PCR Primer (RP1), 1 μL indekseret RNA PCR Primer (RPIX) og 12,5 μL PCR-blanding.
    8. Brug følgende program på termocyklisten: 30 s ved 98 °C, 11 cyklusser på: (10 s ved 98 °C, 30 s ved 60 °C, 30 s ved 72 °C), 10 min ved 72 °C, hold ved 4 °C.
      BEMÆRK: Stoppested: Prøverne kan opbevares ved -20 °C.
  10. Oprydning i biblioteket:
    1. Forvarm DNA-oprydningsperlerne til stuetemperatur.
    2. Bland perlerne, indtil de er godt spredt.
    3. Tilsæt 25 μL af perlerne til PCR-reaktionen. Bland godt ved pipettering.
    4. Inkuberes ved stuetemperatur i 15 min.
    5. Anbring røret på magnetstativet i mindst 5 minutter, indtil væsken ser klar ud.
    6. Fjern og kassér 45 μL af supernatanten.
    7. Der tilsættes 200 μL frisklavet 80% ethanol.
    8. Inkuber i mindst 30 s, fjern og kassér supernatanten uden at forstyrre perlerne.
    9. Gentag ethanolvasken en gang.
    10. Lufttørre perler i 15 min eller indtil de er helt tørre.
    11. Resuspend dem med 25 μL vand. Bland godt ved pipettering.
    12. Inkuberes ved stuetemperatur i 2 min.
    13. Anbring røret på magnetstativet i 5 minutter, indtil væsken ser klar ud.
    14. Overfør 25 μL supernatant til et nyt rør.
    15. Gentag trin 4.10.2-4.10.10 én gang.
    16. Resuspend med 10,5 μL vand. Bland godt ved pipettering.
    17. Inkuberes ved stuetemperatur i 2 min.
    18. Anbring røret på magnetstativet i 5 minutter, indtil væsken ser klar ud.
    19. 10 μL supernatant overføres til et nyt rør og opbevares ved -20 °C.
  11. Vurder bibliotekets kvalitet og kvantitet i henhold til kravet om sekventeringsfaciliteten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Efter laserfangst mikrodissektion, individuelle halespidser af mænd og hermafroditter på 4 tidspunkter (L3 22 timer efter luge; L4 24, 26 og 28 timer efter luge) blev fremstillet til RNA-sekventering under anvendelse af CEL-Seq2-protokollen. CEL-Seq2-primere indeholder unikke stregkoder, der gør det muligt at identificere sekventeringslæsninger fra en bestemt prøve (i dette tilfælde en individuel halespids) bioinformatisk. Sekventeringsdata blev genereret med denne metode for i alt 557 halespidser (266 hermafroditter og 291 hanner på tværs af 4 udviklingstidspunkter, 59-78 haler pr. Køn og tidspunkt). CEL-Seq2 stregkoder blev genfundet for 97% (dvs. 543) af disse halespidser (supplerende tabel S2). For de fleste biblioteker var gendannelsesgraden 99-100%; det var dog 88% for et mandligt tidspunkt. Det er værd at bemærke, at omkring halvdelen af de mandlige halespidser fra 22, 24 og 28 timers tidspunkter blev opbevaret ved -80 ° C i ~ 4 måneder på grund af COVID-19-relaterede forsinkelser. Dette viser, at selvom det er ideelt at forberede sekventeringsbiblioteker kort efter prøveudtagning, er det muligt at opbevare dissekerede prøver i længere tid før bibliotekets forberedelse.

CEL-Seq2-primerne tilføjer også en UMI til hvert mRNA-transkript. Dette muliggør fjernelse af PCR-duplikater og præcis kvantificering af genekspression i prøven. Antallet af UMI'er varierede dramatisk på tværs af halespidser (figur 4; mandligt gennemsnit = 92.560; mandlig min. = 155; mandlig maks. = 1.183.998; hermafroditter gennemsnit = 67.597; hermafroditter min. = 132; hermafroditter maks. = 630.427). For UMI-tællinger pr. halespids, se supplerende tabel S3. På grund af den lave mængde input RNA til enkeltcellebiblioteksforberedelse er enkeltcellesekventeringsdata kendt for at have en stor mængde teknisk støj. Derfor anbefales det at filtrere prøver, der har meget lave eller meget høje UMI-tal før analyse24.

R-pakken powsimR25 blev brugt til at vurdere de statistiske effekt- og prøvestørrelseskrav til pålidelig påvisning af differentielt udtrykte (DE) gener i enkeltcelle- eller bulk RNA-seq-eksperimenter. Parametrene for simuleringerne var baseret på et sekventeringsdatasæt af 70 individuelle mandlige halespidser (ved 24 timers tidspunktet) opnået med metoden beskrevet her. Forventede log-fold ændringer var baseret på resultater fra et separat RNA-seq eksperiment, der samlede 80-100 halespidser. Simuleringerne fastslog, at single-tail-tip-dataene har tilstrækkelig effekt (True Positive Rate = TPR) til at detektere DE-gener, bortset fra gener, der har en meget lav gennemsnitlig ekspressionsværdi (øverst i figur 5; stiplet linje repræsenterer 80% TPR). Tilføjelse af flere simulerede halespidser pr. tidspunkt øgede effekten noget for lavt udtrykte gener. Et lignende mønster ses for False Discovery Rate (FDR). FDR er høj (>0,10) for de lavt udtrykte gener; for mere højt udtrykte gener falder den dog til eller under den nominelle 0,10 cutoff (stiplet linje for FDR i bunden af figur 5). Sammenfattende ville en forøgelse af antallet af udtagne haler pr. tidspunkt over 70 ikke gøre meget for at sænke FDR eller øge effekten. 70 halespidser giver dog en meget lavere FDR og stærkere effekt end 30 halespidser.

Figure 1
Figur 1: Procedureoversigt for synkronisering af Caenorhabditis elegans med hatch-off-metoden og lasermikrodissering af halespidser. Forkortelser: L1-L4 = larvestadier 1 til 4; PEN = polyethylennaphthalat; LMD = laser mikrodissektion. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Udseende af C. elegans L3 hermafroditter og mænd under et dissektionsmikroskop. Hermafroditter (A, B) og mænd (C, D) ved 21-23 timer efter luge kan skelnes under et dissektionsmikroskop (~ 50x forstørrelse) ved morfologien af deres haler (pile). Hermafroditternes hale er smal, mens mænds er hævet og fremstår klar. Skalabjælker = 0,1 mm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Udseende af PEN-membranens glidestruktur og ormhale. Fokus er korrekt til dissektion af vævet set med 20x (A) og 40x (B) linsen ved mikroskopet. (C) Dissekeret hale og delvist udskåret PEN-membran. Efter lukning af hullet i snittet falder membranstykket ned i rørhætten under diaset. (D) Rørhætte med en PEN-membransektion indeholdende en dissekeret halespids. Skalastænger = 0,1 mm (A-C), 1 mm (D). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Naturlige logtransformerede UMI-tal pr. individuel halespids for forskellige tidspunkter og køn. RNA fra individuelle haler blev fremstillet til sekventering ved anvendelse af CEL-Seq2-metoden; 557 haler blev sekventeret i alt med 59-78 haler pr. køn og tidspunkt. Ekstremt lave og høje UMI-outliers ville blive fjernet fra dataene før analyse. Forkortelse: UMI = unik molekylær identifikator. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Resultater af en efterfølgende effektanalyse ved hjælp af simuleringer med powsimR. PowsimR-softwaren bestemmer antallet af uafhængige prøver, der kræves for at detektere DE-gener på forskellige ekspressionsniveauer. Gener binned ved middelekspression transformeret som den naturlige log af UMI-tæller. (A) Kraft (TPR) til at detektere DE-gener mellem to tilstande (her mand vs hermafrodit) for fire forskellige simuleringer (forskellige farvede grafer), der indeholder forskellige prøvestørrelser (antal individuelle halespidser) pr. Tilstand. Stiplet linje angiver 80% TPR. (B) FDR i de samme fire simuleringer som i (A), stiplet linje, der angiver 10% FDR. Graferne viser, at en prøvestørrelse på 70 halespidser (grøn) pr. tilstand er tilstrækkelig til at detektere DE-gener, bortset fra gener med meget lave ekspressionsniveauer. Det vil sige, at kraften og den falske opdagelseshastighed for sådanne gener ikke kan forbedres kraftigt ved at øge prøvestørrelsen ud over 70. Forkortelser: DE = differentielt udtrykt; UMI = unik molekylær identifikator; TPR = ægte positivprocent FDR = falsk opdagelsesrate. Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende tabel S1: Sekvenser af primere anvendt i CEL-Seq2-protokollen. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende tabel S2: Udtaget i forhold til genvundne individuelle halespidser. CEL-Seq2 primere indeholder unikke stregkoder, der gør det muligt at identificere sekventeringslæsninger fra hver prøve, der skal identificeres bioinformatisk. Aflæsninger blev genvundet fra 97% af halespidsprøverne forberedt til sekventering. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende tabel S3: UMI-tællinger af alle prøver med genvundne stregkoder, som angivet i supplerende tabel S2. Forkortelse: UMI = unik molekylær identifikator. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kritiske trin i metoden
Hvis den udføres korrekt, vil den her beskrevne metode opnå robuste RNA-profiler med et relativt lille antal laserdiskerede prøver (70 halespidser i dette eksempel). For prøver fra udviklende dyr er tæt synkronisering imidlertid afgørende for at reducere variationen mellem prøver. Af denne grund anbefaler protokollen hatch-off-metoden til ormsynkronisering. Her kan forskeren bestemme og præcist kontrollere aldersforskellen mellem individer (1 time i den nuværende protokol). Derudover er lugemetoden anvendelig for enhver art, selvom embryonerne er følsomme over for blegemiddel, L1 ikke arresterer, eller genopretning fra L1-anholdelse er variabel. For en vellykket synkronisering ved luge er vasketrinnene afgørende: alle voksne og larver skal fjernes i begyndelsen af rugeperioden, og ingen embryoner skal vaskes af sammen med den nyklækkede L1 i slutningen af rugeperioden. Dette lykkes kun, hvis pladens agaroverflade er ubeskadiget af revner, huller eller bobler, bakterieplænen på pladen er frisk og ikke for tyk, og væsken tilsættes og omrøres kun meget forsigtigt.

Hvis der skal indhentes data separat for hanner og hermafroditter/hunner, er det også vigtigt med en pålidelig identifikation af kønnene. At skelne L3-larver efter køn (se figur 2) kræver erfaring. Det anbefales at øve sig i at plukke L3 hanner og hermafroditter/hunner og kontrollere succesraten, efter at dyrene har udviklet sig til voksne, og kønnene er lette at skelne. Efter enkeltvævs RNA-Seq kan outliers også identificeres ved hovedkomponentanalyse og fjernes om nødvendigt.

For en vellykket genvinding af laserskårne prøver er det vigtigt at reducere statisk elektricitet så meget som muligt. Ladede PEN-membranstykker falder ofte ikke ned i rørhætten, men klæber til diaset eller enhver anden del af mikroskopet. Et middel er at øge fugtigheden i rummet og specifikt omkring mikroskopet ved at placere en lille luftfugter ved siden af scenen. Derudover kan membranglassene behandles med UV-lys. For at gøre dette skal du inkubere dias i et UV-C (254 nm) tværbindingskammer og levere mindst 1 joule energi eller udsætte gliderne for UV-lyset i en laminær luftstrømsbænk i 30 minutter.

Da målet med protokollen er RNA-Seq, er det afgørende at holde et RNase-frit arbejdsmiljø. Begyndende med fikseringsopløsningen skal reagenser, beholdere og forbrugsstoffer være RNase-fri, arbejdsfladen skal dekontamineres, og forskerne skal bære rene handsker. De dissekerede prøver nedfryses hurtigst muligt og opbevares ved -70 °C indtil videre forarbejdning. Det anbefales også at bruge rør med lav tilbageholdelse og spidser til CEL-Seq2-delen af protokollen.

Denne artikel giver kun en grundlæggende oversigt over CEL-Seq2-protokollen, som tidligere blev offentliggjort af dens udviklere med nyttige noter og tip17,18. Det anbefales, at disse publikationer konsulteres, inden CEL-Seq2-metoden anvendes.

LMD-RNA-Seq-dataene kan valideres ved enkeltmolekyle-RNA fluorescerende in-situ-hybridisering (smRNA FISH)26,27,28. smRNA FISH er blevet anvendt i vid udstrækning i C. elegans og er modtagelig for andre nematodearter, forskellig fra immunostaining med eksisterende antistoffer (som muligvis ikke krydsreagerer) eller introduktion af transkriptionelle reportere gennem transgenese. Sidstnævnte fungerer godt i C. elegans og nogle beslægtede Caenorhabditis arter29, men transgenese kan være mere udfordrende i andre nematodearter30,31.

Begrænsninger af metoden
Metoden beskrevet her fungerer meget godt til indsamling af halespidser, et tyndt væv i slutningen af en orm. Dissekering af væv i den tykkere midte af ældre larver eller voksne er mere udfordrende. Softwaren til det instrument, der anvendes her, inkluderer en indstilling til flere snit placeret på efterfølgende dybere niveauer i vævet. Denne indstilling kan bruges til at skære tykkere områder af dyret. Fordi ormene skal fastgøres før dissektion, er strukturelle detaljer vanskelige at se, hvilket forhindrer præcis dissektion af specifikke små strukturer. Som nævnt ovenfor, LMD-RNA-Seq er ikke en HTP metode. 50-70 prøver kan dog dissekeres på en eftermiddag.

Metodens betydning i forhold til eksisterende/alternative metoder
LMD-RNA-Seq kan bruges i enhver art, selvom der ikke er transgene værktøjer til rådighed. Andre metoder er afhængige af FACS-sortering af fluorescerende mærkede celler 8,9,32 eller isolering af mærkede kerner33,34 og kræver således transgene dyr. Metoder, der dissocierer og isolerer celler i postembryonisk C. elegans, har tendens til at savne vævene i de to ender af ormen (Dylan Rahe, personlig kommunikation). Disse forbehold overvindes ved at kombinere enkeltcelle RNA-Seq med kryosesektion af hele orme (RNA-tomografi)35. Denne metode blev brugt til at sammenligne rumlig genekspression mellem C. elegans og en anden rhabditid nematode, Pristionchus pacificus36. Alternativt kan man eksperimentere med formalinfikserede paraffinindlejrede (FFPE) orme. Sådant materiale er med succes blevet anvendt til RNA-Seq efter LMD af pattedyrvævsprøver37. RNA-tomografi og LMD af FFPE-orme er imidlertid begrænset til analyse af kun en håndfuld dyr. De er derfor ikke så velegnede til studiet af dynamisk genekspression i udvikling af væv som LMD-RNA-Seq.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Alle forfattere erklærer, at de ikke har nogen interessekonflikter.

Acknowledgments

Dette arbejde blev finansieret af NIH (R01GM141395) og NSF (1656736) tilskud til DF og NIH stipendium (F32GM136170) til AW. Figur 1 blev oprettet ved hjælp af BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
 0.5 µM PEN membrane glass slides RNase free Leica 11600288 for LMD
500 µL PCR tubes (nuclease-free) Axygen 732-0675 to cut the tail tips into
Compound microscope with 40x objective and DIC any to check age of worms
Desktop humidifier any
Dissection microscope with transmitted light base any for all worm work
glass pasteur pipets any handle of worm pick
glass slides and coverslips any to check age of worms
LMD6 microdissection system Leica multiple to cut tail tips
LoBind tubes 0.5 mL Eppendorf 22431005
M9 Buffer Recipe in WormBook
Methanol 99.8% Sigma 322415 to fix worms
NGM growth medium US Biological N1000 Buffers and salts need to be added: Recipe in WormBook
P10 pipette variablle volume e.g. Gilson
P1000 pipette variable volume e.g. Gilson
P2 pipette variable volume e.g. Gilson
Pipette tips 1,000 µL any
Pipette tips 1-10 µL filtered any
platinum iridium wire Tritech PT-9010 to make worm pick
sterile and nuclease-free 1 mL centrfuge tubes any
Tween 20 Sigma P9416 Add a very small amount to M9 buffer to prevent worms from sticking to the pipet tips
vented 6 mm plastic Petri dishes any
For CEL-Seq2
4200 TapeStation System with reagents for high-sensitivity RNA and DNA detection Aligent automated electrophoresis system
AMPure XP beads Beckman Coulter A63880 DNA cleanup beads
Bead binding buffer  20% PEG8000, 2.5 M NaCl
CEL-Seq2 primers (see Table S1) Sigma Genosys Mastercycler Nexus GX2 Eppendorf 6335000020 Thermal cycler with programmable lid and block for 200 µl tubes.
DNA Polymerase I (E. coli) Invitrogen 18052-025
dNTP mix 10 mM any
E. coli DNA ligase Invitrogen 18052-019
Ethanol
ExoSAP-IT For PCR Product Clean-Up Affymetrix 78200 exonuclease solution
MEGAscript T7 Transcription Kit Ambion AM1334 For step 4.6.1
Nuclease-free water any
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer NEB M0531 PCR mix step 4.9.7
random hexamer RT primer GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA
NNNNNN		 IDT a primer with 6 nucleotides that are random
RNA Fragmentation buffer NEB E6150S
RNA Fragmentation stop buffer NEB E6150S
RNA PCR Index Primers (RPI1–RPI48) Illumina, NEB, or IDT RPIX in protocol step 4.9.7, sequences available from Illumina
RNAClean XP beads Beckman Coulter A63987
RNase AWAY Surface Decontaminant Thermo Scientific 7000TS1 or any other similar product
RNaseH (E. coli) Invitrogen 18021-071
RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor Invitrogen 10777-019
Second strand buffer Invitrogen 10812-014
Superscripit II Invitrogen 18064-014 reverse transcriptase

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Haag, E. S., Fitch, D. H. A., Delattre, M. From "the worm" to "the worms" and back again: the evolutionary developmental biology of nematodes. Genetics. 210 (2), 397-433 (2018).
  2. Sommer, R. J., Bumbarger, D. J. Nematode model systems in evolution and development. Wiley Interdisciplinary Reviews: Developmental Biology. 1 (3), 389-400 (2012).
  3. WormBase. , Available from: https://wormbase.org/#012-3-6 (2022).
  4. WormAtlas. , Available from: https://wormatlas.org (2022).
  5. WormBook. , Available from: http://wormbook.org (2022).
  6. WormBook in Genetics. , Available from: https://academic.oup.com/genetics/pages/wormbook (2022).
  7. Cao, J., et al. Comprehensive single-cell transcriptional profiling of a multicellular organism. Science. 357 (6352), 661-667 (2017).
  8. Kaletsky, R., Murphy, C. T. Transcriptional profiling of C. elegans adult cells and tissues with age. Methods in Molecular Biology. 2144, 177-186 (2020).
  9. Kaletsky, R., et al. Transcriptome analysis of adult Caenorhabditis elegans cells reveals tissue-specific gene and isoform expression. PLoS Genetics. 14 (8), 1007559 (2018).
  10. Packer, J. S., et al. A lineage-resolved molecular atlas of C. elegans embryogenesis at single-cell resolution. Science. 365 (6459), 1971 (2019).
  11. Kulkarni, A., Anderson, A. G., Merullo, D. P., Konopka, G. Beyond bulk: a review of single cell transcriptomics methodologies and applications. Current Opinion in Biotechnology. 58, 129-136 (2019).
  12. Von Stetina, S. E., et al. Cell-specific microarray profiling experiments reveal a comprehensive picture of gene expression in the C. elegans nervous system. Genome Biology. 8 (7), 135 (2007).
  13. Baugh, L. R., et al. The homeodomain protein PAL-1 specifies a lineage-specific regulatory network in the C. elegans embryo. Development. 132 (8), 1843-1854 (2005).
  14. Haenni, S., et al. Analysis of C. elegans intestinal gene expression and polyadenylation by fluorescence-activated nuclei sorting and 3'-end-seq. Nucleic Acids Research. 40 (13), 6304-6318 (2012).
  15. Zhang, S., Banerjee, D., Kuhn, J. R. Isolation and culture of larval cells from C. elegans. PLoS One. 6 (4), 19505 (2011).
  16. Emmert-Buck, M. R., et al. Laser capture microdissection. Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).
  17. Hashimshony, T., et al. CEL-Seq2: sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq. Genome Biology. 17, 77 (2016).
  18. Yanai, I., Hashimshony, T. CEL-Seq2-single-cell RNA sequencing by multiplexed linear amplification. Methods in Molecular Biology. 1979, 45-56 (2019).
  19. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e4019 (2012).
  20. Baugh, L. R. To grow or not to grow: nutritional control of development during Caenorhabditis elegans L1 arrest. Genetics. 194 (3), 539-555 (2013).
  21. Baugh, L. R., Hu, P. J. Starvation responses throughout the Caenorhabditis elegans life cycle. Genetics. 216 (4), 837-878 (2020).
  22. Pepper, A. S., Killian, D. J., Hubbard, E. J. Genetic analysis of Caenorhabditis elegans glp-1 mutants suggests receptor interaction or competition. Genetics. 163 (1), 115-132 (2003).
  23. Mok, D. Z., Sternberg, P. W., Inoue, T. Morphologically defined sub-stages of C. elegans vulval development in the fourth larval stage. BMC Developmental Biology. 15, 26 (2015).
  24. Lytal, N., Ran, D., An, L. Normalization methods on single-cell RNA-seq data: an empirical survey. Frontiers in Genetics. 11, 41 (2020).
  25. Vieth, B., Ziegenhain, C., Parekh, S., Enard, W., Hellmann, I. powsimR: power analysis for bulk and single cell RNA-seq experiments. Bioinformatics. 33 (21), 3486-3488 (2017).
  26. Bolkova, J., Lanctot, C. Quantitative gene expression analysis in Caenorhabditis elegans using single molecule RNA FISH. Methods. 98, 42-49 (2016).
  27. Ji, N., van Oudenaarden, A. Single molecule fluorescent in situ hybridization (smFISH) of C. elegans worms and embryos. WormBook. , 1-16 (2012).
  28. Lee, C., et al. Single-molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smFISH) in Caenorhabditis elegans. Bio-Protocol. 7 (12), 2357 (2017).
  29. Baird, S. E., Chamberlin, H. M. Caenorhabditis briggsae methods. WormBook. , 1-9 (2006).
  30. Felix, M. A. Oscheius tipulae. WormBook. , 1-8 (2006).
  31. Han, Z., et al. Improving transgenesis efficiency and CRISPR-associated tools through codon optimization and native intron addition in Pristionchus nematodes. Genetics. 216 (4), 947-956 (2020).
  32. Fernandes Povoa, E. E., Ebbing, A. L. P., Betist, M. C., vander Veen, C., Korswagen, H. C. An optimized dissociation protocol for FACS-based isolation of rare cell types from Caenorhabditis elegans L1 larvae. MethodsX. 7, 100922 (2020).
  33. Han, M., Wei, G., McManus, C. E., Hillier, L. W., Reinke, V. Isolated C. elegans germ nuclei exhibit distinct genomic profiles of histone modification and gene expression. BMC Genomics. 20 (1), 500 (2019).
  34. Steiner, F. A., Henikoff, S. Cell type-specific affinity purification of nuclei for chromatin profiling in whole animals. Methods in Molecular Biology. 1228, 3-14 (2015).
  35. Ebbing, A. Spatial transcriptomics of C. elegans males and hermaphrodites identifies sex-specific differences in gene expression patterns. Developmental Cell. 47 (6), 801-813 (2018).
  36. Rödelsperger, C., et al. Spatial transcriptomics of nematodes identifies sperm cells as a source of genomic novelty and rapid evolution. Molecular Biology and Evolution. 38 (1), 229-243 (2021).
  37. Amini, P., et al. An optimised protocol for isolation of RNA from small sections of laser-capture microdissected FFPE tissue amenable for next-generation sequencing. BMC Molecular Biology. 18 (1), 22 (2017).

Tags

Biologi udgave 181
Laser mikrodissektion til artsagnostiske enkeltvævsapplikationer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Woronik, A., Kiontke, K., Jallad, R. … More

Woronik, A., Kiontke, K., Jallad, R. S., Herrera, R. A., Fitch, D. H. A. Laser Microdissection for Species-Agnostic Single-Tissue Applications. J. Vis. Exp. (181), e63666, doi:10.3791/63666 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter