Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Lasermikrodissektion för artagnostiska envävnadsapplikationer

Published: March 31, 2022 doi: 10.3791/63666
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 3, 1
1Center for Developmental Genetics, New York University, 2Sacred Heart University, 3Baylor School

Summary

Ett protokoll beskrivs som använder lasermikrodissektion för att isolera enskilda nematodvävnader för RNA-sekvensering. Protokollet kräver inte artspecifika genetiska verktygssatser, vilket gör det möjligt att jämföra genuttrycksprofiler mellan olika arter på nivån för envävnadsprover.

Abstract

Encellsmetoder har revolutionerat analysen av transkriptom av specifika celltyper. De kräver dock ofta artspecifika genetiska "verktygssatser", såsom promotorer som driver vävnadsspecifikt uttryck av fluorescerande proteiner. Vidare tar protokoll som stör vävnader för att isolera enskilda celler bort celler från deras ursprungliga miljö (t.ex. signalering från grannar) och kan resultera i stressreaktioner eller andra skillnader från inhemska genuttryckstillstånd. I det nuvarande protokollet optimeras lasermikrodissektion (LMD) för att isolera enskilda nematodsvansspetsar för studier av genuttryck under manlig svansspetsmorfogenes.

LMD möjliggör isolering av en del av djuret utan behov av cellstörningar eller artspecifika verktygssatser och är därmed tillämpligt på alla arter. Därefter kan encelliga RNA-seq-biblioteksberedningsprotokoll såsom CEL-Seq2 appliceras på LMD-isolerade enskilda vävnader och analyseras med hjälp av standardledningar, med tanke på att ett välannoterat genom eller transkriptom är tillgängligt för arten. Sådana data kan användas för att fastställa hur bevarade eller olika transkriptomen är som ligger till grund för utvecklingen av den vävnaden hos olika arter.

Begränsningar inkluderar förmågan att skära ut vävnaden av intresse och provstorleken. En effektanalys visar att så få som 70 svansspetsar per tillstånd krävs för 80% effekt. Noggrann synkronisering av utveckling behövs för att erhålla detta antal djur i samma utvecklingsstadium. Således beskrivs också en metod för att synkronisera djur med 1 h intervall.

Introduction

Nematoder - särskilt de rabditid nematoder relaterade till modellsystemet Caenorhabditis elegans - är en underbar grupp djur för evolutionär utvecklingsbiologi (EDB) av många skäl 1,2. Fördelarna inkluderar deras lilla antal celler, definierade och konsekventa cellinjer, transparens och enkel odling och djurhållning. Det finns också många resurser tillgängliga, inklusive högkvalitativa genom för flera arter, och för C. elegans, omfattande molekylärgenetiska verktyg och kunskap om utveckling, genetik, anatomi och fysiologi 3,4,5,6.

Som med många andra organismer har förmågan att karakterisera transkriptomdynamik i enstaka vävnader eller enskilda celler revolutionerat analysen av utvecklingen i C. elegans 7,8,9,10. Att kunna jämföra encelliga transkriptom mellan nematoder skulle på samma sätt omvandla EDB med hjälp av dessa organismer. Till exempel skulle sådana jämförelser ge insikt i hur genreglerande nätverk har utvecklats för karaktärer (egenskaper) som har bevarats, för karaktärer som har divergerat eller för karaktärer som utvecklats oberoende.

Att isolera vissa vävnader eller celler från nematoder är dock en av de stora utmaningarna. För många organismer kan enskilda celler skiljas från vävnader och skördas på ett opartiskt sätt eller kan märkas med vävnadsspecifikt uttryck av ett fluorescerande protein och sorteras genom fluorescensaktiverad cellsortering (FACS)11. I C. elegans har isolering av celler med hög genomströmning (HTP) begränsats mestadels till embryon eftersom den tuffa yttre nagelbandet (och hydrostatiskt skelett) har hindrat cellisolering från larver och vuxna. För att komma runt denna utmaning har vissa metoder använt genetiska verktyg i hela C. elegans-maskar, såsom vävnadsspecifik mRNA-märkning12, och jämförelser av differentiella uttryck mellan vildtyp och mutanter som påverkar en celltyp13. Nyare metoder har övervunnit utmaningen genom att lösa upp nagelbandet för att isolera kärnor14 eller hela celler 8,9,15. Cellisolering och cellodling har dock de uppenbara nackdelarna att celler tas bort från sitt naturliga utvecklings- eller anatomiska sammanhang - t.ex. bort från cellcellsignalering och kontakt med den extracellulära matrisen - som förväntas påverka genuttrycksprofilen15. Dessutom är de genetiska verktygen och vävnadsspecifika markörerna artspecifika (dvs. de kan endast användas i C. elegans).

LMD tillhandahåller en alternativ metod för att isolera vävnader utan att störa cellernas naturliga sammanhang. Signifikant för EDB tillåter LMD också transkriptom från homologa vävnader av olika arter att jämföras utan behov av artspecifika genetiska verktygssatser om genom eller hela transkriptomsekvenser av dessa arter är tillgängliga. LMD innebär att man riktar in sig på vävnader genom direkt mikroskopisk observation och använder en lasermikrob - integrerad i mikroskopets optik - för att skära ut och skörda (fånga) vävnaden av intresse16. Begränsningar av LMD är att det inte bidrar till mycket HTP-tillvägagångssätt (även om transkriptionsprofilerna för svansspetsar, som beskrivs i detta protokoll, var robusta med ~ 70 prover), kan vissa prover vara svåra att dissekera ut och skärningar är begränsade till laserns precision och vad som kan visualiseras i mikroskopet.

Syftet med detta protokoll är att beskriva hur LMD, följt av envävnads-RNA-Seq, kan användas för att erhålla steg- och vävnadsspecifika transkriptomdata från nematoder. Specifikt demonstrerar den LMD för att isolera svansspetsar från fjärdestegslarver (L4) av C. elegans. Denna metod kan dock anpassas till andra vävnader och naturligtvis olika arter.

I C. elegans finns det 4 celler som gör svansspetsen hos både män och hermafroditer. Under L4-stadiet hos män - men inte i hermafroditer - ändrar svansspetscellerna sin form och migrerar framåt och inåt. Denna process förekommer också hos vissa men inte alla andra rabditid nematodarter. Därför är svansspetsen en bra modell för utvecklingen av sexuell dimorf morfogenes. På grund av sin position är svansspetsen också lätt att isolera med LMD.

För att erhålla transkriptomprofiler från svansspetsar använder det nuvarande protokollet CEL-Seq2, en RNA-seq-metod utvecklad för enstaka celler17,18. Denna metod har flera fördelar för LMD-härledda vävnader. CEL-Seq2 är mycket känsligt och effektivt och använder unika molekylära identifierare (UMI) för att möjliggöra enkel kvantifiering av mRNA-avläsningar, in vitro-transkription för att säkerställa linjär förstärkning och streckkodning som möjliggör multiplexering av enskilda vävnadsprover. Den enda begränsningen med CEL-Seq2 är att återvunna läsningar är partiska till 3'-änden av mRNA, och de flesta isoformer kan därför inte särskiljas.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Mask synkronisering

OBS: Två metoder beskrivs nedan för att synkronisera utvecklingen av C. elegans och andra rabditidarter.

  1. Synkronisera med första larvstadiet (L1) arrestering efter alkalisk hypoklorit (blekmedel) behandling.
    OBS: Denna metod beskrevs tidigare i detalj19. Denna metod bygger på två egenskaper hos C. elegans som också är sanna för flera andra rabditidarter: (1) Äggskalet är resistent mot blekmedel, medan nagelbandet som omger vuxna och larvmaskar inte ärdet.
    1. Behandla gravida hermafroditer (eller honor) med en utspädd blekmedelslösning för att bryta upp nagelbandet och frigöra embryon.
    2. Ta bort embryona från blekmedlet och håll dem utan mat tills alla L1 har kläckts.
    3. Placera den arresterade L1 på mat, där alla återupptar utvecklingen ungefär samtidigt.
      OBS: Utgång från L1-gripande kan ske inom en timme.
  2. Synkronisering med "hatch-off" -metoden (används här; Figur 1 överst):
    OBS: Hatch-off-metoden möjliggör tät synkronisering utan störningar i utvecklingen (L1-arrestering påverkar utvecklingen även i senare steg21). Protokollet är anpassat från Pepper et al.22. Syftet med denna metod är att samla L1 som har kläckts under en viss period från en platta som endast innehåller embryon.
    1. Välj mammor: På kvällen innan du utför luckan, plocka ~30 gravida hermafroditer på en tallrik sådd med E. coli OP50.
    2. Inkubera vid 25 °C för äggläggning över natten.
      OBS: Välj en platta utan sprickor eller bubblor där maskar kan fastna. Undvik plattor med en mycket tjock bakteriegräsmatta eftersom det blir svårt att ta bort alla maskar senare. Om du arbetar med en temperaturkänslig stam, justera äggläggningstiden för att ta hänsyn till längre embryogenes. Välj mödrar vid det maximala äggläggningsstadiet.
    3. Ta bort mödrar och larver: nästa morgon, under dissekeringsmikroskopet (20x förstoring), pipettera försiktigt 1-2 ml M9-buffert mot plattans vägg utan att spruta; virvla plattan för att lossa maskarna.
    4. Ta bort och kassera all vätska och maskar genom att placera pipettspetsen mot plattans vägg vid kanten av agar för att undvika att sticka hål. Kontrollera att inga maskar (och endast ägg/embryon) finns kvar på tallriken, särskilt inte L1s; annars upprepar du tvätten.
    5. Placera plattan vid 25 °C i 1 timme och vänta tills några L1:or kläcks.
    6. Samla nykläckta L1: släpp försiktigt 1 ml M9-buffert på agar. Virvla plattan för att lossa L1 men inte embryon. Pipettera försiktigt buffert och maskar i ett 1 ml centrifugrör.
    7. Centrifugera röret i 1 min vid ~18 000 × g. Ta bort supernatanten.
    8. Pipettera L1 direkt på bakteriegräsmattan på en sårad platta. Kontrollera under dissektionsmikroskopet att inga vuxna maskar eller embryon är närvarande.
    9. Håll maskarna vid 25 °C tills de har utvecklats till önskat stadium.
      OBS: Om förhållandena är optimala kan ytterligare två satser L1 samlas in från samma platta. Inspektera den ursprungliga plattan för att se till att ingen L1 finns. Tvätta vid behov igen. Upprepa steg 1.2.5-1.2.9.
    10. Kontrollera utvecklingstidpunkten. Innan du fortsätter till nedströmsapplikationen, inspektera några maskar under ett sammansatt mikroskop vid 400x förstoring för att bekräfta att de nådde önskat utvecklingsstadium, här L3.
      OBS: Migrationsavstånd för distala spetsceller eller länkceller kan användas som en guide, förutom vulvautveckling. För vulvautveckling ger Mock et al.23 en användbar vägledning, även om tidpunkten i den studien bestämdes vid 20 °C. Vid 25 °C kommer vildtyp C. elegans att genomgå L3-L4 molt 24 timmar efter kläckning.

2. Samla L4-män och hermafroditer och fixering

  1. Förbered RNAse-fri, kall (-20 °C), 70% metanol före fixering.
  2. Under ett dissektionsmikroskop med 30-50x förstoring börjar du plocka hanar och hermafroditer från synkroniseringsplattorna på separata osedda plattor så snart könen kan särskiljas (~ 21 h efter kläckning, figur 2) och fortsätt plocka i 1-2 timmar eller tills 200 djur samlas in.
  3. Håll maskarna vid 25 °C tills de når önskat stadium för experimentet.
  4. Tvätta maskarna från plattan med 1-2 ml M9-buffert med en pipettspets förtvättad med M9-buffert som innehåller 0,01% tvättmedel (för att förhindra att maskar fastnar i spetsen).
  5. Överför maskarna till ett 1 ml centrifugrör.
  6. Snurra i 1 min vid 21 000 × g för att pelletera maskarna. Ta bort supernatanten.
  7. Tillsätt 1 ml M9-buffert och blanda för att bryta upp pelleten.
  8. Snurra i 1 min vid 21 000 × g för att pelletera maskarna. Ta bort supernatanten.
  9. Upprepa tvätten.
  10. Tillsätt 1 ml iskall 70% metanol och blanda väl.
  11. Snurra i 1 min vid 21 000 × g för att pelletera maskarna. Ta bort supernatanten.
  12. Upprepa steg 2.10 och 2.11.
  13. Tillsätt 500 μl 70 % metanol, blanda och förvara vid 4 °C i 1 timme till över natten.

3. Lasermikrodissektion

OBS: Använd härifrån RNase-fria reagenser och förbrukningsvaror; använd filtertips.

  1. Om CEL-Seq2-metoden används för att bearbeta proverna, förbered en huvudblandning för varje CEL-Seq2-primer (tilläggstabell S1): pipett 2 μl CEL-Seq2-primer, 1 μL 10 mM dNTP och 9 μL 1% β-merkaptoetanol (i RNasfritt vatten) i ett märkt 200 μL rör.
  2. Montering på glid
    1. Under ett dissektionsmikroskop pipetterar 20 μL av de fasta maskarna (20-40 maskar från steg 2.13) på den matta sidan av en polyetennaftalat (PEN) -membranglasglas (där membranet är).
    2. Vänta tills metanolen avdunstar. Använd en glidvärmare för att påskynda avdunstningen.
      OBS: Ytterligare droppar metanol kan appliceras och en pipettspets används för att sprida ut maskarna om de börjar klumpa sig när de torkar. När maskar är i klumpar kan de vara svåra att dissekera.
  3. Ställa in mikroskopet
    OBS: Följande protokoll är specifikt för det instrument som anges i materialförteckningen. Det måste justeras om ett annat LMD-mikroskop används.
    1. Placera en luftfuktare bakom scenen på sidan av LMD-mikroskopet. Se till att ångan blåser direkt på scenen.
      OBS: Luftfuktaren är till hjälp för att minska statisk elektricitet, vilket annars kan förhindra att den lilla membransektionen faller in i rörlocket.
    2. Vrid nyckeln för laserkraft.
    3. Slå på scenkontrollen.
    4. Slå på mikroskopets kontrollbox.
    5. Öppna Laser Microdissection-programvaran .
    6. Ta bort plastskölden över scenen.
    7. Klicka på lossningsknappen med uppåtpilen för att ladda membranrutschbanorna.
    8. Se till att bilden är helt torr, vänd så att membranet är vänd nedåt.
    9. Infoga bilden och klicka på Fortsätt i fönstret ändra exempel .
    10. Byt ut plastskölden.
    11. Längst ned på skärmen väljer du vilken bildhållare som innehåller bilden.
    12. För att ladda rören, klicka på lossningsknappen med nedåtpilen.
    13. Dra ut brickan och ta bort rörblocket.
      OBS: Rörblocket som används för detta experiment är för 500 μL PCR-rör.
    14. Sätt i rörlocken på 500 μL PCR-rör i hållaren och vik röret under.
    15. Sätt tillbaka blocket i facket och skjut tillbaka brickan i mikroskopsteget.
    16. I popup-fönstret för ändringsuppsamlare väljer du PCR-rör och klickar på ok.
    17. Klicka på den tomma rörplatsen längst ned till vänster på skärmen under rörlocken för kollektorenheten.
    18. På mikroskopets kontrollpanel väljer du TL-BF för överförd ljusljusbelysning.
  4. Stickling
    OBS: Detta protokoll är specifikt för det instrument som anges i materialförteckningen.
    1. Använd 2,5x linsen och justera fokus tills maskarna och membranets struktur är synliga.
    2. Byt till 20x-objektivet.
    3. Flytta scenen till en region utan maskar. Justera fokus så att de bubbelliknande strukturerna i membranet har en gulaktig färg (figur 3A,B) för att fokusera lasern på rätt fokalplan.
    4. Ställ in laserparametrarna; för svansspetsar, börja med Power 45, bländare 30 och hastighet 20.
    5. På laserkontrollpanelen väljer du kalibrera. Följ instruktionerna.
      OBS: Instrumentet utför detta steg automatiskt. Det kommer att säkerställa att en form som ritas med musen på skärmen är identisk med den form som skärs ut av lasern.
    6. Längst ner på skärmen vid rörlock för kollektorenheten klickar du på position A.
    7. På höger sida av skärmen väljer du enkel form | Rita + klipp. Till vänster på skärmen väljer du PtoP.
    8. Rita en linje.
    9. Klicka på Start Cut så att lasern skär genom membranet.
      OBS: Det kan också etsa en linje i glaset.
    10. Om denna testskärning ser bra ut (membranet är klippt, kanterna på snittet ser släta ut), fortsätt med nästa steg. Annars justerar du fokus och klipper en annan linje.
    11. Hitta en mask. Byt till Move + Cut och använd musen för att skära genom svansen.
      OBS: Om lasern inte skär genom svansen, justera fokus och öka lasereffekten. För tjockare vävnader kan lasereffekten behöva ställas in på 60.
    12. Spara parametrarna: Fliken Arkiv | Spara applikationskonfiguration; för senare hämtning, Återställ programkonfiguration.
    13. För att samla in provet, byt till inställningen Draw + Cut med PtoP-funktionen och rita en form för att slutföra snittet av en membransektion (figur 3C).
      OBS: Större membransektioner och sektioner formade som rektanglar eller trianglar snarare än cirklar eller ovaler är lättare att hitta i kollektorrörets lock.
    14. Välj nästa rör vid Collector Device Tube Cap längst ner på skärmen och klipp av nästa svansspets.
    15. När fyra svansar har klippts lossar du rörstället (klicka på Lossa med nedåtpil) och hittar membransektionerna under ett dissekerande mikroskop (figur 3D).
      OBS: Sektionerna kan vara placerade i mitten av rörlocket eller fästa på sidan av locket.
    16. Fortsätt med det underordnade programmet. För CEL-Seq2, pipettera 1,2 μl av en CEL-Seq2 primer master mix (från steg 3.1) direkt ovanpå provet.
    17. Stäng röret, märk med primernummer och placera omedelbart rörlocket direkt på en bit torris för att blixtfrysa provet och förhindra RNA-nedbrytning.
    18. Ladda fler rör, återför rörblocket till scenen och skär fler prover. Tillsätt en annan CEL-Seq2 primerblandning till varje svansspets.
    19. Förvara alla rör vid -70 °C.

4. En-tail RNA-sekvensering med CEL-Seq2

OBS: För fullständig information om CEL-Seq2-protokollet, se Yanai och Hashimshony18.

  1. Rengör labbbänkområdet med RNase-dekontamineringslösning för att förhindra RNA-nedbrytning.
  2. Förbered masterblandningar och håll dem på is.
    1. Förbered mastermixen för omvänd transkription: 0,4 μl första strängbuffert, 0,1 μl 0,1 M DTT, 0,1 μl RNas-hämmare och 0,1 μl omvänt transkriptas per prov.
    2. Förbered den andra strängreaktionsmästarblandningen: 7 μl vatten, 2,31 μl andra strängbuffert, 0,23 μl dNTP, 0,08 μl E. coli-ligas , 0,3 μl E. coli DNA-polymeras, 0,08 μl RNaseH per prov.
  3. Bryta upp celler och glödga med primers (se kompletterande tabell S1 för hela listan över primers):
    1. Programmera termocyklern och dess lock till 65 °C.
    2. Hämta proverna från -70 °C och inkubera dem i termocyklern i 2,5 minuter.
    3. Snurra vid 21 000 × g i 30-40 s.
    4. Inkubera vid 65 °C i 2,5 min.
    5. Flytta dem omedelbart till is.
    6. Snurra på 21 000 × g i 30-40 s och återför dem till is.
  4. Konvertera RNA till cDNA:
    1. Tillsätt 0,8 μl av den omvända transkriptionsblandningen till varje svansspets.
    2. Inkubera vid 42 °C i 1 timme.
    3. Värmeinaktivera vid 70 °C i 10 min.
    4. Flytta den omedelbart till is.
    5. Tillsätt 10 μL av den andra strängblandningen till varje svansspets.
    6. Svep på exemplen.
    7. Snurra vid 21 000 × g i 30-40 s.
    8. Inkubera vid 16 °C i 2 timmar.
  5. cDNA-rensning:
    1. Förvarda DNA-saneringspärlorna till rumstemperatur.
    2. Samla upp till 40 prover i ett 1,5 ml centrifugrör (upp till 480 μl).
    3. Blanda pärlorna tills de är väl spridda och tillsätt 20 μl pärlor och 100 μl pärlbindningsbuffert för varje 100 μl av det poolade provet (för 480 μl prov tillsätt 480 μl pärlbuffert och 96 μl pärlor till en slutlig volym upp till 1,056 μl). Blanda väl genom pipettering.
    4. Inkubera vid rumstemperatur i 15 min.
    5. Placera på ett magnetiskt stativ i minst 5 minuter tills vätskan verkar klar.
    6. Ta bort och kassera alla utom 20 μl av supernatanten.
    7. Tillsätt 200 μl nyberedd 80% etanol.
    8. Inkubera i minst 30 s, ta bort supernatanten genom att pipettera av den utan att störa pärlorna. Kassera supernatanten.
    9. Upprepa steg 4.5.7 och 4.5.8 en gång.
    10. Lufttorka pärlorna i 15 min eller tills de är helt torra.
    11. Resuspend pärlorna (~ 6,4 μL) med 6,4 μL vatten. Blanda noggrant genom att pipettera hela volymen upp och ner tio gånger.
    12. Inkubera vid rumstemperatur i 2 min.
    13. Gå direkt till in vitro-transkription (IVT).
  6. In vitro-transkription och fragmentering:
    1. Till röret som innehåller 6,4 μL prov och pärlor, tillsätt följande blandning (totalt 9,6 μL): 1,6 μL 10x T7-buffert, 1,6 μl ATP, 1,6 μL UTP, 1,6 μL CTP och 1,6 μL GTP (varje dNTP vid 75 mM-koncentration) 1,6 μLof T7-enzym.
    2. Inkubera i 13 timmar vid 37 °C med ett 4 °C-grepp.
    3. Tillsätt 6 μl exonukleaslösning (slutvolymen ska vara 22 μl).
    4. Inkubera i 15 min vid 37 °C.
    5. Lägg tillbaka röret på is och tillsätt 5,5 μl fragmenteringsbuffert (0,25 × reaktionsvolym).
    6. Inkubera i 3 min vid 94 °C.
    7. Flytta omedelbart röret till is och tillsätt 2,75 μL fragmenteringsstoppbuffert (0,5 × volym fragmenteringsbuffert tillsatt).
    8. Ta bort pärlorna genom att placera röret på magnetstativet i minst 5 minuter tills vätskan verkar klar.
    9. Överför supernatanten till ett nytt rör.
  7. Förstärkt RNA (aRNA) sanering:
    1. Förvarda RNA-saneringspärlorna till rumstemperatur.
    2. Blanda pärlorna tills de är väl spridda.
    3. Pipettera 55 μl pärlor (1,8 × reaktionsvolym).
    4. Inkubera dem vid rumstemperatur i 10 min.
    5. Placera röret på magnetstativet i minst 5 minuter tills vätskan verkar klar.
    6. Ta bort och kassera 80 μl av supernatanten.
    7. Tillsätt 200 μl nyberedd 70% etanol.
    8. Inkubera i minst 30 s, ta bort supernatanten genom att pipettera utan att störa pärlorna. Kassera supernatanten.
    9. Upprepa etanoltvätten två gånger till.
    10. Lufttorka pärlorna i 15 min eller tills de är helt torra.
    11. Resuspendera pärlorna med 7 μL vatten. Pipettera hela volymen upp och ner 10 gånger för att blanda noggrant.
    12. Inkubera vid rumstemperatur i 2 min.
    13. Placera röret med pärlorna på magnetstativet i 5 minuter tills vätskan verkar klar.
    14. Överför supernatanten till ett nytt rör.
      OBS: Stopppunkt: proverna kan förvaras vid -70 °C.
  8. Valfritt: Kontrollera aRNA-mängden och kvaliteten med ett automatiserat elektroforessystem enligt tillverkarens protokoll.
  9. Förberedelse av biblioteket:
    1. Till 5 μL RNA, tillsätt 1 μL 100 μM slumpmässig hexamer RT-primer (se materialtabellen) och 0,5 μL 10 mM dNTP.
    2. Inkubera vid 65 °C i 5 min.
    3. Tillsätt 4 μL av följande blandning vid rumstemperatur: 2 μl First Strand-buffert, 1 μL 0,1 M DDT, 0,5 μL RNas-hämmare, 0,5 μL omvänt transkriptas.
    4. Inkubera vid 25 °C i 10 min.
    5. Inkubera vid 42 °C i 1 timme (i en hybridiseringsugn eller en förvärmd termisk cykler med locket inställt på 50 °C).
    6. Inkubera vid 70 °C i 10 min.
    7. Överför 5 μl till ett nytt rör (håll resten av reaktionen vid -20 °C). Tillsätt 5,5 μl ultrarent vatten, 1 μl RNA PCR Primer (RP1), 1 μL indexerad RNA PCR Primer (RPIX) och 12,5 μL PCR-blandning.
    8. Använd följande program på termocyklern: 30 s vid 98 °C, 11 cykler av: (10 s vid 98 °C, 30 s vid 60 °C, 30 s vid 72 °C), 10 min vid 72 °C, håll vid 4 °C.
      OBS: Stopppunkt: proverna kan förvaras vid -20 °C.
  10. Rensning av bibliotek:
    1. Förvarda DNA-saneringspärlorna till rumstemperatur.
    2. Blanda pärlorna tills de är väl spridda.
    3. Tillsätt 25 μL av pärlorna till PCR-reaktionen. Blanda väl genom pipettering.
    4. Inkubera vid rumstemperatur i 15 min.
    5. Placera röret på magnetstativet i minst 5 minuter tills vätskan verkar klar.
    6. Ta bort och kassera 45 μl av supernatanten.
    7. Tillsätt 200 μl nyberedd 80% etanol.
    8. Inkubera i minst 30 s, ta bort och kassera supernatanten utan att störa pärlorna.
    9. Upprepa etanoltvätten en gång.
    10. Lufttorka pärlor i 15 min eller tills de är helt torra.
    11. Resuspendera dem med 25 μL vatten. Blanda väl genom pipettering.
    12. Inkubera vid rumstemperatur i 2 min.
    13. Placera röret på magnetstativet i 5 minuter tills vätskan verkar klar.
    14. Överför 25 μL supernatant till ett nytt rör.
    15. Upprepa steg 4.10.2-4.10.10 en gång.
    16. Återsuspendera med 10,5 μL vatten. Blanda väl genom pipettering.
    17. Inkubera vid rumstemperatur i 2 min.
    18. Placera röret på magnetstativet i 5 minuter tills vätskan verkar klar.
    19. Överför 10 μL av supernatanten till ett nytt rör och förvara vid -20 °C.
  11. Bedöm bibliotekets kvalitet och kvantitet enligt kravet på sekvenseringsanläggningen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Efter laserfångande mikrodissektion, individuella svansspetsar på hanar och hermafroditer vid 4 tidpunkter (L3 22 h efter kläckning; L4 24, 26 och 28 h efter lucka) förbereddes för RNA-sekvensering med CEL-Seq2-protokollet. CEL-Seq2-primers innehåller unika streckkoder som gör det möjligt att identifiera sekvenseringsavläsningar från ett visst prov (i detta fall en individuell svansspets) bioinformatiskt. Sekvenseringsdata genererades med denna metod för totalt 557 svansspetsar (266 hermafroditer och 291 män över 4 utvecklingstidpunkter, 59-78 svansar per kön och tidpunkt). CEL-Seq2 streckkoder återfanns för 97% (dvs. 543) av dessa svansspetsar (kompletterande tabell S2). För de flesta bibliotek var återvinningsgraden 99-100%; det var dock 88% för en manlig tidpunkt. Det är värt att notera att ungefär hälften av de manliga svansspetsarna från 22, 24 och 28 timmars tidpunkter lagrades vid -80 ° C i ~ 4 månader på grund av COVID-19-relaterade förseningar. Detta visar att även om det är idealiskt att förbereda sekvenseringsbibliotek strax efter provtagning, är det möjligt att lagra dissekerade prover under en längre tid innan biblioteket förbereds.

CEL-Seq2-primrarna lägger också till en UMI till varje mRNA-transkript. Detta möjliggör borttagning av PCR-dubbletter och exakt kvantifiering av genuttryck i provet. Antalet UU varierade dramatiskt över svansspetsarna (figur 4; manligt medelvärde = 92 560; manlig min. = 155; manligt max. = 1 183 998; hermafroditer medelvärde = 67 597; hermafroditer min. = 132; hermafroditer max. = 630 427). För UMI-antal per svansspets, se kompletterande tabell S3. På grund av den låga mängden ingångs-RNA för förberedelse av encellsbibliotek är encellssekvenseringsdata kända för att ha en stor mängd tekniskt brus. Därför rekommenderas att filtrera prover som har mycket låga eller mycket höga UMI-värden före analys24.

R-paketet powsimR25 användes för att bedöma de statistiska kraft- och provstorlekskraven för att på ett tillförlitligt sätt detektera differentiellt uttryckta (DE) gener i encells- eller bulk-RNA-seq-experiment. Parametrar för simuleringarna baserades på ett sekvenseringsdataset med 70 individuella manliga svansspetsar (vid 24-timmars tidpunkt) erhållna med den metod som beskrivs här. Förväntade log-fold-förändringar baserades på resultat från ett separat RNA-seq-experiment som samlade 80-100 svansspetsar. Simuleringarna bestämde att data med en svansspets har tillräcklig effekt (True Positive Rate = TPR) för att detektera DE-gener, förutom gener som har ett mycket lågt medeluttrycksvärde (överst i figur 5; streckad linje representerar 80% TPR). Att lägga till fler simulerade svansspetsar per tidpunkt ökade effekten något för lågt uttryckta gener. Ett liknande mönster visas för False Discovery Rate (FDR). FDR är hög (>0,10) för de lågt uttryckta generna; För mer högt uttryckta gener faller den dock vid eller under den nominella 0,10 cutoffen (streckad linje för FDR längst ner i figur 5). Sammanfattningsvis skulle en ökning av antalet svansar som provtas per tidpunkt över 70 göra lite för att sänka FDR eller öka effekten. 70 svansspetsar ger dock en mycket lägre FDR och starkare effekt än 30 svansspetsar.

Figure 1
Figur 1: Proceduröversikt för synkronisering av Caenorhabditis elegans med avluckningsmetoden och lasermikrodissektion av svansspetsar. Förkortningar: L1-L4 = larvstadier 1 till 4; PEN = polyetennaftalat; LMD = lasermikrodissektion. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Utseende av C. elegans L3 hermafroditer och hanar under ett dissektionsmikroskop. Hermafroditer (A, B) och hanar (C, D) vid 21-23 h efter kläckning kan särskiljas under ett dissektionsmikroskop (~ 50x förstoring) genom morfologin hos deras svansar (pilar). Hermafroditers svans är smal, medan den hos män är svullen och verkar klar. Skalstreck = 0,1 mm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Utseende av PEN-membranglidstrukturen och masksvansen. Fokus är korrekt för dissektion av vävnaden sett med 20x (A) och 40x (B) linsen vid mikroskopet. (C) Dissekerad svans och delvis utskuren PEN-membran. Efter att ha stängt gapet i snittet kommer membranstycket att falla in i rörlocket under bilden. (D) Rörlock med en PEN-membransektion som innehåller en dissekerad svansspets. Skalstänger = 0,1 mm (A-C), 1 mm (D). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Naturligt logtransformerat UMI-antal per enskild svansspets för olika tidpunkter och kön. RNA från enskilda svansar framställdes för sekvensering med cel-seq2-metoden; Totalt sekvenserades 557 svansar, med 59-78 svansar per kön och tidpunkt. Extremt låga och höga UMI-extremvärden skulle tas bort från data före analys. Förkortning: UMI = unik molekylär identifierare. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: Resultat av en effektanalys i efterhand med hjälp av simuleringar med powsimR. PowsimR-programvaran bestämmer antalet oberoende prover som krävs för att detektera DE-gener på olika uttrycksnivåer. Gener binneras med medeluttryck som omvandlas som den naturliga loggen av UMI-räkningar. (A) Kraft (TPR) för att detektera DE-gener mellan två tillstånd (här, manlig vs hermafrodit) för fyra olika simuleringar (olikfärgade grafer) som innehåller olika provstorlekar (antal individuella svansspetsar) per tillstånd. Streckad linje indikerar 80% TPR. (B) FDR i samma fyra simuleringar som i (A), streckad linje som indikerar 10% FDR. Graferna visar att en provstorlek på 70 svansspetsar (grön) per tillstånd är tillräcklig för att detektera DE-gener, förutom gener med mycket låga uttrycksnivåer. Det vill säga kraften och den falska upptäcktshastigheten för sådana gener kan inte förbättras avsevärt genom att öka provstorleken bortom 70. Förkortningar: DE = differentiellt uttryckt; UMI = unik molekylär identifierare; TPR = sann positiv ränta; FDR = falsk upptäcktshastighet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Kompletterande tabell S1: Sekvenser av primers som används i CEL-Seq2-protokollet. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande tabell S2: Provtagna kontra återvunna individuella svansspetsar. CEL-Seq2-primers innehåller unika streckkoder som gör det möjligt att identifiera sekvenseringsläsningar från varje prov som ska identifieras bioinformatiskt. Avläsningar återfanns från 97% av svansspetsproverna som förberetts för sekvensering. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande tabell S3: UMI-antal av alla prover med återvunna streckkoder, enligt vad som anges i kompletterande tabell S2. Förkortning: UMI = unik molekylär identifierare. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kritiska steg i metoden
Om den utförs korrekt kommer metoden som beskrivs här att erhålla robusta RNA-profiler med ett relativt litet antal laserdissekerade prover (70 svansspetsar i detta exempel). För prover från utvecklande djur är dock tät synkronisering avgörande för att minska variationen mellan proverna. Av denna anledning rekommenderar protokollet hatch-off-metoden för masksynkronisering. Här kan forskaren bestämma och exakt kontrollera åldersskillnaden mellan individer (1 h i detta protokoll). Dessutom är hatch-off-metoden tillämplig på alla arter, även om embryona är känsliga för blekmedel, L1 arresteras inte eller återhämtning från L1-arrestering är variabel. För en lyckad synkronisering genom avluckning är tvättstegen avgörande: alla vuxna och larver måste tas bort i början av kläckningsperioden, och inga embryon ska tvättas bort tillsammans med den nykläckta L1 i slutet av kläckningsperioden. Detta lyckas bara om plattans agaryta är oskadad av sprickor, hål eller bubblor, bakteriegräsmattan på plattan är färsk och inte för tjock, och vätskan tillsätts och omrörs endast mycket försiktigt.

Om data ska erhållas separat för hanar och hermafroditer/honor är det också viktigt att identifiera könen på ett tillförlitligt sätt. Att skilja L3-larver efter kön (se figur 2) kräver erfarenhet. Det rekommenderas att öva på att välja L3-hanar och hermafroditer/honor och kontrollera framgångsgraden efter att djuren har utvecklats till vuxna och könen lätt kan urskiljas. Efter envävnads-RNA-Seq kan extremvärdena också identifieras genom huvudkomponentanalys och vid behov avlägsnas.

För framgångsrik återvinning av laserskurna prover är det viktigt att minska statisk elektricitet så mycket som möjligt. Laddade PEN-membranbitar faller ofta inte ner i rörlocket utan fastnar på bilden eller någon annan del av mikroskopet. Ett botemedel är att höja luftfuktigheten i rummet och specifikt runt mikroskopet genom att placera en liten luftfuktare bredvid scenen. Dessutom kan membranglasen behandlas med UV-ljus. För att göra detta, inkubera diabilder i en UV-C (254 nm) tvärbindningskammare och leverera minst 1 joule energi, eller utsätt bilderna för UV-ljuset i en laminär luftflödesbänk i 30 minuter.

Eftersom målet med protokollet är RNA-Seq är det viktigt att hålla en RNase-fri arbetsmiljö. Från och med fixeringslösningen bör reagenser, behållare och förbrukningsvaror vara RNas-fria, arbetsytan ska dekontamineras och forskarna ska bära rena handskar. De dissekerade proverna bör frysas så snart som möjligt och förvaras vid -70 °C tills vidare bearbetning. Det rekommenderas också att använda lågretentionsrör och tips för CEL-Seq2-delen av protokollet.

Den här artikeln ger endast en grundläggande översikt över CEL-Seq2-protokollet, som tidigare publicerades av dess utvecklare med användbara anteckningar och tips17,18. Det rekommenderas att dessa publikationer konsulteras innan CEL-Seq2-metoden används.

LMD-RNA-Seq-data kan valideras genom enmolekyl-RNA fluorescerande in-situ hybridisering (smRNA FISH)26,27,28. smRNA FISH har använts i stor utsträckning i C. elegans och är mottaglig för andra nematodarter, som skiljer sig från immunfärgning med befintliga antikroppar (som kanske inte korsreagerar) eller införandet av transkriptionella reportrar genom transgenes. Den senare fungerar bra i C. elegans och vissa besläktade Caenorhabditis-arter 29, men transgenes kan vara mer utmanande hos andra nematodarter30,31.

Metodens begränsningar
Metoden som beskrivs här fungerar mycket bra för att samla svansspetsar, en tunn vävnad i slutet av en mask. Att dissekera vävnader i den tjockare mitten av äldre larver eller vuxna är mer utmanande. Programvaran för instrumentet som används här inkluderar en inställning för flera snitt placerade på senare djupare nivåer i vävnaden. Denna inställning kan användas för att skära tjockare områden av djuret. Eftersom maskarna måste fixas före dissektion är strukturella detaljer svåra att se, vilket förhindrar exakt dissektion av specifika små strukturer. Som nämnts ovan är LMD-RNA-Seq inte en HTP-metod. 50-70 prover kan dock dissekeras på en eftermiddag.

Metodens betydelse i förhållande till befintliga/alternativa metoder
LMD-RNA-Seq kan användas i alla arter även om inga transgena verktyg finns tillgängliga. Andra metoder bygger på FACS-sortering av fluorescerande märkta celler 8,9,32 eller isolering av märkta kärnor33,34 och kräver därför transgena djur. Metoder som dissocierar och isolerar celler i postembryonic C. elegans tenderar att missa vävnaderna i maskens två ändar (Dylan Rahe, personlig kommunikation). Dessa försiktighetsåtgärder övervinns genom att kombinera encelligt RNA-Seq med kryosektion av hela maskar (RNA-tomografi)35. Denna metod användes för att jämföra rumsligt genuttryck mellan C. elegans och en annan rabditid nematod, Pristionchus pacificus36. Alternativt kan man experimentera med formalinfixerade paraffininbäddade (FFPE) maskar. Sådant material har framgångsrikt använts för RNA-Seq efter LMD av däggdjursvävnadsprover37. RNA-tomografi och LMD av FFPE-maskar är dock begränsade till analys av endast en handfull djur. De är därför inte lika väl lämpade för studier av dynamiskt genuttryck i utvecklande vävnader som LMD-RNA-Seq.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Alla författare förklarar att de inte har några intressekonflikter.

Acknowledgments

Detta arbete finansierades av NIH (R01GM141395) och NSF (1656736) bidrag till DF och NIH-stipendium (F32GM136170) till AW. Figur 1 skapades med hjälp av BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
 0.5 µM PEN membrane glass slides RNase free Leica 11600288 for LMD
500 µL PCR tubes (nuclease-free) Axygen 732-0675 to cut the tail tips into
Compound microscope with 40x objective and DIC any to check age of worms
Desktop humidifier any
Dissection microscope with transmitted light base any for all worm work
glass pasteur pipets any handle of worm pick
glass slides and coverslips any to check age of worms
LMD6 microdissection system Leica multiple to cut tail tips
LoBind tubes 0.5 mL Eppendorf 22431005
M9 Buffer Recipe in WormBook
Methanol 99.8% Sigma 322415 to fix worms
NGM growth medium US Biological N1000 Buffers and salts need to be added: Recipe in WormBook
P10 pipette variablle volume e.g. Gilson
P1000 pipette variable volume e.g. Gilson
P2 pipette variable volume e.g. Gilson
Pipette tips 1,000 µL any
Pipette tips 1-10 µL filtered any
platinum iridium wire Tritech PT-9010 to make worm pick
sterile and nuclease-free 1 mL centrfuge tubes any
Tween 20 Sigma P9416 Add a very small amount to M9 buffer to prevent worms from sticking to the pipet tips
vented 6 mm plastic Petri dishes any
For CEL-Seq2
4200 TapeStation System with reagents for high-sensitivity RNA and DNA detection Aligent automated electrophoresis system
AMPure XP beads Beckman Coulter A63880 DNA cleanup beads
Bead binding buffer  20% PEG8000, 2.5 M NaCl
CEL-Seq2 primers (see Table S1) Sigma Genosys Mastercycler Nexus GX2 Eppendorf 6335000020 Thermal cycler with programmable lid and block for 200 µl tubes.
DNA Polymerase I (E. coli) Invitrogen 18052-025
dNTP mix 10 mM any
E. coli DNA ligase Invitrogen 18052-019
Ethanol
ExoSAP-IT For PCR Product Clean-Up Affymetrix 78200 exonuclease solution
MEGAscript T7 Transcription Kit Ambion AM1334 For step 4.6.1
Nuclease-free water any
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer NEB M0531 PCR mix step 4.9.7
random hexamer RT primer GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA
NNNNNN		 IDT a primer with 6 nucleotides that are random
RNA Fragmentation buffer NEB E6150S
RNA Fragmentation stop buffer NEB E6150S
RNA PCR Index Primers (RPI1–RPI48) Illumina, NEB, or IDT RPIX in protocol step 4.9.7, sequences available from Illumina
RNAClean XP beads Beckman Coulter A63987
RNase AWAY Surface Decontaminant Thermo Scientific 7000TS1 or any other similar product
RNaseH (E. coli) Invitrogen 18021-071
RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor Invitrogen 10777-019
Second strand buffer Invitrogen 10812-014
Superscripit II Invitrogen 18064-014 reverse transcriptase

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Haag, E. S., Fitch, D. H. A., Delattre, M. From "the worm" to "the worms" and back again: the evolutionary developmental biology of nematodes. Genetics. 210 (2), 397-433 (2018).
  2. Sommer, R. J., Bumbarger, D. J. Nematode model systems in evolution and development. Wiley Interdisciplinary Reviews: Developmental Biology. 1 (3), 389-400 (2012).
  3. WormBase. , Available from: https://wormbase.org/#012-3-6 (2022).
  4. WormAtlas. , Available from: https://wormatlas.org (2022).
  5. WormBook. , Available from: http://wormbook.org (2022).
  6. WormBook in Genetics. , Available from: https://academic.oup.com/genetics/pages/wormbook (2022).
  7. Cao, J., et al. Comprehensive single-cell transcriptional profiling of a multicellular organism. Science. 357 (6352), 661-667 (2017).
  8. Kaletsky, R., Murphy, C. T. Transcriptional profiling of C. elegans adult cells and tissues with age. Methods in Molecular Biology. 2144, 177-186 (2020).
  9. Kaletsky, R., et al. Transcriptome analysis of adult Caenorhabditis elegans cells reveals tissue-specific gene and isoform expression. PLoS Genetics. 14 (8), 1007559 (2018).
  10. Packer, J. S., et al. A lineage-resolved molecular atlas of C. elegans embryogenesis at single-cell resolution. Science. 365 (6459), 1971 (2019).
  11. Kulkarni, A., Anderson, A. G., Merullo, D. P., Konopka, G. Beyond bulk: a review of single cell transcriptomics methodologies and applications. Current Opinion in Biotechnology. 58, 129-136 (2019).
  12. Von Stetina, S. E., et al. Cell-specific microarray profiling experiments reveal a comprehensive picture of gene expression in the C. elegans nervous system. Genome Biology. 8 (7), 135 (2007).
  13. Baugh, L. R., et al. The homeodomain protein PAL-1 specifies a lineage-specific regulatory network in the C. elegans embryo. Development. 132 (8), 1843-1854 (2005).
  14. Haenni, S., et al. Analysis of C. elegans intestinal gene expression and polyadenylation by fluorescence-activated nuclei sorting and 3'-end-seq. Nucleic Acids Research. 40 (13), 6304-6318 (2012).
  15. Zhang, S., Banerjee, D., Kuhn, J. R. Isolation and culture of larval cells from C. elegans. PLoS One. 6 (4), 19505 (2011).
  16. Emmert-Buck, M. R., et al. Laser capture microdissection. Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).
  17. Hashimshony, T., et al. CEL-Seq2: sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq. Genome Biology. 17, 77 (2016).
  18. Yanai, I., Hashimshony, T. CEL-Seq2-single-cell RNA sequencing by multiplexed linear amplification. Methods in Molecular Biology. 1979, 45-56 (2019).
  19. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e4019 (2012).
  20. Baugh, L. R. To grow or not to grow: nutritional control of development during Caenorhabditis elegans L1 arrest. Genetics. 194 (3), 539-555 (2013).
  21. Baugh, L. R., Hu, P. J. Starvation responses throughout the Caenorhabditis elegans life cycle. Genetics. 216 (4), 837-878 (2020).
  22. Pepper, A. S., Killian, D. J., Hubbard, E. J. Genetic analysis of Caenorhabditis elegans glp-1 mutants suggests receptor interaction or competition. Genetics. 163 (1), 115-132 (2003).
  23. Mok, D. Z., Sternberg, P. W., Inoue, T. Morphologically defined sub-stages of C. elegans vulval development in the fourth larval stage. BMC Developmental Biology. 15, 26 (2015).
  24. Lytal, N., Ran, D., An, L. Normalization methods on single-cell RNA-seq data: an empirical survey. Frontiers in Genetics. 11, 41 (2020).
  25. Vieth, B., Ziegenhain, C., Parekh, S., Enard, W., Hellmann, I. powsimR: power analysis for bulk and single cell RNA-seq experiments. Bioinformatics. 33 (21), 3486-3488 (2017).
  26. Bolkova, J., Lanctot, C. Quantitative gene expression analysis in Caenorhabditis elegans using single molecule RNA FISH. Methods. 98, 42-49 (2016).
  27. Ji, N., van Oudenaarden, A. Single molecule fluorescent in situ hybridization (smFISH) of C. elegans worms and embryos. WormBook. , 1-16 (2012).
  28. Lee, C., et al. Single-molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smFISH) in Caenorhabditis elegans. Bio-Protocol. 7 (12), 2357 (2017).
  29. Baird, S. E., Chamberlin, H. M. Caenorhabditis briggsae methods. WormBook. , 1-9 (2006).
  30. Felix, M. A. Oscheius tipulae. WormBook. , 1-8 (2006).
  31. Han, Z., et al. Improving transgenesis efficiency and CRISPR-associated tools through codon optimization and native intron addition in Pristionchus nematodes. Genetics. 216 (4), 947-956 (2020).
  32. Fernandes Povoa, E. E., Ebbing, A. L. P., Betist, M. C., vander Veen, C., Korswagen, H. C. An optimized dissociation protocol for FACS-based isolation of rare cell types from Caenorhabditis elegans L1 larvae. MethodsX. 7, 100922 (2020).
  33. Han, M., Wei, G., McManus, C. E., Hillier, L. W., Reinke, V. Isolated C. elegans germ nuclei exhibit distinct genomic profiles of histone modification and gene expression. BMC Genomics. 20 (1), 500 (2019).
  34. Steiner, F. A., Henikoff, S. Cell type-specific affinity purification of nuclei for chromatin profiling in whole animals. Methods in Molecular Biology. 1228, 3-14 (2015).
  35. Ebbing, A. Spatial transcriptomics of C. elegans males and hermaphrodites identifies sex-specific differences in gene expression patterns. Developmental Cell. 47 (6), 801-813 (2018).
  36. Rödelsperger, C., et al. Spatial transcriptomics of nematodes identifies sperm cells as a source of genomic novelty and rapid evolution. Molecular Biology and Evolution. 38 (1), 229-243 (2021).
  37. Amini, P., et al. An optimised protocol for isolation of RNA from small sections of laser-capture microdissected FFPE tissue amenable for next-generation sequencing. BMC Molecular Biology. 18 (1), 22 (2017).

Tags

Biologi utgåva 181
Lasermikrodissektion för artagnostiska envävnadsapplikationer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Woronik, A., Kiontke, K., Jallad, R. … More

Woronik, A., Kiontke, K., Jallad, R. S., Herrera, R. A., Fitch, D. H. A. Laser Microdissection for Species-Agnostic Single-Tissue Applications. J. Vis. Exp. (181), e63666, doi:10.3791/63666 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter