Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Lasermikrodesisseksjon for artsagnostiske enkeltvevsapplikasjoner

Published: March 31, 2022 doi: 10.3791/63666
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 3, 1
1Center for Developmental Genetics, New York University, 2Sacred Heart University, 3Baylor School

Summary

En protokoll er beskrevet som bruker lasermikrodisseksjon for å isolere individuelle nematodevev for RNA-sekvensering. Protokollen krever ikke artsspesifikke genetiske verktøysett, slik at genuttrykksprofiler kan sammenlignes mellom ulike arter på nivået av enkeltvevsprøver.

Abstract

Encellede metoder har revolusjonert analysen av transkripsjonen av bestemte celletyper. Imidlertid krever de ofte artsspesifikke genetiske "verktøysett", for eksempel promotører som driver vevsspesifikk uttrykk for fluorescerende proteiner. Videre fjerner protokoller som forstyrrer vev for å isolere individuelle celler celler fra sitt opprinnelige miljø (f.eks. signalering fra naboer) og kan føre til stressresponser eller andre forskjeller fra innfødte genuttrykkstilstander. I den nåværende protokollen er lasermikrodisseksjon (LMD) optimalisert for å isolere individuelle nematodehalespisser for studiet av genuttrykk under mannlig halespissmorfogenese.

LMD tillater isolering av en del av dyret uten behov for cellulære forstyrrelser eller artsspesifikke verktøysett og gjelder dermed for alle arter. Deretter kan encellede RNA-seq bibliotekforberedelsesprotokoller som CEL-Seq2 brukes på LMD-isolerte enkeltvev og analyseres ved hjelp av standard rørledninger, gitt at et godt kommentert genom eller transkripsjon er tilgjengelig for arten. Slike data kan brukes til å fastslå hvor konservert eller forskjellig transkripsjonen er som ligger til grunn for utviklingen av vevet i forskjellige arter.

Begrensninger inkluderer evnen til å kutte ut vevet av interesse og prøvestørrelsen. En kraftanalyse viser at så få som 70 halespisser per tilstand kreves for 80% strøm. Tett synkronisering av utvikling er nødvendig for å oppnå dette antall dyr på samme utviklingsstadium. Dermed er en metode for å synkronisere dyr med 1 t intervaller også beskrevet.

Introduction

Nematoder – spesielt rabditid nematoder relatert til modellsystemet Caenorhabditis elegans – er en fantastisk gruppe dyr for evolusjonær utviklingsbiologi (EDB) av mange grunner 1,2. Fordelene inkluderer deres lille antall celler, definerte og konsekvente cellelinjer, gjennomsiktighet og enkel kultur og husdyrhold. Det er også mange ressurser tilgjengelig, inkludert genomer av høy kvalitet for flere arter, og for C. elegans, omfattende molekylære genetiske verktøy og kunnskap om utvikling, genetikk, anatomi og fysiologi 3,4,5,6.

Som med mange andre organismer har evnen til å karakterisere transkripsjonsdynamikk i enkeltvev eller enkeltceller revolusjonert analysen av utvikling i C. elegans 7,8,9,10. Å kunne sammenligne encellede transkripsjoner på tvers av nematoder ville på samme måte transformere EDB ved hjelp av disse organismene. Slike sammenligninger vil for eksempel gi innsikt i hvordan genregulatoriske nettverk har utviklet seg for tegn (egenskaper) som har blitt bevart, for tegn som har divergert, eller for tegn som utviklet seg uavhengig.

Å isolere bestemte vev eller celler fra nematoder er imidlertid en av de store utfordringene. For mange organismer kan enkeltceller dissosieres fra vev og høstes på en objektiv måte eller kan merkes med vevsspesifikk uttrykk for et fluorescerende protein og sorteres etter fluorescensaktivert cellesortering (FACS)11. I C. elegans har høy gjennomstrømning (HTP) isolasjon av celler vært begrenset hovedsakelig til embryoer fordi den tøffe ytre kutiklen (og hydrostatisk skjelett) har hemmet celleisolasjon fra larver og voksne. For å komme seg rundt denne utfordringen har noen metoder brukt genetiske verktøy i hele C. elegans ormer, for eksempel vevsspesifikk mRNA-merking12, og differensialuttrykkssammenligninger mellom wild-type og mutanter som påvirker en celletype13. Nyere metoder har overvunnet utfordringen ved å oppløse kutikalen for å isolere kjerner14 eller hele celler 8,9,15. Celleisolasjon og cellekultur har imidlertid de åpenbare ulempene at celler fjernes fra sin naturlige utviklingsmessige eller anatomiske kontekst – for eksempel vekk fra cellecellesignalering og kontakt med den ekstracellulære matrisen – som forventes å påvirke genuttrykksprofilen15. Videre er de genetiske verktøyene og vevsspesifikke markører artsspesifikke (dvs. de kan bare brukes i C. elegans).

LMD gir en alternativ metode for å isolere vev uten å forstyrre den naturlige konteksten av celler. Betydelig for EDB tillater LMD også transkripsjoner fra homologe vev av forskjellige arter som skal sammenlignes uten behov for artsspesifikke genetiske verktøysett hvis genom eller hele transkripsjonssekvenser av disse artene er tilgjengelige. LMD innebærer å målrette vev ved direkte mikroskopisk observasjon og bruke en lasermikrostråle – integrert i mikroskopets optikk – for å kutte ut og høste (fange) vevet av interesse16. Begrensninger ved LMD er at det ikke bidrar til svært HTP-tilnærminger (selv om transkripsjonsprofilene for halespisser, som beskrevet i denne protokollen, var robuste med ~ 70 prøver), kan visse prøver være vanskelige å dissekere ut, og kutt er begrenset til laserens presisjon og hva som kan visualiseres i mikroskopet.

Formålet med den nåværende protokollen er å beskrive hvordan LMD, etterfulgt av enkeltvevs RNA-Seq, kan brukes til å innhente scene- og vevsspesifikke transkripsjonsdata fra nematoder. Spesielt demonstrerer det LMD for å isolere halespisser fra fjerdetrinns larver (L4) av C. elegans. Denne metoden kan imidlertid tilpasses andre vev og selvfølgelig forskjellige arter.

I C. elegans er det 4 celler som gjør halespissen hos både menn og hermafroditter. I løpet av L4-fasen hos menn – men ikke i hermafroditter – endrer halespisscellene formen og migrerer fremre og innover. Denne prosessen forekommer også hos noen, men ikke alle andre rhabditid nematodearter. Derfor er halespissen en god modell for utviklingen av seksuell dimorfisk morfogenese. På grunn av sin posisjon er halespissen også lett å isolere av LMD.

For å få transkripsjonsprofiler fra halespisser bruker den nåværende protokollen CEL-Seq2, en RNA-seq-metode utviklet for enkeltceller17,18. Denne metoden har flere fordeler for LMD-avledet vev. CEL-Seq2 er svært følsom og effektiv, ved hjelp av unike molekylære identifikatorer (UMIer) for å tillate enkel kvantifisering av mRNA-lesing, in vitro transkripsjon for å sikre lineær forsterkning og barkoding som tillater multipleksing av individuelle vevsprøver. Den eneste begrensningen av CEL-Seq2 er at gjenvunnet lesing er partisk til 3 'slutten av mRNAer, og de fleste isoformer dermed ikke kan skille seg ut.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Synkronisering av ormer

MERK: To metoder er beskrevet nedenfor for å synkronisere utviklingen av C. elegans og andre rabditidarter.

  1. Synkroniser ved første larval stadium (L1) arrestasjon etter alkalisk hypokloritt (blekemiddel) behandling.
    MERK: Denne metoden ble beskrevet tidligere i detalj19. Denne metoden er avhengig av to egenskaper ved C. elegans som også gjelder for flere andre rhabditidarter: (1) Eggeskallet er motstandsdyktig mot blekemiddel, mens kutiklet rundt voksen og larval ormer ikke er det. (2) Førstetrinns larver arresterer utvikling når de holdes uten mat20.
    1. Behandle gravid hermafroditter (eller kvinner) med en fortynnet blekemiddelløsning for å bryte opp kutiklet og frigjøre embryoer.
    2. Fjern embryoene fra blekemiddelet og hold dem uten mat til alle L1 har klekket ut.
    3. Plasser den arresterte L1 på mat, hvor alle gjenopptar utviklingen på omtrent samme tid.
      MERK: Utgang fra L1 arrestasjon kan forekomme innen en time.
  2. Synkronisering med "hatch-off"-metoden (brukes her; Figur 1 øverst):
    MERK: Hatch-off-metoden muliggjør tett synkronisering uten utviklingsforstyrrelser (L1-arrestasjon påvirker utviklingen selv i senere faser21). Protokollen er tilpasset fra Pepper et al.22. Målet med denne metoden er å samle L1 som har klekket over en bestemt periode fra en plate som bare inneholder embryoer.
    1. Velg mødre: På kvelden før du utfører hatch-off, plukke ~ 30 gravid hermafroditter på en tallerken frø med E. coli OP50.
    2. Inkuber ved 25 °C for egglegging over natten.
      MERK: Velg en plate uten sprekker eller bobler der ormer kan sette seg fast. Unngå plater med en veldig tykk bakteriell plen, da det vil være vanskelig å fjerne alle ormer senere. Hvis du arbeider med en temperaturfølsom belastning, juster eggleggingstiden for å ta hensyn til lengre embryogenese. Velg mødre på det maksimale eggleggingsstadiet.
    3. Fjern mødre og larver: neste morgen, under dissekering av mikroskop (20x forstørrelse), forsiktig pipette 1-2 ml M9 buffer mot platens vegg uten å sprute; virvle platen for å løsne ormene.
    4. Fjern og kast all væske og ormer ved å plassere pipettespissen mot platens vegg på kanten av agaren for å unngå å stikke hull. Kontroller at ingen ormer (og bare egg/embryoer) er igjen på tallerkenen, spesielt ikke L1s; Ellers gjentar du vasken.
    5. Plasser platen ved 25 °C i 1 time og vent til noen L1-er klekkes.
    6. Samle nyutviklede L1-er: Slipp forsiktig 1 ml M9-buffer på agaren. Virvle platen for å løsne L1, men ikke embryoer. Pipettebuffer og ormer forsiktig inn i et 1 ml sentrifugerør.
    7. Sentrifuger røret i 1 min ved ~ 18.000 × g. Fjern supernatanten.
    8. Pipette L1 direkte på bakteriell plen av en frøplate. Kontroller under disseksjonsmikroskopet at ingen voksne ormer eller embryoer er til stede.
    9. Hold ormer ved 25 °C til de har utviklet seg til ønsket stadium.
      MERK: Hvis forholdene er optimale, kan ytterligere to partier L1 samles opp fra samme plate. Kontroller startplaten for å forsikre deg om at det ikke finnes l1. Vask om nødvendig igjen. Gjenta trinn 1.2.5-1.2.9.
    10. Sjekk utviklingstidsberegning. Før du går videre til nedstrømsapplikasjonen, inspiser noen ormer under et sammensatt mikroskop ved 400x forstørrelse for å bekrefte at de nådde ønsket utviklingsstadium, her L3.
      MERK: Migrasjonsavstanden til distale spissceller eller koblingsceller kan brukes som en veiledning, i tillegg til vulvautvikling. For vulvautvikling gir Mock et al.23 en nyttig guide, selv om timingen i den studien ble bestemt ved 20 °C. Ved 25 °C vil villtype C. elegans gjennomgå L3-L4 smeltet 24 timer etter klekking.

2. Innsamling av L4 menn og hermafroditter og fiksering

  1. Forbered RNAse-fri, kald (-20 °C), 70 % metanol før fiksering.
  2. Under et disseksjonsmikroskop ved 30-50x forstørrelse begynner du å plukke menn og hermafroditter fra synkroniseringsplatene på separate usette plater så snart kjønnene kan skille seg ut (~ 21 timer etter klekking, figur 2), og fortsett å plukke i 1-2 timer eller til 200 dyr samles inn.
  3. Hold ormene ved 25 °C til de når ønsket stadium for eksperimentet.
  4. Vask ormene av platen med 1-2 ml M9 buffer ved hjelp av en pipettespiss forhåndsvasket med M9 buffer som inneholder 0,01% vaskemiddel (for å forhindre at ormer stikker til spissen).
  5. Overfør ormene til et 1 ml sentrifugerør.
  6. Spinn i 1 min ved 21.000 × g for å pellet ormene. Fjern supernatanten.
  7. Tilsett 1 ml M9 buffer og bland for å bryte opp pelletsen.
  8. Spinn i 1 min ved 21.000 × g for å pellet ormene. Fjern supernatanten.
  9. Gjenta vasken.
  10. Tilsett 1 ml iskald 70% metanol og bland godt.
  11. Spinn i 1 min ved 21.000 × g for å pellet ormene. Fjern supernatanten.
  12. Gjenta trinn 2.10 og 2.11.
  13. Tilsett 500 μL 70% metanol, bland og oppbevar ved 4 °C i 1 time til over natten.

3. Laser mikrodissection

MERK: Herfra bruker du RNase-frie reagenser og forbruksvarer; bruk filtertips.

  1. Hvis CEL-Seq2-metoden brukes til å behandle prøvene, lag en master mix for hver CEL-Seq2 primer (Supplemental Table S1): pipette 2 μL CEL-Seq2 primer, 1 μL 10 mM dNTP og 9 μL 1% β-Mercaptoethanol (i RNase-fritt vann) i et merket 200 μL rør.
  2. Montering på lysbilde
    1. Under et disseksjonsmikroskop, pipette 20 μL av de faste ormene (20-40 ormer fra trinn 2.13) på den matte siden av en polyetylen naftalen (PEN)-membran glass lysbilde (hvor membranen er).
    2. Vent til metanol fordamper. Bruk en skyvevarmer for å øke hastigheten på fordampningen.
      MERK: Ytterligere dråper metanol kan påføres, og en pipettespiss som brukes til å spre ormene ut hvis de begynner å klumpe seg når de tørker. Når ormer er i klumper, kan de være vanskelige å dissekere.
  3. Sette opp mikroskopet
    MERK: Følgende protokoll er spesifikk for instrumentet som er oppført i materiallisten. Det må justeres hvis et annet LMD-mikroskop brukes.
    1. Plasser en stasjonær luftfukter bak scenen på siden av LMD-mikroskopet. Sørg for at dampen blåser direkte på scenen.
      MERK: Luftfukteren er nyttig for å redusere statisk elektrisitet, noe som ellers kan forhindre at den lille membrandelen faller inn i rørhetten.
    2. Vri på tasten for laserkraft.
    3. Slå på strøm for trinnkontroll.
    4. Slå på mikroskopkontrollboksen.
    5. Åpne Laser Microdissection programvare.
    6. Fjern plastskjoldet over scenen.
    7. Klikk på losseknappen med oppoverpilen for å laste inn membranlysbildene.
    8. Pass på at gliden er helt tørr, snu slik at membranen vender ned.
    9. Sett inn lysbildet, og klikk fortsett i endringsprøvevinduet .
    10. Sett på plass plastskjoldet.
    11. Velg hvilken lysbildeholder som inneholder lysbildet, nederst på skjermen.
    12. For å laste rørene, klikk på losseknappen med nedoverpilen.
    13. Trekk skuffen ut og fjern rørblokken.
      MERK: Rørblokken som brukes til dette eksperimentet er for 500 μL PCR-rør.
    14. Sett rørhettene på 500 μL PCR-rør inn i holderen og brett røret under.
    15. Sett blokken tilbake i skuffen og skyv skuffen tilbake i mikroskopstadiet.
    16. I popup-vinduet for endringssamlerenheten velger du PCR-rør og klikker ok.
    17. Klikk på den tomme rørplasseringen nederst til venstre på skjermen under rørhettene til samlerenheten.
    18. I mikroskopets kontrollpanel velger du TL-BF for overført lyslysfeltbelysning.
  4. Skjæring
    MERK: Denne protokollen er spesifikk for instrumentet som er oppført i materialtabellen.
    1. Bruk 2,5x linsen til å justere fokuset til ormene og membranens struktur er synlige.
    2. Bytt til 20x linsen.
    3. Flytt stadiet til et område uten ormer. Juster fokuset slik at de boblelignende strukturene i membranen har en gulaktig farge (figur 3A,B) for å fokusere laseren på riktig fokusplan.
    4. Still inn laserparametrene; For halespisser, start med Power 45, blenderåpning 30 og hastighet 20.
    5. Velg kalibrer i laserkontrollpanelet. Følg instruksjonene.
      MERK: Instrumentet utfører dette trinnet automatisk. Det vil sikre at en form tegnet med musen på skjermen er identisk med formen kuttet ut av laseren.
    6. Klikk på posisjon A nederst på skjermen ved rørhettene til samlerenheten.
    7. Merk én figur på høyre side av skjermen | Tegn + Klipp ut. Velg PtoP til venstre på skjermen.
    8. Tegn en linje.
    9. Klikk Start kutt slik at laseren skjærer gjennom membranen.
      MERK: Det kan også etse en linje inn i glasset.
    10. Hvis dette testkuttet ser bra ut (membranen er kuttet, kantene av kutt ser glatte ut), fortsett med neste trinn. Ellers justerer du fokus og kutter en annen linje.
    11. Finn en orm. Bytt til Move + Cut og bruk musen til å skjære gjennom halen.
      MERK: Hvis laseren ikke skjærer gjennom halen, justerer du fokuset og øker lasereffekten. For tykkere vev kan laserkraften måtte settes til 60.
    12. Lagre parameterne: Kategorien Fil | Lagre programkonfigurasjon; for senere henting, Gjenopprett programkonfigurasjon.
    13. Hvis du vil samle prøven, bytter du til innstillingen Tegn + Klipp ut med PtoP-funksjonen og tegner en form for å fullføre kuttet av en membrandel (figur 3C).
      MERK: Større membranseksjoner og seksjoner formet som rektangler eller trekanter i stedet for sirkler eller ovaler er lettere å finne i oppsamlingsrørhetten.
    14. Velg neste rør på Collector Device Tube Cap nederst på skjermen og klipp neste halespiss.
    15. Når fire haler er kuttet, loss rørstativet (klikk Fjern med nedoverpil) og finn membrandelene under et dissekeringsmikroskop (figur 3D).
      MERK: Seksjonene kan være plassert midt på rørhetten eller sittende fast på siden av hetten.
    16. Fortsett med nedstrømsprogrammet. For CEL-Seq2, pipette 1,2 μL av en CEL-Seq2 primer master mix (fra trinn 3.1) direkte på toppen av prøven.
    17. Lukk røret, merk med primernummer, og plasser straks rørhetten direkte på et stykke tørris for å blinke og fryse prøven og forhindre nedbrytning av RNA.
    18. Last flere rør, returner rørblokken til scenen, og kutt flere prøver. Tilsett en annen CEL-Seq2 primerblanding til hver halespiss.
    19. Oppbevar alle rør ved -70 °C.

4. Single-tail RNA sekvensering med CEL-Seq2

MERK: For fullstendig informasjon om CEL-Seq2-protokollen, se Yanai og Hashimshony18.

  1. Rengjør labbenkområdet med RNase dekontamineringsløsning for å forhindre RNA-nedbrytning.
  2. Forbered mesterblandinger og hold dem på is.
    1. Forbered masterblandingen for omvendt transkripsjon: 0,4 μL første trådbuffer, 0,1 μL 0,1 M DTT, 0,1 μL RNase-hemmer og 0,1 μL omvendt transkripsjon per prøve.
    2. Forbered den andre trådreaksjonsmesterblandingen: 7 μL vann, 2,31 μL andre trådbuffer, 0,23 μL dNTP, 0,08 μL E. coli-ligase , 0,3 μL E. coli DNA-polymerase, 0,08 μL RNaseH per prøve.
  3. Bryte åpne celler og annealing med primere (se Supplerende tabell S1 for den fullstendige listen over primere):
    1. Programmer termosykleren og lokket til 65 °C.
    2. Hent prøvene fra -70 °C og inkuber dem i termosykleren i 2,5 min.
    3. Spinn på 21,000 × g for 30-40 s.
    4. Inkuber ved 65 °C i 2,5 min.
    5. Flytt dem umiddelbart til is.
    6. Spinn på 21.000 × g i 30-40 s og returner dem til is.
  4. Konverterer RNA til cDNA:
    1. Tilsett 0,8 μL av den omvendte transkripsjonsblandingen til hver halespiss.
    2. Inkuber ved 42 °C i 1 time.
    3. Varmeinaktiver ved 70 °C i 10 minutter.
    4. Flytt den umiddelbart til is.
    5. Tilsett 10 μL av den andre trådblandingen til hver halespiss.
    6. Sveip eksemplene.
    7. Spinn på 21.000 × g i 30-40 s.
    8. Inkuber ved 16 °C i 2 timer.
  5. cDNA-opprydding:
    1. Forvarm DNA-oppryddingsperlene til romtemperatur.
    2. Samle opptil 40 prøver i et sentrifugerør på 1,5 ml (opptil 480 μL).
    3. Bland perlene til de er godt spredt og tilsett 20 μL perler og 100 μL perlebindingsbuffer for hver 100 μL av den samlede prøven (for 480 μL prøve tilsett 480 μL perlebuffer og 96 μL perler til et sluttvolum opp til 1,056 μL perle). Bland godt ved pipettering.
    4. Inkuber ved romtemperatur i 15 min.
    5. Plasser på et magnetisk stativ i minst 5 minutter til væsken ser klar ut.
    6. Fjern og kast alle unntatt 20 μL av supernatanten.
    7. Tilsett 200 μL nylaget 80% etanol.
    8. Inkuber i minst 30 s, fjern supernatanten ved å pipette den av uten å forstyrre perlene. Kast supernatanten.
    9. Gjenta trinn 4.5.7 og 4.5.8 én gang.
    10. Lufttørk perlene i 15 min eller til de er helt tørre.
    11. Resuspend perlene (~ 6,4 μL) med 6,4 μL vann. Bland grundig ved å pipettere hele volumet opp og ned ti ganger.
    12. Inkuber ved romtemperatur i 2 min.
    13. Gå rett til in vitro transkripsjon (IVT).
  6. In vitro transkripsjon og fragmentering:
    1. Til røret som inneholder 6,4 μL prøve og perlene, tilsett følgende blanding (9,6 μL totalt): 1,6 μL 10x T7 Buffer, 1,6 μL ATP, 1,6 μL UTP, 1,6 μL CTP og 1,6 μL GTP (hver dNTP ved 75 mM konsentrasjon) 1,6 μLof T7-
    2. Inkuber i 13 timer ved 37 °C med et 4 °C hold.
    3. Tilsett 6 μL eksonukleaseoppløsning (sluttvolumet skal være 22 μL).
    4. Inkuber i 15 min ved 37 °C.
    5. Sett røret tilbake på isen og tilsett 5,5 μL fragmenteringsbuffer (0,25 × reaksjonsvolum).
    6. Inkuber i 3 min ved 94 °C.
    7. Flytt straks røret til is og tilsett 2,75 μL fragmenteringsstoppbuffer (0,5 × volum fragmenteringsbuffer lagt til).
    8. Fjern perlene ved å plassere røret på magnetstativet i minst 5 minutter til væsken ser klar ut.
    9. Overfør supernatanten til et nytt rør.
  7. Forsterket opprydding av RNA (aRNA):
    1. Forvarsel RNA opprydding perler til romtemperatur.
    2. Bland perlene til de er godt spredt.
    3. Pipette 55 μL perler (1,8 × reaksjonsvolum).
    4. Inkuber dem ved romtemperatur i 10 min.
    5. Plasser røret på magnetstativet i minst 5 minutter til væsken ser klar ut.
    6. Fjern og kast 80 μL av supernatanten.
    7. Tilsett 200 μL nylaget 70% etanol.
    8. Inkuber i minst 30 s, fjern supernatanten ved pipettering uten å forstyrre perlene. Kast supernatanten.
    9. Gjenta etanolvasken to ganger til.
    10. Lufttørk perlene i 15 min eller til de er helt tørre.
    11. Resuspend perlene med 7 μL vann. Pipette hele volumet opp og ned 10 ganger for å blande grundig.
    12. Inkuber ved romtemperatur i 2 min.
    13. Plasser røret med perlene på magnetstativet i 5 minutter til væsken ser klar ut.
    14. Overfør supernatanten til et nytt rør.
      MERK: Stoppested: prøver kan oppbevares ved -70 °C.
  8. Valgfritt: Kontroller aRNA-mengden og -kvaliteten med et automatisert elektroforesesystem etter produsentens protokoll.
  9. Klargjøring av bibliotek:
    1. Til 5 μL RNA, tilsett 1 μL 100 μM tilfeldig heksamer RT primer (se materialtabellen) og 0,5 μL 10 mM dNTP.
    2. Inkuber ved 65 °C i 5 minutter.
    3. Tilsett 4 μL av følgende blanding ved romtemperatur: 2 μL First Strand buffer, 1 μL 0,1 M DDT, 0,5 μL RNase-hemmer, 0,5 μL omvendt transkripsjon.
    4. Inkuber ved 25 °C i 10 minutter.
    5. Inkuber ved 42 °C i 1 time (i en hybridiseringsovn eller en forvarmet termisk syklist med lokket satt til 50 °C).
    6. Inkuber ved 70 °C i 10 minutter.
    7. Overfør 5 μL til et nytt rør (hold resten av reaksjonen ved -20 °C). Tilsett 5,5 μL ultrarent vann, 1 μL RNA PCR Primer (RP1), 1 μL indeksert RNA PCR Primer (RPIX) og 12,5 μL PCR-blanding.
    8. Bruk følgende program på termosykleren: 30 s ved 98 °C, 11 sykluser med: (10 s ved 98 °C, 30 s ved 60 °C, 30 s ved 72 °C), 10 min ved 72 °C, hold ved 4 °C.
      MERK: Stoppested: prøver kan oppbevares ved -20 °C.
  10. Opprydding av bibliotek:
    1. Forvarm DNA-oppryddingsperlene til romtemperatur.
    2. Bland perlene til de er godt spredt.
    3. Tilsett 25 μL perler til PCR-reaksjonen. Bland godt ved pipettering.
    4. Inkuber ved romtemperatur i 15 min.
    5. Plasser røret på magnetstativet i minst 5 minutter til væsken ser klar ut.
    6. Fjern og kast 45 μL av supernatanten.
    7. Tilsett 200 μL nylaget 80% etanol.
    8. Inkuber i minst 30 s, fjern og kast supernatanten uten å forstyrre perlene.
    9. Gjenta etanolvasken en gang.
    10. Lufttørke perler i 15 min eller til de er helt tørre.
    11. Resuspend dem med 25 μL vann. Bland godt ved pipettering.
    12. Inkuber ved romtemperatur i 2 min.
    13. Plasser røret på magnetstativet i 5 minutter til væsken ser klar ut.
    14. Overfør 25 μL supernatant til et nytt rør.
    15. Gjenta trinn 4.10.2-4.10.10 én gang.
    16. Resuspend med 10,5 μL vann. Bland godt ved pipettering.
    17. Inkuber ved romtemperatur i 2 min.
    18. Plasser røret på magnetstativet i 5 minutter til væsken ser klar ut.
    19. Overfør 10 μL av supernatanten til et nytt rør og oppbevar ved -20 °C.
  11. Vurdere bibliotekkvalitet og kvantitet i henhold til kravet til sekvenseringsanlegget.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Etter laserfangst mikrodesisseksjon, individuelle halespisser av menn og hermafroditter på 4 tidspunkter (L3 22 timer etter luke; L4 24, 26 og 28 timer etter luke) ble klargjort for RNA-sekvensering ved hjelp av CEL-Seq2-protokollen. CEL-Seq2 primere inneholder unike strekkoder som gjør det mulig å identifisere sekvenseringsavlesninger fra et bestemt utvalg (i dette tilfellet en individuell halespiss) som skal identifiseres bioinformatisk. Sekvenseringsdata ble generert med denne metoden for totalt 557 halespisser (266 hermafroditter og 291 menn over 4 utviklingstidspunkter, 59-78 haler per kjønn og tidspunkt). CEL-Seq2 strekkoder ble gjenvunnet for 97% (dvs. 543) av disse hale tips (Supplerende tabell S2). For de fleste biblioteker var utvinningsgraden 99-100%; Det var imidlertid 88% for ett mannlig tidspunkt. Det er verdt å merke seg at omtrent halvparten av de mannlige halespissene fra 22, 24 og 28 timers tidspunkter ble lagret ved -80 ° C i ~ 4 måneder på grunn av COVID-19-relaterte forsinkelser. Dette viser at selv om det er ideelt å forberede sekvenseringsbiblioteker kort tid etter prøvetaking, er det mulig å lagre dissekerte prøver i lengre tid før bibliotekforberedelse.

CEL-Seq2 primere legger også til en UMI til hver mRNA-transkripsjon. Dette muliggjør fjerning av PCR-duplikater og presis kvantifisering av genuttrykk i prøven. Antall UMIer varierte dramatisk over halespisser (figur 4; mannlig gjennomsnitt = 92 560; mannlig min. = 155; mannlig maks. = 1 183 998; hermafroditter gjennomsnitt = 67 597; hermafroditter min. = 132; hermafroditter maks. = 630 427). For UMI-telling per halespiss, se supplerende tabell S3. På grunn av den lave mengden inngang RNA for forberedelse av enkeltcellebibliotek, er det kjent at sekvenseringsdata med én celle har en stor mengde teknisk støy. Derfor anbefales det å filtrere prøver som har svært lave eller svært høye UMI-tellinger før analyse24.

R-pakken powsimR25 ble brukt til å vurdere kravene til statistisk kraft og utvalgsstørrelse for pålitelig detektering av differensialt uttrykte (DE) gener i encellede eller bulk RNA-seq eksperimenter. Parametrene for simuleringene var basert på et sekvenseringsdatasett med 70 individuelle mannlige halespisser (ved 24-timers tidspunktet) oppnådd med metoden beskrevet her. Forventede log-fold endringer var basert på resultater fra en egen RNA-seq eksperiment som samlet 80-100 hale tips. Simuleringene fastslo at enkelthalespissdataene har tilstrekkelig kraft (True Positive Rate = TPR) til å oppdage DE-gener, bortsett fra gener som har en svært lav gjennomsnittlig uttrykksverdi (øverst i figur 5; stiplet linje representerer 80% TPR). Å legge til mer simulerte halespisser per tidspunkt økte kraften noe for lavt uttrykte gener. Et lignende mønster vises for FDR (False Discovery Rate). FDR er høy (>0,10) for de lavt uttrykte genene; For mer uttrykte gener faller den imidlertid på eller under den nominelle 0,10-cutoffen (stiplet linje for FDR i bunnen av figur 5). Oppsummert vil det å øke antall haler som er samplet per tidspunkt over 70, gjøre lite for å senke FDR eller øke kraften. Imidlertid gir 70 halespisser en mye lavere FDR og sterkere kraft enn 30 halespisser.

Figure 1
Figur 1: Prosedyreoversikt for synkronisering av Caenorhabditis elegans med hatch-off-metoden og lasermikrodisseksjon av halespisser. Forkortelser: L1-L4 = larvetrinn 1 til 4; PEN = polyetylen naftalen; LMD = lasermikrodisseksjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Utseende av C. elegans L3 hermafroditter og menn under et disseksjonsmikroskop. Hermafroditter (A, B) og menn (C, D) ved 21-23 timer etter luke kan skille seg ut under et disseksjonsmikroskop (~ 50x forstørrelse) ved morfologien til halene (pilene). Halen av hermafroditter er smal, mens den for menn er hovent og virker klar. Skalastenger = 0,1 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Utseende på PEN-membranens glidestruktur og ormhale. Fokus er riktig for disseksjon av vevet sett med 20x (A) og 40x (B) linsen på mikroskopet. (C) Dissekert hale og delvis kuttet ut PEN membran. Etter å ha lukket gapet i kuttet, vil membranstykket falle inn i rørhetten under lysbildet. (D) Rørhette med PEN-membranseksjon som inneholder en dissekert halespiss. Skalastenger = 0,1 mm (A-C), 1 mm (D). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Naturlig log-transformert UMI teller per individuelle hale tips for ulike tidspoeng og kjønn. RNA fra individuelle haler ble forberedt for sekvensering ved hjelp av CEL-Seq2-metoden; 557 haler ble sekvensert totalt, med 59-78 haler per kjønn og tidspunkt. Ekstremt lave og høye UMI-outliers ville bli fjernet fra dataene før analyse. Forkortelse: UMI = unik molekylær identifikator. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Resultater av en bakre kraftanalyse ved hjelp av simuleringer med powsimR. PowsimR-programvaren bestemmer antall uavhengige prøver som kreves for å oppdage DE-gener på ulike uttrykksnivåer. Gener er binned av gjennomsnittlig uttrykk forvandlet som den naturlige logg av UMI teller. (A) Kraft (TPR) for å oppdage DE-gener mellom to forhold (her, mann vs hermafroditt) for fire forskjellige simuleringer (forskjellige fargede grafer) som inneholder forskjellige utvalgsstørrelser (antall individuelle halespisser) per tilstand. Stiplet linje angir 80 % TPR. (B) FDR i de samme fire simuleringene som i (A), stiplet linje som indikerer 10% FDR. Grafene viser at en prøvestørrelse på 70 halespisser (grønn) per tilstand er tilstrekkelig for å oppdage DE-gener, bortsett fra gener med svært lave uttrykksnivåer. Det vilt at kraften og den falske oppdagelsesraten for slike gener ikke kan forbedres kraftig ved å øke utvalgsstørrelsen utover 70. Forkortelser: DE = differensialt uttrykt; UMI = unik molekylær identifikator; TPR = sann positiv rente; FDR = falsk oppdagelsesrate. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Supplerende tabell S1: Sekvenser av primere som brukes i CEL-Seq2-protokollen. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende tabell S2: Samplet versus gjenvunnet individuelle hale tips. CEL-Seq2 primere inneholder unike strekkoder som gjør det mulig å identifisere sekvenseringsavlesninger fra hver prøve som skal identifiseres bioinformatisk. Avlesninger ble gjenopprettet fra 97% av halespissprøvene forberedt for sekvensering. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende tabell S3: UMI teller alle prøver med gjenvunnet strekkoder, som nevnt i Supplemental Table S2. Forkortelse: UMI = unik molekylær identifikator. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kritiske trinn i metoden
Hvis den utføres riktig, vil metoden som er beskrevet her, få robuste RNA-profiler med et relativt lite antall laser dissekerte prøver (70 halespisser i dette eksemplet). For prøver fra dyr som utvikler dyr, er imidlertid tett synkronisering avgjørende for å redusere variasjonen mellom prøver. Derfor anbefaler protokollen avlukkemetoden for ormsynkronisering. Her kan forskeren bestemme og nøyaktig kontrollere aldersforskjellen mellom individer (1 t i dagens protokoll). I tillegg gjelder hatch-off-metoden for alle arter, selv om embryoene er følsomme for blekemiddel, L1 ikke arresterer eller utvinning fra L1 arrest er variabel. For en vellykket synkronisering ved hatch-off er vasketrinnene avgjørende: alle voksne og larver må fjernes i begynnelsen av klekkeperioden, og ingen embryoer skal vaskes av sammen med den nylig klekkede L1 på slutten av klekkeperioden. Dette lykkes bare hvis agaroverflaten på platen er uskadet av sprekker, hull eller bobler, er bakteriell plen på platen frisk og ikke for tykk, og væsken tilsettes og omgis bare veldig forsiktig.

Hvis det skal innhentes data separat for menn og hermafroditter/hunner, er pålitelig identifisering av kjønn også viktig. Å skille L3 larver etter kjønn (se figur 2) krever erfaring. Det anbefales å øve på å plukke L3 menn og hermafroditter / kvinner og sjekke suksessraten etter at dyrene har utviklet seg til voksne og kjønnene er lett å skille mellom. Etter enkeltvevs RNA-Seq kan outliers også identifiseres ved hovedkomponentanalyse og fjernes om nødvendig.

For vellykket gjenoppretting av laserkuttede prøver er det viktig å redusere statisk elektrisitet så mye som mulig. Ladede PEN-membranstykker faller ofte ikke inn i rørhetten, men holder seg til lysbildet eller en annen del av mikroskopet. Et middel øker fuktigheten i rommet og spesielt rundt mikroskopet ved å plassere en liten luftfukter ved siden av scenen. I tillegg kan membransklier behandles med UV-lys. For å gjøre dette, inkubere lysbilder i et UV-C (254 nm) krysskoblingskammer og levere minst 1 joule energi, eller eksponere lysbildene for UV-lyset i en laminær luftstrømsbenk i 30 minutter.

Siden målet med protokollen er RNA-Seq, er det viktig å holde et RNase-fritt arbeidsmiljø. Fra og med fikseringsløsningen skal reagenser, beholdere og forbruksvarer være RNase-fri, arbeidsflaten skal dekontamineres, og forskerne bør bruke rene hansker. De dissekerte prøvene skal fryses så snart som mulig og oppbevares ved -70 °C inntil videre behandling. Det anbefales også å bruke rør med lav oppbevaring og tips for CEL-Seq2-delen av protokollen.

Den nåværende artikkelen gir bare en grunnleggende oversikt over CEL-Seq2-protokollen, som tidligere ble publisert av utviklerne med nyttige notater og tips17,18. Det anbefales at disse publikasjonene konsulteres før du bruker CEL-Seq2-metoden.

LMD-RNA-Seq-dataene kan valideres ved enkeltmolekyl-RNA fluorescerende in-situ hybridisering (smRNA FISH)26,27,28. smRNA FISH har blitt mye brukt i C. elegans og er mottagelig for andre nematodearter, forskjellig fra immunostaining med eksisterende antistoffer (som kanskje ikke kryssreagerer) eller innføring av transkripsjonelle reportere gjennom transgenese. Sistnevnte fungerer bra i C. elegans og noen relaterte Caenorhabditis arter29, men transgenese kan være mer utfordrende i andre nematode arter30,31.

Begrensninger ved metoden
Metoden beskrevet her fungerer veldig bra for å samle hale tips, et tynt vev på slutten av en orm. Dissekering av vev i det tykkere midten av eldre larver eller voksne er mer utfordrende. Programvaren til instrumentet som brukes her inkluderer en innstilling for flere kutt plassert på senere dypere nivåer i vevet. Denne innstillingen kan brukes til å kutte tykkere områder av dyret. Fordi ormene må fikses før disseksjon, er strukturelle detaljer vanskelig å se, noe som forhindrer presis disseksjon av bestemte små strukturer. Som nevnt ovenfor er LMD-RNA-Seq ikke en HTP-metode. Imidlertid kan 50-70 prøver dissekeres på en ettermiddag.

Metodens betydning med hensyn til eksisterende/alternative metoder
LMD-RNA-Seq kan brukes i alle arter selv om ingen transgene verktøy er tilgjengelige. Andre metoder er avhengige av FACS-sortering av fluorescerende merkede celler 8,9,32 eller isolering av merkede kjerner33,34 og krever dermed transgene dyr. Metoder som dissosierer og isolerer celler i postembryonic C. elegans har en tendens til å savne vevet i de to endene av ormen (Dylan Rahe, personlig kommunikasjon). Disse forbeholdene overvinnes ved å kombinere encellet RNA-Seq med kryosering av hele ormer (RNA-tomografi)35. Denne metoden ble brukt til å sammenligne romlig genuttrykk mellom C. elegans og en annen rhabditid nematode, Pristionchus pacificus36. Alternativt kan man eksperimentere med formalin-faste parafin-innebygde (FFPE) ormer. Slike materialer har blitt brukt til RNA-Seq etter LMD av pattedyrvevsprøver37. Imidlertid er RNA-tomografi og LMD av FFPE-ormer begrenset til analyse av bare en håndfull dyr. De er derfor ikke like godt egnet for studiet av dynamisk genuttrykk i å utvikle vev som LMD-RNA-Seq.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Alle forfattere erklærer at de ikke har noen interessekonflikter.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble finansiert av NIH (R01GM141395) og NSF (1656736) tilskudd til DF og NIH fellowship (F32GM136170) til AW. Figur 1 ble opprettet ved hjelp av BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
 0.5 µM PEN membrane glass slides RNase free Leica 11600288 for LMD
500 µL PCR tubes (nuclease-free) Axygen 732-0675 to cut the tail tips into
Compound microscope with 40x objective and DIC any to check age of worms
Desktop humidifier any
Dissection microscope with transmitted light base any for all worm work
glass pasteur pipets any handle of worm pick
glass slides and coverslips any to check age of worms
LMD6 microdissection system Leica multiple to cut tail tips
LoBind tubes 0.5 mL Eppendorf 22431005
M9 Buffer Recipe in WormBook
Methanol 99.8% Sigma 322415 to fix worms
NGM growth medium US Biological N1000 Buffers and salts need to be added: Recipe in WormBook
P10 pipette variablle volume e.g. Gilson
P1000 pipette variable volume e.g. Gilson
P2 pipette variable volume e.g. Gilson
Pipette tips 1,000 µL any
Pipette tips 1-10 µL filtered any
platinum iridium wire Tritech PT-9010 to make worm pick
sterile and nuclease-free 1 mL centrfuge tubes any
Tween 20 Sigma P9416 Add a very small amount to M9 buffer to prevent worms from sticking to the pipet tips
vented 6 mm plastic Petri dishes any
For CEL-Seq2
4200 TapeStation System with reagents for high-sensitivity RNA and DNA detection Aligent automated electrophoresis system
AMPure XP beads Beckman Coulter A63880 DNA cleanup beads
Bead binding buffer  20% PEG8000, 2.5 M NaCl
CEL-Seq2 primers (see Table S1) Sigma Genosys Mastercycler Nexus GX2 Eppendorf 6335000020 Thermal cycler with programmable lid and block for 200 µl tubes.
DNA Polymerase I (E. coli) Invitrogen 18052-025
dNTP mix 10 mM any
E. coli DNA ligase Invitrogen 18052-019
Ethanol
ExoSAP-IT For PCR Product Clean-Up Affymetrix 78200 exonuclease solution
MEGAscript T7 Transcription Kit Ambion AM1334 For step 4.6.1
Nuclease-free water any
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer NEB M0531 PCR mix step 4.9.7
random hexamer RT primer GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA
NNNNNN		 IDT a primer with 6 nucleotides that are random
RNA Fragmentation buffer NEB E6150S
RNA Fragmentation stop buffer NEB E6150S
RNA PCR Index Primers (RPI1–RPI48) Illumina, NEB, or IDT RPIX in protocol step 4.9.7, sequences available from Illumina
RNAClean XP beads Beckman Coulter A63987
RNase AWAY Surface Decontaminant Thermo Scientific 7000TS1 or any other similar product
RNaseH (E. coli) Invitrogen 18021-071
RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor Invitrogen 10777-019
Second strand buffer Invitrogen 10812-014
Superscripit II Invitrogen 18064-014 reverse transcriptase

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Haag, E. S., Fitch, D. H. A., Delattre, M. From "the worm" to "the worms" and back again: the evolutionary developmental biology of nematodes. Genetics. 210 (2), 397-433 (2018).
  2. Sommer, R. J., Bumbarger, D. J. Nematode model systems in evolution and development. Wiley Interdisciplinary Reviews: Developmental Biology. 1 (3), 389-400 (2012).
  3. WormBase. , Available from: https://wormbase.org/#012-3-6 (2022).
  4. WormAtlas. , Available from: https://wormatlas.org (2022).
  5. WormBook. , Available from: http://wormbook.org (2022).
  6. WormBook in Genetics. , Available from: https://academic.oup.com/genetics/pages/wormbook (2022).
  7. Cao, J., et al. Comprehensive single-cell transcriptional profiling of a multicellular organism. Science. 357 (6352), 661-667 (2017).
  8. Kaletsky, R., Murphy, C. T. Transcriptional profiling of C. elegans adult cells and tissues with age. Methods in Molecular Biology. 2144, 177-186 (2020).
  9. Kaletsky, R., et al. Transcriptome analysis of adult Caenorhabditis elegans cells reveals tissue-specific gene and isoform expression. PLoS Genetics. 14 (8), 1007559 (2018).
  10. Packer, J. S., et al. A lineage-resolved molecular atlas of C. elegans embryogenesis at single-cell resolution. Science. 365 (6459), 1971 (2019).
  11. Kulkarni, A., Anderson, A. G., Merullo, D. P., Konopka, G. Beyond bulk: a review of single cell transcriptomics methodologies and applications. Current Opinion in Biotechnology. 58, 129-136 (2019).
  12. Von Stetina, S. E., et al. Cell-specific microarray profiling experiments reveal a comprehensive picture of gene expression in the C. elegans nervous system. Genome Biology. 8 (7), 135 (2007).
  13. Baugh, L. R., et al. The homeodomain protein PAL-1 specifies a lineage-specific regulatory network in the C. elegans embryo. Development. 132 (8), 1843-1854 (2005).
  14. Haenni, S., et al. Analysis of C. elegans intestinal gene expression and polyadenylation by fluorescence-activated nuclei sorting and 3'-end-seq. Nucleic Acids Research. 40 (13), 6304-6318 (2012).
  15. Zhang, S., Banerjee, D., Kuhn, J. R. Isolation and culture of larval cells from C. elegans. PLoS One. 6 (4), 19505 (2011).
  16. Emmert-Buck, M. R., et al. Laser capture microdissection. Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).
  17. Hashimshony, T., et al. CEL-Seq2: sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq. Genome Biology. 17, 77 (2016).
  18. Yanai, I., Hashimshony, T. CEL-Seq2-single-cell RNA sequencing by multiplexed linear amplification. Methods in Molecular Biology. 1979, 45-56 (2019).
  19. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e4019 (2012).
  20. Baugh, L. R. To grow or not to grow: nutritional control of development during Caenorhabditis elegans L1 arrest. Genetics. 194 (3), 539-555 (2013).
  21. Baugh, L. R., Hu, P. J. Starvation responses throughout the Caenorhabditis elegans life cycle. Genetics. 216 (4), 837-878 (2020).
  22. Pepper, A. S., Killian, D. J., Hubbard, E. J. Genetic analysis of Caenorhabditis elegans glp-1 mutants suggests receptor interaction or competition. Genetics. 163 (1), 115-132 (2003).
  23. Mok, D. Z., Sternberg, P. W., Inoue, T. Morphologically defined sub-stages of C. elegans vulval development in the fourth larval stage. BMC Developmental Biology. 15, 26 (2015).
  24. Lytal, N., Ran, D., An, L. Normalization methods on single-cell RNA-seq data: an empirical survey. Frontiers in Genetics. 11, 41 (2020).
  25. Vieth, B., Ziegenhain, C., Parekh, S., Enard, W., Hellmann, I. powsimR: power analysis for bulk and single cell RNA-seq experiments. Bioinformatics. 33 (21), 3486-3488 (2017).
  26. Bolkova, J., Lanctot, C. Quantitative gene expression analysis in Caenorhabditis elegans using single molecule RNA FISH. Methods. 98, 42-49 (2016).
  27. Ji, N., van Oudenaarden, A. Single molecule fluorescent in situ hybridization (smFISH) of C. elegans worms and embryos. WormBook. , 1-16 (2012).
  28. Lee, C., et al. Single-molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smFISH) in Caenorhabditis elegans. Bio-Protocol. 7 (12), 2357 (2017).
  29. Baird, S. E., Chamberlin, H. M. Caenorhabditis briggsae methods. WormBook. , 1-9 (2006).
  30. Felix, M. A. Oscheius tipulae. WormBook. , 1-8 (2006).
  31. Han, Z., et al. Improving transgenesis efficiency and CRISPR-associated tools through codon optimization and native intron addition in Pristionchus nematodes. Genetics. 216 (4), 947-956 (2020).
  32. Fernandes Povoa, E. E., Ebbing, A. L. P., Betist, M. C., vander Veen, C., Korswagen, H. C. An optimized dissociation protocol for FACS-based isolation of rare cell types from Caenorhabditis elegans L1 larvae. MethodsX. 7, 100922 (2020).
  33. Han, M., Wei, G., McManus, C. E., Hillier, L. W., Reinke, V. Isolated C. elegans germ nuclei exhibit distinct genomic profiles of histone modification and gene expression. BMC Genomics. 20 (1), 500 (2019).
  34. Steiner, F. A., Henikoff, S. Cell type-specific affinity purification of nuclei for chromatin profiling in whole animals. Methods in Molecular Biology. 1228, 3-14 (2015).
  35. Ebbing, A. Spatial transcriptomics of C. elegans males and hermaphrodites identifies sex-specific differences in gene expression patterns. Developmental Cell. 47 (6), 801-813 (2018).
  36. Rödelsperger, C., et al. Spatial transcriptomics of nematodes identifies sperm cells as a source of genomic novelty and rapid evolution. Molecular Biology and Evolution. 38 (1), 229-243 (2021).
  37. Amini, P., et al. An optimised protocol for isolation of RNA from small sections of laser-capture microdissected FFPE tissue amenable for next-generation sequencing. BMC Molecular Biology. 18 (1), 22 (2017).

Tags

Biologi utgave 181
Lasermikrodesisseksjon for artsagnostiske enkeltvevsapplikasjoner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Woronik, A., Kiontke, K., Jallad, R. … More

Woronik, A., Kiontke, K., Jallad, R. S., Herrera, R. A., Fitch, D. H. A. Laser Microdissection for Species-Agnostic Single-Tissue Applications. J. Vis. Exp. (181), e63666, doi:10.3791/63666 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter