Summary
يوفر هذا البروتوكول طريقة عزل سريعة ومحددة الحجم للحويصلات الصغيرة خارج الخلية عن طريق تحسين حجم فوهة رش الهواء وضغط سائل الغمد وضغط تدفق العينة والجهد والكسب ومعلمات عتبة التشغيل.
Abstract
يمكن إطلاق الحويصلات الصغيرة خارج الخلية (sEV) من جميع أنواع الخلايا وتحمل البروتين والحمض النووي والحمض النووي الريبي. تعمل جزيئات الإشارة كمؤشرات للحالة الفسيولوجية والمرضية للخلية. ومع ذلك ، لا توجد طريقة قياسية لعزل sEV ، مما يمنع تحديد العلامات الحيوية النهائية ودراسات التدخل الدوائي. في هذه المقالة ، نقدم بروتوكولا مفصلا لعزل وتنقية 50-200 نانومتر sEV بواسطة فارز خلايا التدفق. لهذا الغرض ، تم اختيار فوهة 50 ميكرومتر وضغط سائل غمد 80 رطل لكل بوصة مربعة للحصول على معدل فرز جيد وتيار جانبي مستقر. تم استخدام الكريات المجهرية للبوليسترين ذات الحجم القياسي لتحديد مجموعات من الجسيمات 100 و 200 و 300 نانومتر. مع التحسين الإضافي لعتبة تشغيل الجهد والكسب والتشتت الأمامي (FSC) ، يمكن فصل إشارة sEV عن ضوضاء الخلفية. توفر هذه التحسينات لوحة من إعدادات الفرز الحرجة التي تمكن المرء من الحصول على مجموعة تمثيلية من sEV باستخدام FSC مقابل التشتت الجانبي (SSC) فقط. لا تسمح طريقة العزل القائمة على قياس التدفق الخلوي بتحليل الإنتاجية العالية فحسب ، بل تسمح أيضا بالتصنيف المتزامن أو تحليل البروتين ل sEV بناء على تعبير العلامات الحيوية ، مما يفتح العديد من تطبيقات البحث النهائية.
Introduction
تطلق الخلية حويصلات خارج الخلية (EVs) بأحجام مختلفة تؤدي إلى جزيئات إشارات وشوائب غشائية ، وهي مهمة للتواصل بين الخلايا1. تلعب المركبات الكهربائية ذات الأحجام المختلفة أيضا أدوارا بيولوجية مختلفة ، حيث يمكن ل 50-200 نانومتر sEV توزيع الحمض النووي الريبي والحمض النووي والبروتينات بدقة على الموقع الصحيح خارج الخلية. يساعد sEV أيضا في تحديد آليات إفرازها ، والتي لا تتضمن فقط تنظيم العمليات الفسيولوجية الطبيعية مثل المراقبة المناعية ، وصيانة الخلايا الجذعية ، وتخثر الدم ، وإصلاح الأنسجة ولكن أيضا علم الأمراض الكامن وراء العديد من الأمراض مثل تطور الورم وورم خبيث 2,3. يعد العزل والتحليل الفعالان للمركبات الكهربائية أمرا بالغ الأهمية لتحديد المؤشرات الحيوية وتصميم التدخلات الدوائية المستقبلية.
مع البحث المستمر حول التطبيق السريري ل sEV ، طرحت طرق عزل sEV متطلبات أعلى. نظرا لعدم تجانس sEV في الحجم والمصدر والمحتويات ، فضلا عن تشابهها مع المركبات الكهربائية الأخرى في الخواص الفيزيائية والكيميائية الحيوية ، لا توجد طريقة قياسية لعزل sEV 4,5. حاليا ، يعد الطرد المركزي الفائق ، وكروماتوغرافيا استبعاد الحجم (SEC) ، وترسيب البوليمر ، والتقاط التقارب المناعي أكثر طرق عزل sEV شيوعا6. لا يزال الطرد المركزي الفائق هو المعيار الذهبي لعزل sEV في البحث ، على الرغم من كونه يستغرق وقتا طويلا ، مما يؤدي إلى نقاء منخفض مع توزيع واسع الحجم من 40-500 نانومتر وأضرار ميكانيكية كبيرة لل sEV بعد الطرد المركزي طويل المدى7،8،9. يعاني ترسيب البوليمر ، الذي يستخدم عادة البولي إيثيلين جلايكول (PEG) ، من نقاء غير مقبول للتحليل الوظيفي اللاحق مع الترسيب المصاحب لمجاميع البروتين خارج الخلية وتلوث البوليمر10,11. تتطلب الطرق القائمة على التقاط التقارب المناعي أجساما مضادة عالية التكلفة ذات خصوصية متفاوتة ، بالإضافة إلى وجود مشاكل في انخفاض حجم المعالجة وإنتاجية12،13،14. حجم الجسيمات هو أحد المؤشرات الرئيسية لتقييم نقاء sEV المعزول. على الرغم من أن نقاء sEV لا يزال هدفا بعيد المنال ، إلا أن SEC يزيل كمية كبيرة من المكونات المتوسطة ، وجزيئات sEV المستخرجة بواسطة طريقة SEC هي أساسا في حدود 50-200 نانومتر15. التقنيات الحالية لها بعض العيوب ، بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر كونها تستغرق وقتا طويلا ، ونقاء منخفض ، وعائد منخفض ، وضعف قابلية التكاثر ، وانخفاض إنتاجية العينات ، والضرر المحتمل ل sEV ، مما يجعلها غير متوافقة مع الاستخدام السريري16. وبالتالي ، فإن طريقة عزل sEV السريعة وغير المكلفة والمحددة الحجم المطبقة على السوائل الحيوية المتنوعة هي حاجة أساسية في العديد من الحالات البحثية والسريرية.
في قياس التدفق الخلوي ، يتم تحليل الجسيمات المفردة بطريقة عالية الإنتاجية ومتعددة المعلمات ، ويتم فرز المجموعات الفرعية17. نظرا لعدم تجانس المركبات الكهربائية ، سيكون القياس الخلوي لتدفق الجسيمات الواحدة مثاليا ، والذي تم استخدامه للتحقيق في المركبات الكهربائية باتباع نماذج تحليل الخلية ، مع استخدام ملصقات تشتت الضوء والتألق لتحديد الميزات المتعلقة بعلم وظائف الأعضاء ومكونات البروتين18،19،20. ومع ذلك ، فإن قياس التدفق الخلوي التقليدي يواجه تحديا بسبب صغر حجم sEV وانخفاض وفرة المؤشرات الحيوية السطحية. يمكن تحسين حساسية قياس التدفق الخلوي من خلال تحسين معلمات الكشف لتمييز ضوضاء الخلفية و sEV بغض النظر عن استخدام التشتت الأمامي (FSC) أو التشتت الجانبي (SSC) أو عتبة التألقالتي تؤدي إلى تشغيل المعلمة 19.
مع البروتوكول الحالي ، تم تحسين إعدادات الفرز الخلوي عالية التدفق باستخدام حبات الفلورسنت كمعيار. من خلال اختيار حجم الفوهة المناسب ، وضغط سائل الغمد ، ومعلمة تشغيل العتبة ، والفولتية التي تتحكم في شدة الضوء المتناثرة ، تمكنا من عزل مجموعة فرعية محددة من sEV من خليط معقد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ثقافة الخلية
- قم بإعداد وسط استزراع من وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) المكمل بمصل بقري جنيني بنسبة 10٪ (FBS). استزرع خلية سرطان البنكرياس البشرية ، PANC-1 ، في قارورة مزرعة 75 سم2 بكثافة 1 × 106 خلايا / مل. احتضان الثقافة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
- الاستزراع الفرعي للخلايا عندما تصل كثافة الخلية إلى 75٪ -80٪ تحت الملاحظة المجهرية. قم بإزالة الوسط ، وشطف 2x مع 3-5 مل من محلول ملحي عازل للفوسفات (PBS ؛ 0.01 م ، درجة الحموضة 7.2-7.4).
- تخلص من المحلول ، وأضف 1-2 مل من محلول التربسين-EDTA ، واترك الخلايا تنفصل حتى تصبح مستديرة ومعلقة في الوسط تحت المجهر. يضاف وسط جديد ، ونضح ، ويوزع في قارورة استزراع 75 سم2 مع وسط استزراع 15 مل. استخدم نسبة زراعة فرعية من 1: 2 إلى 1: 4 (موصى به).
ملاحظة: يتم تنفيذ جميع العمليات في خزانة السلامة البيولوجية لتجنب تلوث الخلايا.
2. مجموعة الثقافة المتوسطة
- احتضان الخلايا لمدة 48 ساعة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2. جمع طافات الخلايا (90 مل) في أنبوبي طرد مركزي سعة 50 مل وأجهزة طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
- نقل المادة الطافية إلى أنابيب معقمة جديدة وأجهزة طرد مركزي على التوالي عند 2000 × جم لمدة 20 دقيقة ، و 10000 × جم لمدة 30 دقيقة ، و 12000 × جم لمدة 70 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
- قم بإزالة المادة الطافية وشطف الحبيبات ب 10 مل من PBS عن طريق السحب برفق. أجهزة الطرد المركزي عند 12000 × جم لمدة 70 دقيقة عند 4 درجات مئوية مرة أخرى وإعادة تعليق الحبيبات في 10 مل من المخزن المؤقت PBS للحصول على خليط من المركبات الكهربائية.
- إجراء تحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA) لتحديد حجم خليط EV وحجمه. قم بإجراء تحليل NTA وفقا للدليل المرجعي لتشغيل الجهاز والمرجع21.
3. فرز الخلايا
- قم بتنفيذ إجراء بدء التشغيل القياسي لفارز خلايا التدفق. قم بتشغيل الجهاز بالضغط على زر بدء التشغيل . انقر فوق زر طاقة الليزر في لوحة تحكم الليزر. اضغط على زر تغيير الخزانات في القائمة الفرعية لأخذ العينات الذكية للضغط على السوائل.
ملاحظة: تأكد من أن خزان النفايات فارغ ، وأن خزان الغلاف ممتلئ قبل بدء التشغيل. - استخدم فوهة نفاثة في الهواء بالموجات فوق الصوتية 50 ميكرومتر وقم بتثبيتها على مجموعة الفوهة. اضبط الضغط على 80 رطل لكل بوصة مربعة لسائل الغلاف و 80.3 رطل لكل بوصة مربعة لتدفق العينة على وحدة التحكم في الضغط.
- اضغط على زر بدء تدفق الغمد لبدء تدفق الغمد . انقر فوق زر الفقاعة في القائمة الفرعية لأخذ العينات الذكية لإلغاء الفقاعات تلقائيا لمدة 10 دقائق ثم إيقاف تشغيلها.
ملاحظة: بالنسبة لفرز الخلايا ، تتطلب الأحجام المختلفة لفوهات رش الهواء ضغوط سائل غمد مختلفة للحفاظ على استقرار تدفق السائل. في هذه الطريقة ، تم استخدام فوهة 50 ميكرومتر ، وفقط ضغط سائل غمد أكبر من أو يساوي 80 رطل لكل بوصة مربعة يمكن أن يولد تيارات جانبية مستقرة. يحدد فرق الضغط بين تدفق العينة ومائع الغمد سرعة تحميل الفرز. في ظل ظروف الإعداد للطريقة (فرق الضغط بين تدفق العينة ومائع الغمد هو 0.3-0.6 رطل / بوصة مربعة) ، كان تدفق السائل مستقرا نسبيا ، ومكنت سرعة التحميل من زيادة كفاءة الفرز إلى 80٪ من 50٪ لفرق الضغط أقل من 0.3-0.6 رطل / بوصة مربعة. - قم بمحاذاة الدفق وتحديد بقعة الليزر. قم بتشغيل ضوء غرفة الإضاءة لعرض التيار فوق الثقوب. اضبط الميكرومتر لأعلى ولأسفل ولليسار ولليمين والأمام والخلف لتوسيط الدفق على الثقب وتركيز الدفق.
- حدد علامة التبويب اعتراض الليزر والدفق . اضغط على زر السهم الأخضر باستمرار كما يطلب منك إكمال عملية معايرة اعتراض الليزر ومحاذاة الفوهة.
- قم بالوصول إلى شاشة محاذاة الليزر الدقيقة. حدد قناة 640-722/44 (H) كمعلمة المحور X وقناة 405-448/59 (H) كمعلمة المحور Y. اضغط على محدد معلمة الزناد واختر معلمة SSC لليزر 488 نانومتر. افتح جميع مصاريع الليزر.
ملاحظة: تعتمد معلمات المحور X والمحور Y المختارة على تكوين الليزر للنظام. يسمح بالمعلمات الأخرى إذا لم يكن النظام يحتوي على ليزر 640 نانومتر أو 405 نانومتر. للحصول على أفضل النتائج ، حدد الليزر بأكبر فصل مكاني على شريط الثقب (لا يشمل ليزر 355 نانومتر). - قم بتخفيف جزيئات الفلورسنت قوس قزح عن طريق إضافة قطرة واحدة إلى 1 مل من الماء المقطر المزدوج للحصول على تركيز نهائي قدره 1 × 106 حبات لكل مل. افتح باب غرفة العينة وقم بتحميل أنبوب من جزيئات الفلورسنت قوس قزح المعدة.
- اضغط على الزر بدء العينة . اضبط الميكرومتر لأعلى ولأسفل لتحسين شدة التألق ، مما يجعل كل إشارة مكثفة قدر الإمكان. اضغط على زر بدء مراقبة الجودة (QC) على لوحة التحكم بشاشة اللمس لإجراء مراقبة الجودة تلقائيا.
- أداء تأخير السقوط. قم بالوصول إلى شاشة إعداد الفرز وحدد زر تأخير الإفلات. اضغط على الزر تهيئة IntelliSort . يقوم الجهاز تلقائيا بضبط تردد وسعة تذبذب القطيرات للحصول على تأخير السقوط البالغ 25 ± 5 ويكون قادرا على تصور نقطة انقطاع السقوط بوضوح. اضغط على زر الصيانة .
- حدد الأنبوب كنوع إخراج الفرز. ضع حامل أنبوب سعة 15 مل في حجرة الفرز. قم بتشغيل جهد اللوحة واضبط جهد اللوحة على 4000 فولت تقريبا.
- قم بتشغيل نمط الاختبار عن طريق تحديد زر إعداد البث . اضبط شريط تمرير مرحلة الشحن ومنزلق الانحراف للتأكد من أن صورة الدفق مصطفة مع أنبوب التجميع. حدد زر علامة الاختيار .
- قم بتسجيل الدخول إلى محطة عمل Summit على الكمبيوتر. قم بإنشاء بروتوكول جديد من القائمة الرئيسية "ملف". قم بإنشاء مخطط نقطي عن طريق تحديد علامة التبويب الرسم البياني في لوحة تحكم برنامج القمة.
- انقر بزر الماوس الأيمن فوق محاور الرسم النقطي الجديد في مساحة العمل واختر FSC كمعلمة المحور X و SSC كمعلمة المحور Y. تقديم FSC و SSC في شكل لوغاريتمي.
- حدد علامة التبويب اكتساب وحدد موقع لوحة معلمات الاكتساب. قم بتمكين جميع الإشارات في القائمة الفرعية لتمكين المعلمات. اختر FSC كمعلمة تشغيل وقم بتعيين عتبة 0.01. اضبط الجهد والكسب ل FSC و SSC عند 250 و 0.6 لضمان فصل الأحداث داخل مخطط FSC مقابل SSC والسكان.
ملاحظة: إعداد العتبة يعادل ضبط حجم الجسيمات التي يمكن اكتشافها عن طريق قياس التدفق الخلوي. كلما كانت العتبة أكبر ، كلما كانت الجسيمات المكتشفة أكبر ، وسيتم قطع الجسيمات الصغيرة بواسطة العتبة ولا يمكن اكتشافها. في هذه الطريقة ، يتم ضبط العتبة على 0.01 ، لذلك يمكن اكتشاف جميع الجسيمات الأكبر من الضوضاء الإلكترونية.
4. عزل sEV
- قم بتخفيف الكريات المجهرية الفلورية من البوليسترين إلى معلقات 100 نانومتر و 200 نانومتر و 300 نانومتر. أضف 1 ميكرولتر من الكريات المجهرية إلى 1 مل من الماء المقطر المزدوج.
- قم بتحميل تعليق المجهرية على التوالي. حدد ابدأ ضمن قائمة الاستحواذ الخاصة ببرنامج القمة وسجل 20000 حدث.
ملاحظة: عدد الأحداث اختياري. يوصى بما لا يقل عن 5000 حدث لتلبية الأهمية الإحصائية. - انقر بزر الماوس الأيمن على مخطط نقطة FSC مقابل SSC لإنشاء مستطيلات واسحب لتغيير حجم وتغيير موضع مناطق الضوضاء الإلكترونية وسكان المجهر 100 نانومتر. انقر بزر الماوس الأيمن فوق المناطق لإعادة تسميتها باسم R7 و R4 ، على التوالي. كرر الخطوات المذكورة أعلاه لتأطير الكرات المجهرية 200 نانومتر و 300 نانومتر مع المستطيلات على التوالي وإعادة تسميتها باسم R5 و R6 ، على التوالي.
- أخيرا ، حدد منطقة الفرز 50-200 نانومتر بناء على الضوضاء الإلكترونية وموضع جسيمات 200 نانومتر المعرفة على أنها R8.
ملاحظة: يتم وضع حد الكشف الأدنى البالغ 50 نانومتر فوق الضوضاء الإلكترونية لفارز خلايا التدفق مباشرة. وبالتالي يمكن تعريف المنطقة الواقعة بين الضوضاء وعدد 200 نانومتر المجهري على أنها تتراوح بين 50-200 نانومتر. - تحرير قرارات الفرز في لوحة منطق الفرز والإحصاءات. انقر نقرا مزدوجا فوق الحقل الفارغ للدفق الأيسر (L1). حدد المنطقة المسماة R8 لإنشاء منطق الفرز. اختر وضع إحباط النقاء وحدد مغلف قطرة من قطرة واحدة لتيار L1.
- قم بتحميل عينة 500 ميكرولتر من خليط EVs من الخطوة 2.3. اضغط على زر البدء أسفل قائمة الاستحواذ في Summit للحصول على البيانات ، ثم اضغط على Start في قائمة الفرز لجمع 50-200 نانومتر sEV في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل.
ملاحظة: البيئة المعقمة ضرورية لتقليل التلوث أثناء أي إجراء. - راقب وجود sEV بواسطة المجهر الإلكتروني النافذ (TEM) وتحقق من حجم جسيمات sEV باستخدام NTA. قم بإجراء تحليل اللطخة الغربية (WB) لمزيد من التأكيد على تعبير علامات CD9 و CD63 و CD8118.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يوضح الشكل 1 مخطط مخطط التدفق للبروتوكول التجريبي. في هذه الطريقة ، تم استخدام الكريات المجهرية للبوليسترين ذات الحجم القياسي كمعايير مرجعية لتوزيع حجم الجسيمات. في ظل حالة المعلمة الآلية المحددة ، يمكن تمييز إشارة الجسيمات بوضوح عن ضوضاء الخلفية في مخطط FSC مقابل SSC باستخدام الشكل اللوغاريتمي. استراتيجيات البوابات موضحة في الشكل 2. تشير R4 و R5 و R6 إلى مواضع المجهرية 100 نانومتر و 200 نانومتر و 300 نانومتر على التوالي. R7 هو حد الكشف عن الضوضاء الإلكترونية أقل من 50 نانومتر ، و R8 هو نطاق موضع جزيئات 50-200 نانومتر.
كان توزيع حجم الجسيمات لخليط EVs المشتق من خلايا PANC-1 في النطاق الواسع من 40-400 نانومتر بعد الطرد المركزي الفائق (الشكل 3). لعزل وتنقية 50-200 نانومتر sEV ، تم إجراء الفرز الخلوي للتدفق للحصول على الحجم المحدد sEV وفقا لموقع الكرات المجهرية القياسية (الشكل 4). تم التحقق من جودة العزل بواسطة NTA ، ووجد أن نطاق حجم الجسيمات من sEV بعد الفرز كان بين 50-200 نانومتر (كما هو موضح في الشكل 5). تمت ملاحظة وجود sEV بشكل أكبر بواسطة TEM ، المشار إليه بالأسهم الحمراء في الشكل 6A ، وتم تأكيد احتواء sEVs المعزولة على علامات CD9 و CD63 و CD81 من خلال تحليل WB (الشكل 6B).
الشكل 1. مخطط مخطط انسيابي للبروتوكول التجريبي. تم جمع وسط زراعة الخلايا PANC-1 والطرد المركزي الفائق للحصول على خليط EVs. تم تحسين معلمات الفرز لعزل وتنقية 50-200 نانومتر sEV والتي تم التحقق منها بواسطة NTA. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. تحليل التدفق الخلوي للكريات المجهرية للبوليسترين ذات الحجم القياسي لتحديد نطاق الحجم 50-200 نانومتر في مخطط FSC مقابل SSC. تم تحميل وتحليل المعلقات المخففة للكرات المجهرية 100 نانومتر و 200 نانومتر و 300 نانومتر بواسطة مقياس التدفق الخلوي كما هو موضح في مخطط نقطة FSC مقابل SSC. تشير R4 و R5 و R6 إلى مواضع جسيمات 100 نانومتر و 200 نانومتر و 300 نانومتر على التوالي. R7 هو الضوضاء الإلكترونية كحد الكشف عن جسيمات 50 نانومتر ، ويمثل R8 نطاق موضع جزيئات 50-200 نانومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. تحليل NTA لتوزيع حجم الجسيمات للمركبات الكهربائية التي تم الحصول عليها عن طريق الطرد المركزي الفائق. يتم تمثيل التوزيع التكراري لأحجام الجسيمات المختلفة بالبيانات كنسبة مئوية للجسيمات مقابل الحجم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4. تحليل التدفق الخلوي لعينة EV التي تم جمعها. يظهر مخطط نقطة FSC مقابل SSC عينة من خليط EV الذي تم جمعه وتحميله وتحليله بواسطة مقياس التدفق الخلوي. تم فرز sEV في نطاق الحجم من 50-200 نانومتر داخل منطقة R8. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5. التحقق من توزيع حجم الجسيمات من sEV بعد الفرز باستخدام NTA. تظهر النسبة المئوية للجسيمات التمثيلية مقابل الرسم البياني للحجم توزيع حجم sEV الذي تم فرزه. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6. توصيف sEV معزولة عن طريق الفرز. (أ) صورة TEM تمثيلية ل sEV مرتبة (يشار إليها بأسهم حمراء). شريط المقياس = 200 نانومتر. (ب) تحليل اللطخة الغربية لعلامات CD9 و CD81 و CD63 في sEV المصنفة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يحدد هذا البروتوكول طريقة محسنة لعزل وتنقية sEV بحجم الجسيمات المحدد من 50-200 نانومتر باستخدام فارز خلايا التدفق ، والذي تم التحقق من صحته بواسطة NTA. حلت الطريقة مشكلة عنق الزجاجة المتمثلة في الحصول على sEV بحجم جسيم موحد ونقاء عالي ، وتجنب التداخل من الجزيئات البيولوجية غير ذات الصلة الملفوفة في EVs كبيرة الحجم22. يمكن إجراء تحليلات سريعة وعالية الإنتاجية باستخدام قياس التدفق الخلوي ، والذي يمكنه التقاط 100000 جسيم في الثانية واتخاذ 70000 قرار فرز في الثانية17 ، مما يقلل بشكل كبير من الوقت ويعكس عدم تجانس جسيمات sEV. علاوة على ذلك ، يمكن تخصيص هذا البروتوكول القائم على قياس التدفق الخلوي بناء على الاهتمامات الفردية في المجموعات الفرعية للمركبات الكهربائية ذات الأحجام المحددة. يمكن استخدام نطاقات البوابة البديلة لتحديد وعزل المجموعات السكانية ذات الاهتمام بنفس معلمات الأداة المحددة على النحو الوارد أعلاه ، مثل فوهة رش الهواء ، وضغط سائل الغمد ، وضغط تدفق العينة ، ومعلمة عتبة التشغيل.
تكمن الصعوبة التقنية لهذه الطريقة في فصل السكان بنطاقات أحجام مختلفة ، ولا سيما التمييز عن ضوضاء الخلفية. حددنا لوحة من إعدادات الفرز الهامة. أولا ، يؤثر حجم الفوهة على معدل الفرز. من أجل تحسين تركيز sEV الذي تم الحصول عليه عن طريق الفرز ، يتم استخدام فوهة 50 ميكرومتر في هذه الطريقة ، ويلزم 80 رطل لكل بوصة مربعة من ضغط سائل الغمد لتثبيت التيار الجانبي. مع ارتفاع ضغط سائل الغمد ، تزداد ترددات السقوط ، مما يؤدي إلى ارتفاع معدلات الأحداث ووقت فرز أقصر23. ومع ذلك ، فإن زيادة ضغط سائل الغمد يخفف من حساسية FSC وإشارات التألق بسبب تقليل الوقت المستغرق للمرور عبر الليزر وعدد الفوتونات التي تصل إلى الكاشف24. والجدير بالذكر أنه من الصعب الحفاظ على استقرار التيار الجانبي تحت هذا الضغط ، الأمر الذي يتطلب نظافة عالية للفوهة وخط الأنابيب. ثانيا ، يوصى بشدة بالتنظيف بالموجات فوق الصوتية للفوهة وشطف أنابيب قياس التدفق الخلوي لزيادة احتمالية النجاح التجريبي. أخيرا ، الجهد والكسب ضروريان لفصل السكان ، خاصة بالنسبة للجسيمات صغيرة الحجم. هنا ، يمكن للجهد 250 فولت وكسب 0.6 فصل sEV بشكل فعال عند 50-200 نانومتر مع تشغيل FSC ورسمه في شكل لوغاريتمي.
أحد التحذيرات من النهج هو أنه في بعض الحالات ، يكون تركيز sEV مرتفعا جدا ، أو إجمالي sEV ، أثناء عملية الفرز ، مما يجعل من الصعب تحقيق تعليق أحادي الجسيم. سيتم التخلص من sEV المجمعة بسبب الإشارة المفرطة في التضخيم.
بشكل جماعي ، مع مزايا التحليل عالي الإنتاجية لقياس التدفق الخلوي ، قامت هذه الطريقة بتحسين حجم الفوهة وضغط سائل الغمد وضغط تدفق العينة ومعلمة عتبة التشغيل مما أدى إلى عزل ناجح من 50-200 نانومتر sEV. إلى جانب ذلك ، لا تسمح هذه الطريقة بفصل جزيئات الحجم المحدد فحسب ، بل تسمح أيضا بالتصنيف المتزامن أو تحليل البروتين ل sEV بناء على تعبير المستضد ، مما يفتح العديد من التطبيقات البحثية النهائية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من قبل صندوق البحث العلمي بجامعة تشجيانغ للطب الصيني (2020ZG29) ، ومشروع أبحاث الرفاهية العامة الأساسية لمقاطعة تشجيانغ (LGF19H150006 ، LTGY23B070001) ، ومشروع وزارة التعليم بمقاطعة تشجيانغ (Y202147028) ومشروع التكنولوجيا التجريبية لقسم مختبر جامعة تشجيانغ (SJS201712 ، SYB202130).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge tube | Beckman Coulter | 344058 | |
| Culture flasks | Corning | 430641 | |
| Dulbecco’s modified eagle medium | Corning Cellgro | 10-013-CV | |
| Fetal bovine serum | SUER | SUER050QY | |
| Flow cell sorter | Beckman Coulter | Moflo Astrios EQ | |
| Human pancreatic cancer cell, PANC-1 | NA | NA | PANC-1 cells were donated by Professor Weijun Yang, College of Life Sciences, Zhejiang University |
| Laser particle size and zeta potential analyzer | Malvern | Zetasizer Nano ZS 90 | |
| Phosphate buffer saline | Gibco | C20012500BT | |
| Polystyrene fluorescent microspheres | Beckman Coulter | 6602336 | |
| Transmission electron microscopy | JEOL | JEM-1200EX | |
| Trypsin-EDTA solution | Gibco | 1713949 | |
| Ultra rainbow fluorescent particles | Beckman Coulter | B28479 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima-L80XP | |
| Ultracentrifuge rotor | Beckman Coulter | SW32TI |
References
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
- Meldolesi, J. Exosomes and ectosomes in intercellular communication. Current Biology. 28 (8), 435-444 (2018).
- Andaloussi, S. E. L., Mäger, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. A. Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities. Nature Reviews: Drug Discovery. 12 (5), 347-357 (2013).
- Smith, Z. J., et al. Single exosome study reveals subpopulations distributed among cell lines with variability related to membrane content. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 28533 (2015).
- Kalluri, R., LeBleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science. 367 (6478), (2020).
- Doyle, L. M., Wang, M. Z. Overview of extracellular vesicles, their origin, composition, purpose, and methods for exosome isolation and analysis. Cells. 8 (7), 727 (2019).
- Cvjetkovic, A., Lötvall, J., Lässer, C. The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 23111 (2014).
- Zeringer, E., Barta, T., Li, M., Vlassov, A. V.
- Muller, L., Hong, C. S., Stolz, D. B., Watkins, S. C., Whiteside, T. L. Isolation of biologically-active exosomes from human plasma. Journal of Immunological Methods. 411, 55-65 (2014).
- Taylor, D. D., Shah, S. Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes. Methods. 87, 3-10 (2015).
- Coughlan, C., et al. Exosome isolation by ultracentrifugation and precipitation and techniques for downstream analyses. Current Protocols in Cell Biology. 88 (1), 110 (2020).
- Yang, D., et al. and perspective on exosome isolation - efforts for efficient exosome-based theranostics. Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).
- Shao, H., et al. Chip-based analysis of exosomal mRNA mediating drug resistance in glioblastoma. Nature Communications. 6, 6999 (2015).
- Zarovni, N., et al. Integrated isolation and quantitative analysis of exosome shuttled proteins and nucleic acids using immunocapture approaches. Methods. 87, 46-58 (2015).
- Sidhom, K., Obi, P. O., Saleem, A. A. Review of exosomal isolation methods: is size exclusion chromatography the best option. International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6466 (2020).
- Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. Isolation of extracellular vesicles: general methodologies and latest trends. BioMed Research International. 2018, 8545347 (2018).
- McKinnon, K. M.
- Theodoraki, M. N., Hong, C. S., Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D., Whiteside, T. L. Evaluation of exosome proteins by on-bead flow cytometry. Cytometry A. 99 (4), 372-381 (2021).
- Nolan, J. P., Duggan, E. Analysis of individual extracellular vesicles by flow cytometry. Methods in Molecular Biology. 1678, 79-92 (2018).
- Nolan, J. P., Jones, J. C. Detection of platelet vesicles by flow cytometry. Platelets. 28 (3), 256-262 (2017).
- Dragovic, R. A., et al. Sizing and phenotyping of cellular vesicles using Nanoparticle Tracking Analysis. Nanomedicine. 7 (6), 780-788 (2011).
- Ramirez, M. I., et al. Technical challenges of working with extracellular vesicles. Nanoscale. 10 (3), 881-906 (2018).
- Song, X., et al. Improved strategy for jet-in-air cell sorting with high purity, yield, viability, and genome stability. FEBS Open Bio. 11 (9), 2453-2467 (2021).
- Zucker, R. M., Elstein, K. H., Gershey, E. L., Massaro, E. J. Increasing sensitivity of the Ortho analytical cytofluorograph by modifying the fluid system. Cytometry. 11 (7), 848-851 (1990).
