Summary
Este protocolo fornece um método de isolamento rápido e específico para pequenas vesículas extracelulares, otimizando o tamanho do bico de pulverização de ar, a pressão do fluido da bainha, a pressão do fluxo da amostra, a tensão, o ganho e os parâmetros do limiar de disparo.
Abstract
Pequenas vesículas extracelulares (sEV) podem ser liberadas de todos os tipos celulares e transportar proteínas, DNA e RNA. As moléculas sinalizadoras servem como indicadores do estado fisiológico e patológico de uma célula. No entanto, não há um método padrão para o isolamento de sEV, o que impede a identificação de biomarcadores a jusante e estudos de intervenção medicamentosa. Neste artigo, fornecemos um protocolo detalhado para o isolamento e purificação de sEV de 50-200 nm por um classificador de células de fluxo. Para isso, um bocal de 50 μm e uma pressão de fluido de bainha de 80 psi foram selecionados para obter uma boa taxa de classificação e fluxo lateral estável. Microesferas de poliestireno de tamanho padrão foram usadas para localizar populações de partículas de 100, 200 e 300 nm. Com a otimização adicional do limiar de disparo de tensão, ganho e dispersão direta (FSC), o sinal sEV pode ser separado do ruído de fundo. Essas otimizações fornecem um painel de configurações de classificação crítica que permite obter uma população representativa de sEV usando FSC vs. dispersão lateral (SSC) somente. O método de isolamento baseado em citometria de fluxo não só permite a análise de alto rendimento, mas também permite a classificação síncrona ou análise de proteoma de sEV com base na expressão de biomarcadores, abrindo inúmeras aplicações de pesquisa a jusante.
Introduction
Uma célula libera vesículas extracelulares (EVs) de tamanhos variados que resultam em moléculas sinalizadoras e inclusões de membrana, que são importantes para a comunicação intercelular1. EVs de diferentes tamanhos também desempenham diferentes papéis biológicos, com 50-200 nm sEV sendo capaz de distribuir precisamente RNA, DNA e proteínas para o local extracelular correto. A EV também ajuda a determinar seus mecanismos de secreção, envolvendo não apenas a regulação de processos fisiológicos normais, como vigilância imunológica, manutenção de células-tronco, coagulação sanguínea e reparo tecidual, mas também a patologia subjacente a várias doenças, como progressão tumoral e metástase2,3. O isolamento e a análise eficazes de sEV são críticos para identificar biomarcadores e projetar futuras intervenções medicamentosas.
Com pesquisas contínuas sobre a aplicação clínica de sEV, os métodos de isolamento de sEV apresentaram requisitos mais elevados. Devido à heterogeneidade dos EVs em tamanho, fonte e conteúdo, bem como sua semelhança com outros EVs em propriedades físico-químicas e bioquímicas, não existe um método padrão para o isolamento de EVs 4,5. Atualmente, ultracentrifugação, cromatografia de exclusão de tamanho (SEC), precipitação de polímero e captura de imunoafinidade são os métodos mais comuns de isolamento de sEV6. A ultracentrifugação ainda é o padrão ouro para o isolamento de sEV em pesquisas, apesar de ser demorada, resultando em baixa pureza com uma ampla distribuição de tamanho de 40-500 nm e danos mecânicos significativos ao sEV após centrifugação de longa duração 7,8,9. A precipitação polimérica, que geralmente utiliza polietilenoglicol (PEG), sofre de pureza inaceitável para posterior análise funcional com precipitação concomitante de agregados proteicos extracelulares e contaminação do polímero10,11. Métodos baseados em captura de imunoafinidade requerem anticorpos de alto custo com especificidade variável, além de apresentarem problemas com baixo volume de processamento e rendimento12,13,14. O tamanho das partículas é um dos principais indicadores para avaliar a pureza do sEV isolado. Embora a pureza do sEV continue sendo uma meta inatingível, o SEC remove uma quantidade considerável de componentes médios, e as partículas de sEV extraídas pelo método SEC estão principalmente na faixa de 50-200 nm15. As técnicas existentes apresentam algumas desvantagens, incluindo, mas não se limitando a, serem demoradas, de baixa pureza, baixo rendimento, baixa reprodutibilidade, baixo rendimento das amostras e dano potencial de sEV, o que a torna incompatível com o uso clínico16. Assim, um método de isolamento de sEV rápido, barato e com tamanho especificado aplicável a diversos biofluidos é uma necessidade essencial em várias situações clínicas e de pesquisa.
Na citometria de fluxo, partículas isoladas são analisadas de forma multiparamétrica de alto rendimento e os subconjuntos são separados17. Devido à heterogeneidade dos EVs, seria ideal uma medida por citometria de fluxo de partícula única, que tem sido utilizada para investigar EVs seguindo os paradigmas da análise celular, sendo utilizados marcadores de dispersão de luz e fluorescência para identificar características relacionadas à fisiologia e componentes proteicos18,19,20. No entanto, a citometria de fluxo convencional é desafiada pelo pequeno tamanho do sEV e baixa abundância de biomarcadores de superfície. A sensibilidade da citometria de fluxo pode ser melhorada otimizando-se os parâmetros de detecção para distinguir ruído de fundo e sEV, independentemente do uso do parâmetro de dispersão direta (FSC), dispersão lateral (SSC) ou limiar de fluorescência19.
Com o presente protocolo, os ajustes de classificação por citometria de fluxo de alta resolução foram otimizados usando esferas fluorescentes como padrão. Ao selecionar o tamanho adequado do bico, a pressão do fluido da bainha, o parâmetro de disparo do limiar e as tensões que controlam as intensidades de luz espalhada, conseguimos isolar um subconjunto específico de sEV de uma mistura complexa.
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Protocol
1. Cultura celular
- Preparar um meio de cultura de Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB). Cultura de célula humana de câncer de pâncreas, PANC-1, em frasco de 75cm2 a uma densidade de 1 x 106 células/mL. Incubar a cultura a 37 °C com 5% de CO2.
- Subcultivar as células quando a densidade celular atingir 75%-80% sob observação microscópica. Retire o meio e lave 2x com 3-5 mL de solução salina tampão fosfato (PBS; 0,01 M, pH 7,2-7,4).
- Descarte a solução, adicione 1-2 mL de solução de tripsina-EDTA e deixe as células se destacarem até ficarem arredondadas e suspensas no meio ao microscópio. Adicionar meio fresco, aspirar e dispersar em frascos de cultura de 75 cm2 com 15 mL de meio de cultura. Use uma proporção de subcultivo de 1:2 a 1:4 (recomendado).
OBS: Todas as operações são realizadas em gabinete de biossegurança para evitar contaminação celular.
2. Coleção de meios de cultura
- Incubar as células durante 48 h a 37 °C com 5% de CO2. Coletar sobrenadante celular (90 mL) em dois tubos de centrífuga de 50 mL e centrifugar a 300 x g por 10 min a 4 °C.
- Transferir o sobrenadante para novos tubos estéreis e centrifugar sucessivamente a 2.000 x g por 20 min, 10.000 x g por 30 min e 12.000 x g por 70 min a 4 °C.
- Retire o sobrenadante e lave o pellet com 10 mL de PBS pipetando suavemente. Centrifugar a 12.000 x g por 70 min a 4 °C novamente e ressuspender o pellet em 10 mL de tampão PBS para obter uma mistura de EVs.
- Realizar análise de rastreamento de nanopartículas (NTA) para quantificar e dimensionar a mistura de EV. Realizar a análise da NTA de acordo com o manual de referência de operação do instrumento e referência21.
3. Classificação de células
- Execute o procedimento de inicialização padrão do classificador de células de fluxo. Ligue a máquina pressionando o botão Iniciar . Clique no botão Laser Power no painel de controle do laser. Pressione o botão Change Tanks no submenu do amostrador inteligente para pressurizar os fluidics.
NOTA: Certifique-se de que o tanque de resíduos está vazio e o tanque de bainha está cheio antes de iniciar. - Use um bico de jato de ar de 50 μm limpo ultrassonicamente e instale-o no conjunto do bico. Ajuste a pressão para 80 psi para o fluido da bainha e 80,3 psi para o fluxo da amostra no console de pressão.
- Pressione o botão Start Sheath Flow para iniciar o fluxo da bainha. Clique no botão Bolha no submenu do amostrador inteligente para desborbulhar automaticamente por 10 minutos e, em seguida, desativá-lo.
NOTA: Para a classificação de células, diferentes tamanhos de bicos de pulverização de ar requerem diferentes pressões de fluido de bainha para manter a estabilidade do fluxo de líquido. Neste método, um bocal de 50 μm foi usado, e apenas uma pressão do fluido da bainha maior ou igual a 80 psi poderia gerar fluxos laterais estáveis. A diferença de pressão entre o fluxo da amostra e o fluido da bainha determina a velocidade de carregamento da triagem. Sob a condição de ajuste do método (a diferença de pressão entre o fluxo da amostra e o fluido da bainha é de 0,3-0,6 psi), o fluxo de líquido foi relativamente estável, e a velocidade de carregamento permitiu que a eficiência de classificação aumentasse de 50% para 80% para diferença de pressão menor que 0,3-0,6 psi. - Alinhe o fluxo e determine o ponto do laser. Ligue a luz da câmara de iluminação para visualizar o fluxo sobre os orifícios. Ajuste os micrômetros para cima e para baixo, esquerda e direita e frente e verso para centralizar o fluxo no orifício e focalizar o fluxo.
- Selecione a guia Laser e Interceptação de fluxo . Pressione o botão Seta Verde continuamente conforme solicitado para concluir o processo de calibração da interceptação a laser e do alinhamento do bico.
- Acesse a tela de alinhamento a laser fino. Selecione o canal 640-722/44 (H) como o parâmetro do eixo X e o canal 405-448/59 (H) como o parâmetro do eixo Y. Pressione o Seletor de parâmetros de gatilho e escolha o parâmetro SSC do laser de 488 nm. Abra todas as persianas a laser.
NOTA: Os parâmetros dos eixos X e Y escolhidos dependem da configuração a laser do sistema. Outros parâmetros são permitidos se o sistema não tiver um laser de 640 nm ou 405 nm. Para obter melhores resultados, selecione lasers com a maior separação espacial na tira pinhole (não incluindo o laser de 355 nm). - Diluir as partículas fluorescentes arco-íris adicionando uma gota em 1 mL de água bidestilada para uma concentração final de 1 x 106 esferas por mL. Abra a porta da câmara de amostra e carregue um tubo com as partículas fluorescentes do arco-íris preparadas.
- Pressione o botão Start Sample (Iniciar exemplo ). Ajuste os micrômetros para cima e para baixo para otimizar a intensidade da fluorescência, tornando cada sinal o mais intenso possível. Pressione o botão Start Quality Control (QC) no painel de controle da tela sensível ao toque para executar o QC automaticamente.
- Execute o atraso de queda. Acesse a tela de configuração de classificação e selecione o botão de atraso de queda. Pressione o botão IntelliSort Initialization (Inicialização do IntelliSort ). O instrumento ajusta automaticamente a frequência e a amplitude de oscilação da gota para obter o atraso de queda de 25 ± 5 e ser capaz de visualizar o ponto de ruptura da queda claramente. Pressione o botão Manter .
- Selecione tubo como o tipo de saída de classificação. Coloque um suporte de tubo de 15 mL na câmara de classificação. Ligue a tensão da placa e ajuste a tensão da placa para aproximadamente 4000 V.
- Ative o padrão de teste selecionando o botão Configuração de fluxo . Ajuste o controle deslizante da fase de carga e o controle deslizante de deflexão para garantir que a imagem do fluxo esteja alinhada com o tubo de coleta. Selecione o botão Marca de seleção .
- Faça login na estação de trabalho do Summit no computador. Crie um novo protocolo no menu principal Arquivo. Crie um gráfico de pontos selecionando a guia Histograma no painel de controle do software Summit.
- Clique com o botão direito do mouse nos eixos do novo gráfico de pontos no espaço de trabalho e escolha FSC como o parâmetro do eixo X e SSC como o parâmetro do eixo Y. Apresentar o FSC e o SSC de forma logarítmica.
- Selecione a guia Aquisição e localize o painel de parâmetros de aquisição. Habilite todos os sinais no submenu de parâmetros de ativação. Escolha FSC como o parâmetro de gatilho e defina o limite de 0,01. Ajuste a tensão e o ganho de FSC e SSC em 250 e 0,6 para garantir que os eventos dentro do gráfico FSC vs. SSC e as populações sejam separados.
NOTA: A definição de limiar é equivalente à definição do tamanho da partícula que pode ser detectada por citometria de fluxo. Quanto maior for o limiar, maiores serão as partículas detectadas, e as pequenas partículas serão cortadas pelo limiar e não poderão ser detectadas. Neste método, o limiar é definido como 0,01, para que todas as partículas maiores que o ruído eletrônico possam ser detectadas.
4. Isolamento de sEV
- Diluir as microesferas de poliestireno fluorescente para suspensões de 100 nm, 200 nm e 300 nm. Adicionar 1 μL de microesferas a 1 mL de água bidestilada.
- Carregue a suspensão da microesfera sucessivamente. Selecione Iniciar no menu de aquisição do software de cúpula e registre 20.000 eventos.
Observação : o número de eventos é opcional. Nada menos que 5.000 eventos são recomendados para atingir a significância estatística. - Clique com o botão direito do mouse no gráfico de pontos FSC vs. SSC para criar retângulos e arraste para redimensionar e reposicionar as regiões de ruído eletrônico e população de microesferas de 100 nm. Clique com o botão direito do mouse nas regiões para renomeá-las como R7 e R4, respectivamente. Repita os passos acima para enquadrar as microesferas de 200 nm e 300 nm com retângulos sucessivamente e renomeá-las como R5 e R6, respectivamente.
- Finalmente, determinar a região de classificação de 50-200 nm com base no ruído eletrônico e na posição das partículas de 200 nm definidas como R8.
NOTA: O limite inferior de detecção de 50 nm é colocado logo acima do ruído eletrônico do classificador de células de fluxo. A região entre o ruído e a população da microesfera de 200 nm pode, portanto, ser definida entre 50-200 nm. - Edite as decisões de classificação no painel de lógica de classificação e estatísticas. Clique duas vezes no campo em branco do fluxo esquerdo (L1). Selecione a região chamada R8 para criar a lógica de classificação. Escolha o modo de pureza Abortar e selecione um envelope de gota de 1 gota para o fluxo L1.
- Carregar 500 μL de amostra da mistura de EVs da etapa 2.3. Pressione o botão Iniciar no menu de aquisição no Summit para adquirir dados e pressione Iniciar no menu de classificação para coletar sEV de 50-200 nm em um tubo centrífugo de 15 mL.
NOTA: Um ambiente estéril é necessário para minimizar a contaminação durante qualquer procedimento. - Observar a presença de sEV por microscopia eletrônica de transmissão (MET) e verificar o tamanho de partícula de sEV utilizando NTA. Realizar análise de western blot (WB) para confirmar ainda mais a expressão dos marcadores CD9, CD63 e CD8118.
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Representative Results
O fluxograma do protocolo experimental é mostrado na Figura 1. Neste método, microesferas de poliestireno de tamanho padrão foram usadas como padrões de referência para distribuição de tamanho de partículas. Sob a condição de parâmetro instrumental específico, o sinal de partícula pode ser claramente distinguido do ruído de fundo no gráfico FSC vs. SSC usando a forma logarítmica. As estratégias de gating são mostradas na Figura 2. R4, R5 e R6 referem-se às posições das microesferas de 100 nm, 200 nm e 300 nm, respectivamente. R7 é o limite de detecção de ruído eletrônico abaixo de 50 nm, e R8 é a faixa de posição de partículas de 50-200 nm.
A distribuição granulométrica da mistura de EVs derivada das células PANC-1 estava na ampla faixa de 40-400 nm após a ultracentrifugação (Figura 3). Para isolar e purificar o sEV de 50-200 nm, foi realizada a triagem por citometria de fluxo para obter o tamanho específico de sEV de acordo com a localização das microesferas padrão (Figura 4). A qualidade do isolamento foi verificada por NTA, e verificou-se que a faixa de tamanho de partícula de sEV após a triagem estava entre 50-200 nm (como mostrado na Figura 5). A presença de sEV foi ainda observada pela MET, indicada pelas setas vermelhas na Figura 6A, e as sEVs isoladas foram confirmadas como contendo marcadores de CD9, CD63 e CD81 pela análise WB (Figura 6B).
Gráfico 1. Fluxograma do protocolo experimental. O meio de cultura celular PANC-1 foi coletado e ultracentrifugado para obtenção da mistura de EVs. Os parâmetros de classificação foram otimizados para isolamento e purificação de sEV 50-200 nm, o que foi verificado por NTA. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Gráfico 2. Análise por citometria de fluxo de microesferas de poliestireno de tamanho padrão para localizar a faixa de tamanho de 50-200 nm no gráfico FSC vs. SSC. Suspensões diluídas de microesferas de 100 nm, 200 nm e 300 nm foram carregadas e analisadas por citômetro de fluxo, como mostrado no gráfico de pontos FSC vs. SSC. R4, R5 e R6 referem-se às posições das partículas de 100 nm, 200 nm e 300 nm, respectivamente. R7 é o ruído eletrônico como limite de detecção para partículas de 50 nm, e R8 representa a faixa de posição de partículas de 50-200 nm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Gráfico 3. Análise NTA da distribuição granulométrica de EVs obtidos por ultracentrifugação. A distribuição de frequência dos diferentes tamanhos de partículas é representada pelos dados como porcentagem de partículas vs. tamanho. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Gráfico 4. Análise por citometria de fluxo da amostra de EV coletada. O gráfico de pontos FSC vs. SSC mostra uma amostra da mistura EV coletada carregada e analisada por um citômetro de fluxo. Os sEV na faixa de tamanho de 50-200 nm dentro da região R8 foram classificados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Gráfico 5. Verificação da distribuição granulométrica de sEV após a classificação usando NTA. O histograma representativo de porcentagem de partículas versus tamanho mostra a distribuição de tamanho do sEV classificado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Gráfico 6. Caracterização de sEV isolados por triagem. (A) Uma imagem TEM representativa do sEV classificado (indicada por setas vermelhas). Barra de escala = 200 nm. (B) Análise de Western blot dos marcadores CD9, CD81 e CD63 no sEV classificado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este protocolo descreve um método otimizado para isolar e purificar sEV com o tamanho de partícula especificado de 50-200 nm usando um classificador de células de fluxo, que foi validado por NTA. O método resolveu o problema do gargalo de obtenção de sEV com granulometria uniforme e alta pureza, evitando a interferência de moléculas biológicas não relacionadas envoltas em EVs de grande porte22. Análises rápidas e de alto rendimento são possíveis com a citometria de fluxo, que pode capturar 100.000 partículas por segundo e tomar 70.000 decisões de classificação por segundo17, reduzindo consideravelmente o tempo e refletindo a heterogeneidade das partículas de sEV. Além disso, este protocolo baseado em citometria de fluxo pode ser personalizado com base em interesses individuais em subpopulações de EVs de tamanhos específicos. Faixas de comportas alternativas podem ser usadas para identificar e isolar as populações de interesse com os mesmos parâmetros de instrumento definidos acima, como bico de pulverização de ar, pressão do fluido da bainha, pressão do fluxo da amostra e parâmetro de limiar de disparo.
A dificuldade técnica deste método reside na separação de populações com diferentes faixas de tamanho, particularmente distinguindo-se do ruído de fundo. Identificamos um painel de configurações de classificação crítica. Primeiro, o tamanho do bocal afeta a taxa de classificação. A fim de melhorar a concentração de sEV obtida por triagem, um bocal de 50 μm é usado neste método, e 80 psi de pressão do fluido da bainha é necessária para estabilizar o fluxo lateral. Com maior pressão do fluido da bainha, as frequências de queda aumentam, resultando em maiores taxas de eventos e menor tempo de triagem23. No entanto, o aumento da pressão do fluido da bainha atenua a sensibilidade dos sinais de FSC e fluorescência devido ao tempo reduzido de passagem pelo laser e ao número de fótons que chegam ao detector24. Notavelmente, é difícil manter a estabilidade do fluxo lateral sob essa pressão, o que requer alta limpeza do bocal e da tubulação. Em segundo lugar, a limpeza ultra-sônica do bocal e a lavagem dos tubos de citometria de fluxo são fortemente recomendadas para aumentar a probabilidade de sucesso experimental. Por fim, a tensão e o ganho são críticos para a separação da população, especialmente para partículas de tamanho pequeno. Aqui, uma tensão de 250 V e ganho de 0,6 pode efetivamente separar o sEV em 50-200 nm com disparo FSC e plotar em forma logarítmica.
Uma ressalva da abordagem é que, em alguns casos, a concentração do sEV é muito alta, ou do agregado sEV, durante o processo de triagem, dificultando a obtenção de uma suspensão de partícula única. O sEV agregado será descartado devido ao sinal superamplificado.
Coletivamente, com as vantagens da análise de alto rendimento da citometria de fluxo, esse método otimizou o tamanho do bico, a pressão do fluido da bainha, a pressão do fluxo da amostra e o parâmetro do limiar de disparo, levando ao isolamento bem-sucedido de sEV de 50-200 nm. Além disso, este método não só permite a separação de partículas de tamanho específico, mas também permite a classificação síncrona ou análise de proteoma de sEV com base na expressão de antígenos, abrindo inúmeras aplicações de pesquisa a jusante.
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Disclosures
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo Fundo de Pesquisa Científica da Universidade de Medicina Chinesa de Zhejiang (2020ZG29), pelo Projeto de Pesquisa de Bem-Estar Público Básico da Província de Zhejiang (LGF19H150006, LTGY23B070001), pelo Projeto do Departamento de Educação da Província de Zhejiang (Y202147028) e pelo Projeto de Tecnologia Experimental do Departamento de Laboratório da Universidade de Zhejiang (SJS201712, SYB202130).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge tube | Beckman Coulter | 344058 | |
| Culture flasks | Corning | 430641 | |
| Dulbecco’s modified eagle medium | Corning Cellgro | 10-013-CV | |
| Fetal bovine serum | SUER | SUER050QY | |
| Flow cell sorter | Beckman Coulter | Moflo Astrios EQ | |
| Human pancreatic cancer cell, PANC-1 | NA | NA | PANC-1 cells were donated by Professor Weijun Yang, College of Life Sciences, Zhejiang University |
| Laser particle size and zeta potential analyzer | Malvern | Zetasizer Nano ZS 90 | |
| Phosphate buffer saline | Gibco | C20012500BT | |
| Polystyrene fluorescent microspheres | Beckman Coulter | 6602336 | |
| Transmission electron microscopy | JEOL | JEM-1200EX | |
| Trypsin-EDTA solution | Gibco | 1713949 | |
| Ultra rainbow fluorescent particles | Beckman Coulter | B28479 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima-L80XP | |
| Ultracentrifuge rotor | Beckman Coulter | SW32TI |
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