Summary
Este protocolo proporciona un método de aislamiento rápido y específico del tamaño para pequeñas vesículas extracelulares al optimizar el tamaño de la boquilla de pulverización de aire, la presión del fluido de la vaina, la presión del flujo de muestra, el voltaje, la ganancia y los parámetros del umbral de activación.
Abstract
Las pequeñas vesículas extracelulares (sEV) pueden liberarse de todos los tipos de células y transportar proteínas, ADN y ARN. Las moléculas de señalización sirven como indicadores del estado fisiológico y patológico de una célula. Sin embargo, no existe un método estándar para el aislamiento de sEV, que impide la identificación de biomarcadores posteriores y los estudios de intervención farmacológica. En este artículo, proporcionamos un protocolo detallado para el aislamiento y purificación de 50-200 nm sEV mediante un clasificador de células de flujo. Para esto, se seleccionó una boquilla de 50 μm y una presión de fluido de vaina de 80 psi para obtener una buena velocidad de clasificación y una corriente lateral estable. Se utilizaron microesferas de poliestireno de tamaño estándar para localizar poblaciones de partículas de 100, 200 y 300 nm. Con una optimización adicional del umbral de activación de voltaje, ganancia y dispersión directa (FSC), la señal sEV podría separarse del ruido de fondo. Estas optimizaciones proporcionan un panel de configuraciones de ordenación críticas que permite obtener una población representativa de sEV utilizando FSC frente a dispersión lateral (SSC) solamente. El método de aislamiento basado en citometría de flujo no solo permite el análisis de alto rendimiento, sino que también permite la clasificación sincrónica o el análisis del proteoma de sEV basado en la expresión del biomarcador, abriendo numerosas aplicaciones de investigación posteriores.
Introduction
Una célula libera vesículas extracelulares (EV) de diferentes tamaños que resultan en moléculas de señalización e inclusiones de membrana, que son importantes para la comunicación intercelular1. Los EV de diferentes tamaños también desempeñan diferentes funciones biológicas, con 50-200 nm sEV que pueden distribuir con precisión ARN, ADN y proteínas a la ubicación extracelular correcta. El sEV también ayuda a determinar sus mecanismos de secreción, involucrando no sólo la regulación de los procesos fisiológicos normales, como la vigilancia inmune, el mantenimiento de células madre, la coagulación sanguínea y la reparación de tejidos, sino también la patología subyacente a varias enfermedades, como la progresión tumoral y la metástasis 2,3. El aislamiento y el análisis efectivos de sEV son críticos para identificar biomarcadores y diseñar futuras intervenciones farmacológicas.
Con la investigación continua sobre la aplicación clínica de sEV, los métodos de aislamiento de sEV han presentado requisitos más altos. Debido a la heterogeneidad del sEV en tamaño, fuente y contenido, así como a su similitud con otros EV en propiedades fisicoquímicas y bioquímicas, no existe un método estándar para el aislamiento de sEV 4,5. Actualmente, la ultracentrifugación, la cromatografía de exclusión de tamaño (SEC), la precipitación de polímeros y la captura de inmunoafinidad son los métodos de aislamiento de sEV más comunes6. La ultracentrifugación sigue siendo el estándar de oro para el aislamiento de sEV en la investigación, a pesar de llevar mucho tiempo, lo que resulta en una baja pureza con una amplia distribución de tamaño de 40-500 nm y daños mecánicos significativos en el sEV después de la centrifugación a largo plazo 7,8,9. La precipitación polimérica, que generalmente utiliza polietilenglicol (PEG), adolece de una pureza inaceptable para el análisis funcional posterior con precipitación concomitante de agregados proteicos extracelulares y contaminación polimérica10,11. Los métodos basados en la captura de inmunoafinidad requieren anticuerpos de alto costo con especificidad variable, así como problemas con el bajo volumen de procesamiento y rendimientos 12,13,14. El tamaño de partícula es uno de los principales indicadores para evaluar la pureza del sEV aislado. Aunque la pureza de sEV sigue siendo un objetivo inalcanzable, SEC elimina una cantidad considerable de componentes medios, y las partículas de sEV extraídas por el método SEC están principalmente en el rango de 50-200 nm15. Las técnicas existentes tienen algunas desventajas, incluyendo pero no limitado a ser lentas, baja pureza, bajo rendimiento, poca reproducibilidad, bajo rendimiento de las muestras, y daño potencial de sEV, lo que lo hace incompatible con la utilización clínica16. Por lo tanto, un método de aislamiento de sEV rápido, económico y de tamaño especificado aplicable a diversos biofluidos es una necesidad esencial en varias situaciones clínicas y de investigación.
En la citometría de flujo, las partículas individuales se analizan de manera multiparamétrica de alto rendimiento y los subconjuntos se clasifican17. Debido a la heterogeneidad de las EV, sería ideal una medición citométrica de flujo de una sola partícula, que se ha utilizado para investigar las EV siguiendo los paradigmas del análisis celular, con etiquetas de dispersión de luz y fluorescencia utilizadas para identificar características relacionadas con la fisiología y componentes proteicos18,19,20. Sin embargo, la citometría de flujo convencional se ve desafiada por el pequeño tamaño de sEV y la baja abundancia de biomarcadores de superficie. La sensibilidad de la citometría de flujo podría mejorarse optimizando los parámetros de detección para distinguir el ruido de fondo y el sEV, independientemente del uso del parámetro19 de dispersión directa (FSC), dispersión lateral (SSC) o umbral de fluorescencia.
Con el protocolo actual, los ajustes de clasificación por citometría de flujo de alta resolución se optimizaron utilizando perlas fluorescentes como estándar. Al seleccionar el tamaño adecuado de la boquilla, la presión del fluido de la vaina, el parámetro de activación del umbral y los voltajes que controlan las intensidades de luz dispersa, pudimos aislar un subconjunto específico de sEV de una mezcla compleja.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cultivo celular
- Prepare un medio de cultivo del Medio Águila Modificada (DMEM) de Dulbecco suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS). Cultivar la célula de cáncer de páncreas humano, PANC-1, en un matraz de cultivo de 75cm2 a una densidad de 1 x 106 células/ml. Incubar el cultivo a 37 °C con un 5% deCO2.
- Subcultivo de las células cuando la densidad celular alcanza el 75%-80% bajo observación microscópica. Retire el medio y enjuague 2x con 3-5 ml de solución salina tampón fosfato (PBS; 0.01 M, pH 7.2-7.4).
- Deseche la solución, agregue 1-2 ml de solución de tripsina-EDTA y deje que las células se desprendan hasta que se redondeen y suspendan en el medio bajo el microscopio. Añadir el medio fresco, aspirar y dispersar en matraces de cultivo de 75cm2 con 15 ml de medio de cultivo. Use una proporción de subcultivo de 1: 2 a 1: 4 (recomendado).
NOTA: Todas las operaciones se realizan en un gabinete de bioseguridad para evitar la contaminación celular.
2. Colección de medios de cultivo
- Incubar las células durante 48 h a 37 °C con 5% deCO2. Recoger sobrenadante celular (90 ml) en dos tubos centrífugos de 50 ml y centrifugar a 300 x g durante 10 min a 4 °C.
- Transfiera el sobrenadante a nuevos tubos estériles y centrifugar sucesivamente a 2.000 x g durante 20 min, 10 000 x g durante 30 min y 12.000 x g durante 70 min a 4 °C.
- Retire el sobrenadante y enjuague el pellet con 10 ml de PBS pipeteando suavemente. Centrifugar a 12.000 x g durante 70 min a 4 °C de nuevo y resuspender el pellet en 10 mL de tampón PBS para obtener una mezcla de EVs.
- Realizar análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) para cuantificar y dimensionar la mezcla de EV. Realice el análisis NTA de acuerdo con el manual de referencia de operación del instrumento y la referencia21.
3. Clasificación celular
- Realice el procedimiento de inicio estándar del clasificador de celdas de flujo. Encienda la máquina pulsando el botón Inicio . Haga clic en el botón Laser Power (Encendido láser ) en el panel de control láser. Pulse el botón Change Tanks (Cambiar tanques ) en el submenú del muestreador inteligente para presurizar la fluidos.
NOTA: Asegúrese de que el tanque de residuos esté vacío y que el tanque de la vaina esté lleno antes de arrancar. - Utilice una boquilla de chorro de aire de 50 μm limpiada por ultrasonidos e instálela en el conjunto de la boquilla. Ajuste la presión a 80 psi para el fluido de la vaina y 80.3 psi para el flujo de muestra en la consola de presión.
- Pulse el botón Start Sheath Flow (Iniciar flujo de vaina) para iniciar el flujo de flujo de la vaina. Haga clic en el botón Burbuja en el submenú del muestreador inteligente para desburbujear automáticamente durante 10 minutos y, a continuación, apáguelo.
NOTA: Para la clasificación de celdas, diferentes tamaños de boquillas de pulverización de aire requieren diferentes presiones de fluido de vaina para mantener la estabilidad del flujo de líquido. En este método, se utilizó una boquilla de 50 μm, y solo una presión de fluido de vaina mayor o igual a 80 psi podría generar corrientes laterales estables. La diferencia de presión entre el flujo de muestra y el fluido de la vaina determina la velocidad de carga de clasificación. Bajo la condición de ajuste del método (la diferencia de presión entre el flujo de muestra y el fluido de la vaina es de 0.3-0.6 psi), el flujo de líquido fue relativamente estable y la velocidad de carga permitió que la eficiencia de clasificación aumentara a 80% desde 50% para una diferencia de presión inferior a 0.3-0.6 psi. - Alinee la corriente y determine el punto láser. Encienda la luz de la cámara de iluminación para ver la corriente sobre los orificios. Ajuste los micrómetros arriba y abajo, izquierda y derecha y adelante y atrás para centrar la corriente en el agujero de alfiler y enfocar la corriente.
- Seleccione la pestaña Laser and Stream Intercept (Intercepción láser y de flujo ). Presione el botón de flecha verde continuamente según se le solicite para completar el proceso de calibración de intercepción láser y alineación de boquillas.
- Acceda a la pantalla de alineación láser fina. Seleccione el canal 640-722/44 (H) como parámetro del eje X y el canal 405-448/59 (H) como parámetro del eje Y. Pulse el selector de parámetros de disparo y elija el parámetro SSC del láser de 488 nm. Abra todas las persianas láser.
NOTA: Los parámetros de los ejes X e Y elegidos dependen de la configuración láser del sistema. Se permiten otros parámetros si el sistema no tiene un láser de 640 nm o 405 nm. Para obtener los mejores resultados, seleccione los láseres con la mayor separación espacial en la tira estenopeica (sin incluir el láser de 355 nm). - Diluir las partículas fluorescentes del arco iris añadiendo una gota en 1 ml de agua destilada doble para una concentración final de 1 x 106 perlas por ml. Abra la puerta de la cámara de muestras y cargue un tubo de las partículas fluorescentes arco iris preparadas.
- Presione el botón Iniciar muestra . Ajuste los micrómetros hacia arriba y hacia abajo para optimizar la intensidad de la fluorescencia, haciendo que cada señal sea lo más intensa posible. Pulse el botón Iniciar control de calidad (QC) en el panel de control de la pantalla táctil para realizar el control de calidad automáticamente.
- Realizar retardo de caída. Acceda a la pantalla de configuración de ordenación y seleccione el botón de retardo de caída. Presione el botón Inicialización de IntelliSort . El instrumento ajusta automáticamente la frecuencia y amplitud de la oscilación de gotas para obtener el retardo de caída de 25 ± 5 y poder visualizar claramente el punto de ruptura de la gota. Pulse el botón Mantener .
- Seleccione tubo como tipo de salida de ordenación. Coloque un portatubos de 15 ml en la cámara de clasificación. Encienda el voltaje de la placa y ajuste el voltaje de la placa a aproximadamente 4000 V.
- Active el patrón de prueba seleccionando el botón Configuración de transmisión . Ajuste el control deslizante de fase de carga y el control deslizante de deflexión para asegurarse de que la imagen de la transmisión esté alineada con el tubo de recolección. Seleccione el botón Marca de verificación .
- Inicie sesión en la estación de trabajo Summit en el equipo. Cree un nuevo protocolo desde el menú principal Archivo. Cree un diagrama de puntos seleccionando la pestaña Histograma en el panel de control del software Summit.
- Haga clic con el botón derecho en los ejes del nuevo diagrama de puntos en el espacio de trabajo y elija FSC como parámetro del eje X y SSC como parámetro del eje Y. Presentar el FSC y el SSC en forma logarítmica.
- Seleccione la ficha Adquisición y localice el panel de parámetros de adquisición. Habilite todas las señales en el submenú de habilitación de parámetros. Elija FSC como parámetro de activación y establezca el umbral de 0,01. Ajuste el voltaje y la ganancia de FSC y SSC a 250 y 0.6 para garantizar que los eventos dentro de la gráfica FSC vs. SSC y las poblaciones estén separados.
NOTA: El ajuste del umbral es equivalente al ajuste del tamaño de partícula que se puede detectar mediante citometría de flujo. Cuanto mayor sea el umbral, más grandes serán las partículas detectadas, y las partículas pequeñas serán cortadas por el umbral y no podrán ser detectadas. En este método, el umbral se establece en 0.01, por lo que se pueden detectar todas las partículas más grandes que el ruido electrónico.
4. Aislamiento de sEV
- Diluir las microesferas de poliestireno fluorescente en suspensiones de 100 nm, 200 nm y 300 nm. Añadir 1 μL de microesferas a 1 ml de agua destilada doble.
- Cargue la suspensión de microesferas sucesivamente. Seleccione Inicio en el menú de adquisición del software de la cumbre y registre 20,000 eventos.
NOTA: El número de eventos es opcional. Se recomiendan no menos de 5.000 eventos para cumplir con la significación estadística. - Haga clic con el botón derecho en el diagrama de puntos FSC vs. SSC para crear rectángulos y arrastre para cambiar el tamaño y la reposición de las regiones de ruido electrónico y la población de microesferas de 100 nm. Haga clic con el botón derecho en las regiones para cambiarles el nombre como R7 y R4, respectivamente. Repita los pasos anteriores para enmarcar las microesferas de 200 nm y 300 nm con rectángulos sucesivamente y cámbieles el nombre como R5 y R6, respectivamente.
- Finalmente, determine la región de clasificación de 50-200 nm basada en el ruido electrónico y la posición de las partículas de 200 nm definidas como R8.
NOTA: El límite inferior de detección de 50 nm se coloca justo por encima del ruido electrónico del clasificador de celdas de flujo. Por lo tanto, la región entre el ruido y la población de microesferas de 200 nm se puede definir entre 50-200 nm. - Edite las decisiones de ordenación en el panel Lógica de ordenación y estadísticas. Haga doble clic en el campo en blanco de la secuencia izquierda (L1). Seleccione la región denominada R8 para crear la lógica de ordenación. Elija el modo Abortar de pureza y seleccione un sobre de gotas de 1 gota para la secuencia L1.
- Cargue una muestra de 500 μL de mezcla de EVs del paso 2.3. Pulse el botón Inicio situado en el menú de adquisición de Summit para adquirir datos y, a continuación, pulse Inicio en el menú de ordenación para recoger 50-200 nm sEV en un tubo de centrífuga de 15 ml.
NOTA: Un ambiente estéril es necesario para minimizar la contaminación durante cualquier procedimiento. - Observe la presencia de sEV mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM) y verifique el tamaño de partícula de sEV utilizando NTA. Realizar análisis de Western blot (WB) para confirmar aún más la expresión de los marcadores CD9, CD63 y CD8118.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
El diagrama de flujo para el protocolo experimental se muestra en la Figura 1. En este método, se utilizaron microesferas de poliestireno de tamaño estándar como estándares de referencia para la distribución del tamaño de partícula. Bajo la condición específica del parámetro instrumental, la señal de partícula podría distinguirse claramente del ruido de fondo en la gráfica FSC vs. SSC utilizando la forma logarítmica. Las estrategias de acceso se muestran en la Figura 2. R4, R5 y R6 se refieren a las posiciones de las microesferas de 100 nm, 200 nm y 300 nm, respectivamente. R7 es el límite de detección de ruido electrónico por debajo de 50 nm, y R8 es el rango de posición de partículas de 50-200 nm.
La distribución del tamaño de partícula de la mezcla de EVs derivada de células PANC-1 estaba en el amplio rango de 40-400 nm después de la ultracentrifugación (Figura 3). Para aislar y purificar el sEV de 50-200 nm, se realizó una clasificación citométrica de flujo para obtener el tamaño específico de sEV de acuerdo con la ubicación de las microesferas estándar (Figura 4). La calidad del aislamiento fue verificada por NTA, y se encontró que el rango de tamaño de partícula de sEV después de la clasificación estaba entre 50-200 nm (como se muestra en la Figura 5). La presencia de sEV se observó además mediante TEM, indicado por flechas rojas en la Figura 6A, y se confirmó que los sEV aislados contenían marcadores de CD9, CD63 y CD81 mediante análisis WB (Figura 6B).
Figura 1. Diagrama de flujo para el protocolo experimental. Se recolectó el medio de cultivo celular PANC-1 y se ultracentrifugó para obtener la mezcla de EVs. Los parámetros de clasificación se optimizaron para el aislamiento y la purificación de 50-200 nm sEV, que fue verificado por NTA. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Análisis de citometría de flujo de microesferas de poliestireno de tamaño estándar para localizar el rango de tamaño de 50-200 nm en el gráfico FSC vs. SSC. Las suspensiones diluidas de microesferas de 100 nm, 200 nm y 300 nm se cargaron y analizaron mediante un citómetro de flujo como se muestra en el diagrama de puntos FSC vs. SSC. R4, R5 y R6 se refieren a las posiciones de las partículas de 100 nm, 200 nm y 300 nm, respectivamente. R7 es el ruido electrónico como límite de detección para partículas de 50 nm, y R8 representa el rango de posición de partículas de 50-200 nm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Análisis NTA de la distribución del tamaño de partícula de los EV obtenidos por ultracentrifugación. La distribución de frecuencia de diferentes tamaños de partículas se representa mediante los datos como porcentaje de partículas frente a tamaño. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Análisis por citometría de flujo de la muestra EV recogida. El diagrama de puntos FSC vs. SSC muestra una muestra de la mezcla EV recolectada cargada y analizada por un citómetro de flujo. Se clasificaron los sEV en el rango de tamaño de 50-200 nm dentro de la región R8. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. Verificación de la distribución del tamaño de partícula de sEV después de la clasificación mediante NTA. El histograma representativo de porcentaje de partículas frente a tamaño muestra la distribución de tamaño del sEV ordenado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6. Caracterización de sEV aislado por clasificación. (A) Una imagen TEM representativa de sEV ordenado (indicado por flechas rojas). Barra de escala = 200 nm. (B) Análisis Western blot de marcadores CD9, CD81 y CD63 en el sEV ordenado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Este protocolo describe un método optimizado para aislar y purificar sEV con el tamaño de partícula especificado de 50-200 nm utilizando un clasificador de células de flujo, que fue validado por NTA. El método resolvió el problema del cuello de botella de obtener sEV con tamaño de partícula uniforme y alta pureza, evitando la interferencia de moléculas biológicas no relacionadas envueltas en EV de gran tamaño22. Los análisis rápidos y de alto rendimiento son posibles con la citometría de flujo, que puede capturar 100.000 partículas por segundo y tomar 70.000 decisiones de clasificación por segundo17, reduciendo en gran medida el tiempo y reflejando la heterogeneidad de las partículas de sEV. Además, este protocolo basado en citometría de flujo se puede personalizar en función de los intereses individuales en subpoblaciones de EV de tamaños específicos. Se pueden utilizar rangos de compuerta alternativos para identificar y aislar las poblaciones de interés con los mismos parámetros del instrumento establecidos anteriormente, como la boquilla de pulverización de aire, la presión del fluido de la vaina, la presión del flujo de la muestra y el parámetro de umbral de activación.
La dificultad técnica de este método radica en la separación de poblaciones con diferentes rangos de tamaño, distinguiendo particularmente del ruido de fondo. Se identificó un panel de configuraciones de clasificación críticas. Primero, el tamaño de la boquilla afecta la velocidad de clasificación. Para mejorar la concentración de sEV obtenida por clasificación, se utiliza una boquilla de 50 μm en este método, y se requieren 80 psi de presión de fluido de vaina para estabilizar la corriente lateral. Con una mayor presión del fluido de la vaina, las frecuencias de caída aumentan, lo que resulta en mayores tasas de eventos y un tiempo de clasificación más corto23. Sin embargo, el aumento de la presión del fluido de la vaina atenúa la sensibilidad de las señales FSC y de fluorescencia debido al tiempo reducido que tarda en pasar a través del láser y al número de fotones que llegan al detector24. En particular, es difícil mantener la estabilidad de la corriente lateral bajo esta presión, lo que requiere una alta limpieza de la boquilla y la tubería. En segundo lugar, se recomienda encarecidamente la limpieza ultrasónica de la boquilla y el lavado de las tuberías de citometría de flujo para aumentar la probabilidad de éxito experimental. Por último, el voltaje y la ganancia son críticos para la separación de la población, especialmente para partículas de pequeño tamaño. Aquí, un voltaje de 250 V y una ganancia de 0.6 pueden separar efectivamente el sEV a 50-200 nm con disparo FSC y trazado en forma logarítmica.
Una advertencia del enfoque es que, en algunos casos, la concentración del sEV es demasiado alta, o el agregado de sEV, durante el proceso de clasificación, lo que dificulta lograr una suspensión de una sola partícula. El sEV agregado se descartará debido a la señal sobreamplificada.
En conjunto, con las ventajas del análisis de alto rendimiento de la citometría de flujo, este método optimizó el tamaño de la boquilla, la presión del fluido de la vaina, la presión del flujo de la muestra y el parámetro de umbral de activación que conduce a un aislamiento exitoso de 50-200 nm sEV. Además, este método no solo permite la separación de partículas de tamaño específico, sino que también permite la clasificación síncrona o el análisis del proteoma de sEV basado en la expresión de antígenos, abriendo numerosas aplicaciones de investigación posteriores.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores declaran no tener conflictos de intereses.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el Fondo de Investigación Científica de la Universidad de Medicina China de Zhejiang (2020ZG29), el Proyecto de Investigación de Bienestar Público Básico de la Provincia de Zhejiang (LGF19H150006, LTGY23B070001), el Proyecto del Departamento Provincial de Educación de Zhejiang (Y202147028) y el Proyecto de Tecnología Experimental del Departamento de Laboratorio de la Universidad de Zhejiang (SJS201712, SYB202130).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge tube | Beckman Coulter | 344058 | |
| Culture flasks | Corning | 430641 | |
| Dulbecco’s modified eagle medium | Corning Cellgro | 10-013-CV | |
| Fetal bovine serum | SUER | SUER050QY | |
| Flow cell sorter | Beckman Coulter | Moflo Astrios EQ | |
| Human pancreatic cancer cell, PANC-1 | NA | NA | PANC-1 cells were donated by Professor Weijun Yang, College of Life Sciences, Zhejiang University |
| Laser particle size and zeta potential analyzer | Malvern | Zetasizer Nano ZS 90 | |
| Phosphate buffer saline | Gibco | C20012500BT | |
| Polystyrene fluorescent microspheres | Beckman Coulter | 6602336 | |
| Transmission electron microscopy | JEOL | JEM-1200EX | |
| Trypsin-EDTA solution | Gibco | 1713949 | |
| Ultra rainbow fluorescent particles | Beckman Coulter | B28479 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima-L80XP | |
| Ultracentrifuge rotor | Beckman Coulter | SW32TI |
References
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
- Meldolesi, J. Exosomes and ectosomes in intercellular communication. Current Biology. 28 (8), 435-444 (2018).
- Andaloussi, S. E. L., Mäger, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. A. Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities. Nature Reviews: Drug Discovery. 12 (5), 347-357 (2013).
- Smith, Z. J., et al. Single exosome study reveals subpopulations distributed among cell lines with variability related to membrane content. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 28533 (2015).
- Kalluri, R., LeBleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science. 367 (6478), (2020).
- Doyle, L. M., Wang, M. Z. Overview of extracellular vesicles, their origin, composition, purpose, and methods for exosome isolation and analysis. Cells. 8 (7), 727 (2019).
- Cvjetkovic, A., Lötvall, J., Lässer, C. The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 23111 (2014).
- Zeringer, E., Barta, T., Li, M., Vlassov, A. V.
- Muller, L., Hong, C. S., Stolz, D. B., Watkins, S. C., Whiteside, T. L. Isolation of biologically-active exosomes from human plasma. Journal of Immunological Methods. 411, 55-65 (2014).
- Taylor, D. D., Shah, S. Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes. Methods. 87, 3-10 (2015).
- Coughlan, C., et al. Exosome isolation by ultracentrifugation and precipitation and techniques for downstream analyses. Current Protocols in Cell Biology. 88 (1), 110 (2020).
- Yang, D., et al. and perspective on exosome isolation - efforts for efficient exosome-based theranostics. Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).
- Shao, H., et al. Chip-based analysis of exosomal mRNA mediating drug resistance in glioblastoma. Nature Communications. 6, 6999 (2015).
- Zarovni, N., et al. Integrated isolation and quantitative analysis of exosome shuttled proteins and nucleic acids using immunocapture approaches. Methods. 87, 46-58 (2015).
- Sidhom, K., Obi, P. O., Saleem, A. A. Review of exosomal isolation methods: is size exclusion chromatography the best option. International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6466 (2020).
- Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. Isolation of extracellular vesicles: general methodologies and latest trends. BioMed Research International. 2018, 8545347 (2018).
- McKinnon, K. M.
- Theodoraki, M. N., Hong, C. S., Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D., Whiteside, T. L. Evaluation of exosome proteins by on-bead flow cytometry. Cytometry A. 99 (4), 372-381 (2021).
- Nolan, J. P., Duggan, E. Analysis of individual extracellular vesicles by flow cytometry. Methods in Molecular Biology. 1678, 79-92 (2018).
- Nolan, J. P., Jones, J. C. Detection of platelet vesicles by flow cytometry. Platelets. 28 (3), 256-262 (2017).
- Dragovic, R. A., et al. Sizing and phenotyping of cellular vesicles using Nanoparticle Tracking Analysis. Nanomedicine. 7 (6), 780-788 (2011).
- Ramirez, M. I., et al. Technical challenges of working with extracellular vesicles. Nanoscale. 10 (3), 881-906 (2018).
- Song, X., et al. Improved strategy for jet-in-air cell sorting with high purity, yield, viability, and genome stability. FEBS Open Bio. 11 (9), 2453-2467 (2021).
- Zucker, R. M., Elstein, K. H., Gershey, E. L., Massaro, E. J. Increasing sensitivity of the Ortho analytical cytofluorograph by modifying the fluid system. Cytometry. 11 (7), 848-851 (1990).
