Summary
Denne protokol giver en hurtig og størrelsesspecifik isoleringsmetode til små ekstracellulære vesikler ved at optimere størrelsen på luftsprøjtedysen, kappevæsketrykket, prøveflowtrykket, spændingen, forstærkningen og udløsningstærskelparametrene.
Abstract
Små ekstracellulære vesikler (sEV) kan frigives fra alle celletyper og bære protein, DNA og RNA. Signalmolekyler tjener som indikatorer for en celles fysiologiske og patologiske tilstand. Der findes imidlertid ingen standardmetode til sEV-isolering, som forhindrer downstream-biomarkøridentifikation og lægemiddelinterventionsundersøgelser. I denne artikel giver vi en detaljeret protokol til isolering og oprensning af 50-200 nm sEV ved hjælp af en flowcellesorterer. Til dette blev der valgt en 50 μm dyse og 80 psi kappevæsketryk for at opnå en god sorteringshastighed og stabil sidestrøm. Standardstørrelse polystyrenmikrosfærer blev brugt til at lokalisere populationer af 100, 200 og 300 nm partikler. Med yderligere optimering af udløsertærsklen for spænding, forstærkning og fremadspredning (FSC) kunne sEV-signalet adskilles fra baggrundsstøjen. Disse optimeringer giver et panel af kritiske sorteringsindstillinger, der gør det muligt at opnå en repræsentativ population af sEV udelukkende ved hjælp af FSC vs. side scatter (SSC). Den flowcytometribaserede isolationsmetode giver ikke kun mulighed for analyse med høj kapacitet, men giver også mulighed for synkron klassificering eller proteomanalyse af sEV baseret på biomarkørekspressionen, hvilket åbner adskillige downstream-forskningsapplikationer.
Introduction
En celle frigiver ekstracellulære vesikler (EV'er) af forskellig størrelse, der resulterer i signalmolekyler og membranindeslutninger, som er vigtige for intercellulær kommunikation1. EV'er i forskellige størrelser spiller også forskellige biologiske roller, hvor 50-200 nm sEV er i stand til præcist at distribuere RNA, DNA og proteiner til den korrekte ekstracellulære placering. SEV hjælper også med at bestemme deres sekretionsmekanismer, der ikke kun involverer regulering af normale fysiologiske processer såsom immunovervågning, stamcellevedligeholdelse, blodkoagulation og vævsreparation, men også patologien bag flere sygdomme såsom tumorprogression og metastase 2,3. Effektiv isolering og analyse af sEV er afgørende for at identificere biomarkører og designe fremtidige lægemiddelinterventioner.
Med kontinuerlig forskning i den kliniske anvendelse af sEV har isolationsmetoderne for sEV fremsat højere krav. På grund af heterogeniteten af sEV i størrelse, kilde og indhold samt deres lighed med andre EV'er i fysisk-kemiske og biokemiske egenskaber er der ingen standardmetode til sEV-isolering 4,5. I øjeblikket er ultracentrifugering, størrelsesekskluderingskromatografi (SEC), polymerudfældning og immunoaffinitetsindfangning de mest almindelige sEV-isolationsmetoder6. Ultracentrifugering er stadig guldstandarden for sEV-isolering i forskning, på trods af at det er tidskrævende, hvilket resulterer i lav renhed med en bred størrelsesfordeling på 40-500 nm og betydelig mekanisk skade på sEV efter langvarig centrifugering 7,8,9. Polymerudfældning, som normalt bruger polyethylenglycol (PEG), lider af uacceptabel renhed til efterfølgende funktionel analyse med samtidig udfældning af ekstracellulære proteinaggregater og polymerforurening10,11. Immunoaffinitetsfangstbaserede metoder kræver dyre antistoffer med varierende specificitet samt har problemer med lavt behandlingsvolumen og giver12,13,14. Partikelstørrelse er en af hovedindikatorerne til evaluering af renheden af isoleret sEV. Selvom sEV-renhed forbliver et uopnåeligt mål, fjerner SEC en betydelig mængde mediumkomponenter, og sEV-partiklerne ekstraheret ved SEC-metoden ligger hovedsageligt i området 50-200 nm15. De eksisterende teknikker har nogle få ulemper, herunder, men ikke begrænset til, at være tidskrævende, lav renhed, lavt udbytte, dårlig reproducerbarhed, lav gennemstrømning af prøver og potentiel skade på sEV, hvilket gør det uforeneligt med klinisk udnyttelse16. Således er en hurtig, billig og størrelsesspecificeret sEV-isoleringsmetode, der gælder for forskellige biofluider, et væsentligt behov i flere forsknings- og kliniske situationer.
I flowcytometri analyseres enkeltpartikler på en multiparametrisk måde med høj kapacitet, og delmængder sorteres ud17. På grund af EV'ernes heterogenitet ville en cytometrisk måling af enkeltpartikelflow være ideel, som er blevet brugt til at undersøge EV'er efter paradigmerne for celleanalyse, hvor lyssprednings- og fluorescensetiketter bruges til at identificere fysiologirelaterede egenskaber og proteinkomponenter18,19,20. Ikke desto mindre udfordres konventionel flowcytometri af den lille størrelse af sEV og lav overflod af overfladebiomarkører. Følsomheden af flowcytometri kan forbedres ved at optimere detektionsparametre for at skelne baggrundsstøj og sEV uanset brug af fremadrettet spredning (FSC), sidespredning (SSC) eller fluorescenstærskeludløsende parameter19.
Med den nuværende protokol blev flowcytometriske sorteringsindstillinger med høj opløsning optimeret ved hjælp af fluorescerende perler som standard. Ved at vælge den korrekte dysestørrelse, kappevæsketryk, tærskeludløsningsparameter og spændinger, der styrer spredte lysintensiteter, var vi i stand til at isolere en specifik delmængde af sEV fra en kompleks blanding.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cellekultur
- Forbered et dyrkningsmedium af Dulbeccos modificerede ørnemedium (DMEM) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS). Dyrk den menneskelige kræftcelle i bugspytkirtlen, PANC-1, i en 75 cm2 kulturkolbe med en densitet på 1 x 106 celler / ml. Kulturen inkuberes ved 37 °C med 5% CO2.
- Subkultur cellerne, når celletætheden når 75% -80% under mikroskopisk observation. Fjern mediet, og skyl 2x med 3-5 ml fosfatbuffersaltvand (PBS; 0,01 M, pH 7,2-7,4).
- Kassér opløsningen, tilsæt 1-2 ml trypsin-EDTA-opløsning, og lad cellerne løsne sig, indtil de bliver afrundet og suspenderet i mediet under mikroskopet. Tilsæt frisk medium, aspirer og fordel i 75 cm2 dyrkningskolber med 15 ml kulturmedium. Brug et underdyrkningsforhold på 1: 2 til 1: 4 (anbefales).
BEMÆRK: Alle operationer udføres i et biosikkerhedsskab for at undgå cellekontaminering.
2. Indsamling af kulturmedium
- Cellerne inkuberes i 48 timer ved 37 °C med 5% CO2. Cellesupernatant (90 ml) opsamles i to 50 ml centrifugeglas og centrifugeres ved 300 x g i 10 minutter ved 4 °C.
- Supernatanten overføres til nye sterile glas og centrifugeres successivt ved 2 000 x g i 20 minutter, 10 000 x g i 30 minutter og 12 000 x g i 70 minutter ved 4 °C.
- Supernatanten fjernes og pellets skylles med 10 ml PBS ved forsigtigt pipettering. Der centrifugeres igen ved 12.000 x g i 70 minutter ved 4 °C, og pelletpen resuspenderes i 10 ml PBS-buffer for at opnå en blanding af elbiler.
- Udfør nanopartikelsporingsanalyse (NTA) for at kvantificere og dimensionere EV-blandingen. NTA-analysen udføres i henhold til instrumentbetjeningsreferencemanualen og reference21.
3. Cellesortering
- Udfør standardstartproceduren for flowcellesorteringen. Tænd maskinen ved at trykke på knappen Start . Klik på knappen Lasertænd/sluk på laserkontrolpanelet. Tryk på knappen Skift beholdere i undermenuen smart sampler for at sætte fluidikken under tryk.
BEMÆRK: Sørg for, at affaldstanken er tom, og at kappetanken er fuld, inden du starter. - Brug en ultralydrenset 50 μm jet-in-air-dyse og installer den på dyseenheden. Juster trykket til 80 psi for kappevæske og 80,3 psi for prøveflow på trykkonsollen.
- Tryk på knappen Start kappeflow for at starte kappestrømmen. Klik på bobleknappen i undermenuen smart sampler for automatisk at deboble i 10 minutter og derefter slukke for den.
BEMÆRK: Til cellesortering kræver forskellige størrelser luftsprøjtedyser forskellige kappevæsketryk for at opretholde væskestrømningsstabilitet. I denne metode blev der anvendt en dyse på 50 μm, og kun et kappevæsketryk større end eller lig med 80 psi kunne generere stabile sidestrømme. Trykforskellen mellem prøvestrømmen og kappevæsken bestemmer sorteringshastigheden. Under metodens indstillingsbetingelse (trykforskellen mellem prøvestrømmen og kappevæsken er 0,3-0,6 psi) var væskestrømmen relativt stabil, og belastningshastigheden gjorde det muligt for sorteringseffektiviteten at stige til 80% fra 50% for trykforskel mindre end 0,3-0,6 psi. - Juster strømmen, og bestem laserpunktet. Tænd belysningskammerets lys for at se strømmen over pinholes. Juster mikrometer op og ned, venstre og højre og for- og bagside for at centrere strømmen på pinhullet og fokusere strømmen.
- Vælg fanen Laser og Stream Intercept . Tryk kontinuerligt på den grønne pileknap , når du bliver bedt om det, for at fuldføre laserskærings- og dysejusteringskalibreringsprocessen.
- Få adgang til skærmen med finlaserjustering. Vælg 640-722/44 (H)-kanal som X-akseparameter og 405-448/59 (H) -kanal som Y-akseparameter. Tryk på udløserparametervælgeren , og vælg SSC-parameteren for 488 nm-laseren. Åbn alle laserskodder.
BEMÆRK: De valgte parametre for X-aksen og Y-aksen afhænger af systemets laserkonfiguration. Andre parametre er tilladt, hvis systemet ikke har en 640 nm eller 405 nm laser. Du opnår de bedste resultater ved at vælge lasere med den største rumlige adskillelse på pinhole-strimlen (ikke inklusive 355 nm-laseren). - Fortynd regnbuens fluorescerende partikler ved at tilsætte en dråbe i 1 ml dobbeltdestilleret vand til en slutkoncentration på 1 x 106 perler pr. ml. Åbn døren til prøvekammeret, og læg et rør med de fremstillede regnbuefluorescerende partikler i.
- Tryk på knappen Start eksempel . Juster op og ned mikrometer for at optimere fluorescensintensiteten, hvilket gør hvert signal så intenst som muligt. Tryk på knappen Start kvalitetskontrol (QC) på berøringsskærmens kontrolpanel for at udføre QC automatisk.
- Udfør forsinkelse af fald. Åbn sorteringsopsætningsskærmen, og vælg knappen Drop delay. Tryk på knappen IntelliSort-initialisering . Instrumentet justerer automatisk frekvensen og amplituden af dråbeoscillation for at opnå faldforsinkelsen på 25 ± 5 og være i stand til at visualisere dråbens brudpunkt tydeligt. Tryk på knappen Vedligehold .
- Vælg rør som sorteringsoutputtype. Anbring en 15 ml rørholder i sorteringskammeret. Tænd pladespændingen, og indstil pladespændingen til ca. 4000 V.
- Slå testmønsteret til ved at vælge knappen Streamopsætning . Juster skyderen for opladningsfasen og skyderen for afbøjning for at sikre, at billedet af strømmen er ud for opsamlingsrøret. Vælg knappen Afkrydsning .
- Log ind på Summit-arbejdsstationen på computeren. Opret en ny protokol fra hovedmenuen Filer. Opret et prikplot ved at vælge fanen Histogram i Summit-softwarens kontrolpanel.
- Højreklik på akserne i det nye punktdiagram i arbejdsområdet, og vælg FSC som X-akseparameter og SSC som Y-akseparameter. Præsenter FSC og SSC i logaritmisk form.
- Vælg fanen Anskaffelse , og find panelet med anskaffelsesparametre. Aktivér alle signaler i undermenuen for aktiveringsparametre. Vælg FSC som udløserparameter, og indstil tærsklen til 0,01. Juster spændingen og forstærkningen af FSC og SSC ved 250 og 0,6 for at sikre, at begivenheder inden for FSC vs. SSC-plottet og populationer adskilles.
BEMÆRK: Tærskelindstilling svarer til indstilling af den partikelstørrelse, der kan detekteres ved flowcytometri. Jo større tærsklen er, jo større vil de detekterede partikler være, og de små partikler vil blive afskåret af tærsklen og kan ikke detekteres. I denne metode er tærsklen indstillet til 0, 01, så alle partikler større end elektronisk støj kan detekteres.
4. Isolering af sEV
- De fluorescerende polystyrenmikrosfærer fortyndes til suspensioner på 100 nm, 200 nm og 300 nm. Tilsæt 1 μL mikrosfærer til 1 ml dobbeltdestilleret vand.
- Indlæs mikrosfæreophænget successivt. Vælg Start under anskaffelsesmenuen for topmødesoftware, og optag 20.000 begivenheder.
BEMÆRK: Antallet af hændelser er valgfrit. Ikke mindre end 5.000 hændelser anbefales for at imødekomme statistisk signifikans. - Højreklik på FSC vs. SSC dot plot for at oprette rektangler og træk for at ændre størrelse og flytte regionerne med elektronisk støj og 100 nm mikrosfærepopulation. Højreklik på regionerne for at omdøbe dem til henholdsvis R7 og R4. Gentag ovenstående trin for at indramme mikrosfærerne 200 nm og 300 nm med rektangler successivt og omdøbe dem til henholdsvis R5 og R6.
- Endelig bestemmes sorteringsområdet 50-200 nm baseret på den elektroniske støj og placeringen af 200 nm partikler defineret som R8.
BEMÆRK: Den nedre detektionsgrænse på 50 nm er placeret lige over flowcellesortererens elektroniske støj. Området mellem støjen og 200 nm mikrosfærepopulationen kan derfor defineres til at være mellem 50-200 nm. - Rediger sorteringsbeslutninger i panelet Sorteringslogik og statistik. Dobbeltklik på det tomme felt i den venstre (L1) strøm. Vælg området R8 for at oprette sorteringslogikken. Vælg tilstanden Afbryd renhed, og vælg en dråbekonvolut med 1 dråbe til L1-strømmen.
- Der fyldes 500 μL prøve af EV-blanding fra trin 2.3. Tryk på Start-knappen under anskaffelsesmenuen i Summit for at hente data, og tryk derefter på Start i sorteringsmenuen for at samle 50-200 nm sEV i et 15 ml centrifugerør.
BEMÆRK: Et sterilt miljø er nødvendigt for at minimere kontaminering under enhver procedure. - Overhold tilstedeværelsen af sEV ved transmissionselektronmikroskopi (TEM), og kontroller partikelstørrelsen af sEV ved hjælp af NTA. Udfør Western blot-analyse (WB) for yderligere at bekræfte ekspressionen af CD9-, CD63- og CD81-markører18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Rutediagrammet for forsøgsprotokollen er vist i figur 1. I denne metode blev polystyrenmikrosfærer i standardstørrelse anvendt som referencestandarder for partikelstørrelsesfordeling. Under den specifikke instrumentparameterbetingelse kunne partikelsignalet tydeligt skelnes fra baggrundsstøjen i FSC vs. SSC-plottet ved hjælp af den logaritmiske form. Gating strategier er vist i figur 2. R4, R5 og R6 henviser til positionerne for henholdsvis 100 nm, 200 nm og 300 nm mikrosfærer. R7 er detektionsgrænsen for elektronisk støj under 50 nm, og R8 er positionsområdet for 50-200 nm partikler.
Partikelstørrelsesfordelingen af EVs-blandingen afledt af PANC-1-celler var i det brede område 40-400 nm efter ultracentrifugering (figur 3). For at isolere og rense 50-200 nm sEV blev flowcytometrisk sortering udført for at opnå den specifikke størrelse sEV i henhold til placeringen af standardmikrosfærer (figur 4). Kvaliteten af isolationen blev verificeret af NTA, og det blev konstateret, at partikelstørrelsesområdet for sEV efter sortering var mellem 50-200 nm (som vist i figur 5). Tilstedeværelsen af sEV blev yderligere observeret af TEM, angivet med røde pile i figur 6A, og de isolerede sEV'er blev bekræftet at indeholde markører for CD9, CD63 og CD81 ved WB-analyse (figur 6B).
Figur 1. Rutediagramdiagram for forsøgsprotokollen. PANC-1-cellekulturmedium blev opsamlet og ultracentrifugeret for at opnå EV-blandingen. Sorteringsparametre blev optimeret til isolering og oprensning af 50-200 nm sEV, som blev verificeret af NTA. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2. Flowcytometrianalyse af polystyrenmikrosfærer i standardstørrelse for at lokalisere størrelsesområdet 50-200 nm i FSC vs. SSC-plottet. Fortyndede suspensioner på 100 nm, 200 nm og 300 nm mikrosfærer blev indlæst og analyseret af et flowcytometer som vist i FSC vs. SSC dot plot. R4, R5 og R6 henviser til positionerne for henholdsvis 100 nm, 200 nm og 300 nm partikler. R7 er den elektroniske støj som detektionsgrænse for 50 nm partikler, og R8 repræsenterer positionsområdet for 50-200 nm partikler. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3. NTA-analyse af partikelstørrelsesfordeling af EV'er opnået ved ultracentrifugering. Frekvensfordelingen af forskellige partikelstørrelser repræsenteres af dataene som partikelprocent vs. størrelse. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4. Flowcytometrianalyse af den opsamlede EV-prøve. FSC vs. SSC dot plottet viser en prøve af den opsamlede EV-blanding indlæst og analyseret af et flowcytometer. SEV i størrelsesområdet 50-200 nm inden for R8-regionen blev sorteret. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5. Verifikation af partikelstørrelsesfordeling af sEV efter sortering ved hjælp af NTA. Repræsentativ partikelprocent vs. størrelseshistogram viser størrelsesfordelingen af den sorterede sEV. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6. Karakterisering af sEV isoleret ved sortering. (A) Et repræsentativt TEM-billede af sorteret sEV (angivet med røde pile). Skala bar = 200 nm. (B) Western blot-analyse af CD9-, CD81- og CD63-markører i den sorterede sEV. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol skitserer en optimeret metode til at isolere og rense sEV med den specificerede partikelstørrelse på 50-200 nm ved hjælp af en flowcellesorterer, som blev valideret af NTA. Metoden løste flaskehalsproblemet med at opnå sEV med ensartet partikelstørrelse og høj renhed og undgå interferens fra ikke-relaterede biologiske molekyler pakket ind i store elbiler22. Hurtige analyser med høj kapacitet er mulige med flowcytometri, som kan fange 100.000 partikler pr. sekund og træffe 70.000 sorteringsbeslutninger pr. sekund17, hvilket i høj grad reducerer tiden og afspejler heterogeniteten af sEV-partikler. Desuden kan denne flowcytometribaserede protokol tilpasses baseret på individuelle interesser i underpopulationer af elbiler af specifikke størrelser. Alternative gateområder kan bruges til at identificere og isolere populationer af interesse med de samme instrumentparametre, der er indstillet som ovenstående, såsom luftsprøjtedyse, kappevæsketryk, prøveflowtryk og udløsningstærskelparameter.
Den tekniske vanskelighed ved denne metode ligger i adskillelsen af populationer med forskellige størrelsesintervaller, især ved at skelne fra baggrundsstøj. Vi identificerede et panel med kritiske sorteringsindstillinger. For det første påvirker dysens størrelse sorteringshastigheden. For at forbedre koncentrationen af sEV opnået ved sortering anvendes en 50 μm dyse i denne metode, og der kræves 80 psi kappevæsketryk for at stabilisere sidestrømmen. Med højere kappevæsketryk øges faldfrekvenserne, hvilket resulterer i højere hændelseshastigheder og kortere sorteringstid23. Imidlertid dæmper stigende kappevæsketryk følsomheden af FSC- og fluorescenssignaler på grund af den reducerede tid, det tager at passere gennem laseren, og antallet af fotoner, der når detektoren24. Især er det vanskeligt at opretholde stabiliteten af sidestrømmen under dette tryk, hvilket kræver høj renhed af dysen og rørledningen. For det andet anbefales ultralydsrensning af dysen og skylning af flowcytometrirør kraftigt for at øge sandsynligheden for eksperimentel succes. Endelig er spænding og forstærkning afgørende for befolkningsadskillelse, især for små partikler. Her kan en spænding på 250 V og forstærkning på 0,6 effektivt adskille sEV ved 50-200 nm med FSC-udløsning og plotte i logaritmisk form.
En advarsel ved tilgangen er, at koncentrationen af sEV i nogle tilfælde er for høj eller sEV-aggregatet under sorteringsprocessen, hvilket gør det vanskeligt at opnå en enkeltpartikelsuspension. Den aggregerede sEV kasseres på grund af det overforstærkede signal.
Samlet set, med fordelene ved high-throughput analyse af flowcytometri, optimerede denne metode dysestørrelse, kappevæsketryk, prøveflowtryk og udløsningstærskelparameter, hvilket førte til vellykket isolering af 50-200 nm sEV. Desuden tillader denne metode ikke kun adskillelse af specifikke størrelsespartikler, men den giver også mulighed for synkron klassificering eller proteomanalyse af sEV baseret på antigenekspression, hvilket åbner op for adskillige downstream-forskningsapplikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af den videnskabelige forskningsfond ved Zhejiang Chinese Medicine University (2020ZG29), det grundlæggende offentlige velfærdsforskningsprojekt i Zhejiang-provinsen (LGF19H150006, LTGY23B070001), projektet fra Zhejiang Provincial Department of Education (Y202147028) og projektet om eksperimentel teknologi fra Zhejiang University Laboratory Department (SJS201712, SYB202130).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge tube | Beckman Coulter | 344058 | |
| Culture flasks | Corning | 430641 | |
| Dulbecco’s modified eagle medium | Corning Cellgro | 10-013-CV | |
| Fetal bovine serum | SUER | SUER050QY | |
| Flow cell sorter | Beckman Coulter | Moflo Astrios EQ | |
| Human pancreatic cancer cell, PANC-1 | NA | NA | PANC-1 cells were donated by Professor Weijun Yang, College of Life Sciences, Zhejiang University |
| Laser particle size and zeta potential analyzer | Malvern | Zetasizer Nano ZS 90 | |
| Phosphate buffer saline | Gibco | C20012500BT | |
| Polystyrene fluorescent microspheres | Beckman Coulter | 6602336 | |
| Transmission electron microscopy | JEOL | JEM-1200EX | |
| Trypsin-EDTA solution | Gibco | 1713949 | |
| Ultra rainbow fluorescent particles | Beckman Coulter | B28479 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima-L80XP | |
| Ultracentrifuge rotor | Beckman Coulter | SW32TI |
References
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
- Meldolesi, J. Exosomes and ectosomes in intercellular communication. Current Biology. 28 (8), 435-444 (2018).
- Andaloussi, S. E. L., Mäger, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. A. Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities. Nature Reviews: Drug Discovery. 12 (5), 347-357 (2013).
- Smith, Z. J., et al. Single exosome study reveals subpopulations distributed among cell lines with variability related to membrane content. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 28533 (2015).
- Kalluri, R., LeBleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science. 367 (6478), (2020).
- Doyle, L. M., Wang, M. Z. Overview of extracellular vesicles, their origin, composition, purpose, and methods for exosome isolation and analysis. Cells. 8 (7), 727 (2019).
- Cvjetkovic, A., Lötvall, J., Lässer, C. The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 23111 (2014).
- Zeringer, E., Barta, T., Li, M., Vlassov, A. V.
- Muller, L., Hong, C. S., Stolz, D. B., Watkins, S. C., Whiteside, T. L. Isolation of biologically-active exosomes from human plasma. Journal of Immunological Methods. 411, 55-65 (2014).
- Taylor, D. D., Shah, S. Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes. Methods. 87, 3-10 (2015).
- Coughlan, C., et al. Exosome isolation by ultracentrifugation and precipitation and techniques for downstream analyses. Current Protocols in Cell Biology. 88 (1), 110 (2020).
- Yang, D., et al. and perspective on exosome isolation - efforts for efficient exosome-based theranostics. Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).
- Shao, H., et al. Chip-based analysis of exosomal mRNA mediating drug resistance in glioblastoma. Nature Communications. 6, 6999 (2015).
- Zarovni, N., et al. Integrated isolation and quantitative analysis of exosome shuttled proteins and nucleic acids using immunocapture approaches. Methods. 87, 46-58 (2015).
- Sidhom, K., Obi, P. O., Saleem, A. A. Review of exosomal isolation methods: is size exclusion chromatography the best option. International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6466 (2020).
- Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. Isolation of extracellular vesicles: general methodologies and latest trends. BioMed Research International. 2018, 8545347 (2018).
- McKinnon, K. M.
- Theodoraki, M. N., Hong, C. S., Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D., Whiteside, T. L. Evaluation of exosome proteins by on-bead flow cytometry. Cytometry A. 99 (4), 372-381 (2021).
- Nolan, J. P., Duggan, E. Analysis of individual extracellular vesicles by flow cytometry. Methods in Molecular Biology. 1678, 79-92 (2018).
- Nolan, J. P., Jones, J. C. Detection of platelet vesicles by flow cytometry. Platelets. 28 (3), 256-262 (2017).
- Dragovic, R. A., et al. Sizing and phenotyping of cellular vesicles using Nanoparticle Tracking Analysis. Nanomedicine. 7 (6), 780-788 (2011).
- Ramirez, M. I., et al. Technical challenges of working with extracellular vesicles. Nanoscale. 10 (3), 881-906 (2018).
- Song, X., et al. Improved strategy for jet-in-air cell sorting with high purity, yield, viability, and genome stability. FEBS Open Bio. 11 (9), 2453-2467 (2021).
- Zucker, R. M., Elstein, K. H., Gershey, E. L., Massaro, E. J. Increasing sensitivity of the Ortho analytical cytofluorograph by modifying the fluid system. Cytometry. 11 (7), 848-851 (1990).
