Summary
Dit protocol biedt een snelle en groottespecifieke isolatiemethode voor kleine extracellulaire blaasjes door de grootte van de luchtsproeikop te optimaliseren, de druk van de mantelvloeistof, de druk van de monsterstroom, de spanning, versterking en triggerdrempelparameters.
Abstract
Kleine extracellulaire blaasjes (sEV) kunnen worden vrijgegeven uit alle celtypen en dragen eiwit, DNA en RNA. Signaalmoleculen dienen als indicatoren van de fysiologische en pathologische toestand van een cel. Er is echter geen standaardmethode voor sEV-isolatie, die downstream biomarkeridentificatie en geneesmiddelinterventiestudies voorkomt. In dit artikel geven we een gedetailleerd protocol voor de isolatie en zuivering van 50-200 nm sEV door een flowcelsorteerder. Hiervoor werd gekozen voor een mondstuk van 50 μm en een mantelvloeistofdruk van 80 psi om een goede sorteersnelheid en een stabiele zijstroom te verkrijgen. Polystyreenmicrosferen van standaardformaat werden gebruikt om populaties van deeltjes van 100, 200 en 300 nm te lokaliseren. Met extra optimalisatie van de spannings-, versterkings- en forward scatter (FSC) triggering threshold, kon het sEV-signaal worden gescheiden van de achtergrondruis. Deze optimalisaties bieden een paneel met kritieke sorteerinstellingen waarmee men een representatieve populatie van sEV kan verkrijgen met alleen FSC versus side scatter (SSC). De op flowcytometrie gebaseerde isolatiemethode maakt niet alleen analyse met hoge doorvoer mogelijk, maar maakt ook synchrone classificatie of proteoomanalyse van sEV mogelijk op basis van de biomarkerexpressie, waardoor tal van downstream-onderzoekstoepassingen worden geopend.
Introduction
Een cel geeft extracellulaire blaasjes (EV's) van verschillende groottes af die resulteren in signaalmoleculen en membraaninsluitsels, die belangrijk zijn voor intercellulaire communicatie1. EV's van verschillende groottes spelen ook verschillende biologische rollen, waarbij 50-200 nm sEV in staat is om RNA, DNA en eiwitten nauwkeurig te verdelen naar de juiste extracellulaire locatie. De sEV helpt ook bij het bepalen van hun secretiemechanismen, waarbij niet alleen de regulatie van normale fysiologische processen zoals immuunsurveillance, stamcelonderhoud, bloedstolling en weefselherstel betrokken is, maar ook de pathologie die ten grondslag ligt aan verschillende ziekten zoals tumorprogressie en metastase 2,3. Effectieve isolatie en analyse van sEV zijn van cruciaal belang voor het identificeren van biomarkers en het ontwerpen van toekomstige medicijninterventies.
Met continu onderzoek naar de klinische toepassing van sEV hebben de isolatiemethoden van sEV hogere eisen gesteld. Vanwege de heterogeniteit van sEV in grootte, bron en inhoud, evenals hun gelijkenis met andere EV's in fysisch-chemische en biochemische eigenschappen, is er geen standaardmethode voor sEV-isolatie 4,5. Momenteel zijn ultracentrifugatie, grootte-uitsluitingschromatografie (SEC), polymeerprecipitatie en immunoaffiniteitsafvang de meest voorkomende sEV-isolatiemethoden6. Ultracentrifugatie is nog steeds de gouden standaard voor sEV-isolatie in onderzoek, ondanks dat het tijdrovend is, wat resulteert in een lage zuiverheid met een brede grootteverdeling van 40-500 nm en aanzienlijke mechanische schade aan de sEV na langdurige centrifugatie 7,8,9. Polymeerprecipitatie, waarbij meestal polyethyleenglycol (PEG) wordt gebruikt, lijdt aan onaanvaardbare zuiverheid voor latere functionele analyse met gelijktijdige precipitatie van extracellulaire eiwitaggregaten en polymeerverontreiniging10,11. Op immunoaffiniteitsvangst gebaseerde methoden vereisen dure antilichamen met verschillende specificiteit, evenals problemen met een laag verwerkingsvolume en opbrengstenvan 12,13,14. Deeltjesgrootte is een van de belangrijkste indicatoren om de zuiverheid van geïsoleerde sEV te evalueren. Hoewel sEV-zuiverheid een onbereikbaar doel blijft, verwijdert SEC een aanzienlijke hoeveelheid mediumcomponenten en liggen de sEV-deeltjes die met de SEC-methode worden geëxtraheerd voornamelijk in het bereik van 50-200 nm15. De bestaande technieken hebben een paar nadelen, waaronder maar niet beperkt tot tijdrovend, lage zuiverheid, lage opbrengst, slechte reproduceerbaarheid, lage doorvoer van monsters en potentiële schade aan sEV, waardoor het onverenigbaar is met klinisch gebruik16. Een snelle, goedkope en op maat gespecificeerde sEV-isolatiemethode die van toepassing is op diverse biovloeistoffen is dus een essentiële behoefte in verschillende onderzoeks- en klinische situaties.
In flowcytometrie worden afzonderlijke deeltjes geanalyseerd op een multiparametrische manier met hoge doorvoer en worden subsets gesorteerd17. Vanwege de heterogeniteit van EV's zou een cytometrische meting van één deeltjesstroom ideaal zijn, die is gebruikt om EV's te onderzoeken volgens de paradigma's van celanalyse, waarbij lichtverstrooiings- en fluorescentielabels worden gebruikt om fysiologiegerelateerde kenmerken en eiwitcomponenten te identificeren18,19,20. Niettemin wordt conventionele flowcytometrie uitgedaagd door de kleine omvang van sEV en de lage abundantie van oppervlaktebiomarkers. De gevoeligheid van flowcytometrie kan worden verbeterd door detectieparameters te optimaliseren om achtergrondgeluid en sEV te onderscheiden, ongeacht het gebruik van forward scatter (FSC), side scatter (SSC) of fluorescentiedrempel triggering parameter19.
Met het huidige protocol werden hoge resolutie flowcytometrische sorteerinstellingen geoptimaliseerd met standaard fluorescerende kralen. Door de juiste spuitmondgrootte, de druk van de mantelvloeistof, de drempeltriggerparameter en spanningen te selecteren die de intensiteit van het verstrooide licht regelen, konden we een specifieke subset van sEV isoleren van een complex mengsel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Celkweek
- Bereid een kweekmedium van Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS). Kweek de menselijke alvleesklierkankercel, PANC-1, in een 75 cm2 kweekkolf met een dichtheid van 1 x 106 cellen/ml. Incubeer de cultuur bij 37 °C met 5% CO2.
- Subcultuur de cellen wanneer de celdichtheid 75% -80% bereikt onder microscopische observatie. Verwijder het medium en spoel 2x met 3-5 ml fosfaatbufferzoutoplossing (PBS; 0,01 M, pH 7,2-7,4).
- Gooi de oplossing weg, voeg 1-2 ml trypsine-EDTA-oplossing toe en laat de cellen loskomen totdat ze afgerond en gesuspendeerd zijn in het medium onder de microscoop. Voeg vers medium toe, aspiraat en dispergeer in75 cm 2 kweekkolven met 15 ml kweekmedium. Gebruik een subteeltverhouding van 1:2 tot 1:4 (aanbevolen).
OPMERKING: Alle bewerkingen worden uitgevoerd in een bioveiligheidskast om celbesmetting te voorkomen.
2. Collectie cultuurmedium
- Incubeer de cellen gedurende 48 uur bij 37 °C met 5% CO2. Verzamel celsupernatant (90 ml) in twee centrifugebuizen van 50 ml en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 4 °C bij 300 x g .
- Breng het supernatant over in nieuwe steriele buizen en centrifugeer achtereenvolgens bij 2.000 x g gedurende 20 minuten, 10 000 x g gedurende 30 minuten en 12.000 x g gedurende 70 minuten bij 4 °C.
- Verwijder het supernatant en spoel de pellet af met 10 ml PBS door voorzichtig te pipetteren. Centrifugeer opnieuw bij 12.000 x g gedurende 70 minuten bij 4 °C en resuspensie van de pellet in 10 ml PBS-buffer om een mengsel van EV's te verkrijgen.
- Voer nanodeeltjestraceringsanalyse (NTA) uit om het EV-mengsel te kwantificeren en te dimensioneren. Voer de NTA-analyse uit volgens de handleiding voor de bediening van het instrument en referentie21.
3. Celsortering
- Voer de standaard opstartprocedure van de stroomcelsorteerder uit. Schakel het apparaat in door op de knop Opstarten te drukken. Klik op de knop Laser Power op het laserbedieningspaneel. Druk op de knop Tanks wijzigen in het submenu van de slimme sampler om de fluidics onder druk te zetten.
OPMERKING: Zorg ervoor dat de afvaltank leeg is en dat de manteltank vol is voordat u opstart. - Gebruik een ultrasoon gereinigd 50 μm jet-in-air mondstuk en installeer het op de nozzle-assemblage. Stel de druk in op 80 psi voor de mantelvloeistof en 80,3 psi voor de monsterstroom op de drukconsole.
- Druk op de knop Schedestroom starten om de mantelstroom te laten stromen. Klik op de knop Bubbel in het submenu smart sampler om automatisch gedurende 10 minuten te debubbleen en schakel het vervolgens uit.
OPMERKING: Voor het sorteren van cellen vereisen verschillende maten luchtsproeiers verschillende vormen van mantelvloeistofdruk om de stabiliteit van de vloeistofstroom te behouden. Bij deze methode werd een mondstuk van 50 μm gebruikt en alleen een mantelvloeistofdruk groter dan of gelijk aan 80 psi kon stabiele zijstromen genereren. Het drukverschil tussen de monsterstroom en de mantelvloeistof bepaalt de laadsnelheid van het sorteren. Onder de instelconditie van de methode (het drukverschil tussen de monsterstroom en de mantelvloeistof is 0,3-0,6 psi) was de vloeistofstroom relatief stabiel en de laadsnelheid maakte het mogelijk om de sorteerefficiëntie te verhogen van 50% naar 80% voor een drukverschil van minder dan 0,3-0,6 psi. - Lijn de stroom uit en bepaal de laservlek. Zet het licht van de verlichtingskamer aan om de stroom over de gaatjes te bekijken. Pas de micrometers omhoog-en-omlaag, links en rechts en voor- en achterkant aan om de stroom op het gaatje te centreren en de stroom scherp te stellen.
- Selecteer het tabblad Laser and Stream Intercept . Druk continu op de groene pijlknop als u wordt gevraagd om het kalibratieproces voor laseronderschepping en uitlijning van de spuitmond te voltooien.
- Open het fijne laseruitlijningsscherm. Selecteer het kanaal 640-722/44 (H) als de parameter X-as en het kanaal 405-448/59 (H) als de parameter Y-as. Druk op de Trigger Parameter Selector en kies de SSC-parameter van de 488 nm-laser. Open alle laserluiken.
OPMERKING: De gekozen parameters van de X-as en de Y-as zijn afhankelijk van de laserconfiguratie van het systeem. Andere parameters zijn toegestaan als het systeem geen 640 nm of 405 nm laser heeft. Voor de beste resultaten selecteert u lasers met de grootste ruimtelijke scheiding op de pinhole strip (exclusief de 355 nm laser). - Verdun de regenboog fluorescerende deeltjes door één druppel toe te voegen aan 1 ml dubbel gedestilleerd water voor een uiteindelijke concentratie van 1 x 106 kralen per ml. Open de deur van de monsterkamer en laad een buis van de voorbereide regenboog fluorescerende deeltjes.
- Druk op de knop Voorbeeld starten . Pas micrometers op en neer aan om de fluorescentie-intensiteit te optimaliseren, waardoor elk signaal zo intens mogelijk wordt. Druk op de knop Start Quality Control (QC) op het bedieningspaneel van het touchscreen om QC automatisch uit te voeren.
- Voer valvertraging uit. Open het scherm voor het instellen van sorteren en selecteer de knop voor het vertragen van de neerzet. Druk op de knop IntelliSort Initialization . Het instrument past automatisch de frequentie en amplitude van druppeloscillatie aan om de valvertraging van 25 ± 5 te verkrijgen en het afbreekpunt van de druppel duidelijk te kunnen visualiseren. Druk op de knop Onderhouden .
- Selecteer buis als het sorteeruitvoertype. Plaats een buishouder van 15 ml in de sorteerkamer. Zet de plaatspanning AAN en stel de plaatspanning in op ongeveer 4000 V.
- Schakel het testpatroon in door de knop Stream instellen te selecteren. Pas de schuifregelaar voor de laadfase en de afbuigingsschuifregelaar aan om ervoor te zorgen dat het beeld van de stroom is uitgelijnd met de verzamelbuis. Selecteer de knop Vinkje .
- Meld u aan bij het Summit-werkstation op de computer. Maak een nieuw protocol vanuit het hoofdmenu Bestand. Maak een dot plot door het tabblad Histogram te selecteren in het configuratiescherm van Summit software.
- Klik met de rechtermuisknop op de assen van de nieuwe puntenplot in de werkruimte en kies FSC als de X-asparameter en SSC als de Y-asparameter. Presenteer de FSC en SSC in logaritmische vorm.
- Selecteer het tabblad Acquisitie en zoek het deelvenster met acquisitieparameters. Schakel alle signalen in het submenu van het inschakelen van parameters in. Kies FSC als triggerparameter en stel de drempel in van 0,01. Pas de spanning en versterking van FSC en SSC aan op 250 en 0,6 om ervoor te zorgen dat gebeurtenissen binnen het FSC versus SSC-plot en de populaties worden gescheiden.
OPMERKING: Het instellen van de drempelwaarde is gelijk aan het instellen van de deeltjesgrootte die kan worden gedetecteerd door flowcytometrie. Hoe groter de drempel is, hoe groter de gedetecteerde deeltjes zullen zijn, en de kleine deeltjes zullen worden afgesneden door de drempel en kunnen niet worden gedetecteerd. Bij deze methode wordt de drempel ingesteld op 0,01, zodat alle deeltjes groter dan elektronische ruis kunnen worden gedetecteerd.
4. Isolatie van sEV
- Verdun de fluorescerende polystyreenmicrosferen tot suspensies van 100 nm, 200 nm en 300 nm. Voeg 1 μL microsferen toe aan 1 ml dubbel gedestilleerd water.
- Laad de microsfeersuspensie achtereenvolgens. Selecteer Start onder het acquisitiemenu van de Summit-software en neem 20.000 gebeurtenissen op.
OPMERKING: Het aantal gebeurtenissen is optioneel. Niet minder dan 5.000 gebeurtenissen worden aanbevolen om aan statistische significantie te voldoen. - Klik met de rechtermuisknop op de FSC vs. SSC dot plot om rechthoeken te maken en sleep om het formaat en de positie van de gebieden met elektronische ruis en 100 nm microsfeerpopulatie te wijzigen. Klik met de rechtermuisknop op de regio's om ze te hernoemen naar respectievelijk R7 en R4. Herhaal de bovenstaande stappen om de microsferen van 200 nm en 300 nm achtereenvolgens met rechthoeken te omlijsten en ze te hernoemen naar respectievelijk R5 en R6.
- Bepaal ten slotte het sorteergebied van 50-200 nm op basis van de elektronische ruis en de positie van 200 nm-deeltjes gedefinieerd als R8.
OPMERKING: De onderste detectiegrens van 50 nm bevindt zich net boven de elektronische ruis van de flowcelsorteerder. Het gebied tussen de ruis en de 200 nm microsfeerpopulatie kan daarom worden gedefinieerd als tussen 50-200 nm. - Bewerk sorteerbeslissingen in het deelvenster Sorteerlogica en statistieken. Dubbelklik op het lege veld van de linker (L1) stream. Selecteer het gebied met de naam R8 om de sorteerlogica te maken. Kies de zuiverheidsmodus Abort en selecteer een druppelomhulsel van 1 druppel voor de L1-stream.
- Laad 500 μL monster van ev-mengsel uit stap 2.3. Druk op de Start-knop onder het acquisitiemenu in Summit om gegevens te verkrijgen en druk vervolgens op Start in het sorteermenu om 50-200 nm sEV in een centrifugebuis van 15 ml te verzamelen.
OPMERKING: Een steriele omgeving is noodzakelijk om besmetting tijdens elke procedure te minimaliseren. - Observeer de aanwezigheid van sEV door transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) en controleer de deeltjesgrootte van sEV met behulp van NTA. Voer western blot (WB) analyse uit om de expressie van CD9, CD63 en CD81 markers18 verder te bevestigen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het stroomdiagram voor het experimentele protocol is weergegeven in figuur 1. Bij deze methode werden polystyreenmicrosferen van standaardgrootte gebruikt als referentiestandaarden voor de verdeling van de deeltjesgrootte. Onder de specifieke instrumentele parameterconditie kon het deeltjessignaal duidelijk worden onderscheiden van de achtergrondruis in de FSC vs. SSC-plot met behulp van de logaritmische vorm. Gatingstrategieën zijn weergegeven in figuur 2. R4, R5 en R6 verwijzen naar de posities van respectievelijk 100 nm, 200 nm en 300 nm microsferen. R7 is de detectiegrens van elektronische ruis onder 50 nm en R8 is het positiebereik van 50-200 nm deeltjes.
De deeltjesgrootteverdeling van het EV-mengsel afgeleid van PANC-1-cellen lag in het brede bereik van 40-400 nm na ultracentrifugatie (figuur 3). Om de 50-200 nm sEV te isoleren en te zuiveren, werd flowcytometrische sortering uitgevoerd om de specifieke grootte sEV te verkrijgen volgens de locatie van standaardmicrosferen (figuur 4). De kwaliteit van de isolatie werd geverifieerd door NTA en er werd vastgesteld dat het deeltjesgroottebereik van sEV na sortering tussen 50-200 nm lag (zoals weergegeven in figuur 5). De aanwezigheid van sEV werd verder waargenomen door TEM, aangegeven door rode pijlen in figuur 6A, en de geïsoleerde sEV's bleken markers van CD9, CD63 en CD81 te bevatten door WB-analyse (figuur 6B).
Figuur 1. Stroomdiagram voor het experimentele protocol. PANC-1 celkweekmedium werd verzameld en ultracentrifugeerd om het EV-mengsel te verkrijgen. Sorteerparameters werden geoptimaliseerd voor isolatie en zuivering van 50-200 nm sEV, wat werd geverifieerd door NTA. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Flowcytometrie-analyse van polystyreenmicrosferen van standaardformaat om het 50-200 nm-groottebereik in de FSC vs. SSC-plot te lokaliseren. Verdunde suspensies van 100 nm, 200 nm en 300 nm microsferen werden geladen en geanalyseerd door een flowcytometer zoals weergegeven in de FSC vs. SSC dot plot. R4, R5 en R6 verwijzen naar de posities van respectievelijk 100 nm, 200 nm en 300 nm deeltjes. R7 is de elektronische ruis als de detectiegrens voor 50 nm-deeltjes en R8 vertegenwoordigt het positiebereik van 50-200 nm-deeltjes. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. NTA-analyse van deeltjesgrootteverdeling van EV's verkregen door ultracentrifugatie. De frequentieverdeling van verschillende deeltjesgroottes wordt weergegeven door de gegevens als deeltjespercentage versus grootte. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Flowcytometrie-analyse van het verzamelde EV-monster. De FSC vs. SSC dot plot toont een monster van het verzamelde EV-mengsel geladen en geanalyseerd door een flowcytometer. De sEV in het groottebereik van 50-200 nm binnen het R8-gebied werden gesorteerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. Verificatie van de deeltjesgrootteverdeling van sEV na sortering met NTA. Representatief deeltjespercentage versus groottehistogram toont de grootteverdeling van de gesorteerde sEV. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6. Karakterisering van sEV geïsoleerd door sortering. (A) Een representatieve TEM-afbeelding van gesorteerde sEV (aangegeven met rode pijlen). Schaalbalk = 200 nm. (B) Western blot analyse van CD9, CD81 en CD63 markers in de gesorteerde sEV. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol schetst een geoptimaliseerde methode om sEV te isoleren en te zuiveren met de gespecificeerde deeltjesgrootte van 50-200 nm met behulp van een flowcelsorteerder, die werd gevalideerd door NTA. De methode loste het knelpuntprobleem op van het verkrijgen van sEV met uniforme deeltjesgrootte en hoge zuiverheid, waarbij interferentie van niet-gerelateerde biologische moleculen verpakt in grote EV'swerd vermeden 22. Snelle, high-throughput analyses zijn mogelijk met flowcytometrie, die 100.000 deeltjes per seconde kan opvangen en 70.000 sorteerbeslissingen per seconde kan nemen17, waardoor de tijd aanzienlijk wordt verkort en de heterogeniteit van sEV-deeltjes wordt weerspiegeld. Bovendien kan dit op flowcytometrie gebaseerde protocol worden aangepast op basis van individuele interesses in subpopulaties van EV's van specifieke grootte. Alternatieve poortbereiken kunnen worden gebruikt om de relevante populaties te identificeren en te isoleren met dezelfde instrumentparameters die zijn ingesteld als de bovenstaande, zoals luchtsproeik, mantelvloeistofdruk, monsterstroomdruk en triggerdrempelparameter.
De technische moeilijkheid van deze methode ligt in de scheiding van populaties met verschillende groottebereiken, met name onderscheiden van achtergrondgeluid. We hebben een panel met kritieke sorteerinstellingen geïdentificeerd. Ten eerste heeft de grootte van het mondstuk invloed op de sorteersnelheid. Om de concentratie van sEV verkregen door sorteren te verbeteren, wordt bij deze methode een mondstuk van 50 μm gebruikt en is 80 psi mantelvloeistofdruk vereist om de zijstroom te stabiliseren. Bij een hogere druk van de mantelvloeistof nemen de valfrequenties toe, wat resulteert in hogere gebeurtenissnelheden en een kortere sorteertijd23. Het verhogen van de druk van de mantelvloeistof verzwakt echter de gevoeligheid van FSC- en fluorescentiesignalen vanwege de kortere tijd die nodig is om door de laser te gaan en het aantal fotonen dat de detector bereikt24. Met name is het moeilijk om de stabiliteit van de zijstroom onder deze druk te behouden, wat een hoge reinheid van het mondstuk en de pijpleiding vereist. Ten tweede worden ultrasone reiniging van het mondstuk en het spoelen van flowcytometriebuizen sterk aanbevolen om de kans op experimenteel succes te vergroten. Ten slotte zijn spanning en versterking van cruciaal belang voor populatiescheiding, vooral voor kleine deeltjes. Hier kan een spanning van 250 V en een versterking van 0,6 de sEV effectief scheiden bij 50-200 nm met FSC-triggering en plot in logaritmische vorm.
Een kanttekening bij de aanpak is dat in sommige gevallen de concentratie van de sEV te hoog is, of het sEV-aggregaat, tijdens het sorteerproces, waardoor het moeilijk is om een suspensie van één deeltjes te bereiken. De geaggregeerde sEV wordt weggegooid vanwege het overversterkte signaal.
Gezamenlijk, met de voordelen van high-throughput analyse van flowcytometrie, optimaliseerde deze methode de grootte van de nozzle, de druk van de mantelvloeistof, de samplestroomdruk en de triggerende drempelparameter die leidde tot een succesvolle isolatie van 50-200 nm sEV. Bovendien maakt deze methode niet alleen de scheiding van deeltjes van specifieke grootte mogelijk, maar het maakt ook synchrone classificatie of proteoomanalyse van sEV mogelijk op basis van antigeenexpressie, waardoor tal van downstream-onderzoekstoepassingen worden geopend.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling te hebben.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door het Scientific Research Fund van Zhejiang Chinese Medicine University (2020ZG29), het Basic Public Welfare Research Project van de provincie Zhejiang (LGF19H150006, LTGY23B070001), het Project van Zhejiang Provincial Department of Education (Y202147028) en het Project of Experimental Technology van Zhejiang University Laboratory Department (SJS201712, SYB202130).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge tube | Beckman Coulter | 344058 | |
| Culture flasks | Corning | 430641 | |
| Dulbecco’s modified eagle medium | Corning Cellgro | 10-013-CV | |
| Fetal bovine serum | SUER | SUER050QY | |
| Flow cell sorter | Beckman Coulter | Moflo Astrios EQ | |
| Human pancreatic cancer cell, PANC-1 | NA | NA | PANC-1 cells were donated by Professor Weijun Yang, College of Life Sciences, Zhejiang University |
| Laser particle size and zeta potential analyzer | Malvern | Zetasizer Nano ZS 90 | |
| Phosphate buffer saline | Gibco | C20012500BT | |
| Polystyrene fluorescent microspheres | Beckman Coulter | 6602336 | |
| Transmission electron microscopy | JEOL | JEM-1200EX | |
| Trypsin-EDTA solution | Gibco | 1713949 | |
| Ultra rainbow fluorescent particles | Beckman Coulter | B28479 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima-L80XP | |
| Ultracentrifuge rotor | Beckman Coulter | SW32TI |
References
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
- Meldolesi, J. Exosomes and ectosomes in intercellular communication. Current Biology. 28 (8), 435-444 (2018).
- Andaloussi, S. E. L., Mäger, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. A. Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities. Nature Reviews: Drug Discovery. 12 (5), 347-357 (2013).
- Smith, Z. J., et al. Single exosome study reveals subpopulations distributed among cell lines with variability related to membrane content. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 28533 (2015).
- Kalluri, R., LeBleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science. 367 (6478), (2020).
- Doyle, L. M., Wang, M. Z. Overview of extracellular vesicles, their origin, composition, purpose, and methods for exosome isolation and analysis. Cells. 8 (7), 727 (2019).
- Cvjetkovic, A., Lötvall, J., Lässer, C. The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 23111 (2014).
- Zeringer, E., Barta, T., Li, M., Vlassov, A. V.
- Muller, L., Hong, C. S., Stolz, D. B., Watkins, S. C., Whiteside, T. L. Isolation of biologically-active exosomes from human plasma. Journal of Immunological Methods. 411, 55-65 (2014).
- Taylor, D. D., Shah, S. Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes. Methods. 87, 3-10 (2015).
- Coughlan, C., et al. Exosome isolation by ultracentrifugation and precipitation and techniques for downstream analyses. Current Protocols in Cell Biology. 88 (1), 110 (2020).
- Yang, D., et al. and perspective on exosome isolation - efforts for efficient exosome-based theranostics. Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).
- Shao, H., et al. Chip-based analysis of exosomal mRNA mediating drug resistance in glioblastoma. Nature Communications. 6, 6999 (2015).
- Zarovni, N., et al. Integrated isolation and quantitative analysis of exosome shuttled proteins and nucleic acids using immunocapture approaches. Methods. 87, 46-58 (2015).
- Sidhom, K., Obi, P. O., Saleem, A. A. Review of exosomal isolation methods: is size exclusion chromatography the best option. International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6466 (2020).
- Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. Isolation of extracellular vesicles: general methodologies and latest trends. BioMed Research International. 2018, 8545347 (2018).
- McKinnon, K. M.
- Theodoraki, M. N., Hong, C. S., Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D., Whiteside, T. L. Evaluation of exosome proteins by on-bead flow cytometry. Cytometry A. 99 (4), 372-381 (2021).
- Nolan, J. P., Duggan, E. Analysis of individual extracellular vesicles by flow cytometry. Methods in Molecular Biology. 1678, 79-92 (2018).
- Nolan, J. P., Jones, J. C. Detection of platelet vesicles by flow cytometry. Platelets. 28 (3), 256-262 (2017).
- Dragovic, R. A., et al. Sizing and phenotyping of cellular vesicles using Nanoparticle Tracking Analysis. Nanomedicine. 7 (6), 780-788 (2011).
- Ramirez, M. I., et al. Technical challenges of working with extracellular vesicles. Nanoscale. 10 (3), 881-906 (2018).
- Song, X., et al. Improved strategy for jet-in-air cell sorting with high purity, yield, viability, and genome stability. FEBS Open Bio. 11 (9), 2453-2467 (2021).
- Zucker, R. M., Elstein, K. H., Gershey, E. L., Massaro, E. J. Increasing sensitivity of the Ortho analytical cytofluorograph by modifying the fluid system. Cytometry. 11 (7), 848-851 (1990).
