Summary
このプロトコルは、エアスプレーノズルのサイズ、シース液の圧力、サンプルフロー圧力、電圧、ゲイン、およびトリガーしきい値パラメータを最適化することにより、小さな細胞外小胞の迅速かつサイズ固有の分離方法を提供します。
Abstract
小さな細胞外小胞(sEV)は、すべての細胞タイプから放出され、タンパク質、DNA、およびRNAを運びます。シグナル伝達分子は、細胞の生理学的および病理学的状態の指標として役立つ。しかし、sEVの分離には標準的な方法がないため、下流のバイオマーカーの同定や薬物介入研究ができません。この記事では、フローセルソーターによる50-200 nm sEVの分離と精製のための詳細なプロトコルを提供します。このために、50μmのノズルと80psiのシース液圧を選択して、良好な選別速度と安定したサイドストリームを得ました。標準サイズのポリスチレンミクロスフェアを使用して、100、200、および300 nmの粒子の集団を見つけました。電圧、利得、順方向散乱(FSC)トリガスレッショルドをさらに最適化することで、sEV信号をバックグラウンドノイズから分離することができます。これらの最適化は、FSC対側方散乱(SSC)のみを使用してsEVの代表的な母集団を取得できるようにする重要なソート設定のパネルを提供します。フローサイトメトリーベースの単離法は、ハイスループット分析を可能にするだけでなく、バイオマーカー発現に基づくsEVの同期分類またはプロテオーム解析を可能にし、多くのダウンストリーム研究アプリケーションを開きます。
Introduction
細胞はさまざまなサイズの細胞外小胞(EV)を放出し、細胞間コミュニケーションに重要なシグナル伝達分子と膜封入体をもたらします1。異なるサイズのEVも異なる生物学的役割を果たし、50〜200nmのsEVはRNA、DNA、およびタンパク質を正しい細胞外位置に正確に分配することができます。sEVはまた、免疫監視、幹細胞維持、血液凝固、組織修復などの正常な生理学的プロセスの調節だけでなく、腫瘍の進行や転移などのいくつかの疾患の根底にある病状を含む、それらの分泌メカニズムを決定するのに役立ちます2,3。sEVの効果的な分離と分析は、バイオマーカーを特定し、将来の薬物介入を設計するために重要です。
sEVの臨床応用に関する継続的な研究により、sEVの分離方法はより高い要件を提唱しています。sEVのサイズ、ソース、内容の不均一性、および物理化学的および生化学的特性における他のEVとの類似性により、sEVを分離するための標準的な方法はありません4,5。現在、超遠心分離、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)、ポリマー沈殿、および免疫親和性捕捉が最も一般的なsEV分離方法です6。超遠心分離は、時間がかかるにもかかわらず、研究におけるsEV分離のゴールドスタンダードであり、その結果、40〜500 nmの広いサイズ分布で低純度になり、長期遠心分離後のsEVに重大な機械的損傷が生じます7,8,9。通常ポリエチレングリコール(PEG)を使用するポリマー沈殿は、細胞外タンパク質凝集体の沈殿とポリマー汚染を伴うその後の機能分析では許容できない純度に悩まされています10,11。免疫親和性捕捉ベースの方法は、様々な特異性を有する高コストの抗体を必要とし、また、処理量および収率が低いという問題を有する12,13,14。粒子径は、単離されたsEVの純度を評価するための主要な指標の1つです。sEVの純度は達成不可能な目標のままですが、SECはかなりの量の媒体成分を除去し、SEC法によって抽出されたsEV粒子は主に50〜200nmの範囲にあります15。既存の技術には、時間がかかる、純度が低い、収率が低い、再現性が低い、サンプルのスループットが低い、sEVの潜在的な損傷など、いくつかの欠点があり、臨床利用と両立しません16。したがって、多様な生体液に適用可能な迅速で安価でサイズ指定のsEV分離方法は、いくつかの研究および臨床状況で不可欠なニーズです。
フローサイトメトリーでは、単一粒子がハイスループット、マルチパラメトリック方式で分析され、サブセットが選別されます17。EVの不均一性のために、単一粒子フローサイトメトリー測定が理想的であり、これは細胞分析のパラダイムに従ってEVを調査するために使用されており、光散乱および蛍光標識を使用して生理学関連の特徴およびタンパク質成分を特定するために使用されている18,19,20。それにもかかわらず、従来のフローサイトメトリーは、sEVのサイズが小さく、表面バイオマーカーの存在量が少ないという課題があります。フローサイトメトリーの感度は、前方散乱(FSC)、側方散乱(SSC)、または蛍光閾値トリガーパラメータ19の使用に関係なく、バックグラウンドノイズとsEVを区別するように検出パラメータを最適化することで改善できます。
本プロトコルでは、蛍光ビーズを標準として高分解能フローサイトメトリーのソート設定を最適化しました。適切なノズルサイズ、シース液圧力、しきい値トリガーパラメータ、および散乱光強度を制御する電圧を選択することにより、複雑な混合物からsEVの特定のサブセットを分離することができました。
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Protocol
1. 細胞培養
- 10%ウシ胎児血清(FBS)を添加したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)の培養培地を調製する。ヒト膵臓がん細胞PANC-1を75 cm2 の培養フラスコ内で1 x 106 細胞/mLの密度で培養します。培養物を5%CO2と共に37°Cでインキュベートする。
- 顕微鏡観察下で細胞密度が75%〜80%に達したときに細胞を継代培養する。培地を除去し、3〜5 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS、0.01 M、pH 7.2〜7.4)で2回すすぎます。
- 溶液を廃棄し、1〜2 mLのトリプシン-EDTA溶液を加え、細胞が丸くなり、顕微鏡下で培地に懸濁するまで細胞を剥離させます。新鮮な培地を加え、吸引し、15 mLの培養液と共に75cm2 の培養フラスコに分散させる。1:2から1:4のサブ栽培比を使用してください(推奨)。
注:すべての操作は、細胞の汚染を避けるためにバイオセーフティキャビネットで行われます。
2. 培地回収
- 細胞を5%CO2と共に37°Cで48時間インキュベートする。細胞上清(90 mL)を2本の50 mL遠沈管に集め、300 x g で4°Cで10分間遠心分離します。
- 上清を新しい滅菌チューブに移し、4°Cで2,000 x gで20分間、10,000 x gで30分間、12,000 x gで70分間連続して遠心分離します。
- 上清を取り除き、穏やかにピペッティングすることにより、ペレットを10 mLのPBSですすいでください。再び12,000 x g で4°Cで70分間遠心分離し、ペレットを10 mLのPBSバッファーに再懸濁してEVの混合物を得ました。
- ナノ粒子追跡分析(NTA)を実行して、EV混合物を定量化およびサイズ調整します。NTA分析は、機器操作リファレンスマニュアルおよびリファレンス21に従って実行します。
3.セルソーティング
- フローセルソーターの標準的な起動手順を実行します。 スタートアップ ボタンを押して、コンピュータの電源を入れます。レーザー コントロールパネルのレーザー出力 ボタンをクリックします。スマートサンプラーサブメニューのタンク の変更 ボタンを押して、流路系を加圧します。
注意: 起動する前に、廃棄物タンクが空で、シースタンクがいっぱいであることを確認してください。 - 超音波洗浄された50μmジェットインエアノズルを使用し、ノズルアセンブリに取り付けます。圧力コンソールで、シース液の場合は80psi、サンプルフローの場合は80.3psiに圧力を調整します。
- [シー スフローの開始 ]ボタンを押して、シースストリームの流れを開始します。スマートサンプラーサブメニューのバブルボタンをクリックすると、10分間自動的に バブル 除去してからオフにします。
注意: セルソーティングの場合、異なるサイズのエアスプレーノズルは、液体の流れの安定性を維持するために異なるシース液圧力を必要とします。この方法では、50μmのノズルを使用し、80psi以上のシース液圧のみが安定したサイドストリームを生成できました。サンプルフローとシース液の圧力差によって、選別の負荷速度が決まります。本法の設定条件(試料流量とシース液の圧力差は0.3-0.6psi)では、液流は比較的安定しており、負荷速度により、圧力差が0.3-0.6psi未満の場合、選別効率を50%から80%に高めることができた。 - 流れを揃え、レーザースポットを決定します。照明チャンバーライトをオンにして view ピンホール上のストリーム。上下、左右、前後のマイクロメータを調整して、ストリームをピンホールの中央に配置し、ストリームに焦点を合わせます。
- [ レーザーとストリームのインターセプト ] タブを選択します。プロンプトが表示されたら 緑色の矢印 ボタンを押し続けて、レーザーインターセプトとノズルアライメントのキャリブレーションプロセスを完了します。
- ファインレーザーアライメントスクリーンにアクセスします。X軸パラメータとして 640-722/44 (H)チャネルを選択し、Y軸パラメータとして 405-448/59(H) チャネルを選択します。トリガーパラメータ セレクター を押して、488nmレーザーの SSCパラメータ を選択します。すべてのレーザーシャッターを開きます。
注意: 選択するX軸とY軸のパラメータは、システムのレーザー構成によって異なります。システムに640nmまたは405nmのレーザーがない場合は、他のパラメーターを使用できます。最良の結果を得るには、ピンホールストリップ上で最大の空間分離を持つレーザーを選択してください(355 nmレーザーは含まれません)。 - 1mLの二重蒸留水に1滴を加えて、1mLあたり1 x 106 ビーズの最終濃度で虹蛍光粒子を希釈します。試料室の扉を開け、調製した虹蛍光粒子のチューブを装填する。
- [ サンプルの開始 ]ボタンを押します。上下のマイクロメータを調整して蛍光強度を最適化し、各シグナルを可能な限り強くします。タッチスクリーンコントロールパネルの品質管理 の開始 (QC)ボタンを押して、QCを自動的に実行します。
- ドロップ遅延を実行します。ソート設定画面にアクセスし、ドロップ遅延ボタンを選択します。 [IntelliSort 初期化 ] ボタンを押します。液滴振動の周波数と振幅を自動的に調整し、25±5の落下遅延を実現し、液滴のブレークオフポイントをはっきりと視覚化することができます。 メンテナンス ボタンを押します。
- ソート出力タイプとしてチューブを選択します。15 mLチューブホルダーをソートチャンバーに入れます。プレート電圧をONにし、プレート電圧を約4000Vに設定します。
- [ストリームのセットアップ] ボタンを選択して、テスト パターンをオンにします。充電位相スライダーと偏向スライダーを調整して、ストリームの画像が収集チューブと揃っていることを確認します。[チェック マーク] ボタンを選択します。
- コンピュータでSummitワークステーションにログインします。[ファイル] メイン メニューから新しいプロトコルを作成します。ドットプロットを作成するには、Summitソフトウェアコントロールパネルの ヒストグラム タブを選択します。
- ワークスペースで新しいドットプロットの軸を右クリックし、X軸パラメータとして FSC 、Y軸パラメータとして SSC を選択します。FSCとSSCを対数形式で提示します。
- [取得]タブを選択し、 取得 パラメータパネルを見つけます。パラメータを有効にするサブメニューですべての信号を有効にします。トリガーパラメータとして FSC を選択し、しきい値を0.01に設定します。FSCとSSCの電圧とゲインを250と0.6に調整して、FSC対SSCプロット内のイベントと母集団が分離されるようにします。
注:閾値設定は、フローサイトメトリーで検出できる粒子サイズを設定することと同じです。閾値が大きいほど、検出される粒子は大きくなり、小さな粒子は閾値によって切り落とされ、検出できなくなります。この方法では、閾値を0.01に設定しているため、電子ノイズよりも大きいすべての粒子を検出できます。
4. sEVの分離
- 蛍光ポリスチレンミクロスフェアを100 nm、200 nm、および300 nmの懸濁液に希釈します。1 μLのミクロスフェアを1 mLの二重蒸留水に加えます。
- マイクロスフェアサスペンションを連続してロードします。サミットソフトウェアの取得メニューで [開始 ]を選択し、20,000のイベントを記録します。
注: イベントの数はオプションです。統計的有意性を満たすために、5,000 イベント以上が推奨されます。 - FSC対SSCドットプロットを右クリックして長方形を作成し、ドラッグして電子ノイズと100nmの微小球集団の領域のサイズと位置を変更します。領域を右クリックして、それぞれR7とR4の名前に変更します。上記の手順を繰り返して、200 nmと300 nmのミクロスフェアを長方形で連続してフレーム化し、それぞれR5とR6に変更します。
- 最後に、電子ノイズとR8として定義された200nm粒子の位置に基づいて、50〜200nmの選別領域を決定します。
注:50nmの下限検出は、フローセルソーターの電子ノイズのすぐ上に配置されています。したがって、ノイズと200nmの微小球集団との間の領域は、50〜200nmの間であると定義することができる。 - ソートロジックと統計パネルでソート決定を編集します。左側のストリーム(L1)ストリームの空白フィールドをダブルクリックします。 R8 という名前の領域を選択して、並べ替えロジックを作成します。純度の 中止 モードを選択し、L1ストリームに1滴の液滴エンベロープを選択します。
- ステップ2.3のEV混合物のサンプル500 μLをロードします。Summitの取得メニューの下にある スタートボタンを押してデータ を取得し、ソートメニューの スタート を押して50〜200 nmのsEVを15 mLの遠心チューブに収集します。
注意: 手順中の汚染を最小限に抑えるには、無菌環境が必要です。 - 透過型電子顕微鏡(TEM)でsEVの存在を観察し、NTAを用いてsEVの粒径を確認します。ウェスタンブロット(WB)分析を実行して、CD9、CD63、およびCD81マーカーの発現をさらに確認しました18。
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Representative Results
実験プロトコルのフローチャート図を 図1に示します。この方法では、標準サイズのポリスチレンミクロスフェアを粒度分布の参照標準として使用しました。特定の機器パラメータ条件下では、対数形式を使用して、粒子信号はFSC対SSCプロットのバックグラウンドノイズと明確に区別できました。ゲーティング戦略を 図 2 に示します。R4、R5、およびR6は、それぞれ100nm、200nm、および300nmの微小球の位置を指す。R7は50nm未満の電子ノイズの検出限界であり、R8は50〜200nmの粒子の位置範囲です。
PANC-1細胞由来のEVs混合物の粒度分布は、超遠心後40-400nmの広い範囲にありました(図3)。50-200 nmのsEVを単離および精製するために、フローサイトメトリーソーティングを実施し、標準的なミクロスフェアの位置に応じて特定のサイズのsEVを取得しました(図4)。分離の品質はNTAによって検証され、選別後のsEVの粒径範囲は50〜200nmであることがわかりました( 図5を参照)。さらに、 図6Aの赤い矢印で示すTEMによりsEVの存在を観察し、WB分析により、分離されたsEVにCD9、CD63、およびCD81のマーカーが含まれていることを確認しました(図6B)。
図 1.実験プロトコルのフローチャート図。 PANC-1細胞培養液を回収し、超遠心分離してEVs混合物を得た。ソーティングパラメータは、NTAによって検証された50-200 nm sEVの分離と精製のために最適化されました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図 2.FSC対SSCプロットで50〜200 nmのサイズ範囲を特定するための標準サイズのポリスチレンミクロスフェアのフローサイトメトリー分析。 100 nm、200 nm、および300 nmのミクロスフェアの希釈懸濁液をロードし、FSC対SSCドットプロットに示すようにフローサイトメーターで分析しました。R4、R5、およびR6は、それぞれ100nm、200nm、および300nmの粒子の位置を指す。R7は50nmの粒子の検出限界としての電子ノイズであり、R8は50〜200nmの粒子の位置範囲を表す。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図 3.超遠心法で得られたEVの粒度分布のNTA解析 異なる粒子サイズの頻度分布は、粒子のパーセンテージ対サイズとしてデータによって表されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図 4.収集したEVサンプルのフローサイトメトリー分析。 FSC対SSCドットプロットは、フローサイトメーターでロードおよび分析された収集されたEV混合物のサンプルを示しています。R8領域内の50〜200nmのサイズ範囲のsEVを選別した。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図 5.NTAを用いた選別後のsEVの粒度分布の検証 代表的な粒子の割合対サイズのヒストグラムは、ソートされたsEVのサイズ分布を示します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図 6.選別によって分離されたsEVの特性評価。 (A)選別されたsEVの代表的なTEM像(赤矢印で示す)。スケールバー= 200 nm。(B)選別されたsEV中のCD9、CD81、およびCD63マーカーのウェスタンブロット分析。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルは、NTAによって検証されたフローセルソーターを使用して、指定された粒子サイズ50〜200nmのsEVを分離および精製するための最適化された方法を概説しています。この方法は、大型EV22に包まれた無関係な生体分子からの干渉を回避し、均一な粒径と高純度のsEVを得るというボトルネックの問題を解決した。フローサイトメトリーでは、毎秒100,000個の粒子を捕捉し、毎秒70,000回の選別決定を行うことができ、高速でハイスループットな分析が可能になり17、時間を大幅に短縮し、sEV粒子の不均一性を反映します。さらに、このフローサイトメトリーベースのプロトコルは、特定のサイズのEVの亜集団に対する個々の関心に基づいてカスタマイズすることができます。代替ゲート範囲を使用して、エアスプレーノズル、シース液圧力、サンプル流量圧力、トリガーしきい値パラメータなど、上記と同じ機器パラメータで関心のある母集団を識別および分離できます。
この方法の技術的困難は、特にバックグラウンドノイズと区別するために、異なるサイズ範囲を持つ集団を分離することにあります。重要な並べ替え設定のパネルを特定しました。まず、ノズルのサイズが選別速度に影響します。選別により得られるsEVの濃度を向上させるために、この方法では50μmのノズルを用い、サイドストリームを安定させるために80psiのシース液圧が必要である。シース液の圧力が高くなると、落下頻度が増加し、その結果、イベント率が高くなり、選別時間が短くなります23。しかしながら、シース液圧力を増加させると、レーザを通過するのにかかる時間および検出器24に到達する光子の数が減少するため、FSCおよび蛍光信号の感度が減衰する。特に、この圧力下でサイドストリームの安定性を維持することは困難であり、それはノズルおよびパイプラインの高い清浄度を必要とする。第二に、実験の成功の可能性を高めるために、ノズルの超音波洗浄とフローサイトメトリーパイプのフラッシングが強く推奨されます。最後に、電圧と利得は、特に小さなサイズの粒子の場合、集団の分離にとって重要です。ここでは、250Vの電圧と0.6のゲインにより、FSCトリガーと対数形式でプロットすることで、50〜200nmのsEVを効果的に分離できます。
このアプローチの注意点の1つは、選別プロセス中にsEVの濃度が高すぎるか、sEV凝集体が高すぎて、単一粒子懸濁液を達成することが困難になることです。集約されたsEVは、信号が過剰に増幅されるため破棄されます。
フローサイトメトリーのハイスループット分析の利点を総合すると、この方法はノズルサイズ、シース液圧、サンプル流量圧力、およびトリガーしきい値パラメーターを最適化し、50〜200 nm sEVの分離に成功しました。さらに、この方法は特定のサイズの粒子の分離を可能にするだけでなく、抗原発現に基づくsEVの同期分類またはプロテオーム解析を可能にし、多くのダウンストリーム研究アプリケーションを開くことができます。
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Disclosures
著者は利益相反を宣言しません。
Acknowledgments
この研究は、浙江中医薬大学科学研究基金(2020ZG29)、浙江省基礎公共福祉研究プロジェクト(LGF19H150006、LTGY23B070001)、浙江省教育局プロジェクト(Y202147028)、浙江大学実験技術プロジェクト(SJS201712、SYB202130)の支援を受けました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge tube | Beckman Coulter | 344058 | |
| Culture flasks | Corning | 430641 | |
| Dulbecco’s modified eagle medium | Corning Cellgro | 10-013-CV | |
| Fetal bovine serum | SUER | SUER050QY | |
| Flow cell sorter | Beckman Coulter | Moflo Astrios EQ | |
| Human pancreatic cancer cell, PANC-1 | NA | NA | PANC-1 cells were donated by Professor Weijun Yang, College of Life Sciences, Zhejiang University |
| Laser particle size and zeta potential analyzer | Malvern | Zetasizer Nano ZS 90 | |
| Phosphate buffer saline | Gibco | C20012500BT | |
| Polystyrene fluorescent microspheres | Beckman Coulter | 6602336 | |
| Transmission electron microscopy | JEOL | JEM-1200EX | |
| Trypsin-EDTA solution | Gibco | 1713949 | |
| Ultra rainbow fluorescent particles | Beckman Coulter | B28479 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima-L80XP | |
| Ultracentrifuge rotor | Beckman Coulter | SW32TI |
References
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