Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

אופטימיזציה של פרמטרים למיון ציטומטרי של זרימה לבידוד וטיהור של בועיות חוץ-תאיות קטנות בתפוקה גבוהה

Published: January 20, 2023 doi: 10.3791/64360
Automatic Translation
1, 2, 3, 3, 3, 3, 3, 2
1Central Laboratory of Women’s Hospital, Zhejiang University School of Medicine, 2School of Medical Technology and Information Engineering, Zhejiang Chinese Medical University, 3Core Facilities, Zhejiang University School of Medicine

Summary

פרוטוקול זה מספק שיטת בידוד מהירה וספציפית לגודל עבור בועיות חוץ-תאיות קטנות על ידי מיטוב גודל פיית ריסוס האוויר, לחץ נוזל הנדן, לחץ זרימת הדגימה, מתח, רווח ופרמטרי סף הפעלה.

Abstract

שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות (sEV) יכולות להשתחרר מכל סוגי התאים ולשאת חלבון, דנ"א ורנ"א. מולקולות איתות משמשות אינדיקטורים למצב הפיזיולוגי והפתולוגי של התא. עם זאת, אין שיטה סטנדרטית לבידוד sEV, המונעת זיהוי סמנים ביולוגיים במורד הזרם ומחקרי התערבות תרופתית. במאמר זה, אנו מספקים פרוטוקול מפורט לבידוד וטיהור של 50-200 ננומטר sEV על ידי ממיין תאי זרימה. לשם כך, נבחרו זרבובית 50 מיקרומטר ולחץ נוזל נדן 80 psi כדי להשיג קצב מיון טוב וזרם צד יציב. מיקרוספרות פוליסטירן בגודל סטנדרטי שימשו לאיתור אוכלוסיות של חלקיקי 100, 200 ו-300 ננומטר. עם מיטוב נוסף של סף הפעלת המתח, הרווח והפיזור הקדמי (FSC), ניתן להפריד את אות ה- sEV מרעשי הרקע. אופטימיזציות אלה מספקות פאנל של הגדרות מיון קריטיות המאפשר לקבל אוכלוסייה מייצגת של sEV באמצעות FSC לעומת פיזור צד (SSC) בלבד. שיטת הבידוד מבוססת ציטומטריית זרימה לא רק מאפשרת ניתוח תפוקה גבוהה, אלא גם מאפשרת סיווג סינכרוני או ניתוח פרוטאום של sEV בהתבסס על ביטוי הסמן הביולוגי, ופותחת יישומי מחקר רבים במורד הזרם.

Introduction

תא משחרר שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) בגדלים שונים שגורמות למולקולות איתות ותכלילי ממברנה, החשובים לתקשורת בין-תאית1. כלי רכב חשמליים בגדלים שונים ממלאים גם תפקידים ביולוגיים שונים, כאשר 50-200 ננומטר sEV מסוגלים להפיץ במדויק רנ"א, דנ"א וחלבונים למיקום החוץ תאי הנכון. ה- sEV מסייע גם לקבוע את מנגנוני ההפרשה שלהם, הכוללים לא רק את הרגולציה של תהליכים פיזיולוגיים נורמליים כגון מעקב חיסוני, תחזוקת תאי גזע, קרישת דם ותיקון רקמות, אלא גם את הפתולוגיה העומדת בבסיס מספר מחלות כגון התקדמות הגידול וגרורות 2,3. בידוד וניתוח יעילים של sEV הם קריטיים לזיהוי סמנים ביולוגיים ולתכנון התערבויות עתידיות בתרופות.

עם מחקר מתמשך על היישום הקליני של sEV, שיטות הבידוד של sEV הציבו דרישות גבוהות יותר. בשל ההטרוגניות של sEV בגודל, במקור ובתוכן, כמו גם הדמיון שלהם עם כלי רכב חשמליים אחרים בתכונות פיסיקוכימיות וביוכימיות, אין שיטה סטנדרטית לבידוד sEV 4,5. נכון לעכשיו, אולטרה-צנטריפוגה, כרומטוגרפיית אי הכללת גודל (SEC), משקעים פולימריים ולכידת זיקה חיסונית הן שיטות בידוד sEV הנפוצות ביותר6. אולטרה-צנטריפוגה היא עדיין תקן הזהב לבידוד sEV במחקר, למרות היותה גוזלת זמן, וכתוצאה מכך טוהר נמוך עם פיזור גודל רחב של 40-500 ננומטר ונזק מכני משמעותי לרכב החשמלי לאחר צנטריפוגה ארוכת טווח 7,8,9. משקעים פולימריים, אשר בדרך כלל משתמש פוליאתילן גליקול (PEG), סובל טוהר בלתי מתקבל על הדעת עבור ניתוח פונקציונלי לאחר מכן עם משקעים במקביל של אגרגטים חלבונים תאיים וזיהום פולימר10,11. שיטות מבוססות לכידת זיקה חיסונית דורשות נוגדנים בעלות גבוהה עם ספציפיות משתנה, כמו גם יש בעיות עם נפח עיבוד נמוך ותשואות12,13,14. גודל החלקיקים הוא אחד המדדים העיקריים להערכת הטוהר של sEV מבודד. למרות שטוהר sEV נותר יעד בלתי ניתן להשגה, SEC מסיר כמות ניכרת של רכיבים בינוניים, וחלקיקי sEV המופקים בשיטת SEC הם בעיקר בטווח של 50-200 ננומטר15. לטכניקות הקיימות יש כמה חסרונות, כולל אך לא מוגבל להיותן גוזלות זמן, טוהר נמוך, תפוקה נמוכה, יכולת שחזור ירודה, תפוקה נמוכה של דגימות ונזק פוטנציאלי של sEV, מה שהופך אותן ללא תואמות לניצול קליני16. לפיכך, שיטת בידוד sEV מהירה, זולה ומוגדרת בגודל המתאים לנוזלים ביולוגיים מגוונים היא צורך חיוני במספר מצבים מחקריים וקליניים.

בציטומטריית זרימה, חלקיקים בודדים מנותחים באופן רב-פרמטרי בתפוקה גבוהה, ותת-קבוצות ממוינות17. בשל ההטרוגניות של כלי רכב חשמליים, מדידה ציטומטרית של זרימה של חלקיק יחיד תהיה אידיאלית, אשר שימשה לחקר כלי רכב חשמליים בעקבות הפרדיגמות של ניתוח תאים, עם תוויות פיזור אור ופלואורסצנטיות המשמשות לזיהוי תכונות הקשורות לפיזיולוגיה ורכיבי חלבון18,19,20. עם זאת, ציטומטריית זרימה קונבנציונלית מאותגרת על ידי הגודל הקטן של sEV והשפע הנמוך של סמנים ביולוגיים על פני השטח. ניתן לשפר את הרגישות של ציטומטריית זרימה על ידי אופטימיזציה של פרמטרי זיהוי כדי להבחין בין רעשי רקע ו- sEV ללא קשר לשימוש בפיזור קדמי (FSC), פיזור צד (SSC) או פרמטר מפעיל סף פלואורסצנטי19.

עם הפרוטוקול הנוכחי, הגדרות מיון ציטומטריות זרימה ברזולוציה גבוהה עברו אופטימיזציה באמצעות חרוזים פלואורסצנטיים כסטנדרט. על ידי בחירת גודל הזרבובית המתאים, לחץ נוזל הנדן, פרמטר הפעלת הסף והמתחים השולטים בעוצמות האור המפוזרות, הצלחנו לבודד תת-קבוצה ספציפית של sEV מתערובת מורכבת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. תרבית תאים

  1. הכינו מדיום תרבית של מדיום הנשר המותאם של דולבקו (DMEM) בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי (FBS). תרבית את תא סרטן הלבלב האנושי, PANC-1, בבקבוק תרביתבגודל 75 ס"מ 2 בצפיפות של 1 x 106 תאים / מ"ל. לדגור על התרבית ב 37 ° C עם 5% CO2.
  2. תת-תרבית התאים כאשר צפיפות התאים מגיעה ל-75%-80% תחת תצפית מיקרוסקופית. הסר את המדיום ושטוף 2x עם 3-5 מ"ל של מלח חיץ פוספט (PBS; 0.01 M, pH 7.2-7.4).
  3. השליכו את התמיסה, הוסיפו 1-2 מ"ל של תמיסת טריפסין-EDTA, ותנו לתאים להתנתק עד שהם מתעגלים ומרחפים בתווך מתחת למיקרוסקופ. מוסיפים מדיום טרי, שואפים ומפזריםל-75 ס"מ 2 צלוחיות תרבית עם מדיום תרבית 15 מ"ל. השתמשו ביחס תת-טיפוח של 1:2 עד 1:4 (מומלץ).
    הערה: כל הפעולות מבוצעות בארון בטיחות ביולוגית כדי למנוע זיהום תאים.

2. אוסף מדיום תרבות

  1. לדגור על התאים במשך 48 שעות ב 37 ° C עם 5% CO2. לאסוף supernatant התא (90 מ"ל) בשני צינורות צנטריפוגות 50 מ"ל וצנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C.
  2. העבר את הסופרנאטנט לצינורות סטריליים חדשים ולצנטריפוגות ברצף במהירות של 2,000 x גרם למשך 20 דקות, 10,000 x גרם למשך 30 דקות ו- 12,000 x גרם למשך 70 דקות ב- 4 ° C.
  3. מוציאים את הסופרנאטנט ושוטפים את הגלולה עם 10 מ"ל PBS על ידי פיפטינג עדין. צנטריפוגה ב 12,000 x גרם במשך 70 דקות ב 4 ° C שוב להשהות את הגלולה ב 10 מ"ל של חיץ PBS כדי לקבל תערובת של EVs.
  4. בצע ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים (NTA) כדי לכמת ולשנות את גודל תערובת הרכב החשמלי. ביצוע ניתוח נת"ע בהתאם למדריך הייחוס להפעלת המכשיר והפניה21.

3. מיון תאים

  1. בצע את הליך ההפעלה הסטנדרטי של סדרן תאי הזרימה. הפעל את ההתקן על-ידי לחיצה על לחצן ההפעלה . לחץ על לחצן הפעלת לייזר בלוח הבקרה של הלייזר. לחץ על הלחצן Change Tanks בתפריט המשנה של הדוגם החכם כדי להפעיל לחץ על הפלואידיקה.
    הערה: ודא שמיכל האשפה ריק ומיכל הנדן מלא לפני ההפעלה.
  2. השתמש בפיית סילון באוויר בגודל 50 מיקרומטר שנוקה באולטרסאונד והתקן אותה על מכלול הזרבובית. התאם את הלחץ ל- 80 psi עבור נוזל נדן ו- 80.3 psi עבור זרימת הדגימה במסוף הלחץ.
  3. לחץ על הלחצן Start Sheath Flow כדי להתחיל את זרימת הנדן. לחץ על לחצן הבועות בתפריט המשנה של הדוגם החכם כדי לבטל את הבועה באופן אוטומטי למשך 10 דקות ולאחר מכן כבה אותה.
    הערה: עבור מיון תאים, גדלים שונים של חרירי תרסיס אוויר דורשים לחצים שונים של נוזל מעטפת כדי לשמור על יציבות זרימת הנוזל. בשיטה זו נעשה שימוש בפייה של 50 מיקרומטר, ורק לחץ נוזל נדן גדול או שווה ל 80 psi יכול ליצור זרמי צד יציבים. הפרש הלחצים בין זרימת הדגימה לבין נוזל הנדן קובע את מהירות ההעמסה של המיון. בתנאי ההגדרה של השיטה (הפרש הלחצים בין זרימת הדגימה לנוזל הנדן הוא 0.3-0.6 psi), זרימת הנוזל הייתה יציבה יחסית, ומהירות ההעמסה אפשרה ליעילות המיון לעלות ל-80% מ-50% עבור הפרש לחצים קטן מ-0.3-0.6 psi.
  4. יישר את הזרם וקבע את נקודת הלייזר. הפעל את אור תא התאורה כדי לראות את הזרם מעל חורי הסיכה. כוונן את המיקרומטרים למעלה ולמטה, משמאל ומימין ומלפנים ומאחור כדי למרכז את הזרם על חור הסיכה ולמקד את הזרם.
  5. בחר בכרטיסיה לייזר ויירוט זרם . לחץ על לחצן החץ הירוק ברציפות כפי שתתבקש לעשות כדי להשלים את תהליך כיול יירוט הלייזר ויישור הזרבובית.
  6. גש למסך יישור הלייזר העדין. בחר 640-722/44 (H) כפרמטר ציר X וערוץ 405-448/59 (H) כפרמטר ציר Y. לחץ על בורר פרמטרי ההדק ובחר בפרמטר SSC של הלייזר 488 ננומטר. פתחו את כל תריסי הלייזר.
    הערה: הפרמטרים ציר X וציר Y שנבחרו תלויים בתצורת הלייזר של המערכת. פרמטרים אחרים מותרים אם למערכת אין לייזר 640 ננומטר או 405 ננומטר. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, בחר לייזרים עם ההפרדה המרחבית הגדולה ביותר ברצועת חור הסיכה (לא כולל לייזר 355 ננומטר).
  7. לדלל את חלקיקי הקשת הפלואורסצנטית על ידי הוספת טיפה אחת לתוך 1 מ"ל של מים מזוקקים כפול לריכוז סופי של 1 x 106 חרוזים למ"ל. פתח את דלת תא הדגימה וטען צינור של חלקיקי הקשת הפלואורסצנטית המוכנים.
  8. לחץ על הלחצן Start Sample . כוונן מיקרומטרים למעלה ולמטה כדי למטב את עוצמת הפלואורסצנטיות, ולהפוך כל אות לאינטנסיבי ככל האפשר. לחץ על לחצן התחל בקרת איכות (QC) בלוח הבקרה של מסך המגע כדי לבצע QC באופן אוטומטי.
  9. בצע עיכוב נפילה. גש למסך הגדרת המיון ובחר בלחצן השהיית השחרור. לחץ על לחצן IntelliSort Initialization . המכשיר מתאים באופן אוטומטי את התדירות והמשרעת של תנודת הטיפות כדי להשיג את עיכוב הירידה של 25 ± 5 ולהיות מסוגל לדמיין את נקודת השבירה של הטיפה בבירור. לחץ על הלחצן Maintain (תחזוק ).
  10. בחר צינור כסוג פלט המיון. הניחו מחזיק צינור בנפח 15 מ"ל בתא המיון. הפעל את מתח הצלחת והגדר את מתח הצלחת לכ- 4000 וולט.
  11. הפעל את תבנית הבדיקה על-ידי בחירה בלחצן הגדרת זרם . התאימו את מחוון שלב הטעינה ואת מחוון הסטייה כדי לוודא שתמונת הזרם מסודרת עם צינור האיסוף. בחר בלחצן סמן ביקורת .
  12. התחברו לתחנת העבודה Summit במחשב. צור פרוטוקול חדש מהתפריט הראשי קובץ. צור תרשים נקודות על-ידי בחירה בכרטיסייה היסטוגרמה בלוח הבקרה של תוכנת Summit.
  13. לחץ לחיצה ימנית על הצירים של התוויית הנקודות החדשה בסביבת העבודה ובחר FSC כפרמטר ציר X ו - SSC כפרמטר ציר Y. הצג את FSC ו- SSC בצורה לוגריתמית.
  14. בחר בכרטיסייה Acquisition ואתר את חלונית פרמטרי הרכישה. הפעל את כל האותות בתפריט המשנה של פרמטרים מפעילים. בחר FSC כפרמטר הגורם המפעיל והגדר את הסף של 0.01. התאם את המתח והרווח של FSC ו- SSC ב- 250 ו- 0.6 כדי להבטיח הפרדה בין אירועים בתרשים FSC לעומת SSC ואוכלוסיות.
    הערה: הגדרת סף שקולה להגדרת גודל החלקיק שניתן לזהות באמצעות ציטומטריית זרימה. ככל שהסף גדול יותר, כך החלקיקים שיתגלו יהיו גדולים יותר, והחלקיקים הקטנים ייחתכו על ידי הסף ולא ניתן יהיה לאתר אותם. בשיטה זו, הסף מוגדר ל -0.01, כך שניתן לזהות את כל החלקיקים הגדולים יותר מרעש אלקטרוני.

4. בידוד של sEV

  1. דללו את מיקרוספרות הפוליסטירן הפלואורסצנטיות לתרחיפים של 100 ננומטר, 200 ננומטר ו-300 ננומטר. הוסף 1 μL של microspheres 1 מ"ל של מים מזוקקים כפול.
  2. טען את מתלה המיקרספירה. בחר התחל בתפריט הרכישה של תוכנת Summit והקליט 20,000 אירועים.
    הערה: מספר האירועים הוא אופציונלי. לא פחות מ-5,000 אירועים מומלצים כדי לעמוד במובהקות סטטיסטית.
  3. לחץ לחיצה ימנית על תרשים הנקודות FSC לעומת SSC כדי ליצור מלבנים וגרור כדי לשנות גודל ולמקם מחדש את אזורי הרעש האלקטרוני ואוכלוסיית המיקרספירה של 100 ננומטר. לחץ לחיצה ימנית על האזורים כדי לשנות את שמם ל- R7 ו- R4, בהתאמה. חזור על השלבים לעיל כדי למסגר את המיקרוספרות של 200 ננומטר ו- 300 ננומטר עם מלבנים ברצף ושנה את שמם ל- R5 ו- R6, בהתאמה.
  4. לבסוף, קבע את אזור המיון של 50-200 ננומטר בהתבסס על הרעש האלקטרוני והמיקום של חלקיקי 200 ננומטר המוגדרים כ- R8.
    הערה: מגבלת הזיהוי התחתונה של 50 ננומטר ממוקמת בדיוק מעל הרעש האלקטרוני של ממיין תאי הזרימה. לפיכך, ניתן להגדיר את האזור שבין הרעש לבין אוכלוסיית המיקרספרת של 200 ננומטר כנע בין 50 ל-200 ננומטר.
  5. ערוך החלטות מיון בחלונית 'לוגיקת מיון' ו'סטטיסטיקה'. לחץ פעמיים על השדה הריק של זרם אחד (L1) השמאלי. בחר את האזור בשם R8 כדי ליצור את לוגיקת המיון. בחר את מצב הטוהר בטל ובחר מעטפת טיפה של טיפה אחת עבור זרם L1.
  6. טען דגימה של 500 μL של תערובת כלי רכב חשמליים משלב 2.3. לחץ על לחצן התחל תחת תפריט הרכישה ב- Summit כדי לקבל נתונים, ולאחר מכן לחץ על התחל בתפריט המיון כדי לאסוף sEV של 50-200 ננומטר לתוך צינור צנטריפוגה של 15 מ"ל.
    הערה: סביבה סטרילית נחוצה כדי למזער זיהום במהלך כל הליך.
  7. שימו לב לנוכחות של sEV על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת (TEM) וודאו את גודל החלקיקים של sEV באמצעות NTA. בצע ניתוח כתם מערבי (WB) כדי לאשר עוד יותר את הביטוי של סמני CD9, CD63 ו- CD8118.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

דיאגרמת תרשים הזרימה של פרוטוקול הניסוי מוצגת באיור 1. בשיטה זו, מיקרוספרות פוליסטירן בגודל סטנדרטי שימשו כתקני ייחוס להתפלגות גודל חלקיקים. תחת תנאי הפרמטר האינסטרומנטלי הספציפי, ניתן היה להבחין בבירור בין אות החלקיקים לרעשי הרקע בתרשים FSC לעומת SSC באמצעות הצורה הלוגריתמית. אסטרטגיות גאטינג מוצגות באיור 2. R4, R5 ו-R6 מתייחסים למיקומים של מיקרוספרות של 100 ננומטר, 200 ננומטר ו-300 ננומטר, בהתאמה. R7 הוא גבול הזיהוי של רעש אלקטרוני מתחת ל-50 ננומטר, ו-R8 הוא טווח המיקום של חלקיקים של 50-200 ננומטר.

התפלגות גודל החלקיקים של תערובת כלי הרכב החשמליים שמקורה בתאי PANC-1 הייתה בטווח רחב של 40-400 ננומטר לאחר אולטרה-צנטריפוגה (איור 3). כדי לבודד ולטהר את ה-sEV של 50-200 ננומטר, בוצע מיון ציטומטרי של זרימה כדי לקבל את הגודל הספציפי sEV בהתאם למיקום של מיקרוספרות סטנדרטיות (איור 4). איכות הבידוד אומתה על-ידי נת"ע, ונמצא כי טווח גודל החלקיקים של sEV לאחר מיון היה בין 50-200 ננומטר (כפי שניתן לראות באיור 5). נוכחות של sEV נצפתה גם על-ידי TEM, כפי שמצוין על-ידי חיצים אדומים באיור 6A, וה-sEV המבודדים אושרו כמכילים סמנים של CD9, CD63 ו-CD81 על-ידי ניתוח WB (איור 6B).

Figure 1
איור 1. דיאגרמת תרשים זרימה עבור פרוטוקול הניסוי. מדיום תרבית תאים PANC-1 נאסף ועבר אולטרה-צנטריפוגה כדי להשיג את תערובת כלי הרכב החשמליים. פרמטרי המיון הותאמו לבידוד וטיהור של 50-200 ננומטר sEV שאומת על ידי נת"ע. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2. ניתוח ציטומטריית זרימה של מיקרוספרות פוליסטירן בגודל סטנדרטי כדי לאתר את טווח הגדלים של 50-200 ננומטר בתרשים FSC לעומת SSC. מתלים מדוללים של מיקרוספרות 100 ננומטר, 200 ננומטר ו-300 ננומטר נטענו, ונותחו על ידי ציטומטר זרימה כפי שניתן לראות בתרשים נקודות FSC לעומת SSC. R4, R5 ו-R6 מתייחסים למיקומים של חלקיקי 100 ננומטר, 200 ננומטר ו-300 ננומטר, בהתאמה. R7 הוא הרעש האלקטרוני כגבול הגילוי של חלקיקי 50 ננומטר, ו-R8 מייצג את טווח המיקום של חלקיקים של 50-200 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3. ניתוח נת"ע של התפלגות גודל החלקיקים של כלי רכב חשמליים המתקבלת על ידי אולטרה-צנטריפוגה. התפלגות התדרים של גדלי חלקיקים שונים מיוצגת על ידי הנתונים כאחוז חלקיקים לעומת גודל. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4. ניתוח ציטומטריית זרימה של דגימת EV שנאסף. תרשים הנקודות FSC לעומת SSC מציג דגימה של תערובת EV שנאספה ונטענה ונותחה על ידי ציטומטר זרימה. ה-sEV בטווח המידות של 50-200 ננומטר באזור R8 מוינו. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5. אימות התפלגות גודל החלקיקים של sEV לאחר מיון באמצעות נת"ע. היסטוגרמה של אחוז חלקיקים מייצג לעומת היסטוגרמה של גודל מציגה את התפלגות הגודל של sEV ממוין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6. אפיון sEV מבודד על ידי מיון. (A) תמונת TEM מייצגת של sEV ממוין (מסומן בחצים אדומים). סרגל קנה מידה = 200 ננומטר. (B) ניתוח כתמים מערביים של סמני CD9, CD81 ו-CD63 ב-sEV הממוין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פרוטוקול זה מתאר שיטה אופטימלית לבידוד וטיהור sEV עם גודל החלקיקים שצוין של 50-200 ננומטר באמצעות ממיין תאי זרימה, שאומת על ידי נת"ע. השיטה פתרה את בעיית צוואר הבקבוק של קבלת sEV עם גודל חלקיקים אחיד וטוהר גבוה, תוך הימנעות מהפרעות של מולקולות ביולוגיות לא קשורות עטופות ברכבים חשמליים גדולים22. ניתוחים מהירים בעלי תפוקה גבוהה אפשריים באמצעות ציטומטריית זרימה, שיכולה ללכוד 100,000 חלקיקים בשנייה ולקבל 70,000 החלטות מיון בשנייה17, מה שמקצר מאוד את הזמן ומשקף את ההטרוגניות של חלקיקי sEV. יתר על כן, פרוטוקול זה המבוסס על ציטומטריית זרימה יכול להיות מותאם אישית בהתבסס על אינטרסים אינדיבידואליים בתת-אוכלוסיות של כלי רכב חשמליים בגדלים ספציפיים. ניתן להשתמש בטווחי שערים חלופיים כדי לזהות ולבודד את האוכלוסיות המעניינות באמצעות אותם פרמטרים של מכשירים שנקבעו כמו לעיל, כגון זרבובית ריסוס אוויר, לחץ נוזל מעטפת, לחץ זרימת דגימה ופרמטר סף הפעלה.

הקושי הטכני של שיטה זו נעוץ בהפרדה בין אוכלוסיות בעלות טווחי גודל שונים, בעיקר להבדיל מרעשי רקע. זיהינו פאנל של הגדרות מיון קריטיות. ראשית, גודל הזרבובית משפיע על קצב המיון. על מנת לשפר את ריכוז sEV המתקבל על ידי מיון, זרבובית 50 מיקרומטר משמש בשיטה זו, ו 80 psi של לחץ נוזל נדן נדרש כדי לייצב את זרם הצד. עם לחץ נוזל נדן גבוה יותר, תדרי הירידה גדלים, וכתוצאה מכך שיעורי אירועים גבוהים יותר וזמן מיון קצר יותר23. עם זאת, הגדלת לחץ נוזל הנדן מחלישה את הרגישות של אותות FSC ופלואורסצנטיות בשל הזמן המופחת שלוקח לעבור דרך הלייזר ומספר הפוטונים המגיעים לגלאי24. יש לציין כי קשה לשמור על יציבות הזרם הצדדי תחת לחץ זה, הדורש ניקיון גבוה של הזרבובית והצנרת. שנית, ניקוי קולי של הזרבובית ושטיפה של צינורות ציטומטריה זרימה מומלץ מאוד להגדיל את הסבירות להצלחה ניסיונית. לבסוף, מתח ורווח הם קריטיים להפרדת אוכלוסיות, במיוחד עבור חלקיקים בגודל קטן. כאן, מתח של 250 V ורווח של 0.6 יכול להפריד ביעילות את sEV ב 50-200 ננומטר עם הפעלת FSC ותרשים בצורה לוגריתמית.

אחת ההסתייגויות של הגישה היא שבמקרים מסוימים, ריכוז ה-sEV גבוה מדי, או צבר ה-sEV, במהלך תהליך המיון, מה שמקשה על השגת השעיה של חלקיק יחיד. ה-sEV המצטבר יימחק עקב האות המוגבר יתר על המידה.

באופן קולקטיבי, עם היתרונות של ניתוח תפוקה גבוהה של ציטומטריית זרימה, שיטה זו אופטימיזציה של גודל הזרבובית, לחץ נוזל הנדן, לחץ זרימת הדגימה ופרמטר סף ההפעלה המוביל לבידוד מוצלח של 50-200 ננומטר sEV. חוץ מזה, לא רק ששיטה זו מאפשרת הפרדה של חלקיקים בגודל ספציפי, אלא היא גם מאפשרת סיווג סינכרוני או ניתוח פרוטאום של sEV על בסיס ביטוי אנטיגן, ופותחת יישומי מחקר רבים במורד הזרם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי קרן המחקר המדעי של אוניברסיטת ג'ג'יאנג לרפואה סינית (2020ZG29), פרויקט מחקר הרווחה הציבורית הבסיסית של מחוז ג'ג'יאנג (LGF19H150006, LTGY23B070001), הפרויקט של מחלקת החינוך של מחוז ג'ג'יאנג (Y202147028) ופרויקט הטכנולוגיה הניסויית של מחלקת המעבדות של אוניברסיטת ג'ג'יאנג (SJS201712, SYB202130).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Centrifuge tube Beckman Coulter 344058
Culture flasks Corning  430641
Dulbecco’s modified eagle medium Corning Cellgro 10-013-CV
Fetal bovine serum SUER SUER050QY
Flow cell sorter Beckman Coulter Moflo Astrios EQ
Human pancreatic cancer cell, PANC-1 NA NA PANC-1 cells were donated by Professor Weijun Yang, College of Life Sciences, Zhejiang University
Laser particle size and zeta potential analyzer  Malvern Zetasizer Nano ZS 90
Phosphate buffer saline Gibco C20012500BT
Polystyrene fluorescent microspheres Beckman Coulter 6602336
Transmission electron microscopy JEOL JEM-1200EX
Trypsin-EDTA solution Gibco 1713949
Ultra rainbow fluorescent particles Beckman Coulter B28479
Ultracentrifuge Beckman Coulter Optima-L80XP
Ultracentrifuge rotor Beckman Coulter SW32TI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
  2. Meldolesi, J. Exosomes and ectosomes in intercellular communication. Current Biology. 28 (8), 435-444 (2018).
  3. Andaloussi, S. E. L., Mäger, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. A. Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities. Nature Reviews: Drug Discovery. 12 (5), 347-357 (2013).
  4. Smith, Z. J., et al. Single exosome study reveals subpopulations distributed among cell lines with variability related to membrane content. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 28533 (2015).
  5. Kalluri, R., LeBleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science. 367 (6478), (2020).
  6. Doyle, L. M., Wang, M. Z. Overview of extracellular vesicles, their origin, composition, purpose, and methods for exosome isolation and analysis. Cells. 8 (7), 727 (2019).
  7. Cvjetkovic, A., Lötvall, J., Lässer, C. The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 23111 (2014).
  8. Zeringer, E., Barta, T., Li, M., Vlassov, A. V. Strategies for isolation of exosomes. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (4), 319-323 (2015).
  9. Muller, L., Hong, C. S., Stolz, D. B., Watkins, S. C., Whiteside, T. L. Isolation of biologically-active exosomes from human plasma. Journal of Immunological Methods. 411, 55-65 (2014).
  10. Taylor, D. D., Shah, S. Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes. Methods. 87, 3-10 (2015).
  11. Coughlan, C., et al. Exosome isolation by ultracentrifugation and precipitation and techniques for downstream analyses. Current Protocols in Cell Biology. 88 (1), 110 (2020).
  12. Yang, D., et al. and perspective on exosome isolation - efforts for efficient exosome-based theranostics. Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).
  13. Shao, H., et al. Chip-based analysis of exosomal mRNA mediating drug resistance in glioblastoma. Nature Communications. 6, 6999 (2015).
  14. Zarovni, N., et al. Integrated isolation and quantitative analysis of exosome shuttled proteins and nucleic acids using immunocapture approaches. Methods. 87, 46-58 (2015).
  15. Sidhom, K., Obi, P. O., Saleem, A. A. Review of exosomal isolation methods: is size exclusion chromatography the best option. International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6466 (2020).
  16. Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. Isolation of extracellular vesicles: general methodologies and latest trends. BioMed Research International. 2018, 8545347 (2018).
  17. McKinnon, K. M. Flow cytometry: an overview. Current Protocols in Immunology. 120, 1-11 (2018).
  18. Theodoraki, M. N., Hong, C. S., Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D., Whiteside, T. L. Evaluation of exosome proteins by on-bead flow cytometry. Cytometry A. 99 (4), 372-381 (2021).
  19. Nolan, J. P., Duggan, E. Analysis of individual extracellular vesicles by flow cytometry. Methods in Molecular Biology. 1678, 79-92 (2018).
  20. Nolan, J. P., Jones, J. C. Detection of platelet vesicles by flow cytometry. Platelets. 28 (3), 256-262 (2017).
  21. Dragovic, R. A., et al. Sizing and phenotyping of cellular vesicles using Nanoparticle Tracking Analysis. Nanomedicine. 7 (6), 780-788 (2011).
  22. Ramirez, M. I., et al. Technical challenges of working with extracellular vesicles. Nanoscale. 10 (3), 881-906 (2018).
  23. Song, X., et al. Improved strategy for jet-in-air cell sorting with high purity, yield, viability, and genome stability. FEBS Open Bio. 11 (9), 2453-2467 (2021).
  24. Zucker, R. M., Elstein, K. H., Gershey, E. L., Massaro, E. J. Increasing sensitivity of the Ortho analytical cytofluorograph by modifying the fluid system. Cytometry. 11 (7), 848-851 (1990).

Tags

פסילה גיליון 191
אופטימיזציה של פרמטרים למיון ציטומטרי של זרימה לבידוד וטיהור של בועיות חוץ-תאיות קטנות בתפוקה גבוהה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Song, X., Shen, H., Li, Y., Xing,… More

Song, X., Shen, H., Li, Y., Xing, Y., Wang, J., Guo, C., Huang, Y., Chen, J. Optimization of Flow Cytometric Sorting Parameters for High-Throughput Isolation and Purification of Small Extracellular Vesicles. J. Vis. Exp. (191), e64360, doi:10.3791/64360 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter