Summary
인간 혈장 내 칼시토닌 유전자 관련 펩타이드(CGRP) 농도와 관련된 발표된 데이터는 일관성이 없습니다. 이러한 불일치는 이 신경펩티드를 정량화하기 위한 표준화되고 검증된 방법론이 없기 때문일 수 있습니다. 여기에서는 인간 혈장에서 CGRP를 정제하고 정량화하기 위한 검증된 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
칼시토닌 유전자 관련 펩타이드(CGRP)는 편두통의 병태생리학에서 추정되는 역할을 하는 혈관활성 신경펩타이드이며 바이오마커 상태의 후보가 될 수 있습니다. CGRP는 활성화시 신경 섬유에서 방출되어 삼차 원심성 신경 분포를받는 혈관 구조에서 멸균 신경 인성 염증 및 동맥 혈관 확장을 유도합니다. 말초 맥관 구조에서 CGRP의 존재는 효소 결합 면역 흡착 분석 (ELISA)과 같은 단백질체 분석을 사용하여 인간 혈장에서이 신경 펩티드를 검출하고 정량화하기위한 연구에 박차를 가했다. 그러나 6.9분의 반감기와 종종 완전히 설명되지 않은 분석 프로토콜의 기술적 세부 사항의 가변성으로 인해 문헌에서 일관되지 않은 CGRP ELISA 데이터가 생성되었습니다. 여기서, 인간 혈장에서 CGRP의 정제 및 정량화를위한 수정 된 ELISA 프로토콜이 제시된다. 절차적 단계에는 시료 수집 및 준비, 정제 수단으로 극성 흡착제를 사용한 추출, 비특이적 결합을 차단하기 위한 추가 단계, ELISA를 통한 정량화가 포함됩니다. 또한, 이 프로토콜은 희석 실험의 스파이크 및 회수 및 선형성으로 검증되었습니다. 이 검증 된 프로토콜은 이론적으로 편두통뿐만 아니라 CGRP가 역할을 할 수있는 다른 질병이있는 개인의 혈장에서 CGRP 농도를 정량화하는 데 사용할 수 있습니다.
Introduction
칼시토닌 유전자 관련 펩타이드(CGRP)는 혈관주위 국소화가 있는 뉴런 섬유와 비뉴런 조직에 존재하는 37개 아미노산 뉴로펩타이드입니다. CGRP의 두 가지 형태 인 α-CGRP와 β-CGRP는 90 % 이상의 상 동성을 공유하고 생리 기능을 공유합니다. 그러나 αCGRP는 중추 신경계 및 말초 신경계에서 발견되는 반면 βCGRP는 장 신경계에서 발견됩니다 1,2. 통각 수용체 활성화 및 칼슘 의존성 엑소 사이토 시스시, CGRP는 뉴런에서 방출되어 동맥 혈관 확장 및 혈장 단백질 유출을 포함하는 무균 신경 인성 염증을 유도합니다 3,4,5,6,7. 여기에서 CGRP는 모세 혈관 후 혈관에 나타나며 편두통 8,9,10,11과 같은 구 심성 통각 수용 활성화를 유발하는 질병에 대한 바이오 마커 일 수 있습니다. 참고로, CGRP는 혈관 신생 및 면역 조절에서의 역할을 통해 COVID-19와 관련이 있으며 바람직하지 않은 질병 진화를 예측할 수 있습니다12,13. 따라서, 인간 혈장에서 CGRP의 정확한 정량화를위한 프로토콜은 광범위한 가치를 가질 수있다.
편두통에서 CGRP의 역할에 가장 많은 관심을 기울였을 것입니다. 전임상 및 임상 연구를 기반으로 CGRP는 편두통에 대한 가능한 바이오 마커 및 치료 표적으로 제시되었습니다 3,4,5,6,7,8,9,10. 일부 연구에서는 대조군 참가자10,14,15에 비해 일시적인 편두통이 있는 코호트에서 CGRP의 상승을 발견했습니다. 편두통 치료를위한 임상 시험에서 CGRP 억제제의 성공은 편두통의 원인 인자로서 CGRP 상승을 암시하는 것으로 보인다. 그러나 모든 조사자가 이러한 결과를 확증한 것은 아닙니다(16,17,18,19). 또한, 편두통의 비 두통 증상에서 CGRP의 역할은 아직 밝혀지지 않았다. 현재의 연구는 편두통의 전정 증상에서 CGRP의 역할을 이해하고자하는 열망에 의해 동기가 부여되었습니다.
문헌에서 일관되지 않은 CGRP 면역 분석 데이터는 몇 가지 이유 때문일 수 있습니다. 첫째, 말초 맥관 구조에서 CGRP의 반감기는 세린 프로테아제 21, 인슐린 분해 효소 및 기타 메탈로 프로테아제 22, 중성 엔도 펩티다아제 23 및 엔도 텔린 전환 효소 -1 24의 활성으로 인해 6.9 분 20이다. 둘째, CGRP를 정량화하는 데 사용되는 면역 측정법의 다양한 기술적 세부 사항은 그러한 연구에서 완전히 설명되지 않았습니다. 마지막으로, 면역 분석 방법론의 표준화 부족은 그림을 더욱 복잡하게 만듭니다.
이 기사에서는 인간 혈장에서 α- 및 βCGRP의 정제 및 정확한 정량화를 허용하는 수정된 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) 프로토콜에 대해 설명합니다. 키트의 항체는 아밀린, 칼시토닌 또는 물질 P와 교차 반응하지 않습니다. 이 프로토콜은 스파이크 및 회수 및 희석의 선형성과 같은 필요한 검증 실험을 거쳤으며, 이에 대한 데이터는 여기에 제시되어 있습니다. 검증을 거친 이러한 CGRP ELISA 프로토콜은 이전에 문헌에 완전히 설명되지 않았습니다. 이 프로토콜은 편두통뿐만 아니라심장 2,25, 피부과 26, 산부인과 27, 류마티스28,29, 근골격계30,31, 내분비 32,33 및 바이러스 성 질환12,13의 맥락에서 인간 혈장에서 CGRP를 정량화하는 데 사용할 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
이 프로토콜은 Johns Hopkins Institutional Review Board(NA_00092491)의 승인을 받아 동의한 개인의 인간 혈장 샘플을 사용하여 개발되었습니다.
1. 시료 채취 및 준비
- 표준 정맥 천자 방법34를 통해 전주복 정맥에서 5mL의 전혈을 6mL 진공 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 수집 튜브에 수집합니다.
- 표적 펩티드의 용해를 막기 위하여 수집 후에 관에 aprotinin (10,000 KIU/mL)의 aprotinin (10,000 KIU/mL) 경쟁적인 세린 프로테아제 저해제의 0.5 mL를 추가하십시오. 아프로티닌이 혈액과 적절하게 섞일 수 있도록 튜브를 10번 뒤집습니다. 그런 다음 다음 단계까지 튜브를 얼음에 보관하십시오.
- 혈액 수집 후 60분 이내에 4°C에서 4분 동안 튜브를 604 x g 에서 원심분리합니다.
- 피펫으로 혈장 분획을 제거하고 2mL 둥근 바닥 멸균 극저온 생물로 옮깁니다.
- 극저온 난자를 즉시 -80°C에서 최대 2주 동안 보관합니다.
2. 혈장 시료 추출
- 추출 카트리지를 15mL 원뿔형 원심분리기 튜브 안에 넣고 카트리지의 외부 돌출부가 튜브의 외부 돌출부로 지지되도록 합니다.
- 먼저 5mL의 100% 메탄올을 통과시킨 다음 10mL의 초순수를 카트리지에 통과시켜 카트리지를 활성화합니다.
- 유체가 중력 구동 흐름을 통해 카트리지를 통과하면 튜브에 모입니다.
- 액체가 카트리지를 삼키지 않도록 과도한 액체가 쌓이면 버리십시오.
- 실험 과정에서 카트리지가 마르지 않는지 확인하십시오.
- 혈장 250μL를 4% 아세트산 750μL로 희석합니다.
- 1mL의 혈장과 아세트산 용액을 카트리지에 천천히 통과시킵니다.
알림: 이 단계는 통과된 각 밀리리터에 대해 중력 구동 흐름을 통해 약 30초가 소요됩니다. - 카트리지를 4% 아세트산 10mL로 세척합니다. 이전과 마찬가지로 액체가 카트리지를 삼키지 않도록 축적된 초과 유체를 버리십시오.
- 카트리지에서 마지막 아세트산 한 방울을 제거한 후 튜브에서 카트리지를 꺼내 새 15mL 원추형 원심분리기 튜브에 넣습니다.
- 4% 아세트산 2.7mL와 100% 메탄올 0.3mL를 혼합하여 100% 메탄올과 4% 아세트산의 10:1 용액을 준비한다. 이 용액을 한 번에 1mL의 카트리지에 통과시켜 CGRP를 용출시키는 데 사용하십시오. 통과 된 각 밀리리터의 용액 사이에 25 분 동안 일시 중지하십시오. 용리액을 버리지 마십시오.
- 튜브에는 메탄올과 아세트산 용액의 마지막 밀리리터가 통과한 후 25분 후에 용출된 유체 3mL가 들어 있습니다. 각 1mL의 용리액을 1.7mL 미세원심분리기 튜브에 넣습니다.
알림: 이렇게 하면 각 카트리지에서 3개의 미세 원심분리기 튜브가 생성됩니다. - 각 튜브를 미니 원심분리기에 1초 동안 넣어 모든 용리액이 각 튜브의 바닥에 오도록 합니다.
- 4 ° C에서 진공 원심 분리로 모든 샘플을 건조시킵니다 (수용액의 경우 1,400 rpm에서 농축기 기능으로 설정, g- 힘은 튜브의 위치에 따라 달라 지므로 130-250 x g 범위).
알림: 진공 원심분리기가 샘플을 건조하는 데 걸리는 시간은 사용되는 미세 원심분리기 튜브의 유형에 따라 다릅니다. - 분석 절차(단계 4.1)를 진행하기 직전에, 실온(RT) 또는 20°C로 해동된 효소면역분석법(EIA) 완충액( 재료 표 참조)으로 이전에 건조된 샘플을 재구성한다.
알림: 건조된 샘플을 재구성하는 데 사용되는 EIA 버퍼의 부피는 원래 샘플과 같아야 합니다.amp부피 또는 250μL.
3. ELISA 플레이트의 제조 - 비특이적 결합을 제한하기 위한 차단
- 플레이트의 각 웰에 250μL의 트리스 완충 식염수(TBS)/생선 젤라틴 차단 완충액을 추가합니다.
- 플레이트 위에 커버 시트를 놓고 RT에서 2시간 동안 배양합니다.
- 커버 시트를 제거하고 멀티채널 피펫을 사용하여 반전 또는 흡인으로 플레이트를 비웁니다. 그런 다음 종이 타월로 접시를 닦아 액체의 흔적을 버립니다.
- 플레이트를 층류 후드에 10분 동안 그대로 두어 플레이트를 건조시킵니다.
- 플레이트가 눈에 띄게 건조되면 실리카겔 건조제 봉지와 함께 그립 밀봉 호일 파우치에 넣고 파우치를 -20°C에서 24시간 동안 보관합니다.
참고: 플레이트는 플레이트 배양 후 4주 이내에 사용해야 합니다.
4. 분석 절차 전
- 키트 지침에 따라 시약 (EIA 버퍼, CGRP 표준, CGRP 품질 관리, CGRP 추적기, 세척 버퍼)을 준비하십시오. 16-20 시간 배양 기간이 끝난 후에 만 Ellman의 시약을 준비하십시오.
- 모든 샘플을 해동하고 나머지 프로토콜을 수행하기 전에 RT로 시약을 투여합니다.
5. 분석 절차
- 키트에서 제공하는 세척 완충액(300μL/웰)으로 차단된 플레이트의 각 웰을 5회 헹굽니다. 각 헹굼에 대해 세척 버퍼를 웰에 넣은 후 30초 동안 일시 중지한 다음 액체를 버리거나 다중 채널 피펫을 사용하여 흡인합니다.
- 최종 헹굼 후, 반전(웰 내의 액체를 배출하기 위해 플레이트 반전) 또는 다중 채널 피펫을 사용한 흡인에 의해 웰에서 모든 완충액을 제거합니다. 마지막 방울을 종이 타월에 닦아내고 모든 액체가 우물에서 눈에 띄게 제거 될 때까지 거꾸로 된 판을 두드립니다.
- "블랭크" 웰로 알려진 시약이나 완충액이 없는 웰을 최소 2개 이상 따로 보관하십시오. 그런 다음 비특이적 결합(NSB)을 위해 적어도 두 개의 다른 웰을 따로 보관하십시오.
- 100μL의 EIA 버퍼를 각 NSB 웰에 분배합니다.
- 100 μL의 CGRP 표준물질을 적절한 웰에 이중으로 분배합니다.
- 100 μL의 시료(EIA 완충액에서 재구성됨)와 품질 관리를 적절한 웰에 이중으로 분배합니다.
- 100 μL의 CGRP 추적자 (아세틸 콜린 에스테라아제에 부착 된 항 -CGRP 항체)를 NSB, CGRP 표준물질, 샘플 및 품질 관리가 포함 된 각 웰에 분배합니다. "블랭크" 웰에 추적기를 분배하지 마십시오.
- 투명 커버 시트를 사용하여 플레이트를 덮고 각 웰의 샘플과 시약이 크게 증발하지 않도록 각 웰을 밀봉합니다. 플레이트를 4°C에서 16-20시간 동안 인큐베이션합니다.
- 배양이 완료된 후 키트 지침에 따라 Ellman의 시약을 재구성합니다.
- 플레이트를 뒤집어 모든 액체를 제거합니다. 각 웰(위에서 설명한 대로)을 300μL의 세척 완충액으로 3회 헹굽니다.
- 세 번째 헹굼 후 플레이트에서 액체를 제거하고 플레이트를 셰이커 플레이트에 놓고 120rpm에서 2분 동안 흔들어 줍니다.
- 접시를 세 번 더 씻으십시오. 최종 헹굼 후, 멀티채널 피펫을 사용하여 반전 또는 흡인에 의해 웰로부터 모든 완충액을 제거한다. 마지막 액체 방울을 종이 타월에 닦아내고 모든 액체가 우물에서 눈에 띄게 제거될 때까지 거꾸로 된 판을 두드립니다.
알림: ELISA 마이크로플레이트 세척기를 사용하는 경우 이 단계에서 설명한 추가 3회 세척이 필요하지 않을 수 있습니다. - Ellman의 시약 200μL을 각 웰에 분주합니다("블랭크" 웰 제외).
- 새 커버 시트로 플레이트를 덮고 알루미늄 호일로 싸서 빛에 노출되지 않도록 합니다. RT에서 어둠 속에서 1 시간 동안 배양하십시오.
- 마른 종이 타월로 뒷면을 닦아 분광 광도계 판독을 혼란스럽게 할 수 있는 플레이트 뒷면에 액체가 없는지 확인하십시오.
- 플레이트의 405nm(노란색)에서의 흡광도를 판독합니다.
6. 데이터 분석
- 각 "Blank", NSB, 표준물질, 품질 관리 및 샘플에 대한 평균 흡광도를 계산합니다.
- 표준물질, 품질 관리 및 시료 흡광도 값에서 NSB 평균 흡광도 값을 뺍니다.
- y축에 흡광도를, x축에 농도를 표시합니다. 4개 매개변수 로지스틱 회귀 모델을 사용하여 표준 곡선을 구성합니다.
- 곡선이 구성되면 곡선의 방정식을 사용하여 품질 관리 및 샘플에 대한 보간된 농도를 결정하며, 이는 x축에서 읽을 수 있습니다.
알림: 표준 곡선은 품질 관리를 위해 계산된 보간 농도가 예상 농도의 25% 이내인 경우에만 검증됩니다(일반적으로 125pg/mL이지만 품질 관리 바이알의 라벨 참조).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
프로토콜에는 강조해야 할 몇 가지 주요 단계가 있습니다. 첫째, 세린 프로테아제 억제제 인 아프로티닌은 CGRP의 추가 효소 분해를 방지하기 위해 수집 즉시 전혈 샘플에 첨가되어야합니다. 세린 프로테아제는 CGRP 대사에 중요한 역할을하는 것으로 나타 났으며, 이전 연구에서는 인간21,35에서 CGRP를 정량화하는 데 아 프로 티닌을 사용했습니다. 프로테아제 억제제를 사용하지 않고 샘플 준비가 60 분 이상 걸리면 ELISA를 수행 할 때 CGRP 수치가 감소 할 것으로 예상 할 수 있습니다. 둘째, ELISA 이전의 고체상 추출은 용리액에 CGRP를 농축시키고 혈장 매트릭스에서 잠재적으로 간섭하는 분자를 제거합니다. 이 추출 단계는 스파이크 및 회수 실험에서 CGRP의 수율을 증가시킵니다 (다음 섹션에서 자세히 설명). 추출 후 냉장실에서의 진공 원심 분리는 CGRP의 손실을 더욱 제한합니다. 셋째, ELISA 전에 차단 완충액을 사용하여 마이크로타이터 플레이트를 차단해야 합니다. 이를 통해 완충액의 비특이적 단백질을 플레이트의 나머지 결합 부위에 수동적으로 흡착하여 배경 신호를 줄일 수 있습니다. 차단은 비현실적으로 높은 CGRP 수율을 줄이는 데 도움이 됩니다.
스파이크 및 회수 실험은 CGRP 검출이 표준 곡선 희석제 (여기서는 EIA 완충액)와 실험 샘플 매트릭스 (여기서는 혈장) 간의 차이에 의해 영향을 받는지 여부를 결정합니다. 혈장 및 / 또는 혈청은 CGRP에 대한 항체 결합을 차단하거나 펩타이드를 분해하는 분자를 함유 할 수 있으므로 CGRP의 시작 농도를 정확하게 검출하고 정량화하는 분석의 능력을 방해 할 수 있습니다. 이를 위해 혈장 샘플에 알려진 양의 CGRP를 첨가하고 ( "스파이크"단계) 추출 및 ELISA 후 CGRP가 얼마나 많이 "회수"되었는지 계산했습니다. CGRP 스톡을 제조사로부터 입수하여 사용할 때까지 -20°C 냉동고에 보관하였다.
희석 테스트의 선형성에서, 샘플은 연속적으로 희석되고, CGRP의 농도는 각 희석에 대해 계산된다. 희석 된 샘플이 CGRP 농도에서 적절한 선형 감소를 나타내지 않으면 EIA 버퍼 또는 플라즈마가 일부 농도에서 CGRP의 검출을 방해하거나 표준 곡선이 영향을받는 범위에서 정확하지 않음을 나타냅니다. 상술한 스파이크 및 회수 실험을 수행함에 있어서, 본 발명자들은 "스파이크된" 샘플을 연속적으로 희석하였다; 우리는 200 pg / mL의 CGRP 농도를 제공하기 위해 혈장 샘플을 스파이크 한 다음 샘플을 100 pg / mL로 희석 한 다음 50 pg / mL로 희석했습니다.
심혈관, 호흡기 또는 최근 두통이나 신경 학적 증상의 병력이없는 3 명의 참가자의 혈장 샘플에 다양한 농도의 CGRP가 첨가되었습니다. 프로토콜은 스파이크되지 않은 대조군 샘플 외에도 이러한 샘플에 대해 실행되었습니다. 그림 1 은 희석 실험의 스파이크 및 회수 및 선형성에 대한 플레이트 맵의 예를 보여줍니다. 선형 범위를 넘어 피팅할 수 있는 표준 곡선을 만들기 위해 4개의 매개변수 로지스틱 피팅을 수행했습니다(표 1 및 그림 2). 회수율은 각각의 스파이크 샘플에 대해 계산되었으며 허용 범위 내에 있었습니다(표 2). 희석의 선형성은 스파이크된 샘플에서 입증되었습니다(그림 3). 표 3 은 제조업체의 지침에 따라 그리고 비특이적 결합을 차단하기 위해 추가 단계를 포함하기 전에 수행된 실패한 스파이크 및 회수 실험에서 얻은 결과를 보여줍니다. 이들 데이터는 125%의 상한을 초과하는 회수율을 보여주며, 이는 비특이적 결합의 존재를 나타낸다. 블로킹 버퍼를 사용하여 플레이트를 블로킹하는 프로토콜의 단계(단계 3.1-3.5)를 추가한 후, 본 발명자들은 이 효과를 감소시키고 허용 가능한 회수 값들을 달성할 수 있었다(표 2). 편두통이나 전정 증상이없는 3 명의 환자에서 혈장 내 CGRP의 평균 농도는 1.68 ± 0.13 pg / mL 인 것으로 나타났다. 향후 실험은 더 큰 규모의 대조군 환자에서 현재 방법론을 활용하는 것을 목표로 해야 합니다.
그림 1: 플레이트 맵 예시. 각 플레이트에는 표준물질, 샘플, 블랭크 및 NSB 웰이 모두 중복되거나 삼중으로 포함되어야 합니다. 블랭크 웰에는 액체가 없어야 하며 NSB 웰에는 독점 효소 면역분석 완충액, 효소 결합 2차 항체 및 Ellman's 시약이 포함되어야 합니다. NSB 웰의 평균 흡광도 값은 표준 곡선을 생성하기 전에 표준물질의 흡광도 값에서 빼야 합니다. NSB 웰의 평균 흡광도 값도 회수율을 계산하기 전에 샘플의 흡광도 값에서 빼야 합니다. 플레이트 위치의 영향은 없습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 4개 매개변수 로지스틱(4PL) 회귀 표준 곡선의 예. 이 표준 곡선은 표 1에 표시된 것과 유사한 형태의 방정식으로 수학적으로 설명됩니다. 4PL 회귀 곡선은 선형 곡선에 비해 생물학적 시스템에 더 적합합니다. 이 곡선과 방정식은 표준이 만들어진 동일한 플레이트에서 품질 관리 및 샘플을 보간하는 데 사용됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 희석액의 선형성 꺾은선형 차트는 200pg/mL로 스파이크된 후 1:2 및 1:4로 연속 희석된 샘플을 보여줍니다. 이 데이터는 광범위한 희석에 대한 선형성을 보여 주며, 이는 분석 방법이 광범위한 CGRP 농도에서 정확하다는 것을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 매개 변수 | 값 |
| 엑스50 | 294.75 |
| 방정식 |  |
| 방정식 형식 |  |
표 1: 역가가 X50인 4PL 매개변수 회귀 표준 곡선 방정식의 예. 4PL 회귀 곡선은 생물학적 시스템에서 볼 수 있는 복잡성을 수용합니다. 이 곡선은 선형 회귀보다 더 적합하기 때문에 ELISA의 결과를 분석하는 데 사용되었습니다.
| 흡광도(OD) | 보간 농도(pg/mL) | 수율 비율 | |
| 스파이크되지 않은 제어 | -0.0434 | 곡선에 떨어지지 않음(즉, ~0) | |
| 200pg/mL로 급증 | 0.2712 | 214.7 ± 23.4 | 107.40% |
| 100pg/mL로 급증 | 0.0966 | 102.7 ± 2.35 | 102.70% |
| 50pg/mL로 급증 | 0.0205 | 55.1 ± 12.65 | 110.20% |
표 2: 고체상 추출 및 플레이트 차단의 부족으로 인한 3명의 대조군 참가자의 성공적인 스파이크 및 회수 실험 결과. 스파이크 샘플의 수율은 모두 이상적인 100 % 수율의 20 % 이내로 떨어졌으며, 이는 CGRP 검출이 플라즈마의 실험 샘플 매트릭스에 영향을받지 않음을 나타냅니다.
| 흡광도(OD) | 보간 농도(pg/mL) | 수율 비율 | |
| 스파이크되지 않은 제어 | -0.2087 | 곡선에 떨어지지 않음(즉, ~0) | |
| 200pg/mL로 급증 | 2.371 | 264.2 ± 104 | 132.10% |
| 100pg/mL로 급증 | 1.134 | 167.5 ± 31.2 | 167.50% |
| 50pg/mL로 급증 | 0.3218 | 80.55 ± 4.54 | 161.10% |
표 3: 플레이트 차단 부족으로 인한 3명의 대조군 참가자의 실패한 스파이크 및 회복 실험 결과. 스파이크 샘플의 수율 비율은 모두 120% 수율의 상한선을 훨씬 상회하여 분석이 NSB에 의해 손상될 수 있음을 나타냅니다. 이러한 결과를 얻은 후, 분석 전에 플레이트에서 NSB를 차단하기 위해 프로토콜에 3.1-3.5 단계를 추가했습니다.
| 흡광도(OD) | 보간 농도(pg/mL) | 수율 비율 | |
| 스파이크되지 않은 제어 | 0.0401 | 12.93 | |
| 100pg/mL로 급증 | 0.0315 | 10.17±2.31 | 10.17% |
| 50pg/mL로 급증 | 0.0152 | 4.895±15.4 | 9.79% |
| 25pg/mL로 급증 | 0.0007 | 0.2177±6.43 | 0.87% |
표 4: 3명의 대조군 참가자의 실패한 스파이크 및 회복 실험 결과. 스파이크 샘플의 수율은 모두 수율 하한인 80% 미만으로 떨어졌으며, 이는 가능한 분해 및 경쟁적인 결합 프로세스를 해결하기 위해 추가 최적화가 필요함을 나타냅니다. 이러한 결과는 검출 하한이 2.23pg/mL이고 분석 내 cv가 10%, 분석 간 cv가 12%< 다른 제조업체의 경쟁력 있는 ELISA 분석에서 나온 것입니다<.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
이 기사에서는 인간 혈장에서 CGRP의 검출 및 정량화를 허용하는 검증된 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 상용 CGRP ELISA 키트가이 분자를 정확하게 정량화하지 못하는 것으로 밝혀진 후에 합성되었습니다. 샘플 준비 프로토콜과 유효한 표준 곡선을 확립한 후, 희석 실험의 스파이크 및 회수율 및 선형성은 회수율이 예상보다 훨씬 낮다는 것을 보여주었다. 상이한 상용 CGRP ELISA 키트를 사용하여 유사한 결과가 발견되었다(표 4). 참고로 널리 인정되는 표준 회수율은 80-120%36입니다. 이러한 결과는 CGRP에 결합하는 다른 분자 인 CGRP21,22,23,24를 분해하는 프로테아제 활성의 존재를 시사하여 플레이트의 항체에 대한 결합 또는 플레이트의 항체에 대한 비 표적 단백질의 경쟁적 결합을 제한한다.
이러한 가능한 교란 요인을 제어하기 위해 추출 프로토콜은 ELISA 전에 독점적인 흡착제를 사용한 추출을 통해 혈장을 정제하도록 최적화되었습니다. 이 흡착제는 표면적으로 CGRP와 같은 극성 분자를 분리합니다. ELISA 이전에 추출의 효능을 결정하기 위해, 양성 대조군이 추출 된 다음 ELISA를 수행함에 따라 알려진 농도의 CGRP로 스파이크 된 인간 혈장 샘플. 이 스파이크 샘플은 ~ 50 % -60 %의 회수율 만 산출했습니다. 이러한 결과는 외인성으로 첨가 된 CGRP가 예상대로 혈장에서 검출되지 않는다는 것을 나타냅니다.
프로토콜의 다양한 다른 단계들이 최적화되었다: 분해를 억제하기 위해 원심분리 전에 전혈 샘플에 세린 프로테아제 억제제를 첨가하는것 21, 추출 후 진공 원심분리의 온도를 낮추고, 원심분리 후 재현탁 방법을 조정한다. 이러한 변화 이후의 스파이크 및 회수 실험은 비현실적으로 높은 CGRP 농도를 나타 냈으며, 이는 120 % 이상의 회수율을 나타냈다 (표 3). 안심할 수 있게도, Messlinger et al.37의 유사한 분석을 사용하여 추출한 후 예상보다 높은 값이 최근에 보고되었으며, 이는 이것이 여전히 문제임을 나타냅니다. Messlinger et al. 혈장 추출 후의 분석이 이러한 현상에 대한 이유를 제공하지 않고 실제 CGRP 농도를 재현하지 못한다는 것을 인정합니다37.
우리는 비특이적 결합을 유발하는 ELISA 마이크로타이터 플레이트의 잔류 결합 능력이 높은 회수율의 원인이 될 수 있다는 가설을 세웠습니다. ELISA 전에, 플레이트를 차단 완충액, TBS/생선 젤라틴 완충액과 함께 배양하여 이 결합 용량을 감소시켰습니다. 이 추가 단계는 보다 적절한 회수율을 가져왔습니다(표 2). 따라서, 블로킹 버퍼의 사용을 포함하여, 위에서 논의된 수정 및 최적화는 프로토콜에서 중요한 단계로 남아 있다. 이러한 단계를 통해 2pg/mL로 표시된 원래 제조업체 키트에 비해 1.05pg/mL의 검출 한계를 낮출 수 있습니다.
문제 해결과 관련하여 2.10단계에서는 용리액을 건조하기 위해 진공 원심분리가 필요합니다. 이 단계의 길이는 샘플이 들어 있는 미세 원심분리기 튜브의 유형에 따라 달라지는 것으로 관찰되었습니다. 재료 표에 설명된 미세 원심분리기 튜브를 사용하여 이 단계는 일반적으로 5시간 동안 지속됩니다. 그러나 더 큰 부피의 대체 미세 원심분리기 튜브를 사용하는 경우 이 단계는 최대 11시간 동안 지속될 수 있습니다. 진공 원심분리에 대한 대안은 샘플을 동결건조 또는 동결건조하는 것일 수 있으며, 이는 추출 후 샘플을 동결시켜야 한다. 그러나, 동결건조는 이 프로토콜의 구축에서 시험되지 않았다. 또한 CGRP의 농도가 예상보다 체계적으로 낮 으면 모든 시약, 특히 항체를 사용하기 전에 실온으로 해동해야합니다. 항체 및 추적자 용액과 같은 시약의 불안정성은 CGRP 결합의 체계적인 오류에 기여할 수 있습니다. 수율이 계속 불충분 한 경우, CGRP에 대한 항체 결합은 완충액으로 재구성 함에도 불구하고 용리 액 (메탄올 및 아세트산 용액)의 상대적 산도에 의해 영향을받을 수 있습니다. 이 경우 pH 정류 단계는 완충액으로 재구성한 후 논리적으로 추가됩니다.
이 프로토콜의 한계는 임의의 ELISA 방법론, 특히 항체 불안정성과 관련된 한계를 포함한다38. 항체 시약은 분석에 사용하기 전에 실온으로 해동해야 합니다. 그러나 장기간 온난화하면 변성이 발생하여 결과적으로 CGRP 결합 효과가 감소 할 수 있습니다. 또한 CGRP는 다양한 비 세린 프로테아제에 의해 분해되어 위음성 결과가 증가 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 세린 프로테아제를 첨가하고 샘플 처리 시간을 60분 미만으로 제한하여 분해를 제한하지만 분해는 여전히 발생할 수 있습니다. 또 다른 한계는 테스트된 동결-해동 주기가 없다는 것입니다. Lee et al.39 는 동결-해동 주기가 단백질의 감수성에 따라 혈청 및 혈장 단백질 양을 증가시키거나 감소시킬 수 있음을 입증했습니다. 동결-해동 주기에 대한 CGRP의 감수성은 문헌에서 완전히 테스트되지 않았지만 Messlinger et al. CGRP의 수준은 동결 및 해동의 한 주기에 따라 감소한다고 언급했습니다37. 또한, 이 프로토콜의 수율은 친수성 표면으로 설계된 단백질 LoBind 튜브를 사용하여 이점을 얻을 수 있으므로 단백질 회수율이 향상될 수 있습니다.
우리는 이러한 검증 실험이 인간 혈장 16,18,35,40,41에서 CGRP를 정량화하는 최근 연구의 저자에 의해 수행되지 않은 것으로 보입니다. Messlinger et al.37의 ELISA 방법론에 대한 검토는 그러한 통제의 필요성을 강조하고 이를 사용하지 않은 연구에 의문을 제기합니다. 우리는 프로토콜을 검증하고 표준화하는 우리의 작업이 미래의 CGRP 연구를 더 나은 기반으로 삼을 것이라고 믿습니다. 이러한 프로토콜의 의미는 광범위하며 이론적으로 신경 학적 및 비 신경계 질환 과정에서 CGRP의 바이오 마커 상태를 조사하는 것으로 확장 될 수 있습니다 2,25,26,27,28,29,30,31,32,33.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 더 이상 추가 할 공개가 없습니다.
Acknowledgments
이 프로토콜에 대한 유용한 토론을 해주신 Robert N. Cole, Lauren R. DeVine, Marcos Iglesias에게 감사드립니다. 이는 미국 이비인후과 학회(Fellowship Grant, PSK), 미국 청력 연구 재단(90066548/90072266, JPC), 국립 보건원(NIH)의 구성 요소인 국립 중개 과학 발전 센터(NCATS) 및 NIH 의학 연구 로드맵(UL1 TR003098, NSF)의 자금 지원으로 부분적으로 지원되었습니다. 출판물의 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 Johns Hopkins ICTR, NCATS 또는 NIH의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.7 mL Safeseal microcentrifuge tube | Sorenson Bioscience, Inc. | 11510 | |
| 99% methanol | ThermoFisher Scientific | L13255.0F | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Falcon | 14-959-49B | |
| 2 mL round bottom sterile cryovials | CRYO.S | 122263 | |
| 4% acetic acid | ThermoFisher Scientific | 035572.K2 | |
| 6.0 mL Vacutainer EDTA collection tube | BD | 367863 | |
| Allegra 64R benchtop centrifuge | Beckman Coulter, Inc. | 367586 | |
| Aprotinin | VWR | 76344-814 | |
| CGRP (human) ELISA kit | Bertin Bioreagent | A05481 | |
| CGRP stock | Bertin Bioreagent | ||
| EIA Buffer | Bertin Bioreagent | A07000 | |
| Ellman's Reagent | Bertin Bioreagent | A09000_49+1 | |
| Multichannel pipettes | ThermoFisher Scientific | 4661180N | |
| Oasis HLB 3 cc Vac Cartridges | Waters | WAT094226 | |
| Orbital Shaker | Bellco | 7744-01010 | |
| Precision micropipettes | ThermoFisher Scientific | F144055MG | |
| SpectraMax M Series Multi-Mode Microplate reader | Molecular Devices | Part Number M2 | |
| TBS/Fish Gelatin | Bioworld, from Fischer Scientific | 50-199-167 | |
| Ultrapure water ELISA Grade | Bertin Bioreagent | A07001 | |
| Vacufuge plus - Centrifuge Concentrator | Eppendorf | 22820109 | |
| Wash Buffer | Bertin Bioreagent | A17000 |
References
- Russell, F. A., King, R., Smillie, S. -J., Kodji, X., Brain, S. D. Calcitonin gene-related peptide: physiology and pathophysiology. Physiological Reviews. 94 (4), 1099-1142 (2014).
- Brain, S. D., Grant, A. D. Vascular actions of calcitonin gene-related peptide and adrenomedullin. Physiological Reviews. 84 (3), 903-934 (2004).
- Edvinsson, L., Ekman, R., Jansen, I., McCulloch, J., Uddman, R. Calcitonin gene-related peptide and cerebral blood vessels: distribution and vasomotor effects. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 7 (6), 720-728 (1987).
- Donnerer, J., Stein, C. Evidence for an increase in the release of CGRP from sensory nerves during inflammation. Annals of the New York Academy of Sciences. 657, 505-506 (1992).
- Goadsby, P. J., Edvinsson, L., Ekman, R. Release of vasoactive peptides in the extracerebral circulation of humans and the cat during activation of the trigeminovascular system. Annals of Neurology. 23 (2), 193-196 (1988).
- Markowitz, S., Saito, K., Moskowitz, M. A. Neurogenically mediated leakage of plasma protein occurs from blood vessels in dura mater but not brain. The Journal of Neuroscience. 7 (12), 4129-4136 (1987).
- Saito, K., Markowitz, S., Moskowitz, M. A. Ergot alkaloids block neurogenic extravasation in dura mater: proposed action in vascular headaches. Annals of Neurology. 24 (6), 732-737 (1988).
- Lassen, L. H., et al. CGRP may play a causative role in migraine. Cephalalgia. 22 (1), 54-61 (2002).
- Cady, R. K., Vause, C. V., Ho, T. W., Bigal, M. E., Durham, P. L. Elevated saliva calcitonin gene-related peptide levels during acute migraine predict therapeutic response to rizatriptan. Headache. 49 (9), 1258-1266 (2009).
- Cernuda-Morollón, E., et al. Interictal increase of CGRP levels in peripheral blood as a biomarker for chronic migraine. Neurology. 81 (14), 1191-1196 (2013).
- Messlinger, K. The big CGRP flood-sources, sinks and signalling sites in the trigeminovascular system. The Journal of Headache and Pain. 19, 22 (2018).
- Ochoa-Callejero, L., et al. Circulating levels of calcitonin gene-related peptide are lower in COVID-19 patients. Journal of the Endocrine Society. 5 (3), (2021).
- Rizzi, M., et al. CGRP plasma levels correlate with the clinical evolution and prognosis of hospitalized acute COVID-19 patients. Viruses. 14 (10), 2123 (2022).
- Goadsby, P. J., Edvinsson, L., Ekman, R. Vasoactive peptide release in the extracerebral circulation of humans during migraine headache. Annals of Neurology. 28 (2), 183-187 (1990).
- Sarchielli, P., et al. Clinical-biochemical correlates of migraine attacks in rizatriptan responders and non-responders. Cephalalgia. 26 (3), 257-265 (2006).
- Greco, R., et al. Plasma levels of CGRP and expression of specific microRNAs in blood cells of episodic and chronic migraine subjects: towards the identification of a panel of peripheral biomarkers of migraine. The Journal of Headache and Pain. 21 (1), 122 (2020).
- Tvedskov, J. F., et al. No increase of calcitonin gene-related peptide in jugular blood during migraine. Annals of Neurology. 58 (4), 561-568 (2005).
- Pellesi, L., et al. Plasma levels of CGRP during a 2-h infusion of VIP in healthy volunteers and patients with migraine: An exploratory study. Frontiers in Neurology. 13, 871176 (2022).
- Kruuse, C., Iversen, H. K., Jansen-Olesen, I., Edvinsson, L., Olesen, J. Calcitonin gene-related peptide (CGRP) levels during glyceryl trinitrate (GTN)-induced headache in healthy volunteers. Cephalalgia. 30 (4), 467-474 (2010).
- Kraenzlin, M. E., Ch'ng, J. L., Mulderry, P. K., Ghatei, M. A., Bloom, S. R. Infusion of a novel peptide, calcitonin gene-related peptide (CGRP) in man. Pharmacokinetics and effects on gastric acid secretion and on gastrointestinal hormones. Regulatory Peptides. 10 (2-3), 189-197 (1985).
- Brain, S. D., Williams, T. J. Substance P regulates the vasodilator activity of calcitonin gene-related peptide. Nature. 335 (6185), 73-75 (1988).
- Kim, Y. -G., Lone, A. M., Nolte, W. M., Saghatelian, A. Peptidomics approach to elucidate the proteolytic regulation of bioactive peptides. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (22), 8523-8527 (2012).
- Katayama, M., et al. Catabolism of calcitonin gene-related peptide and substance P by neutral endopeptidase. Peptides. 12 (3), 563-567 (1991).
- Hartopo, A. B., et al. Endothelin-converting enzyme-1 gene ablation attenuates pulmonary fibrosis via CGRP-cAMP/EPAC1 pathway. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 48 (4), 465-476 (2013).
- Mair, J., et al. Plasma CGRP in acute myocardial infarction. Lancet. 335 (8682), 168 (1990).
- Antúnez, C., et al. Calcitonin gene-related peptide modulates interleukin-13 in circulating cutaneous lymphocyte-associated antigen-positive T cells in patients with atopic dermatitis. The British Journal of Dermatology. 161 (3), 547-553 (2009).
- Gangula, P. R., et al. Pregnancy and steroid hormones enhance the vasodilation responses to CGRP in rats. The American Journal of Physiology. 276 (1), H284-H288 (1999).
- Hernanz, A., Medina, S., de Miguel, E., Martín-Mola, E. Effect of calcitonin gene-related peptide, neuropeptide Y, substance P, and vasoactive intestinal peptide on interleukin-1beta, interleukin-6 and tumor necrosis factor-alpha production by peripheral whole blood cells from rheumatoid arthritis and osteoarthritis patients. Regulatory Peptides. 115 (1), 19-24 (2003).
- Takeba, Y., Suzuki, N., Kaneko, A., Asai, T., Sakane, T. Evidence for neural regulation of inflammatory synovial cell functions by secreting calcitonin gene-related peptide and vasoactive intestinal peptide in patients with rheumatoid arthritis. Arthritis and Rheumatism. 42 (11), 2418-2429 (1999).
- Ahmed, M., Srinivasan, G. R., Theodorsson, E., Schultzberg, M., Kreicbergs, A. Effects of surgical denervation on substance P and calcitonin gene-related peptide in adjuvant arthritis. Peptides. 16 (4), 569-579 (1995).
- Neugebauer, V., Rümenapp, P., Schaible, H. G. Calcitonin gene-related peptide is involved in the spinal processing of mechanosensory input from the rat's knee joint and in the generation and maintenance of hyperexcitability of dorsal horn-neurons during development of acute inflammation. Neuroscience. 71 (4), 1095-1109 (1996).
- Wang, L. H., et al. Serum levels of calcitonin gene-related peptide and substance P are decreased in patients with diabetes mellitus and coronary artery disease. The Journal of International Medical Research. 40 (1), 134-140 (2012).
- Zelissen, P. M., Koppeschaar, H. P., Lips, C. J., Hackeng, W. H.
- World Health Organization. WHO Guidelines on Drawing Blood: Best Practices in Phlebotomy. 3, Blood-sampling systems. World Health Organization. , Geneva. (2010).
- Raffaelli, B., et al. Plasma calcitonin gene-related peptide (CGRP) in migraine and endometriosis during the menstrual cycle. Annals of Clinical and Translational Neurology. 8 (6), 1251-1259 (2021).
- Andreasson, U., et al. A practical guide to immunoassay method validation. Frontiers in Neurology. 6, 179 (2015).
- Messlinger, K., et al. CGRP measurements in human plasma-a methodological study. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 41 (13), 1359-1373 (2021).
- Sakamoto, S., et al. Enzyme-linked immunosorbent assay for the quantitative/qualitative analysis of plant secondary metabolites. Journal of Natural Medicines. 72 (1), 32-42 (2018).
- Lee, J. -E., Kim, S. Y., Shin, S. -Y. Effect of repeated freezing and thawing on biomarker stability in plasma and serum samples. Osong Public Health and Research Perspectives. 6 (6), 357-362 (2015).
- Fan, P. -C., Kuo, P. -H., Lee, M. T., Chang, S. -H., Chiou, L. -C. Plasma calcitonin gene-related peptide: A potential biomarker for diagnosis and therapeutic responses in pediatric migraine. Frontiers in Neurology. 10, 10 (2019).
- Raffaelli, B., et al. Change of CGRP plasma concentrations in migraine after discontinuation of CGRP-(receptor) monoclonal antibodies. Pharmaceutics. 15 (1), 293 (2023).
