소프트 Musculoskeletal 조직에서 줄기 세포를 분리

이 절차의 전반적인 목표는 골격근과 같은 근골격계 연조직에서 성체 줄기세포를 분리하는 것입니다. 이것은 먼저 연조직의 생검을 실시하여 그것을 제거하고 잘게 자르는 방식으로 이루어집니다. 절차의 두 번째 단계는 조직을 효소로 소화하는 것입니다.

절차의 세 번째 단계는 반복적인 사전 도금 단계를 통해 줄기 세포를 분리하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 분리된 줄기 세포를 식별하는 것입니다. 궁극적으로 면역형광, 현미경 검사 및/또는 유세포 분석을 사용하여 세포의 형태학적 및 세포 거동을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

안녕하세요, 저는 피츠버그 대학교 정형외과 분자병리학 연구실의 Lee입니다. 오늘은 골격근과 같은 Mus 골격계의 연조직에서 성체 줄기 세포를 분리하는 방법을 보여 드리겠습니다. 안녕하세요, 저는 조니 워드 박사입니다.

저는 University of Pittsburgh School of Medicine의 정형외과 교수입니다. 저는 이영 박사님과 긴밀히 협력해 왔으며, 이 시술은 골격근에서 다른 종류의 줄기세포를 단열하고 표준적인 조직과 같은 변형 조직을 단열하기 위해 노력해 왔습니다. 우리는 기본적으로 중개 의학 응용 프로그램에 대한 연구 연구를 위해 줄기 세포를 분리하기 위해 실험실의 절차를 사용합니다.

그러니 공부해 봅시다. 줄기세포를 분리할 수 있는 조직에는 야생형 마우스의 뒷다리에 있는 경골 또는 가자미근에서 채취한 힘줄과 골격근이 포함됩니다. 피부와 뼈의 잔여물을 제거한 후 5% FBS가 보충된 차가운 HBSS가 들어 있는 접시에 조직을 넣습니다.

다음으로, 차가운 HBSS가 들어 있는 콜라겐 코팅된 접시에 조직을 따로 놓습니다. 골격근 조직을 사용하여 조직 해리 및 소화를 위한 기본 절차를 시연합니다. 마이크로 가위 및/또는 메스 날을 사용하여 골격 조직을 거친 슬러리, pH, 효소 분해, 조직의 효소 분해로 다지십시오.

MIT 조직 슬러리를 약 3, 500 RPM에서 섭씨 4도에서 5분 동안 원심분리기의 별도 15 밀리리터 튜브로 옮기는 것으로 시작합니다. Resus가 HBSS를 현탁시켜 SANE 세척을 제거하고 원심분리를 반복합니다. supernat를 제거한 후에, prewarm.0.2%collagenase의 10 밀리리터를 추가해서 슬러리를 소화하십시오.

Type 11은 섭씨 37도에서 60분 동안 배양하고 60분 배양이 완료되면 10분마다 튜브를 손으로 흔듭니다. 원심 분리기를 사용한 다음 10ml의 DYS 공간 용액에 슬러리를 재현탁합니다. 섭씨 37도에서 45분 동안 배양하고 45분 배양 원심분리기 및 Resus가 HBSS 용액에서 0.2%트립의 10밀리리터에 슬러리를 현탁시킨 후 10분마다 손으로 흔듭니다.

우리는 보통 섭씨 37도에서 15-20분 동안 배양하면서 10분마다 튜브를 뒤집으면 배양이 완료됩니다. 여기에 표시된 바와 같이 조직에서 충분한 단일 세포가 방출되면 생성된 세포를 원심분리하고 세포 펠릿을 5ml의 증식으로 현탁시킵니다. 중간 PM은 추출물을 일련의 바늘을 통해 18 게이지 바늘을 통해 두 번, 23 게이지 바늘을 통해 한 번, 마지막으로 27 게이지 바늘을 통해 한 번 통과시켜 세포 현탁액을 해리합니다.

마지막으로 세포 추출물을 70미크론 세포 여과기에 통과시켜 prepl 기술을 시작합니다. 방금 준비된 세포 추출물을 원심분리하고 펠릿을 증식 상태로 재현탁시킵니다. 콜라겐으로 코팅된 T 25 플라스크에 세포 혼합물 5ml를 중간 플레이트로 만들고 PP로 판매하며 가습된 5% 이산화탄소 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 2시간 동안 배양했습니다.

두 시간 후. 비부착 세포를 새로운 콜라겐 코팅된 T 25 플라스크로 옮기고 PP 2로 판매합니다. PP 1이라고 표시된 이전 T 25 플라스크에 5ml의 PM을 추가합니다.

두 플라스크를 모두 24시간 동안 인큐베이터에 다시 넣습니다. 24시간 후, PP 2에서 비부착 세포를 새로운 콜라겐 ENC 코팅 T 25 플라스크로 옮기고 PP 3으로 표시합니다. 5ml의 증식 배지를 PP 2라고 표시된 플라스크에 추가합니다.

플라스크를 인큐베이터에 다시 넣으십시오. 집단 PP 6이 될 때까지 24시간마다 절차를 반복합니다. 줄기세포 집단이 생성됩니다.

분리된 PP 6개의 세포는 수가 매우 적고 FBS가 풍부한 증식 배지에서 유지되어야 합니다. 그것은 매일 바뀌었습니다. PP six 배양에 있는 대부분의 세포는 다음 1-2주 배양 동안 죽습니다.

크고 건강한 PP 6 개체군은 일반적으로 1-2주간의 추가 확장 후에 생성됩니다. 부유 세포의 다른 모든 그룹도 유지하여 증식할 수 있도록 하고 도립 현미경을 사용하여 정기적으로 검사합니다. PP 1 플라스크와 PP 2 플라스크에 부착되는 초기 부착 세포는 대부분 섬유화 세포입니다.

콜라겐 코팅 플라스크에 부착되는 세포는 48-96시간 이내에 더 오랜 기간 후에 생성됩니다. PP 3 및 PP 4는 대부분 근 아세포입니다. 근육 위성 세포는 종종 PP 5에서 주로 보이지만 96시간 이후의 prepl 세포는 성체 줄기 세포로 간주되며 작고 둥글며 반투명하게 보입니다.

분리 초기에는 줄기세포, 항원 1호 및 CDC 34와 같은 줄기세포 마커의 발현을 위해 면역조직화학(immunohistochemistry)을 통해 추가로 특성화할 수 있습니다. 우리는 방금 쥐의 두 번째 덩어리에서 줄기 세포를 분리하는 방법을 보여줬습니다. 이 절차를 수행할 때 모든 절차 중에 스테로이드를 유지하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

줄기세포가 분리되면 세포의 줄기세포 특성을 유지하기 위해 해당 세포를 저밀도로 배양해야 합니다. 그게 다야. 시청해 주셔서 감사드리며 여러분의 경험에 행운을 빕니다 그리고 이것을 실험에 사용해보실 수 있기를 바랍니다.

감사합니다.