인간 조혈 세포 콜로니 형성 세포 (CFC) 어세이

셀 (CFC) 분석을 형성 식민지는 조혈 progenitors은 세미 솔리드 매체 식민지를 형성하는에서 시험 관내 분석이다. 콜로니 형태, 세포 형태학 및 유동세포계측법의 조합은 다른 조혈 lineages 따라 분아 따위에 의해 번식하고 차별 progenitors의 능력을 평가하는 데 사용됩니다.

이 절차는 반고체 배지에서 조혈 전구 세포가 배양을 시작하기 위해 서로 다른 조혈 계통을 따라 증식하고 분화하는 능력을 평가합니다. 사이토카인이 있는 상태에서 갓 해동한 CD 34 양성 세포는 2일 후 활성화를 촉진합니다. 바이러스가 사전 로드된 플레이트에 활성화된 CD 34 양성 세포를 추가하여 GFP 발현 테스트 구조체의 레트로바이러스 형질주입을 수행합니다.

48 시간 후에 팩시밀리에 의하여 GFP 긍정적인 세포를 고립시키고, 그 후에 성장 인자로 보충된 semi-solid 메틸셀룰로오스 매체에 있는 이 세포를 도금하고, 식민지가 표면에 나타날 때까지 대략 2 주 동안 배양하십시오. 마지막으로, 콜로니를 수확하고, 시토신을 사용하여 슬라이드의 세포를 고정화하고, 조혈 계통 및 성숙 단계의 현미경 측정을 위해 오른쪽 기자로 염색합니다. 이 방법은 백혈병 발생 연구에서 기계론적 통찰력, 즉 조혈 분화에 대한 종양 유전자의 영향을 제공할 수 있습니다.

배양을 보려면 마지막 작은 얼음 결정이 남을 때까지 부드럽게 흔들어 섭씨 37도에서 얼어붙은 CD 34개의 양성 세포 바이알을 빠르게 해동하고 세포 현탁액을 50ml 원추형 튜브로 옮깁니다. 1ml의 실온, 2%F-B-S-I-M-D-M 매체로 바이알에 남아 있는 세포를 부드럽게 헹구고 부드럽게 소용돌이치면서 50ml 튜브에 적가합니다. 이제 3분 동안 기다립니다.

2ml의 매체를 천천히 첨가하면서 부드럽게 혼합하고 다시 3분 동안 평형을 유지합니다. 3분 간격으로 희석된 세포 현탁액에 동일한 부피의 배지를 추가하는 이 절차를 반복하고, 최종 부피가 32ml에 도달할 때까지 첨가 사이에 부드럽게 소용돌이치고, 실온에서 10분 동안 250G에서 원심분리한 세포를 수집하고, 펠릿 위에 약 0.5ml의 배지를 남기고 슈퍼넷을 제거합니다. 펠릿을 20 밀리리터의 배지에 현탁시키고 200 G에서 8분 동안 원심분리하여 세포를 한 번 세척합니다.실온에서 제정신을 제거하고 밀리리터당 약 50만 개의 세포로 완전한 IMDM 배지에서 세포를 현탁시킵니다.

마지막으로, 세포 농도를 결정하기 위해 10 마이크로 리터의 현탁액을 동일한 부피의 0.4 % 트리안 블루 용액과 혼합 된 마이크로 튜브에 넣고 계산합니다. 혈구 분석기를 사용하여 활성화 사이토카인 배양액이 보충된 완전한 IMDM 배지를 첨가하여 세포를 밀리리터당 10에서 5로 희석하고, 형질도입 당일 2일 동안 5%의 이산화탄소로 가습된 섭씨 37도의 인큐베이터에서 세포를 세포 수를 세고, 바이러스 사전 로딩을 시작하기 전에 세포 수를 계산하여 preco A 24 well 미처리 조직 배양 플레이트를 준비하기 위해 준비해야 할 웰의 수를 결정합니다. 밀리리터당 25마이크로그램의 레트로 액틴 용액 400마이크로리터를 각 웰에 추가하고 층류 생물 안전 후드의 실온에서 2시간 동안 배양합니다.

레트로 액틴 용액을 제거하고 실온에서 30분 동안 배양하여 각 웰에 2% BSA를 코딩합니다. 한편, 바이러스 재고 용액을 해동하여 얼음에 보관하십시오. 그런 다음 각 웰에 0.5ml의 바이러스 제제를 첨가하고 섭씨 4도에서 15분 동안 2, 200G로 원심분리하여 BSA 용액 로드 바이러스를 흡인합니다.

웰에서 바이러스 용액을 제거하고 바이러스 로딩을 세 번 더 반복합니다. 마지막으로 차가운 IMDM 배지로 각 웰을 헹굽니다. 이제 원심분리를 통해 사전 활성화된 CD 34 양성 세포를 수집하고 사이토카인 분취 0.15 백만 CD 34 양성 세포가 보충된 새로운 완전한 IMDM 배지에 세포를 재현탁시키고 각 바이러스로 코딩된 웰, 웰에 넣고 5% 이산화탄소가 있는 가습된 섭씨 37도 인큐베이터에서 2일 동안 배양하여 부드럽게 그러나 철저하게 형질도입된 세포를 수확합니다.

바이러스가 떠다니는 플레이트에서 세포를 현탁시키고 50미크론 세포 필터를 통해 현탁액을 원뿔형 튜브로 여과합니다. 10마이크로리터의 세포 현탁액을 마이크로 튜브에 넣습니다. 동일한 부피의 trian blue 용액과 혼합하고 혈구 분석기를 사용하여 세포를 계수합니다.

0.02%EDTA가 함유된 0.8ml의 차가운 HBSS로 각 웰을 헹구고 50미크론 CEL Trix 셀 필터를 통해 동일한 수집 튜브에 추가합니다. 원심분리로 세포를 펠렛화하고 차가운 HBSS로 한 번 씻습니다. HBSS에서 최종 세포 펠릿을 1%BA로 재현탁하고 일반적으로 실험 설계를 기반으로 하는 고속 세포 분류기 핵심 시설에서 수행되는 후속 세포 분류를 위해 세포를 얼음 위에 어두운 곳에 보관합니다.

필요한 수의 CFC 분석 매체 와류를 격렬하게 해동하여 혼합하고 세포를 추가하기 전에 기포가 표면으로 올라오도록 튜브를 최소 5분 동안 그대로 둡니다. 이제 3000개의 바이러스 형질도입 분류된 세포를 차가운 2%F-B-S-I-M-D-M 배지가 들어 있는 멸균 마이크로 튜브에 넣고 최종 현탁액을 0.3ml로 조정합니다. 세포를 현탁시키고 전체 세포 현탁액을 메틸 컬트 성장 배지의 3ml 분취액으로 옮깁니다.

격렬하게 와류를 통해 균일한 세포 현탁액을 생성합니다. 튜브를 3분 동안 정지시킵니다. 세포를 플레이트하려면 3 밀리리터 주사기에 16 게이지 뭉툭한 끝 바늘을 부착하고 2.2 밀리리터를 뽑습니다.

큰 기포가 흡수되지 않도록 주의하면서 30mm 무처리 조직 배양 접시 2개에 각각 1.1밀리리터씩 밀어 넣고 100mm 접시에 물 접시와 함께 중복 접시를 회전시켜 혼합물을 고르게 펴 놓습니다. 2주 동안 3리터의 멸균 수질 배양을 계속합니다. 형태에 따라 군체를 특성화하고 점수를 매기는 방법은 점수 매기기 그리드가 표시된 배양 접시에서 40배 배율의 도립 현미경을 사용하여 점수를 매깁니다.

배양 결과를 문서화하기 위해 600DPI에서 일반 스캐너를 사용하여 전체 CFC 분석 플레이트를 스캔하고 컬러 카메라가 장착된 도립 현미경을 사용하여 대표적인 집락의 저출력 사진 현미경을 촬영하여 분화 및 증식 세포를 추가 분석합니다. 전체 CFC 분석 플레이트에서 세포 증식 세포는 형태학적 분석을 위해 세척 및 계수된 2%F-B-S-I-M-D-M의 여러 부피의 실온에서 현탁하여 회수됩니다. CFC 분석 플레이트에서 회수된 30, 000개의 세포를 슬라이드로 옮깁니다. STOs 스핀 원심 분리기를 사용하여 슬라이드를 밤새 자연 건조하여 슬라이드를 효율적으로 염색합니다.

용액을 포함하는 9개의 염색 용기로 구성된 조립 라인을 다음 순서로 설정합니다. 절대 메탄올, 오른쪽 gemsa, 스톡 용액, 오른쪽 gemsa 완충액, 50% 메탄올 및 물, 2개의 물 인산염 버퍼 pH 6 및 마지막으로 2개의 물 용기. 슬라이드를 슬라이드 캐리어에 넣고 절대 메탄올에 2분 동안 담그고 여분의 메탄올을 빼냅니다.

즉시 슬라이드 캐리어를 담그고 5분 동안 gemsa 스톡 용액을 씁니다. 캐리어를 pH 6.4의 오른쪽 gemsa 완충액으로 옮기고 10분 동안 배양합니다. 캐리어를 50% 메탄올에 두 번, 물에 10번, 다음 물 용기에 10번, 인산염 완충액에 5번 담급니다.

pH 6.0입니다. 캐리어를 물에 넣고 2분 동안 배양합니다. 마지막 물통에서 세척을 반복합니다.

이제 슬라이드가 캐리어에서 완전히 자연 건조되도록 합니다. 각 슬라이드를 제거하고 메탄올을 적신 Kim 물티슈로 슬라이드 뒷면을 닦아 얼룩을 제거합니다. cyto seal 60 한 방울과 커버 유리를 밀봉합니다.

현미경을 사용하여 각 GM 지속 슬라이드에 대해 500 세포 감별 계수를 수행합니다. 이 실험의 목적을 위해 세포는 원시 세포, 중간 골수성 세포, 성숙 골수성 세포, 중간 적혈구 세포 및 성숙 적혈구 세포의 5가지 범주로 나뉩니다. 예를 들어, 새로운 98 매의 대조군 발현과 비교했을 때, 9개의 종양 유전자는 붉은 적혈구 군집의 형성을 증가시켰습니다.

종양유전자의 이러한 시장 영향은 저배율에서 군체를 관찰할 때 분명하게 나타납니다. GEM sustaining에 의한 추가 형태학적 검사는 세포 집단의 계통 및 성숙 정도에 대한 정보를 제공합니다. 이 예에서 새로운 98 Hawks의 도입, 9는 적혈구 증식을 가진 세포의 수를 전반적으로 증가시키고 적혈구 및 골수성 성숙의 억제를 억제했습니다.

이 SA는 반고체 배지에서 콜로니를 증식, 분화 및 형성하는 입력 세포 제제의 능력을 측정하여 조혈 세포 분화에 대한 통찰력을 제공합니다.