Name: 인간 조혈 세포 콜로니 형성 세포 (CFC) 어세이 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-18T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: 학습하세요 인간 CD34+ 조혈 전구세포의 증식과 분화를 평가하는 콜로니 형성 세포(CFC) 어세이 방법을. 레트로바이러스 전달과 메틸셀룰로스 배양을 통해 백혈병 발생 기전 연구에 활용합니다.

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우리는 유동세포계측법 장비 및 정렬 서비스를 제공하는 고속 셀 분류기 코어의 사용, 의학 세인트 루이스, MO에있는 반스 - 쥬이시 병원 워싱턴 대학 학교에서 앨빈 J. Siteman 암 센터를 주셔서 감사합니다. 이 작품은 보건 기금의 국립 연구소 R01 HL082549 및 K02 HL084179 (NRY)에 의해 지원되었다. Siteman 암 센터는 NCI 암 센터 지원 그랜트 P30 CA91842에 의해 부분적으로 지원됩니다.

1. 시약의 준비 <ol><li> FMS 관련 티로신 키나제 3 멸균 1000x 재고 솔루션 준비 (를 편명 - 3) 리간드, 대식 세포 / 과립구 콜로니 - 자극 인터루킨 (IL) -3 인자 (GM - CSF), 줄기 세포 인자 (SCF), thrombopoietin (TPO), 및 IL - 6 제조 업체의 지시에 따라. 무균 Retronectin 주식 솔루션 (1mg/ml)도 제조 업체의 지시에 따라 준비. 작은 aliquots하여 해당 주식 솔루션을 나누어 반복 동결 - 해동을 피하기 위해 -20 ° C에서 보관. </li><li> IMDM에 2% FBS를 준비합니다. </li><li> 최종 20% FBS의 농도, 2 MM의 글루타민, 100 단위 / ML 페니실린 / 스트렙토 마이신 (PS) 완벽한 IMDM 매체를 준비합니다. 바로 사용하기 전에 다음과 같은 크린 시토킨 추가 : 100 NG / ML 편명 - 3 리간드, 20 NG / ML GM - CSF, 100 NG / ML SCF, 100 NG / ML TPO, 50 NG / ML IL - 3, 100 NG / ML IL - 6. </li><li> HBSS의 1 % BSA (페놀 레드없이 칼슘 및 MG - 무료) 및 D - PBS (CA &amp; MG 무료)에서 2 % BSA를 준비합니다. 4 0.22 μm의 주사기 필터 및 매장 ° C. 통과하여 솔루션을 소독 </li><li> 4 HBSS와 저장소에 0.02 % EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)을 준비 ° C. </li><li> -80에서 aliquots에 대한 관심과 저장소의 DNA ° C. 인코딩 GaLV - pseudotyped 레트로 바이러스 준비 이 절차는이 문서의 범위 밖이지만, (1-3) 다른 설명되어 있습니다. </li></ol> Giemsa의 스테 이닝을위한 <ol start="7"><li> 그냥 사용하기 전에 깨끗한 유리병에 1 μm의 여과지를 통해 두 번 라이트 / Giemsa 얼룩 솔루션을 필터링합니다. </li><li> 지오다노 공식 - 즉시 사용하기 전에 필터링 라이트 / Giemsa 얼룩 솔루션과 인산염 버퍼 솔루션, 산도 6.4 200 ML 50 ML을 혼합하여 라이트 / Giemsa 버퍼 산도 6.4 준비합니다. </li><li> 3.5 LH 2 O.에서 KH 2 PO 27.3 g 4 나 2 HPO 4 4.62 g을 용해하여 인산 버퍼 용액, pH를 6.0 준비 </li><li> H 2 O.에서 50 %의 메탄올을 준비 </li></ol> 2. 절차 해동 및 CD34의 사전 활성화 + 세포 <ol><li> 37 신속하게 냉동 CD34 + 세포의 병을 해동 ° C 부드럽게 마지막 작은 얼음 결정이 남아 때까지 떨고 50 ML 원뿔 튜브에 세포 현탁액 (1 ML)를 송금. 부드럽게 실온 1 ML와 유리병에서 남아있는 세포를 씻어 2% FBS / IMDM하고 부드럽게 소용돌이 치는 동안 50 ML 튜브 드롭 현명한를 추가합니다. 3 분만 기다. 다음, 천천히 부드럽게 혼합하면서 2% FBS / IMDM 2 ML을 추가하고, 3 분 기다리십시오. 최종 볼륨 32 ML에 도달할 때까지, FBS / IMDM 그 3 분 간격으로 희석 세포 현탁액과 같은 볼륨 2 % 추가 추가 사이에 부드럽게 소용돌이에 의해 절차를 반복합니다. </li><li> 실온에서 10 분 250 XG에 원심 분리기와 0.5 주변 ML 뒤에 떠나는 뜨는을 제거합니다. </li><li> 20 ML 2퍼센트 FBS / IMDM에 정지하고 실온에서 팔분 200 XG에 centrifuging하여 펠렛을 씻으십시오. </li><li> 뜨는을 제거하고 약 0.5 X 10 6 세포 / ML에서 전체 IMDM 매체에있는 세포를 일시 중지합니다. Trypan 파랑 솔루션의 같은 볼륨 (0.4 %)와 microtube, 혼합에 세포 현탁액의 10 μl를 타고 hemocytometer를 사용하여 계산합니다. </li><li> (1.3 참조) 크린 시토킨와 보충 전체 IMDM 미디어를 추가하여 0.1-0.15 X 10 6 세포 / ML로 세포를 희석 </li><li> 문화 2 일 5 % CO 2 humidified 37 ° C 배양기에서 세포. </li></ol> 바이러스 사전로드하여 Retroviral 전달 <ol start="7"><li> 형질 도입의 날, 준비하는 우물의 수를 결정하는 preloading 바이러스를 시작하기 전에 세포를 계산합니다. </li><li> 25 μg / ML에 Retronectin 재고 솔루션을 희석하고 24 잘되지 않은 대우 조직 문화 판의 각 잘 ~ 400 μl를 추가합니다. 사전 코팅으로 층류 흐름 biosafety 후드에 실온에서 2 시간 동안 부화. </li><li> Retronectin 솔루션을 제거하고 각 잘하는 D - PBS의 2 % BSA 400 μl를 추가합니다. 실온에서 30 분 알을 품다. </li><li> 바이러스 주식 솔루션을 녹여 얼음 계속. BSA 솔루션을 제거하기 위해 각 물론 바이러스 준비 0.5 ML를 추가하고 4 2200 XG에서 원심 분리기 ° C 15 분. </li><li> 우물에서 바이러스 솔루션을 제거하고 2.10보다 세 번에 설명되어있는 바이러스 로딩을 반복합니다. </li><li> 추운 0.5 ML HBSS (+ 칼슘 &amp; MG) 또는 IMDM 각 잘 린스. </li><li> 상온에서 팔분 200 XG에 centrifuging하여 미리 활성화 CD34 + 세포를 수집합니다. </li><li> 크린 시토킨 완벽한 IMDM 매체에서 1.5 ML 당 0.1-0.15 X 10 6 세포에서 세포를 Resuspend. </li><li> 각 물론 1.5 ML의 세포 현탁액을 추가하고 2 일간 5 % CO 2 humidified 37 ° C 배양기에서 알을 품다. </li></ol> 의 세포 분류와 컬렉션은 세포를 transduced <ol start="16"><li> 부드럽게하지만 철저하게 바이러스 로드된 판 위에있는 세포를 일시 중지원뿔 관에 50 μm의 CellTrics 전지 필터를 통해 S 및 필터. Trypan 파랑 솔루션의 동일한 볼륨 microtube, 혼합에 세포 현탁액의 10 μl를 타고 hemocytometer를 사용하여 계산합니다. 감기 0.02 % EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) / HBSS (페놀 레드없이 칼슘 및 MG - 무료)의 0.8 ML 각 잘 씻어 50 μm의 CellTrics 전지 필터를 통해 동일한 수집 관에 추가할 수 있습니다. </li><li> 4 팔분 ° C 200 XG에서 세포를 원심 분리기, 4 8 분 200 XG에 centrifuging하여 추위 HBSS와 펠렛을 (페놀 레드없이 칼슘 및 MG - 무료) 씻어 ° C. </li><li> BSA / HBSS (페놀 레드 않고 칼슘 &amp; MG 무료) 15 X 10 6 / ML 또는 셀 정렬 0.250 ML 최소 볼륨의 농도 1 %의 펠렛을 Resuspend. 어둠 속에서 얼음 세포 보관하십시오. 감기 20% FBS / IMDM / 정렬 세포를 수집하기 위해 글루타민 / PS 매체를 포함하는 튜브를 준비합니다. 정렬은 MoFlo 고속 분류기을 (Dako, Glostrup, 덴마크)를 사용하여 의학의 워싱턴 대학 학교에서 앨빈 J. Siteman 암 센터의 고속 셀 분류기 코어에서 수행됩니다. </li></ol> CFC 분석 <ol start="19"><li> CFC 분석 미디어 3 ML aliquots의 필요한 번호를 녹여. 와동이 적극적으로 혼합 및 튜브 어떤 거품이 세포를 추가하기 전에 표면에 상승에 제출하도록 적어도 5 분 대기하도록. </li><li> 각 정렬 샘플에 대한 세포 농도를 얻으려면 대략적인 세포 현탁액 볼륨으로 정렬 시설에서 제공하는 휴대폰 번호를 나누었습니다. 3000을 가지고 바이러스 transduced, 차가운 2% FBS / IMDM을 포함하는 멸균 microtube에 정렬 세포. 사전 조정의 최종 정지 볼륨 약 0.3 ML됩니다 FBS / IMDM 그런데 2 %의 볼륨을. </li><li> , 세포를 일시 중지 및 2 MM L - 글루타민 1 % 메틸 셀룰로오스로 구성되어 있습니다 Methocult GF + H4435, 30 % FBS, 1 % BSA, 10 -4 M 2 - 메르 캅 토 에탄올의 3 ML의 나누어지는으로 전체 0.3 ML 세포 현탁액을 전송 50 NG / ML SCF, 20 NG / ML GM - CSF, 20 NG / ML IL - 3, 20, NG / ML IL - 6, 20 NG / ML G - CSF, 3 유닛 / IMDM에 ML erythropoietin. 1.3 %의 메틸 셀룰로오스 메틸 셀룰로오스로 구성되어 인간의 풍부한 미디어 (R &amp; D 시스템), 25 % FBS, 1 % BSA, 5 × 10 -5 M 2 - 메르 캅 토 에탄올, 2 MM L - 글루타민, 50 NG / ML SCF, 20 NG / GM - CSF ML, 20 NG / ML IL - 3, 20, NG / ML IL - 6, 20 NG / ML G - CSF, 3 유닛 / IMDM에 ML erythropoietin도 사용할 수 있습니다. </li><li> 와동이 적극적으로 혼합물이 완전히 상승하고 3-4 회를 떨어뜨릴 수 있습니다. 튜브 3 분 가만히 보자. </li><li> 3 ML의 주사기에 16 게이지 날이 엔드 바늘을 첨부하고 2.2 ML를 그립니다. 큰 거품을 그려하지 마십시오 몇 번 데이트를 추진하여 처음에 그들을 추방. 각각의 두 개의 30mm 비 취급 그릇에 1.1 ML를 밀어 넣기 및 회전에 의해 균일하게 혼합 분산. </li><li> 3 ML 멸균 물이 들어있는 물을 접시와 함께 100mm 접시에 접시를 중복 배치합니다. 17일 - 14 문화. </li><li> 점수 그리드로 표시된 문화 접시에있는 40x 배율에서 거꾸로 현미경으로 자신의 형태에 따라 식민지를 특징 및 점수. 순수 erythroid, myelomonocytic 및 혼합 : 우리의 분석의 목적은 식민지 3 범주로 구분됩니다. 더 콜로니 subclassification에 대한 제조 업체의 지시 사항을 참조하십시오. </li><li> 전체 CFC 분석 플레이트는 일반 600 DPI에서 스캐너, 그리고 식민지의 ph​​otomicrographs가 컬러 카메라가 장착된 거꾸로 현미경을 사용하는가 취해질 수 저전력을 (40x)를 사용하여 배율없이 검사할 수 있습니다. </li><li> 분화와 확산의 자세한 분석을 위해, 전체 CFC 분석 플레이트의 세포는 실내 온도 2퍼센트 FBS / IMDM 몇 권 정지하여 복구할 수 있습니다. 4 10 분 ° C 300 XG에서 원심 분리 후, 세포가 2% FBS / IMDM, 계산하고, 두 유동세포계측법에 대한 항체와 스테인드 또는 Giemsa의 얼룩을위한 Cytospin의 원심 분리기를 사용하여 슬라이드로 전송에 resuspended 있습니다. </li></ol> 항체 얼룩 및 유동세포계측법 <ol start="28"><li> 4 8 분 200 XG에 원심 분리기 세포 HBSS에 차가운 50% 정상 마우스 혈청에서 ° C와 resuspend (페놀 레드 않고 칼슘 &amp; MG 무료). </li><li> 관 당 80 μl (12 X 75mm 왕복 하단 튜브)에 약 5 × 10 5 세포를 놓고 얼음 계속. 항체 혼합물 (노 항체 컨트롤에 대한 약 20 μl 혼합 또는 부정적인 제어 솔루션)와 가볍게 튜브를 감청하여 믹스를 추가합니다. 없이 항체 또는 각 fluorochrome위한 안티 CD45 항체와 교정 제어 튜브를 준비합니다. 20 분 동안 어둡고 품어 얼음 속에서 플레이스 튜브. 가볍게 처음 10 분 후에 튜브를 도청하여 섞는다. 20 분 부화 후, 차가운 HBSS와 튜브를 작성하여 4 8 분 200 XG에 원심 분리기 ° C. 감기 0.5 % paraformaldehyde / HBSS에서 펠렛을 Resuspend. 항체의 혼합물은 일반적으로 다음과 같은 분석을 위해 사용됩니다. 골수양 차별 화를위한 : CD11b (phycoerythrin - 복합 클론 ICRF44) / CD33 (allophycocyanin - 복합 클론 WM53) / CD45 (phycoerythrin - Cy7 - congjugated 복제 HI30). erythroid 차별 경우 : CD71 (phycoerythrin - 복합 클론 M - A712) / CD235a (allophycocyanin - 복합 클론 GA - R2) / CD45 (phycoerythrin - Cy7 - congjugated 복제 HI30). </li><li> 유동세포계측법 5 색상 두 레이저 (BD Biosciences)로 업그레이 드 FACScan 흐름 cytometer에 의과 워싱턴 대학 학교에서 앨빈 J. Siteman 암 센터의 고속 셀 분류기 코어에서 수행하고 CellQuest (BD Biosciences) 또는를 사용하여 분석됩니다 FlowJO v7.2.4 (트리 스타 (주), 애쉬 랜드, OR, 미국) 소프트웨어. </li></ol> Giemsa의 얼룩 <ol start="31"><li> CFC 분석 플레이트에서 발견한 약 30,000 세포는 0.3에서 일시 중지 위에 설명한 ML 2퍼센트 FBS / IMDM하고 실온에서 10 분 1,000 RPM에서 Cytospin의 원심 분리기를 사용하여 슬라이드로 전학 왔어. </li><li> 다음과 같은 순서로 솔루션을 포함하는 구 얼룩 혈관을 설정합니다. <ol><li> 절대 메탄올 </li><li> 라이트 / Giemsa 재고 솔루션 </li><li> 라이트 / Giemsa 버퍼, pH를 6.4 </li><li> H 2 O의 50 % 메탄올 </li><li> H 2 O </li><li> H 2 O </li><li> 인산염 버퍼, 산도 6.0 </li><li> H 2 O </li><li> H 2 O </li></ol></li><li> 슬라이드 캐리어에 슬라이드를 삽입하고 (# 1) 절대 메탄올에서 수영 2 분 및 초과 메탄올을 얼룩. </li><li> 즉시, 5 분 라이트 / Giemsa 주식 솔루션에 슬라이드 캐리어 (# 2) 수영. </li><li> 라이트 / Giemsa 버퍼, pH를 6.4 (# 3)에 캐리어 전송 10 분 알을 품다. </li><li> (# 4) 50 % 메탄올에 두 항공사를 찍어, H 2 O (# 5), H 2 O (# 6)에서 다른 10 배, 10 배 그리고 인산 버퍼, pH를 6.0에서 5 시간 (# 7) . </li><li> H 2 O (# 8)에 캐리어를 전송 2 분 알을 품다. H 2 O (# 9)에 세척을 반복합니다. </li><li> 슬라이드는 캐리어에서 완전히 건조 공기를 허용합니다. 각 슬라이드를 제거하고 얼룩을 제거하기 위해 메탄올 - 절어 Kimwipes와 슬라이드의 뒷면을 닦아냅니다. Cytoseal 60 방울 날인에 덮개 유리를 놓습니다. </li><li> 500 세포 차동 개수는 올림푸스 BX51 현미경을 사용하여 각 Giemsa 묻은 슬라이드 수행됩니다. 셀 다섯 범주로 나누어집니다 : 원시 세포가 폭발하고 promyelocytes를 포함, 중간 골수양 세포가 myelocytes 및 metamyelocytes을 포함, 성숙한 골수양 세포는 밴드, 세그먼트 neutrophils, monocytes, 그리고 macrophages를 포함, 중간 erythroid 세포는 중간 hemoglobinization와 세포를 포함하며, 성숙 erythroid 세포는 다음과 같습니다 전체 hemoglobinization과 세포. Photomicrographs는 60x 기름 목적으로 올림 DP71 카메라로 찍은 있습니다. </li></ol> 3.0) 대표 결과 : <ol><li> CFC 분석 : 입력 셀 인구의 일부는, 분아 따위에 의해 번식 차별화, 그리고됩니다 14-17 일 잠복기 동안 반 고체 매체에 양식 ​​식민지. 본 실험에서는, 그것은 NUP98 - HOXA9 oncogene의 표현이 두드러진 빨간색 (erythroid 식민지) (그림 1) (3)의 형성을 일으킨 것이 분명하다. </li><li> 항체 스테 이닝 및 유동세포계측법 : CFC 분석 플레이트에서 수집한 세포의 흐름 cytometric immunophenotyping은 세포 인구의 분화 상태에 대한 정보를 제공합니다. 특정 분화 마커에 대한 항체의 결합 사용하여, 세포의 성숙의 혈통과 수준을 평가하실 수 있습니다. 이 경우에는 CD235a은 erythroid 세포를 식별하는 데 사용되었다. 그림 2A에 표시된 NUP98 - HOXA9는 CD235a + erythroid 세포의 비율 증가의 원인이 있지만, 이러한 세포 CD235a 표현의 밝기는 erythroid의 성숙의 억제를 나타내는, 컨트롤에 비해 감소했다. 그림 2B에서 골수양 세포들은 CD33 양성의 미덕에 의해 식별됩니다. NUP98 - HOXA9은 골수양 성숙 (3)의 억제와 일치하는 CD11b 표현의 밝기의 감소와 함께, CD33 + 세포의 숫자 감소가 발생했습니다. 그러므로 유동세포계측법 결과 NUP98 - HOXA9은 골수양 및 erythroid 모두 성숙의 억제와 erythroid 증식을 일으킨 것을 보여줍니다. </li><li> Giemsa의 스테 이닝 : CFC 분석 플레이트에서 수집한 세포의 형태학의 검사는 세포 인구의 성숙의 혈통과 학위에 대한 정보를 제공합니다. morphologically 얻은 결론은 흐름 cytometric 연구에 의해 얻은과는 다를 수 있으며, 따라서 이러한 방법 (3) 서로 보완하고 있습니다. 실험은 적어도 3 회 반복되며, 위에서 설명한 각각의 시간은 500 세포 차동 개수는 세포의 5 종류를 구별하기 위해 수행됩니다. 이러한 세포의 예는 그림 3에서 지적하고 있습니다. 결과는 사이에 통계적으로 의미있는 차이 oncogene - transduced 샘플과 제어가 있는지 확인하기 위해 tabulated 및 분석입니다. 이 경우 결과는 NUP98 - HOXA9는 숫자에 전반적인 증가를 일으킨 것으로 나타났다erythroid의 증식과 erythroid 및 골수양 성숙 (3) (표시되지 않음)을 모두 억제와 세포의. </li></ol> 그림 전설 <img src="/files/ftp_upload/2195/2195fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1 : 인간의 CFC의 형태에 NUP98 - HOXA9의 효과. 기본 인간의 CD34 + 세포는 retrovirally 제어 MSCV - IRES - GFP 벡터 또는 벡터 중 하나가 NUP98 - HOXA9 표현과 transduced 있었고, 세포가 GFP의 양성을 위해 정렬했다. 한 천 세포 CFC 분석을위한 두 가지 중복 접시의 각에 씨앗을 품고 있었고, 실험 3 4 독립 번 반복되었다. 확대 (왼쪽)와 대표 erythroid 식민지 (오른쪽)의 낮은 전력 photomicrographs없이 대표 접시 (3) 표시됩니다. <img src="/files/ftp_upload/2195/2195fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2 : 유동세포계측법가 NUP98 - HOXA9에 의해 인간의 기본 CD34 + 세포 분화의 장애를 보여줍니다. (A) erythroid의 차별 화를위한 유동세포계측법 : CFC의 접시의 세포는 (그림 1 참조) CD45와 CD235a하는 항체와 수확 및 스테인드했다. CD235a는 + 게이트는 제어 세포에 비해 CD235a의 표현을 보여주는 히스토그램 (오른쪽 패널)에 역모를했습니다 (B) 골수양 차별 화를위한 유동세포계측법 : CFC 접시의 세포는 CD45과 CD33와 수확 및 스테인드했다. CD33는 + 게이트 (오른쪽 패널) 컨트롤에 비해 CD11b 표현을 보여주는 히스토그램을 꾸몄다되었습니다. 각 게이트 이내에 떨어지는 세포의 비율 (3) 표시됩니다. <img src="/files/ftp_upload/2195/2195fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3 : 셀 형태가 NUP98 - HOXA9에 의해 분화의 방해가 벡터 제어에 비해 보여줍니다. Cytospin 얼룩은 CFC의 접시에서 준비하고 Giemsa 물들일되었습니다. Photomicrographs는 60x 오일 목적으로 대표 분야에서 찍은. B : 폭발, MM : 성숙 골수양, IM : 중간 골수양, ME : 성숙 erythroid, IE : 중급 erythroid (3).

<ol><li>Takeda, A., Goolsby, C., Yaseen, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NUP98-HOXA9+induces+long-term+proliferation+and+blocks+differentiation+of+primary+human+CD34%2B+hematopoietic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">NUP98-HOXA9 induces long-term proliferation and blocks differentiation of primary human CD34+ hematopoietic cells.</a> Cancer Res. , 66-6628 (2006).</li>
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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

CFC의 분석은 조혈 progenitors의 확산과 차별의 패턴을 결정하고 oncogenes의 효과를 (4, 5) 연구에 광범위하게 사용되고 있습니다. 그것은 식민지가 단일 조상의 자손을 나타내는 개별적으로 추가 분석을 위해 제거할 수 있습니다 그러한 clonal 분석,되는 액체 문화 이상의 장점이 있습니다. 이러한 전지는 사용 감지 장기적인 문화 시작 셀 (LTC - IC) 분석 (6, 7). CFC 분석의 한계는 더 어려서 progenitors 또는 조혈 줄기 세포의 검출을 위해 적합하지 않습니다이다 실험은 AML - 관련 oncogene NUP98 - HOXA9은 골수양 및 erythroid 성숙을 억제하고 erythroid 증식 (1, 3) 원인이되는 보여줍니다 여기에서 설명한. 메틸 셀룰로오스 기반의 문화가 비교적 장기이고 CFC 매체 항생제를 포함하지 않기 때문에, 그것은 특히 중과 정렬 후, 세포 문화의 오염을 방지하기 위해 파라마운트 중요하다. 작은 박테리아 또...

<table><tbody><tr><td>IMDM</td><td>Life Technologies</td><td>12440</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>06150</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin (PS)</td><td>Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>FLT-3 리간드</td><td>PeproTech Inc</td><td>300-19</td><td></td></tr><tr><td>GM-CSF</td><td>PeproTech Inc</td><td>300-03</td><td></td></tr><tr><td>SCF</td><td>PeproTech Inc</td><td>300-07</td><td></td></tr><tr><td>TPO</td><td>PeproTech Inc</td><td>300-18</td><td></td></tr><tr><td>IL3</td><td>PeproTech Inc</td><td>200-03</td><td></td></tr><tr><td>IL6</td><td>PeproTech Inc</td><td>200-06</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민(Bovine Serum Albumin)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP118</td><td></td></tr><tr><td>Retronectin</td><td>Takara Bio Inc</td><td>T100A</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life Technologies</td><td>14175</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>14200</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue 용액 (0.4%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Methocult GF+ H4435</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>04445</td><td></td></tr><tr><td>인간 메틸셀룰로오스 강화 배지(Human Methylcellulose Enriched Media)</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>HSC005</td><td></td></tr><tr><td>Wright/Giemsa 염색액</td><td>Harleco</td><td>64571</td><td></td></tr><tr><td>인산 완충 용액, pH 6.4 - Giordano 포뮬러</td><td>Ricca Chemical Company</td><td>1450</td><td></td></tr><tr><td>메탄올</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412-4</td><td></td></tr><tr><td>Cytoseal 60</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>8310</td><td></td></tr><tr><td>정상 생쥐 혈청(Normal Mouse Serum)</td><td>Rockland Immunochemicals</td><td>D208</td><td></td></tr><tr><td>Phyc&amp;#8211;rythrin 접합 Anti-Human CD11b</td><td>BD Biosciences</td><td>555388</td><td></td></tr><tr><td>Allophycocyanin 접합 Anti-Human CD33</td><td>BD Biosciences</td><td>551378</td><td></td></tr><tr><td>Phyc&amp;#8211;rythrin-Cy7 접합 Anti-Human CD45</td><td>BD Biosciences</td><td>557748</td><td></td></tr><tr><td>Phyc&amp;#8211;rythrin 접합 Anti-Human CD71</td><td>BD Biosciences</td><td>555537</td><td></td></tr><tr><td>Allophycocyanin 접합 Anti-Human CD235a</td><td>BD Biosciences</td><td>551336</td><td></td></tr><tr><td>Phyc&amp;#8211;rythrin-Cy7 접합 Anti-Human CD45</td><td>BD Biosciences</td><td>557748</td><td></td></tr><tr><td>24-웰 비처리 조직 배양 플레이트</td><td>BD Biosciences</td><td>35-1147</td><td></td></tr><tr><td>30 mm 비처리 디쉬</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>27150</td><td></td></tr><tr><td>100 mm 조직 배양 디쉬</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-12</td><td></td></tr><tr><td>격자 무늬 스코어링 디쉬</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>27500</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 원심분리 튜브</td><td>BD Biosciences</td><td>35-2097</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 원심분리 튜브</td><td>BD Biosciences</td><td>35-2070</td><td></td></tr><tr><td>3 ml 주사기</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>28240</td><td></td></tr><tr><td>16 게이지 둔단, 1&amp;frac12; 인치 바늘</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>28110</td><td></td></tr><tr><td>50 &amp;mu;m CellTrics 세포 필터</td><td>Partec</td><td>04-004-2327</td><td></td></tr><tr><td>혈구계수기(Hemocytometer)</td><td>Fisher Scientific</td><td>0267110</td><td></td></tr><tr><td>TPX 샘플 챔버</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>A78710018</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Superfrost/Plus 현미경 슬라이드, 사전 세척됨</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Shandon 필터 카드</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>5991022</td><td></td></tr><tr><td>Shandon 사이토스핀 슬라이드 홀더</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>59920063</td><td></td></tr><tr><td>Shandon Complete Staining Assembly 100</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>100</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark Corporation</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>1 &amp;mu;m 여과지</td><td>VWR international</td><td>28307-134</td><td></td></tr><tr><td>도립 현미경</td><td>Nikon Instruments</td><td>Diaphot</td><td></td></tr><tr><td>현미경 카메라</td><td>Nikon Instruments</td><td>DS-F11</td><td></td></tr><tr><td>현미경</td><td>Olympus Corporation</td><td>BX51</td><td></td></tr><tr><td>현미경 카메라</td><td>Olympus Corporation</td><td>DP71</td><td></td></tr><tr><td>스캐너</td><td>Microtek</td><td>Scanmaker 4</td><td></td></tr><tr><td>볼텍스 믹서</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-812</td><td></td></tr><tr><td>조직 배양 인큐베이터</td><td>Sanyo</td><td>MCO-18AIC</td><td></td></tr><tr><td>사이토스핀(Cytospin)</td><td>Shandon, Inc.</td><td>Cytospin 2</td><td></td></tr><tr><td>벤치탑 원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>5810-R</td><td></td></tr><tr><td>초순수 제조 시스템</td><td>Barnstead</td><td>Nanopure-Diamond</td><td></td></tr></tbody></table>

인간 조혈 세포 콜로니 형성 세포 (cfc) 어세이

Colony Forming Cell (CFC) Assay for Human Hematopoietic Cells

인간 조혈 줄기 / 전구 세포는 보통 골수, 코드 혈액, 또는 주변 혈액에서 얻은 있으며, 조혈 및 leukemogenesis을 연구하는 데 사용됩니다. 그들은 림프 및 골수양 lineages로 차별화하는 능력이 있습니다. 셀 (CFC) 분석을 형성 식민지는 semisolid 매체 식민지를 형성하는 능력에 의해 증식 및 조혈 progenitors의 차별 패턴을 연구하는 데 사용됩니다. 입력 세포의 고정 숫자에 의해 형성된 콜로니의 숫자와 형태 차별 progenitors의 능력에 대한 사전 정보를 제공하고 세포 분열 따위에 의해 번식. 전지는 더욱 자신의 번호와 유동세포계측법 및 Giemsa 묻은 슬라이드 morphologic 평가를 사용하여 차별 상태를 평가하기 위해 각각의 식민지에서 또는 전체 접시에서 수확 수 있습니다. 이 분석은 골수양하지만 림프하지 차별을 평가하는 데 유용합니다. 이 맥락에서 용어 골수양는 granulocytic, monocytic erythroid 및 megakaryocytic lineages을 포괄하기 위해 넓은 의미에서 사용됩니다. 우리는 주변 혈액에서 파생 기본 인간의 CD34 + 세포의 분화에 oncogenes의 효과를 평가하기 위해이 분석을 사용했습니다. 이러한 목적 세포에 대한이 사건 NUP98 - HOXA9에서, 제어 retroviral 구조 또는 관심의 oncogene을 표현하는 구성 하나와 transduced 있습니다. 우리는 관심과 GFP 표지의 유전자를 생산하는 bicistronic mRNA를 표현 일반적으로 사용되는 retroviral 벡터, MSCV - IRES - GFP를 사용합니다. 세포 retroviral 전달하기 전에 이틀 동안 크린 시토킨의 면전에서 성장하여 미리 활성화됩니다. 또 이틀 뒤에는, GFP + 세포는 형광 활성화된 셀 정렬 (외과)에 의해 격리되며 크린 시토킨로 보충하고 식민지는 일반적으로 표면을 14 일에 나타날 때까지 incubated 메틸 셀룰로오스 함유 semisolid 매체와 혼합. 식민지의 개수와 형태가 설명되어 있습니다. 세포는 다음 접시에서 제거 씻어, 계산 및 유동세포계측법 및 morphologic 심사를 받게됩니다. 조혈 동안 표현 세포 표면 마커 특정 항체와 유동세포계측법는 가계와 성숙 단계에 대한 정보를 제공합니다. 라이트 - Giemsa의 얼룩 후 현미경으로 각각의 세포의 형태학의 연구는 혈통과 성숙에 관한 자세한 정보를 제공합니다. 세포의 비교 oncogene 조혈 차별에 oncogene의 효과를 밝혀와 transduced들에게 빈 벡터 제어와 transduced.

셀 (CFC) 분석을 형성 식민지는 조혈 progenitors은 세미 솔리드 매체 식민지를 형성하는에서 시험 관내 분석이다. 콜로니 형태, 세포 형태학 및 유동세포계측법의 조합은 다른 조혈 lineages 따라 분아 따위에 의해 번식하고 차별 progenitors의 능력을 평가하는 데 사용됩니다.

인간 조혈 세포 콜로니 형성 세포 (CFC) 어세이

인간 조혈모세포/전구세포는 일반적으로 골수, 제대혈 또는 말초혈액에서 얻으며, 조혈 작용과 ...을 연구하는 데 사용됩니다.

본 절차는 반고체 배지에서 조혈 전구세포가 증식하고 서로 다른 조혈 계통으로 분화하여 배양을 시작하는 능력을 평가합니다. 해동한 지 얼마 되지 않은 CD 34 양성 세포를 사이토카인이 존재하는 환경에서 2일간 배양하여 활성화를 촉진합니다. 바이러스가 미리 로딩된 플레이트에 활성화된 CD 34 양성 세포를 첨가하여 GFP 발현 테스트 컨스트럭트의 레트로바이러스 형질전환을 수행합니다.48시간 후 FACS를 통해 GFP 양성 세포를 분리한 다음, 성장 인자가 첨가된 반고체 메틸셀룰로오스 배지에 이 세포들을 도말하고 표면에 콜로니가 나타날 때까지 약 2주 동안 배양합니다. 마지막으로, 콜로니를 수확하여 사이토카인으로 슬라이드에 세포를 고정하고, 라이트 기자(Wright-Giemsa) 염색을 통해 조혈 계통 및 성숙 단계를 현미경으로 판정합니다. 이 방법은 백혈병 발생 연구, 특히 온코진(oncogene)이 조혈 분화에 미치는 영향에 대한 기전적 통찰을 제공할 수 있습니다.배양 상태를 빠르게 확인하기 위해, 동결된 CD 34 양성 세포 바이알을 37 °C에서 마지막 작은 얼음 결정이 남을 때까지 부드럽게 흔들어 빠르게 해동한 후, 세포 현탁액을 50 mL 원심 분리관으로 옮깁니다. 바이알에 남아 있는 세포를 상온의 2% F-B-S-I-M-D-M 배지 1 mL로 부드럽게 헹구어내고, 관을 부드럽게 돌려가며 50 mL 튜브에 한 방울씩 첨가합니다. 이제 3분 동안 대기합니다.부드럽게 혼합하면서 배지 2 mL를 천천히 첨가한 후, 다시 3분 동안 평형을 맞춥니다. 최종 부피가 32 mL가 될 때까지 3분 간격으로 희석된 세포 현탁액에 동일한 부피의 배지를 첨가하는 과정을 반복하며, 첨가 사이에는 부드럽게 소용돌이치듯 섞어줍니다. 세포를 수집하기 위해 실온에서 250 G로 10분 동안 원심분리하고, 펠릿 위에 약 0.5 mL의 배지만 남기고 상층액을 제거합니다. 펠릿을 20 mL의 배지에 현탁하고 실온에서 200 G로 8분 동안 원심분리하여 세포를 1회 세척합니다. 상층액을 제거하고 세포를 mL당 약 50만 개의 세포 농도로 완전 IMDM 배지에 현탁합니다.마지막으로, 세포 농도를 결정하기 위해 현탁액 10 µL를 마이크로 튜브에 취해 동일한 부피의 0.4% tripan blue 용액과 혼합한 후 계수합니다. hemocytometer를 사용하여 활성 사이토카인 칵테일이 첨가된 완전 IMDM 배지를 추가함으로써 세포 농도를 10⁵ cells/mL로 희석합니다. 세포를 5% CO₂가 포함된 37 °C 습윤 배양기에서 2일 동안 배양합니다. 형질전환 당일, 바이러스 프리로딩을 시작하기 전 세포 수를 계수하여 24-well 비처리 조직 배양 플레이트에 준비할 well 수를 결정합니다. 각 well에 25 µg/mL retro actin solution 400 µL를 넣고 층류 생물안전 작업대(laminar flow biosafety hood) 내 실온에서 2시간 동안 배양합니다.레트로 액틴 용액을 제거하고, 2%BSA로 30분 동안 상온에서 배양하여 각 웰을 코팅합니다. 그동안 바이러스 스톡 용액을 해동하여 얼음 위에 보관합니다. 그런 다음 BSA 용액을 흡입하여 제거하고, 각 웰에 0.5 milliliter의 바이러스 조제액을 첨가하여 바이러스를 로딩한 후, 4 °C에서 2,200 G로 15분 동안 원심분리합니다.웰에서 바이러스 용액을 제거하고 바이러스 로딩을 3회 더 반복합니다. 마지막으로, 각 웰을 차가운 IMDM 배지로 헹굽니다. 이제 원심분리를 통해 사전 활성화된 CD 34 양성 세포를 수집하고, 사이토카인이 첨가된 신선한 완전 IMDM 배지에 세포를 재현탁합니다. 바이러스가 코팅된 각 웰에 0.15 million의 CD 34 양성 세포를 분주하고, 형질전환된 세포를 부드럽지만 철저하게 수확하기 위해 5% carbon dioxide가 포함된 37 degree Celsius 습윤 배양기에서 2일 동안 배양합니다.바이러스 부유 플레이트에서 세포를 현탁시키고, 50 micron 세포 필터를 통해 원심 분리 튜브로 현탁액을 여과합니다. 세포 현탁액 10 µL를 마이크로 튜브에 취합니다. 동일한 부피의 trypan blue 용액과 혼합한 후, 혈구계수기를 사용하여 세포 수를 측정합니다.각 웰을 0.02% EDTA가 포함된 차가운 HBSS 0.8 milliliter로 헹구고, 50 micron CEL Trix 세포 필터를 통해 동일한 수집 튜브에 추가합니다. 원심분리를 통해 세포를 펠렛화하고 차가운 HBSS로 한 번 세척합니다. 최종 세포 펠렛을 1% BA가 포함된 HBSS에 재현탁하고, 이후의 세포 분리(cell sorting)를 위해 세포를 얼음 위 암소에 보관합니다. 세포 분리는 일반적으로 실험 설계에 따라 고속 세포 분리 코어 시설에서 수행됩니다.필요한 수량의 CFC 분석 배지 분주액을 해동하고, 강하게 볼텍싱하여 혼합한 후, 세포를 첨가하기 전 기포가 표면으로 올라올 수 있도록 튜브를 최소 5분 동안 그대로 둡니다. 이제 바이러스가 형질전환된 분리 세포 3000개를 차가운 2%F-B-S-I-M-D-M 배지가 담긴 멸균 마이크로 튜브에 넣고 최종 현탁액 부피를 0.3 milliliters로 조정합니다. 세포를 현탁하고 전체 세포 현탁액을 3 milliliters의 methyl cult 성장 배지 분주액으로 옮깁니다.강하게 볼텍싱하여 균질한 세포 현탁액을 만듭니다. 튜브를 3분 동안 그대로 둡니다. 세포를 도말하기 위해, 3 mL 주사기에 16게이지 뭉툭한 바늘(blunt end needle)을 장착하고 2.2 mL를 취합니다.큰 기포가 유입되지 않도록 주의하며, 처리되지 않은 30 mm 조직 배양 접시 두 개에 각각 1.1 mL씩 분주하고 접시를 회전시켜 혼합물을 고르게 펴줍니다. 두 개의 접시를 수조가 포함된 100 mm 플레이트에 함께 넣습니다. 멸균된 3 L 배양액에서 2주 동안 배양을 지속합니다. 스코어링 그리드가 표시된 배양 접시에서 도립 현미경을 사용하여 40배 배율로 콜로니의 형태를 관찰하고 특성을 분류하여 점수를 매깁니다.배양 결과를 기록하기 위해, 일반 스캐너를 사용하여 600 DPI로 CFC 분석 플레이트 전체를 스캔하고, 컬러 카메라가 장착된 도립 현미경을 사용하여 대표 콜로니의 저배율 사진을 촬영하여 분화 및 증식 세포를 추가 분석합니다. CFC 분석 플레이트 전체에서 회수된 세포들을 상온의 2% F-B-S-I-M-D-M으로 세척 및 현탁하여 형태학적 분석을 위해 세포 수를 측정합니다. CFC 분석 플레이트에서 회수된 세포 30,000개를 슬라이드로 옮깁니다. 슬라이드를 효율적으로 염색하기 위해 STOs 스핀 원심분리기를 사용하여 슬라이드를 하룻밤 동안 공기 건조시킵니다.다음 순서대로 용액이 담긴 9개의 염색 용기로 조립 라인을 구성하십시오: 절대 메탄올, Giemsa 원액, Giemsa 완충액, 50% 메탄올 및 물, 물 용기 2개, pH 6 인산 완충액, 그리고 마지막으로 물 용기 2개. 슬라이드를 슬라이드 캐리어에 넣고 절대 메탄올에 2분 동안 담근 후, 과잉 메탄올을 제거하십시오.슬라이드 캐리어를 Giemsa 스톡 용액에 즉시 담가 5분 동안 처리합니다. 캐리어를 pH 6.4의 Giemsa 완충액으로 옮겨 10분 동안 배양합니다. 캐리어를 50% methanol에 2회, 증류수에 10회, 그다음 증류수 용기에 10회, 그리고 인산염 완충액에 5회 담가 세척합니다.pH 6.0. 캐리어를 물로 옮겨 2분 동안 배양합니다. 마지막 물 용기에서 세척 과정을 반복합니다.이제 슬라이드가 캐리어 안에서 완전히 자연 건조되도록 둡니다. 각 슬라이드를 꺼내어 슬라이드 뒷면을 메탄올을 적신 Kim wipes로 닦아 오염물을 제거합니다. Cyto seal 60 한 방울을 떨어뜨리고 커버 글라스를 덮어 밀봉합니다.현미경을 사용하여 각 GM 유지 슬라이드에 대해 500개의 세포 분별 계산을 수행합니다. 본 실험의 목적을 위해 세포는 미분화 세포, 중간 골수성 세포, 성숙 골수성 세포, 중간 적혈구계 세포 및 성숙 적혈구계 세포의 다섯 가지 범주로 나뉩니다. 예를 들어, new 98 hawks의 대조군 발현과 비교했을 때, nine oncogene은 적색 적혈구 군집의 형성을 증가시켰습니다.저배율에서 콜로니를 관찰하면 이 온코진의 시장 영향이 분명하게 나타납니다. GEM 지속을 통한 추가적인 형태학적 검사는 세포 집단의 계보와 성숙 정도에 대한 정보를 제공합니다. 이 예시에서, 새로운 98 Hawks, a nine의 도입은 적혈구 과형성과 적혈구 및 골수성 성숙의 억제 모두를 유발하여 세포 수의 전반적인 증가를 가져왔습니다.본 SA는 입력 세포 준비물이 반고체 배지에서 증식, 분화 및 콜로니를 형성하는 능력을 측정함으로써 조혈 세포 분화에 대한 통찰을 제공합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

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인간 조혈 세포 콜로니 형성 세포 (CFC) 어세이

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