마우스 아이의 망막 줄기 세포의 분리

이 비디오에서는, 우리는 마우스 눈 ciliary 상피에서 망막 줄기 세포를 분리하고 clonal 망막 분야를 형성하는 문화에서 그들을 성장하는 방법을 보여줍니다 것입니다. 절연되는 분야는 줄기 세포의 추기경 속성을 가지고 : 자기 갱신과 multipotentiality.

이 절차의 전반적인 목표는 눈의 섬모 상피에서 망막 줄기 세포를 분리하는 것입니다. 이것은 먼저 시신경에서 시작하여 눈을 청소하고 반으로 자르고, 각막을 절단하고 시신경에서 다시 만난 다음, 신경 망막과 수정체를 제거함으로써 이루어집니다. 절차의 두 번째 단계는 각막 홍채와 망막 색소 상피를 절단하여 섬모 상피를 절단하는 것입니다.

절차의 세 번째 단계는 모양체 상피를 효소로 치료하고 공막을 제거하고 상피를 기계적으로 단일 세포로 해리하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 무혈청 배지에 세포를 재현탁하고 성장 인자를 가진 무혈청 배지가 포함된 조직 배양 플레이트에 플레이트를 삽입하는 것입니다. 궁극적으로, 클론구(clonal sphere)를 통해 안구의 섬모 상피에서 발견되는 줄기세포의 수를 in vitro에서 형성할 수 있는 결과를 얻을 수 있습니다.

안녕하세요, 제 이름은 브렌다 콜스입니다. 우리 연구실은 양서류와 물고기의 눈 재생 능력에 대한 논문을 연구할 때 이 방법을 처음 생각해 냈고, 포유류의 눈에도 같은 능력을 가진 세포가 있을 수 있다는 가설을 세웠습니다. 망막 줄기세포의 분리는 1차 배양 실험 전용 특정 무균실에서 수행됩니다.

이 절차를 시작하기 전에 해부 현미경과 차가운 광원을 설정한 다음 멸균 해부 기구를 배치하십시오. 각 후드에는 단계 사이에 기구를 살균하기 위한 핫 비트 살균기가 있습니다. 인공 뇌척수액이 들어 있는 멸균 페트리 접시에 즉시 넣은 눈에서 망막 줄기세포를 분리할 것입니다 승인된 동물 윤리 프로토콜에 따라 희생된 쥐에서 제거한 후 이 절차의 가장 어려운 부분은 현미경으로 둥근 물체를 해부하는 것입니다.

관심 조직을 파괴하지 않도록 세심한 주의를 기울여야 합니다 해부 현미경 아래에서 집게로 눈을 청소하십시오. 각막 공막 경계에 붙어 있는 머리카락과 연결된 조직을 제거한다. 그런 다음 톱니 모양의 집게로 눈을 고정한 상태에서 A CSF가 있는 새 접시로 눈을 옮깁니다.

각진 마이크로 해부 가위를 사용하여 안구 근육을 제거합니다. 시신경도 제거하고, 아직 눈에 붙어 있다면 이 과정에서 눈을 찌그러뜨리지 않도록 하십시오. CSF로 새로운 요리로 눈을 옮깁니다.

다음으로 곡선형 마이크로 해부 가위를 사용하여 눈을 반으로 자릅니다. 시신경에서 시작하여 각막의 중앙을 절단하여 절단이 시작된 시신경에서 다시 만납니다. 두 눈의 크기가 대략 같으면 다음 단계를 더 쉽게 수행할 수 있으므로 이상적입니다.

두 개의 집게를 사용하여 각막을 잡고 두 눈의 반쪽을 부드럽게 떼어냅니다. 눈껍질에서 수정체, 내장, 신경 망막을 제거하고 버립니다. A CSF가 있는 껍질을 새 접시로 옮깁니다.

이제 섬모 상피를 분리할 준비가 되었습니다. 먼저 각막이 오른쪽에 있고 망막 색소 상피가 왼쪽에 오도록 안피의 방향을 잡습니다. RPE 쪽의 곧은 집게로 안대를 부드럽게 고정합니다.

다음으로, 메스를 사용하여 톱질하는 대신 메스를 부드럽게 눌러 각막과 홍채를 눈의 모양체 상피에서 잘라냅니다. 그 후, RPE에서 섬모 상피를 잘라냅니다. 톱니 모양이 없는 집게를 사용하여 섬모 상피 스트립을 A CSF가 포함된 새로운 35mm 접시로 옮깁니다.

같은 방법으로 다른 안피에서 섬모 상피를 분리하십시오. 섬모 상피 스트립이 수집되면 스트립을 2ml의 디스 공간이 포함된 35mm 접시로 옮깁니다. 스트립이 있는 접시를 섭씨 37도의 인큐베이터에 10분 동안 놓습니다.

10분 후, 디스 공간의 스트립을 Halle Ur Haase와 Kind reic acid에 여과된 2ml가 들어 있는 접시로 옮깁니다. 접시를 섭씨 37도에서 10분 동안 놓습니다. 이제 해부 현미경으로 돌아가 곧은 집게로 공막을 잡고 있습니다.

곡선의 아래쪽 등급이 지정되지 않은 겸자를 사용하여 공막에서 섬모 상피를 부드럽게 긁어냅니다. 접시에서 공막을 제거합니다. 접시에 남겨야 할 모든 것.

이제 관심 세포와 효소 용액입니다. 화재 광택 면이 꽂힌 피펫을 사용하여 용액을 14리터 튜브로 옮깁니다. 이 용액을 30회 트리트레이트하여 용액을 피펫 안팎으로 부드럽게 밀어 넣고 1500RPM으로 5분 동안 튜브를 원심분리하여 상피 세포

원심분리가 완료되면 원심분리기에서 튜브를 조심스럽게 제거합니다. 세포가 튜브 바닥에서 떨어지기 쉽기 때문입니다. 이 단계에서 파이어폴리싱 피펫을 사용하여 SuperNet의 대부분을 부드럽게 흡인한 다음 무혈청 배지에 1ml의 트립신 억제제를 세포에 첨가합니다.

작은 시추공 면 플러그 피펫을 사용하여 단일 세포 현탁액이 될 때까지 샘플을 약 50회 트라이빙합니다. 튜브를 다시 5분 동안 원심분리합니다. 1500 RPM에서 상층액을 제거하고 1 ml의 도금으로 교체하십시오.

매체: 세포를 재현탁하기 위해 불에 광택이 나는 유리 피펫을 사용하여 부드럽게 냉장 보관합니다. 세포를 세고 나면 원하는 밀도로 도금합니다. 24웰 플레이트에서는 일반적으로 각 웰을 먼저 배지로 채운 다음 세포 현탁액을 추가하여 500마이크로리터의 배지의 최종 부피를 얻어 마이크로리터당 10개의 셀을 플레이트

플레이트를 섭씨 37도의 이산화탄소 인큐베이터에 넣으면 이 절차가 성공적으로 수행되었을 때 7일 후에 발생하는 구체를 셀 때까지 움직이지 않습니다. 절개된 섬모 상피 세포는 낮은 밀도로 해리되고 도금된 후 다음과 같이 보여야 합니다. 배양에서 7일이 지나면 발생하는 망막 줄기 세포 구체를 계산합니다.

구는 직경이 75미크론 이상이어야 하며 줄기세포 유래 구로 계산되기 위해 자유롭게 떠 있어야 합니다. 그러나 일부 세포는 증식이 제한되어 크기 기준을 충족하지 않는 PHE를 형성하며 줄기세포 유래 구체로 계산되지 않습니다. 그러한 소행성의 예가 여기에 나와 있습니다.

이 기술은 시각 과학 분야의 연구자들이 망막 질환 치료에 망막 줄기세포를 사용할 수 있는 가능성을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.