Name: 마우스 아이의 망막 줄기 세포의 분리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-11T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: 배우세요 마우스 눈의 섬모체 상피에서 망막 줄기 세포를 분리하고 배양하여 클론 망막 구체를 형성하는 방법을. 이 기술은 재생 의학 및 망막 질환 치료 연구에 활용됩니다.

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우리는 그녀의 귀중한 도움 로라 클라크 감사합니다. 줄기 세포 네트워크, CIHR 및 NIH :이 작품은 제정신에 의해 지원됩니다.

1. 분석 해 봅시다 솔루션 및 효소 솔루션 준비 <ol><li> 인공 대뇌 척수 (ACSF)와 미리의 혈청이없는 미디어를 만들어 냉동. </li><li> Kynurenic 산성 (0.2 MG / ML)을 무게와 그것이 쉽게 용해되지 않으므로 미리 37 ° C waterbath에서 힐로 ACSF 10 ML에 디졸브. </li><li> 트립신 (1.33 MG / ML)과 Hyaluronidase (0.67 MG / ML) 한 15 ML 튜브의 위치를​​ 밖으로 무게 필요한 때까지 -20 ° C에서 보관하십시오. 이 튜브에 Kynurenic 산성 솔루션을 추가하고 사용하기 직전 22 μm의 주사기 필터를 사용하여 필터링합니다. </li><li> 트립신 억제제를 달다 (Ovamucoid : 1 MG / ML)과 따뜻한 세럼 - 무료 미디어 및 22μm 주사기 필터를 사용하여 필터에 디졸브. </li><li> FGF2 (10 NG / ML)과 헤파린 (2 μg / ML)이있는 세럼 - 무료 미디어 : 도금 미디어를 확인하십시오. </li></ol> 2. 마우스 아이의 망막 줄기 세포를 분리 <ol><li> 망막 줄기 세포의 분리는 기본 문화 실험 전용 특정 멸균 실에서 수행됩니다. 전에이 절차를 시작하기 위해 해부 현미경과 추위에 광원을 설정하고, 다음 멸균 해부 악기를 배치. 각 후드 단계 사이에 악기를 살균을 위해 뜨거운 구슬 살균기 있습니다. </li><li> 우리는 승인된 동물 윤리 프로토콜에 따라 희생 생쥐에서 그들의 제거 후 인공 대뇌 척수 (ACSF)를 포함하는 멸균 배양 접시에 바로 배치되었습니다 눈에서 망막 줄기 세포를 분리합니다. </li><li> 해부 현미경, 집게로 시선을 청소 : 머리와 각막 / scleral 국경에 첨부되어 결합 조직의 제거. 다음 ACSF로 새로운 접시에 눈을 전송합니다. </li><li> 부드럽게 톱니 모양의 집게로 고정 시선을 잡고 있지만, 안구 근육을 제거하는 직각 마이크로 해부 가위를 사용합니다. 그것이 아직도 눈에에 연결된 경우뿐만 아니라 시신경을 제거합니다. 이 과정에서 눈에 죽겠어하지보십시오. ACSF있는 새로운 요리에 눈을 전송. </li><li> 다음 사용 곡선 마이크로 해부 가위 절반에 눈을 잘라 : 시신경 시에 시작해서 각막의 중앙을 통해 컷, 컷이 시작되었다 시신경에 다시 회의. 이것은 다음 단계로 쉽게 때문에 안구의 두 가지 크기가 대략 동등한있다면 그것은 이상적입니다. </li><li> 두 눈 껍질 부드럽게 두 개의 집게를 사용하여 각막을 개최하는 것은 따로 반쪽. 제거하고 렌즈, 내장, 그리고 눈 껍질에서 신경 망막을 삭제. ACSF로 새로운 접시에 껍질을 전송합니다. </li><li> 이제 우리는 ciliary 상피를 분리 준비가되어 있습니다. 시작하려면, 오리엔트 눈 쉘은 때문에 각막이 오른쪽과 망막 색소 상피 (RPE)에있는 왼쪽에 있습니다. 부드럽게 RPE 측면에 바로 포셉와 눈 껍질을 핀. </li><li> 다음 부드럽게 메스에 아래로 밀고보다는 제재의 움직임을 사용하여 눈 ciliary 상피에서 떨어진 각막과 홍채를 잘라 메스를 사용합니다. </li><li> 그 후, 멀리 RPE에서 ciliary 상피를 잘라. ACSF을 포함하는 새로운 35 mm 요리에 ciliary 상피의 스트립을 전송하지 않는 톱니 모양의 집게를 사용하십시오. </li><li> 동일한 방식으로, 다른 눈 껍질에서 ciliary 상피를 분리. </li><li> 두 ciliary 상피 스트립이 수집되고 나면, Dispase 2 ML을 포함하는 35 mm 접시에 스트립을 전송하기만하면됩니다. 10 분 동안 37 ° C 배양기에서 스트립과 접시를 놓습니다. </li><li> 십분 후, 여과 트립신, Hyaluronidase, 그리고 Kynurenic 산성 2 ML을 포함하는 요리로 Dispase에서 스트립을 전송. 37 접시를 놓고 ° C를 10 분. </li><li> 이제 해부 현미경으로 돌아갑니다. 스트레이트 집게로 공막엔을 누른 상태에서 부드럽게 떨어져 공막엔에서 ciliary 상피를 긁어 곡선이 아닌 톱니 모양의 집게의 바닥을 사용합니다. </li><li> 접시에서 공막엔를 제거합니다. 이제 접시에 남아있을 것이 모든 관심과 효소 솔루션의 세포 수 있습니다. </li><li> 화재 - 세련된 솜 연결 피펫을 사용하여 14 ML 튜브에이 솔루션을 전송합니다. 부드럽게 피펫의에서 밖으로 솔루션을 강제하여 상피 세포를 분리 휴식이 솔루션을 30 번 씹다. </li><li> 1,500 RPM에서 5 분 동안 원심 튜브. 세포가이 단계에서 튜브의 바닥을오고하는 경향이 있기 때문에 원심 분리가 완료되면 조심스럽게 원심에서 튜브를 제거합니다. </li><li> 부드럽게 불타는 광택 피펫을 사용하여 표면에 뜨는의 대부분을 대기음 다음 세포로 세럼 - 무료 미디어 트립신 억제제 1 ML를 추가합니다. 그것이 단일 세포 현탁액 때까지 약 50 번 샘플을 씹다하는 작은 시추공 솜 연결 피펫을 사용합니다. </li><li> 1,500 RPM에서 5 분 동안 다시 튜브를 원심 분리기. </li><li> 뜨는을 제거하고 도금 매체 1 ML로 바꾸십시오. 세포를 resuspend에 불을 광택 유리 피펫을 사용하여 부드럽게 가루로 빻다. </li><li> 개수 후24 - 잘 판에서 원하는 농도에서 세포, 접시 그들을 주입. 우리는 일반적으로 판 10 세포 / 중간 각 잘 첫번째 입력하고 다음 미디어 500 μL의 최종 볼륨을 얻기 위해 세포 현탁액을 추가하여 μL. </li><li> 당신은 7 일 후 발생하는 분야를 계산하기 전까지 이동되지 않습니다 37 ° C CO 2 배양기에서 접시를 놓습니다. </li></ol> 3. 망막 줄기 세포를 분리 결과 <ol><li> 이 절차가 성공적으로 수행되면, 해부 ciliary 상피 세포는 저밀도 (그림 1)에서 dissociated 및 도금 후에 같이한다. </li><li> 문화 7 일 후에 발생하는 망막 줄기 세포 분야가 포함됩니다. 구형은 직경과 줄기 세포 파생된 영역으로 계산하는 자유 부동 75 μm의 이상되어야합니다. (그림 2). 그러나, 일부 세포는 크기의 기준을 충족하지 않으며 줄기 세포 파생된 분야로 계산되지 않습니다 제한된 증식 및 양식 spheroids을 것입니다, 이러한 회전 타원체의 예제는 (그림 2) 여기에 표시됩니다. </li></ol> 4. 대표 결과 <img src="/files/ftp_upload/2209/2209fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. <img src="/files/ftp_upload/2209/2209fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2.

<ol><li>Tropepe, V., Coles, B. L., Chiasson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+stem+cells+in+the+adult+mammalian+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Retinal stem cells in the adult mammalian eye.</a> Science. 287, 2032-2036 (2000).</li>
<li>Ahmad, I., Tang, L., Pham, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+neural+progenitors+in+the+adult+mammalian+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Identification of neural progenitors in the adult mammalian eye.</a> Biochem Biophys Res Commun. 270, 517-521 (2000).</li>
<li>Coles, B. L., Angenieux, B., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facile+isolation+and+the+characterization+of+human+retinal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Facile isolation and the characterization of human retinal stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 15772-15777 (2004).</li>
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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

이 프로토콜은 마우스 눈 1-3의 ciliary 상피에서 망막 줄기 세포를 분리하는 방법에 대해 설명합니다. ciliary 상피의 스트립을 격리에 대한 방법론 그러나 단일 세포 현탁액을 달성을위한 효소와 방법론이 프로토콜에 최적화되었습니다, 다를 수 있습니다. 그것은 이러한 각각의 시선에서 격리 수있는 분야의 총 개수에 부정적인 영향을 미칠 것처럼부터 고립되어있다 ciliary 상피의 스트립이 RPE이나 각막의 다량을 포함하지 않는 것이 또한 중요합니다. 또한, 우리가 원래 두뇌 neurospheres 13 공식화 것을 확인하는 혈청이없는 미디어는 망막 줄기 세포 분야의 성장에 이상적입니다. 하나는 그들이 성장하는 분야가 함께 14 집계되지 않도록 도금 및 보육에 배치받은 후 세포가 방해되지 않도록해야합니다. 망막 줄기 세포가 clonal 분야를 형성되면, 그들은 눈 당 줄기 세포의 미래의 수치를 얻기 위해 계산하실 수 있습니다. 분야 다음 다음 단일 셀에 dissociated하고 확인할 자기 갱신 기능을 passaged 또는 다른 성장 요인의 조합 및 / 또는 단백질을 사용하여 신경 망막과 RPE의 서로 다른 세포 유형으로 차별화된 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Stemi 2000 현미경</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>냉광원</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>KL1500</td><td>듀얼 암 광학 라이트</td></tr><tr><td>곡선형 Mini Vannas 가위</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-10</td><td></td></tr><tr><td>각진 Vannas 가위</td><td>Fine Science Tools</td><td>15005-08</td><td></td></tr><tr><td>#7 Dumont 핀셋</td><td>Fine Science Tools</td><td>11272-30</td><td>무톱니형</td></tr><tr><td>#5 Dumont 핀셋</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-10</td><td>직형</td></tr><tr><td>미세 핀셋</td><td>Fine Science Tools</td><td>11051-10</td><td>톱니형 곡선형</td></tr><tr><td>#3 메스 핸들</td><td>Almedic</td><td>2586-M36-10</td><td></td></tr><tr><td>#10 메스 날</td><td>Almedic</td><td>2580-M90-10</td><td></td></tr><tr><td>Hot Bead 멸균기</td><td>Fine Science Tools</td><td>18000-45</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>VWR international</td><td>CACB354235</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1005</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6254</td><td></td></tr><tr><td>Kynurenic Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K3375</td><td>1000 IU</td></tr><tr><td>Trypsin 억제제</td><td>Roche Group</td><td>10109878001</td><td></td></tr><tr><td>35 mm 디쉬</td><td>VWR international</td><td>CA354235</td><td></td></tr><tr><td>24-웰 플레이트</td><td>VWR international</td><td>CA73521-004</td><td></td></tr><tr><td>면전 피펫</td><td>VWR international</td><td>14672-400</td><td>화염 연마 처리</td></tr><tr><td>14 mL 튜브</td><td>Falcon BD</td><td>352057</td><td>폴리스티렌</td></tr><tr><td>무혈청 배지</td><td></td><td></td><td>조성법은 Ref# 13 참조</td></tr><tr><td>FGF2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0291</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149</td><td>100 IU</td></tr></tbody></table>

마우스 아이의 망막 줄기 세포의 분리

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

성인 마우스 망막 줄기 세포 (RSC)은 포유류의 눈 1,2,3의 ciliary 상피 (CE) 내에서 발견된 드문 정지 세포이다. 모두를 형성 CE가 아닌 색소 내부 및 색소 외부 세포 레이어로 구성되어 있으며, CE에서 단일 색소 세포에서 발생하는 clonal RSC 식민지는 차별화된 수있는 두 색소가 아닌 색소의 세포로 구성되어 있습니다 신경 망막과 RPE 세포의 종류. 분야 내의 모든 세포가 모두 적어도 몇 가지 색소 4가 포함되어 있는지 여부에 대한 논란이있다, 그러나 세포는 여전히 1-3 신경 망막 내에있는 다른 세포 유형을 형성 수 있습니다. 등 양서류와 물고기 종 (种)에서는, 그들의 눈을 그러나, 부상 5시 이후엔 재생 능력이있다, 포유류의 눈은 그런 재생 특성을 보여줍니다 않습니다. 우리는 심지어 부상 후뿐만 아니라 안구 손상의 수리 물리 또는 유전자 모델을 도와 세포의 잠재적인 소스로 그들을 사용하여 생체내에서 줄기 세포를 식별하고 6-8 포유류의 망막 줄기 세포가 정지 유지 메커니즘을 이해하기 위해 추구 9-12 통해 이식. 여기서 우리는 clonal 망막 줄기 세포 분야를 형성하기 위해 마우스 눈에서 ciliary 상피 세포를 분리과 문화에서 그들을 성장하는 방법에 대해 설명합니다. 생체내에있는 줄기 세포에 대한 알려진 마커가 없으므로,이 분야는 prospectively 눈 ciliary 상피 내에 줄기 세포의 인구를 식별하는 유일한 알려진 방법입니다.

이 비디오에서는, 우리는 마우스 눈 ciliary 상피에서 망막 줄기 세포를 분리하고 clonal 망막 분야를 형성하는 문화에서 그들을 성장하는 방법을 보여줍니다 것입니다. 절연되는 분야는 줄기 세포의 추기경 속성을 가지고 : 자기 갱신과 multipotentiality.

성체 마우스 망막 줄기세포(RSC)는 포유류 안구의 섬모상 상피(CE) 내에서 발견되는 희귀한 정지기 세포입니다1,2,3. 섬모상 상피는 ...로 구성됩니다.

본 절차의 전반적인 목표는 안구의 모양체 상피에서 망막 줄기세포를 분리하는 것입니다. 우선 안구를 세척한 다음, 시신경에서 시작하여 각막을 거쳐 다시 시신경으로 이어지게 안구를 절반으로 자르고, 신경 망막과 수정체를 제거함으로써 이를 수행합니다. 절차의 두 번째 단계는 각막, 홍채 및 망막 색소 상피를 잘라내어 모양체 상피를 분리하는 것입니다.절차의 세 번째 단계는 섬모 상피를 효소적으로 처리하고, 공막을 제거한 후 상피를 기계적으로 해리하여 단일 세포로 만드는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 세포를 무혈청 배지에 재부유시키고, 성장 인자가 포함된 무혈청 배지가 담긴 조직 배양 플레이트에 분주하는 것입니다. 결과적으로, 인비트로(in vitro) 클론 구체 형성을 통해 눈의 섬모 상피에서 발견되는 줄기세포의 수를 전망하는 결과를 얻을 수 있습니다.안녕하세요, 제 이름은 Brenda Coles입니다. 저희 연구실은 양서류와 어류 안구의 재생 능력에 관한 논문들을 연구하던 중, 포유류의 안구에도 이와 동일한 능력을 갖춘 세포가 있을 것이라는 가설을 세우고 이 방법을 처음으로 고안했습니다. 망막 줄기세포의 분리는 일차 배양 실험 전용 멸균실에서 수행됩니다.본 절차를 시작하기 전에 해부 현미경과 냉광원을 설치하고 멸균된 해부 도구들을 준비하십시오. 각 후드에는 단계별로 도구를 멸균할 수 있는 고온 비드 멸균기가 구비되어 있습니다. 승인된 동물 윤리 규정에 따라 희생된 마우스에서 적출하여 인공 뇌척수액이 담긴 멸균 페트리 접시에 즉시 보관한 안구로부터 망막 줄기세포를 분리할 것입니다. 본 절차에서 가장 어려운 부분은 현미경 하에서 둥근 물체를 해부하는 것입니다.관심 조직이 손상되지 않도록 각별한 주의를 기울여야 합니다. 실체 현미경 하에서 핀셋으로 눈을 세척합니다. 각막 공막 경계에 붙어 있는 털과 결합 조직을 제거합니다. 그 후 톱니 핀셋으로 눈을 고정한 상태에서 A CSF가 담긴 새 접시로 눈을 옮깁니다.각도가 조절된 미세 해부 가위를 사용하여 안구 근육을 제거합니다. 시신경이 여전히 안구에 연결되어 있다면 이 역시 제거하되, 이 과정에서 안구를 압착하지 않도록 주의하십시오. 안구를 CSF가 담긴 새 접시로 옮깁니다.다음으로 곡선형 미세 해부 가위를 사용하여 안구를 절반으로 자릅니다. 시신경에서 시작하여 각막 중앙을 가로질러 절단이 시작되었던 시신경 지점으로 돌아오도록 자릅니다. 다음 단계를 더 쉽게 진행하기 위해 안구의 두 조각이 거의 동일한 크기가 되도록 하는 것이 이상적입니다.두 개의 포셉으로 각막을 잡고, 두 개의 안구 절반을 조심스럽게 떼어냅니다. 안구 껍질(eye shells)에서 수정체 내장물과 신경 망막을 제거하여 버립니다. 껍질을 A CSF가 담긴 새 디쉬로 옮깁니다.이제 섬모상피를 분리할 준비가 되었습니다. 먼저 각막이 오른쪽에, 망막색소상피(RPE)가 왼쪽에 오도록 안구 껍질의 방향을 잡습니다. 직선 핀셋을 사용하여 RPE 쪽의 안구 껍질을 부드럽게 고정합니다.다음으로, 톱질하듯 자르지 말고 메스를 살며시 아래로 눌러 각막과 홍채를 안구의 모양체 상피에서 절개하여 분리합니다. 그 후, 모양체 상피를 RPE에서 분리하여 절단합니다. 톱니가 없는 포셉을 사용하여 분리한 모양체 상피 조각을 A CSF가 담긴 새로운 35 millimeter 디쉬로 옮깁니다.동일한 방법으로 반대편 안구 껍질에서 섬모 상피를 분리합니다. 섬모 상피 조각들이 모두 수집되면, 2mL의 dis space가 들어있는 35mm 디쉬로 조각들을 옮깁니다. 조각들이 담긴 디쉬를 37°C 인큐베이터에 10분 동안 둡니다.10분 후, 스트립을 해당 공간에서 Haldane-Hasse 및 citric acid가 포함된 여과된 점적액 2 mL가 들어 있는 접시로 옮깁니다. 접시를 37 °C에서 10분 동안 둡니다. 이제 직선 핀셋으로 공막을 누른 상태에서 해부 현미경으로 다시 돌아옵니다.곡선형 비치수 핀셋(non-rated forceps)의 끝부분을 사용하여 공막에서 섬모 상피를 조심스럽게 긁어냅니다. 접시에서 공막을 제거합니다. 이제 접시에는 섬모 상피만 남아 있어야 합니다.이제 관심 세포와 효소 용액을 준비합니다. 화염 멸균한 면전 피펫을 사용하여 용액을 14 liter 튜브로 옮깁니다. 이 용액을 피펫으로 부드럽게 흡입하고 배출하여 30회 트리투레이션(trituration)함으로써 상피 세포를 분리시킨 후, 튜브를 1500 RPM에서 5분 동안 원심 분리합니다.원심분리가 완료되면 원심분리기에서 튜브를 조심스럽게 꺼냅니다. 세포가 튜브 바닥에서 떨어지기 쉽기 때문입니다. 이 단계에서 화염 연마된 피펫을 사용하여 SuperNet의 대부분을 부드럽게 흡입하여 제거한 다음, 세포에 무혈청 배지로 희석한 trypsin inhibitor 1 mL를 첨가합니다.작은 보어홀 면 마개 피펫을 사용하여 샘플을 약 50회 정도 트리톤화(trituration)하여 단일 세포 현탁액으로 만듭니다. 튜브를 1500 RPM에서 5분 동안 다시 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 1 mL의 플레이팅 용액으로 교체합니다.화염 연마된 유리 피펫을 사용하여 배지를 부드럽게 피펫팅하여 세포를 재부유시킵니다. 세포 수를 센 후, 원하는 밀도로 플레이트에 분주합니다. 24웰 플레이트의 경우, 일반적으로 각 웰에 배지를 먼저 채운 다음 세포 현탁액을 추가하여 최종 부피가 500 µL가 되도록 하여 마이크로리터당 10개의 세포를 분주합니다.플레이트를 37 °C 이산화탄소 배양기에 넣고, 이 절차가 성공적으로 수행되었을 때 7일 후 생성되는 구체를 계수할 때까지 이동시키지 마십시오. 해부된 섬모 상피세포는 해리 후 저밀도로 플레이팅했을 때 이와 같은 모습이어야 합니다. 배양 7일 후, 생성된 망막 줄기세포 구체를 계수합니다.줄기세포 유래 구체로 계산되려면 구체의 직경이 75 microns 이상이어야 하며 자유롭게 부유하는 상태여야 합니다. 하지만 일부 세포는 증식이 제한되어 크기 기준을 충족하지 못하는 PHE를 형성하며, 이는 줄기세포 유래 구체로 계산되지 않습니다. 이러한 아스테로이드의 발달 후 예시가 여기에 나와 있습니다.이 기술은 시각 과학 분야의 연구자들이 망막 질환 치료에 망막 줄기세포를 사용할 가능성을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.

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연구

JoVE Journal

Biology

생물학

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여기에서는 확장된 생체 외 실험을 위해 쥐의 눈에서 망막을 분리하는 자세한 방법론을 제공합니다. 이 프로토콜은 살아있는 조직에서 망막 신경교세포를 제자리 로 유지함으로써 제공되는 연구 방법을 활용하고자 하는 연구자가 기술적으로 까다로운 접근 방식에 접근할 수 있도록 하는 것을 강조합니다.

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마우스 아이의 망막 줄기 세포의 분리

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