마우스 피질 중간 뉴런 전구세포에서 아가로스 포매 전기천공 보조 유전자 전달

관심 유전자를 운반하는 플라스미드 벡터와 추적 염료를 포함하는 DNA 혼합물로 마이크로피펫을 채웁니다. 마이크로 매니퓰레이터에 고정합니다.

아가로스 블록을 현미경 아래에 배치하고 그 위에 피질 중간 뉴런이 있는 아가로스 포매 마우스 배아 뇌 절편을 놓습니다.

마이크로피펫을 내리고 DNA 혼합물을 중간 뉴런 전구 영역에 주입합니다. 추적 염료는 주입 부위를 표시합니다.

페트리 접시 전극에 또 다른 아가로스 블록을 배치하고 커버 전극에 아가로스 컬럼을 배치합니다.

슬라이스를 블록에 옮기고 주사 부위 위에 커버 전극을 정렬합니다.

짧은 전기 펄스를 적용하여 세포막을 일시적으로 투과화하여 플라스미드가 핵에 들어갈 수 있도록 합니다.

세포 생존력을 유지하기 위해 슬라이스를 배지에서 배양합니다.

핵 내부에서 플라스미드는 유전자 발현을 유발하고 표적 단백질을 생성하며 중간 뉴런 전구 기능을 조절합니다.

주입의 경우, 각 벡터에 대해 마이크로리터당 1마이크로그램 농도로 발현 및 대조군 벡터 DNA를 혼합하고, 1-10번째 희석으로 빠른 녹색 원액을 첨가한다. 당긴 내경 0.5mm, 외경 1mm 유리 마이크로피펫에 10마이크로리터의 DNA 혼합물을 채우고 마이크로피펫을 공압 피코 펌프 인젝터에 넣습니다. 더 큰 아가로스 블록을 실체 현미경 아래에 놓고 주입할 슬라이스를 아가로스 조각에 놓습니다.

그런 다음 슬라이스의 선택된 내측 신경절 또는 꼬리 신경절 융기 영역에 25-50 나노리터 부피를 주입합니다. 주입 직후 작은 아가로스 블록을 페트리 접시 전극에 놓고 평평한 끝 마이크로 주걱을 사용하여 아가로스 컬럼을 모바일 커버 전극에 부착합니다.

지지 멤브레인이 있는 주입된 슬라이스를 아가로스 블록에 옮기고 아가로스 컬럼이 있는 상단 전극을 슬라이스의 선택한 영역 위에 놓습니다. 그런 다음 500밀리초 간격으로 125볼트의 두 개의 5밀리초 펄스로 영역을 전기 도금합니다. 전기천공 후, 지지막이 있는 슬라이스를 고정 접시에 다시 넣고 접시를 조직 배양 인큐베이터로 되돌립니다.