FSL은 구조 : 생물 학적 마커의 범위와 셀 / Virion 표면을 수정하기위한 간단한 방법을 자신의 생존에 영향을주지 않고

이 실험 절차의 전반적인 목표는 살아있는 세포 또는 S의 표면을 생체 활성 구조체로 무해하고 빠르게 표지하는 것입니다. 이는 먼저 기능성 스페이서, 지질 또는 FSL 구조체 용액을 준비함으로써 수행됩니다. 그다음, 구조체 용액과 세포 또는 VIR 용액을 동일한 비율로 혼합합니다.

세 번째 단계로, 혼합물을 37 °C에서 60분 동안 배양합니다. 마지막 단계는 표면 처리된 세포(cells) 또는 세포 성분(cytes), 또는 표면 처리된 VIRs 또는 VIRs를 세척한 후 평소와 같이 실험에 사용하는 것입니다. 최종적으로, 표면 처리된 살아있는 세포(S)는 유세포 분석법(flow cytometry), 현미경 관찰 및 응집 반응을 포함한 모든 일반적인 실험 분석 기술을 통해 시각화할 수 있습니다.

공유 결합 표지법과 같은 기존 방법과 비교하여 이 기술의 주요 장점은 신속하고 견고하며 유연하고, 변형된 세포나 Varian의 생존력에 영향을 주지 않는다는 점입니다. FSL 구성물 스톡 용액을 준비하려면, 먼저 제품 바이알에 희석제 1 mL를 첨가하여 건조된 FSL 제품을 재구성함으로써 1 mg/mL 스톡 용액을 만듭니다. 바이알을 30초 동안 초음파 처리하고, 스톡 용액을 100 µL 멸균 용기에 소분하여 2~8 °C에서 최대 일주일 동안 보관하십시오.

삽입 직전에 사용할 FSL 컨스트럭트 작업 용액을 준비하려면, 용액을 다시 30초 동안 초음파 처리하여 응집된 세포들을 균질화한 다음, FSL 컨스트럭트와 버퍼를 필요한 농도로 희석하십시오. 작업 용액은 2~8°C에서 최대 일주일 동안 보관하십시오. 지질이 없는 배지 또는 PBS에서 재현탁한 후, 결합되지 않은 지질이 없는 FSL 변형을 위해 세포를 원심 분리하십시오. 그런 다음 세포를 100 µL의 희석액에 팩킹하고, 대조군을 위한 세포를 동일한 조건에서 세척하여 100 µL의 미변형 세포로 준비하십시오.

필요한 경우 적절하게 희석한 FSL 용액 100 µL를 추가합니다. 동시에, 관련 없는 FSL 용액 및/또는 PBS를 사용하여 음성 대조군을 생성합니다. 그 후, 모든 세포 서브셋을 37 °C에서 1시간 동안 배양합니다.

遊離 FSL 구조체를 제거하기 위해 모든 세포를 지질 제거 배지 또는 PBS로 2회 세척하고, 지질 제거 배지로 적절한 현탁액을 준비합니다. FSL 변형 과정이 완료되면, 세포를 4~8 °C에서 보관할 수 있습니다. FSL 구조체는 세 가지 주요 성분으로 구성되며, 그 중 기능성 헤드 또는 F는 다양한 생물학적 기능 그룹이 될 수 있습니다.

스페이서 RS는 수분 분산성을 향상시키기 위해 기능성 헤드가 막에서 떨어져 있도록 간격을 유도하고, 인간 혈청 및 DAL 지질 또는 L과 반응하지 않도록 설계되었으며, 이를 통해 구조체가 표면 4에 자발적으로 결합할 수 있게 합니다. 대표적인 FSL 그룹이 다음 다섯 개의 이미지에 나와 있습니다. 살아있는 생쥐 배아를 무혈청 세포 배양 배지에서 37 °C로 2시간 동안 처리하는 방법으로 FSL 플루오레세인으로 직접 라벨링하고, 세척한 후 형광 현미경으로 관찰하였습니다.

첫 번째 이미지에서는 zop palita free 2세포 거울상 배아(mirroring embryo)를 확인할 수 있습니다. 배아 중앙의 강한 염색은 전형적인 제1극체 염색 양상을 나타냅니다. 다음 두 이미지에서는 현미경 초점 평면 밖에 있는 세포들이 희미하게 염색된 zop palita free 4세포 및 8세포 거울상 배아가 나타나 있습니다.

마지막 이미지에는 zop palita가 없는 16세포 거울상 배아가 표시되어 있으며, 이는 FSL fluorescein으로 라벨링된 살아있는 거울상 배아의 모습입니다. 다음 일련의 이미지들에는 배아와 zop LUCITA가 모두 라벨링된 4~5일 된 온전한 거울상 포배 배아가 표시되어 있습니다. 제브라피쉬의 FSL fluorescein 라벨링 모습이 나타나 있습니다. 첫 번째 이미지는 혈관 내로 FSL fluorescein을 직접 주입한 수정 후 52시간 된 제브라피쉬 치어의 미세 혈관 조영술 사진입니다.

제브라피쉬 혈관의 염색 결과를 여기에서 확인할 수 있습니다. FSL fluorescein, 불균질한 제브라피쉬 신장 조직 세포 또는 ZK cytes를 ex vivo로 제작한 후, 수정 후 52시간이 경과한 수용 제브라피쉬의 혈류에 미세 주입하였습니다. 주입 2시간 후, 타임랩스 현미경을 이용해 형광 하에서 혈관을 이미징하여 ZK cytes의 in vivo 관찰을 수행하였습니다. 표시된 단일 비디오 프레임에서 주황색 화살표는 느리게 이동하거나 정지된 커다란 세포를, 녹색 화살표는 이동으로 인해 흐릿하게 보이는 빠르게 이동하는 세포를 나타냅니다. 이 이미지에서는 제브라피쉬 배아를 FSL fluorescein 함유 배지에 최대 5일 동안 침지시켜 구성물을 경구 섭취함으로써 달성한 FSL fluorescein 라벨링 결과가 나타나 있습니다.

왼쪽의 FSL 플루오레신 처리 제브라피쉬 명시야 현미경 이미지는 오른쪽의 인접한 형광 이미지에 대응합니다. 형광은 주로 장관에 위치하였습니다. 여기에 제시된 처리하지 않은 대조군 배아에서는 염색이 관찰되지 않았습니다.

여기서는 37 °C에서 2시간 동안 10 µg/mL의 FSL fluorescein으로 직접 표지한 vesicular stomatitis virus(VSV)를 4% paraform aldehyde로 고정한 후 flow cytometry로 분석한 결과, VSV virion의 정제 과정 없이도 FSL 표지가 가능함이 나타났습니다. FSL 표지 후 과정이 필요했습니다. 이 히스토그램은 FSL fluorescein으로 표지된 human A Puerto Rico 8 19 34 또는 H1N1 VIRs에 감염된 돼지 고환 세포를 보여줍니다.

형광을 띠지 않는 비감염 세포는 검은색 선으로 표시되며, 돼지 세포와 H1N1 코로나의 융합으로 인해 형광이 나타난 세포는 빨간색 선으로 표시됩니다. 이어지는 일련의 이미지에서는 세포를 먼저 37 °C에서 1시간 동안 FSL biotin으로 라벨링한 후, 세척하고 Fluor 4로 라벨링된 avadon과 반응시킨 다음, 다시 세척하여 형광 현미경 관찰을 위해 습식 마운팅하였습니다. 첫 번째 이미지는 마우스 배아 포배의 합성 공초점 이미지를 보여주며, 이 그림은 이전 이미지에 나타난 배아의 중앙 공초점 단면을 보여줍니다.

여기에 살아있어 운동성이 있는 인간 정자가 있습니다. 흐릿하게 보이는 것은 이들의 움직임으로 인한 결과입니다. 삽입 후 4% Paraformaldehyde로 고정한 인간 정자의 더 뚜렷한 대표 이미지는 여기 이 그림에서 확인할 수 있습니다.

FSL biotin으로 표지된 인간 적혈구는 4% 파라포름알데히드 고정이 FSL 표지에 영향을 주지 않음을 보여주며, 이는 다음 두 그림에 예시되어 있습니다. 여기에서 4% 파라포름알데히드로 고정된 RL 95 인간 자궁내막암 세포를 관찰할 수 있습니다. 반면, 이 이미지의 RL 95 인간 자궁내막암 세포는 고정되지 않은 상태입니다. 고정 여부에 따른 두 이미지 간의 표지 차이는 거의 관찰되지 않습니다.

정맥 주입 2시간 후 채취한 혈액 샘플에서 관찰된 FSL biotin 표지 RBC cytes가 왼쪽에 표시되어 있으며, 오른쪽에는 동일한 세포 영역을 광학 현미경으로 관찰한 모습과 형광 현미경으로 관찰한 모습이 나타나 있으며, 여기서 두 개의 cytes가 녹색으로 식별됩니다. cytes와 표지되지 않은 세포의 비율을 계산하여 생존 지표로 사용할 수 있습니다. 마지막 FSL biotin 표지 세포 이미지는 abated beads에 결합시켜 시각화한 살아있는 인간 자궁내막 biotin cytes를 보여줍니다.

이 마지막 일련의 이미지들은 FSL 구조체와 혈액형 마커 간의 상호작용을 보여줍니다. 첫 번째 이미지는 500 µg/mL 농도의 FSLG로 코팅된 인간 적혈구 GLI cytes를 인간 혈청 희석액에 대해 테스트한 결과입니다. 인간 적혈구는 자연적으로 Xena 항원 GALI 항원과 반응하지 않습니다.

따라서, cytes는 혈청 내 항체 수준을 정량화하는 데 사용할 수 있습니다. 본 예시에서는 FSL 수준을 점진적으로 낮춘 cytes를 제작하여 환자의 항원 역가가 1:32인 것으로 결정되었습니다. 항원 역가를 산출하는 것과 유사하게, 항체를 검출하기 위한 최적의 항원 수준을 결정할 수 있으며, 항체 수준이 특정 역가를 초과할 때만 양성 결과가 나오도록 세포를 제작할 수 있습니다.

양성 결과를 얻기 위해 필요한 FSL 항원의 수준은 검출되는 항체의 품질과 수준에 따라 달라집니다. 일반적으로 탄수화물 항원의 경우, 100 micrograms per milliliter 농도의 FSL 용액은 강한 양성 반응을 나타냅니다. 특정 수준의 항원을 갖도록 수정된, 이른바 표준화된 인간 O형 적혈구를 사용합니다.

A 혈구는 인간 혈청 내의 anti-A를 정확하고 재현성 있게 정량하는 데 사용됩니다. 본 예시에서는 공여자의 적혈구로 혈구를 준비하였으며, 테스트한 O형 혈청의 anti-A 수치는 1:32로 확인되었습니다. 여기 여섯 번째 튜브에 표시된 것처럼, 단일 O형 적혈구 샘플에 A형 및 B형 항원을 동시에 삽입하여 A-weak, B-weak 혈구를 생성하였습니다.

이 세포들은 VO 품질 관리 목적으로 사용될 수 있습니다. 특수하게 제조된 a-weak, B-weak 세포를 anti-A 및 anti-B 시약으로 분석하면, 이 그림에서 확인되는 것과 같이 튜브의 하단 중앙 영역에서 반응이 일어나는 예상된 약한 반응이 나타납니다. 이 간단한 기술은 적절하게 수행될 경우 2시간 이내에 완료될 수 있습니다.