活体成像的鼠标使用2 - 光子显微镜的胸腺

双光子显微镜允许在器官深处的区域采集图像。当两个能量大致相等的光子与分子相互作用时，就会在双光子显微镜中激发荧光蛋白，产生的激发相当于吸收具有两倍能量的单个光子。因此，在双光子显微镜中，使用红外激光器，允许在厚组织中进行成像采集，从而最大限度地减少光漂白和光损伤。

此外，由于激发仅限于焦平面，因此没有离焦荧光。与新的立体定向工具和外科手术一起，它成为记录活体动物细胞行为的强大技术。在本文中，使用两个光子显微镜获取胸腺的活体图像。

在这个器官中，T 细胞成熟，因此该技术可用于涉及细胞发育的研究。现在让我们开始协议 首先准备动物用 900 拉德照射 8 周大的裸体动物。照射后，将动物放回笼子中，直到骨髓转移。

准备骨髓悬液 用供体小鼠的二氧化碳安乐死并去除后肢后，从骨骼中取出皮肤和肌肉并保留在 PBS 中。将骨头转移到含有 PBS 的新培养皿中。切开骨头的末端。

用 PBS 填充注射器，并使用 25 号针头冲洗骨头。或者，将骨头转移到研钵中，用杵粉碎，用强力移液离心机将骨髓匀浆粉碎。在 400 G.Resus 下暂停 5 分钟。

将细胞悬浮在 PBS 中，然后静脉注射到受照射的小鼠中。某种软骨髓发生在移植后的最初几天。由于未被 10 pl 重构，小鼠在辐射后 10 天开始死亡。

然而，我们等待 6 到 8 周才能认为我们的动物已经完全重组。继续动物准备。骨髓移植后 4 至 6 周，将进行胚胎胸腺移植，以便在体内观察胸腺细胞。

首先，在第 15 天安乐死后，用二氧化碳对怀孕的雌性进行采集胚胎，取出每个胚胎的胸腺，将它们放入装有冷 PBS 的盘子中，直到使用用氯胺酮、甲苯噻嗪麻醉受体动物，并将它们放在加热垫上。当动物深度麻醉时，用乙醇清洗该区域。切开皮肤，切开腹膜，定位并露出肾脏。

一旦肾脏暴露出来，在肾囊上做一个小切口，并在其下方做一个口袋。胚胎胸腺被添加到这个口袋内。最后将肾脏放回原来的位置，并关闭腹膜腔和皮肤。

缝合后，动物必须接受镇痛药并放在加热垫上，直到它们开始从麻醉剂中恢复。可以每周进行血样分析，跟踪 CD 4 阳性细胞和 CD 8 阳性细胞之间的比率。比率约为 1.521 的动物接受了胸腺。

移植胸腺中细胞群的百分比与内源性对照胸腺中发现的百分比相似。动物。移植胸腺的活体成像需要新的动物手术并使用我们的动物支架装置。首先，注射氯胺酮、甲苯噻嗪和美学。

一旦动物失去知觉，将其放在加热垫上静脉注射。注射 Rodin b 异硫氰酸酯葡聚糖，以便将来观察组织中的血流。打开皮肤和腹膜腔，露出含有移植胸腺的肾脏，以防止肾脏恢复到原来的位置。

用缝线缝合皮肤切口的外侧。将动物转移到动物支架顶部的加热垫上。捏住肾脏的两侧。

使用铝箔制成的夹子。关闭动物支架并放置顶部加热器。探头尽可能靠近您的组织。

在准备工作上加入低熔点的 aros。用顶部加热器盖住整个制剂。监测麻醉并每 40 分钟给予麻醉剂 Boosts。

完成手术后，整个设置现在转移到双光子显微镜上，以进行进一步的成像采集。在我们的案例中，我们使用了 Prairie Ultima 双光子显微镜，配备了一个并列蓝宝石激光器、四个顶部 PMT 和一个 20 倍水浸物镜。首先打开激光器和显微镜。

然后根据所需的波长添加 RIC 反射镜和滤光片组。将动物放入显微镜下。将所有加热垫连接到它们的控制器。

在顶部加热器孔的顶部加水，然后小心地将物镜放入水中。使用 XY、Z 外部控制器专注于血管或 GFPT 寄存器。快速找到感兴趣的区域。

调整 PMT 的增益以优化分色，并最大限度地减少在背景上获得足够信号所需的激光。找到感兴趣区域后，在我们的基本设置中通过采集 50 微米深度组织体积的序列图像来开始延时成像采集。获取每个卷需要 30 秒。

因此，在此体积的 30 次连续重复后达到 60 分钟的图像采集。该视频显示了胸腺内的 GFP 阳性细胞。注意细胞运动和血管内的血流。

但是，如果准备不好，在这种情况下，器官温度会很低。即使血流继续，细胞也会停止移动。这里描述的方法允许在 ViiV 中观察胸腺细胞。

这些方法对于任何有兴趣在 T 细胞发育过程中观察胸腺细胞分布和相互作用的免疫学家都应该非常有用，尽管方法非常简单，但应该注意几个步骤以避免任何实验伪影。例如，您应该注意不要损坏任何血管，因为这会减少组织内的氧合。此外，温度应始终保持在 37 摄氏度。

最后，此处获得的结果对于验证任何其他结果或通过 x vivo 技术获得的结果应该非常有用。